II rok BIOTECHNOLOGII

II rok BIOTECHNOLOGII METABOLIZM ZWIĄZKÓW LIPIDOWYCH Rok akademicki 2015/2016 REGULAMIN ĆWICZEŃ 1. Nadrzędne znaczenie ma regulamin ćwiczeń z biochemii dla studentów biotechnologii obowiązujący podczas wszystkich bloków ćwiczeniowych oraz regulamin zaliczenia ćwiczeń z przedmiotu Metabolizm, cz. I modułu. 2. Ćwiczenia z metabolizmu związków lipidowych: A. odbywają się trzy zblokowane ćwiczenia. Ponieważ nie ma możliwości odrabiania ćwiczeń, jednorazowa nieobecność (usprawiedliwiona również) oznacza niezaliczenie ćwiczeń. B. oprócz zajęć laboratoryjnych (24 godziny lekcyjne) w skład ćwiczeń wliczane są następujące godziny lekcyjne: - spotkanie z kierownikiem ćwiczeń w celu omówienia ocenionego raportu (termin ustalany indywidualnie, 1 godzina, spotkanie jest obowiązkowe) - konsultacje odnośnie rozwiązywania zadań obliczeniowych (termin ustalany przez starostę roku, spotkanie nieobowiązkowe wliczane do sumy godzin przeprowadzonych na ćwiczeniach, 2-3 godziny lekcyjne) - konsultacje odnośnie przygotowania do kolokwium zaliczeniowego z publikacji naukowych (termin ustalany przez starostę roku, spotkanie nieobowiązkowe wliczane do sumy godzin przeprowadzonych na ćwiczeniach, 2-3 godziny lekcyjne). C. ćwiczenia przeprowadzone zostaną w trybie projektu. Każdy zespół (dwu lub trzyosobowy) przez trzy tygodnie ćwiczeń będzie badał właściwości otrzymanych do analizy ekstraktów z materiału biologicznego oraz, dodatkowo, substancji wskazanych przez prowadzącego ćwiczenia. Po zakończeniu ćwiczeń każdy zespół przygotowuje raport, który należy przesłać pocztą elektroniczną w wersji doc lub docx kierownikowi ćwiczeń do 31 grudnia 2015r. Raport może zostać zwrócony w celu dokonania poprawek, możliwa jest tylko jedna poprawa każdego sprawozdania. Sprawozdanie dostarczone do dwu dni po wyznaczonym terminie ocenione będzie adekwatnie do zawartych treści, bez możliwości poprawy, dostarczone po 2 stycznia 2015r będzie ocenione na ocenę niedostateczną. D. każde ćwiczenie rozpoczynać będzie się kolokwium wejściowym dotyczącym ćwiczenia przewidzianego na dany dzień. Kolokwium to nie może być poprawiane, a pytania do niego układa prowadzący ćwiczenie. Do kolokwium wstępnego należy przygotować się, korzystając z niniejszego opracowania. Kolokwium wstępne jest oceniane przez osobę prowadzącą ćwiczenie, a ocena z nich uzyskana jest brana pod uwagę przy wystawianiu oceny końcowej. E. kolokwium zaliczeniowe jest pisemne i składa się z pytań otwartych i zadań rachunkowych. Odbędzie się ono w połowie stycznia 2016r. Kolokwium piszą w tym samym terminie wszystkie grupy. Kolokwium poprawkowe odbędzie się w terminie do 2 tygodni od przekazania ocen z I terminu. Do kolokwium zaliczeniowego proszę przygotowywać się korzystając z niniejszego opracowania, materiałów zawartych w skrypcie (Polanowski A (red.) Laboratorium z biochemii, Wrocław 2005 - wersja papierowa lub wersja elektroniczna dostępna na stronie WB) oraz materiałów opublikowanych na stronie internetowej Wydziału Biotechnologii: http://www.biotech.uni.wroc.pl/studenci/licencjackie-2-rok/ F. Ocena z tej części ćwiczeń: - dla osób, które zaliczyły kolokwium w I terminie: 75% oceny z kolokwium zaliczeniowego+25% średniej ocen z kolokwium wstępnego i raportu. - dla osób, które zaliczyły kolokwium w II terminie: ocena z kolokwium poprawkowego -0.5 stopnia. Jeżeli z kolokwium student otrzymał 3.0, na zaliczenie też jest ocena dostateczna. Ocena zostanie przekazana dr J. Ciuraszkiewicz w celu wystawienia końcowej oceny z całości ćwiczeń z Metabolizmu. 1

INSTRUKCJE DO ĆWICZEŃ Ekstrakcja związków o charakterze przeciwutleniaczy z materiału biologicznego. 1. Odważyć w zlewce miarowej 1 g suszu (herbata, zioła) i dopełnić do podziałki 50 ml wrzącą wodą. Parzyć pod przykryciem 10 min. Po przestudzeniu przesączyć i/lub odwirować. Do eksperymentów używać 20-50 μl naparów. 2. Ekstrakty metanolowe z materiału biologicznego zostały wykonane w proporcji 15 ml metanolu do 1 g badanego zliofilizowanego materiału. Należy pamiętać, aby przechowywać je pomiędzy zajęciami w lodówce i aby nie używać ich bezpośrednio po wyjęciu z lodówki, przed użyciem powinny stać na stole laboratoryjnym do czasu uzyskania temperatury pokojowej (ok. 20 min). Proszę bardzo dokładnie zakręcać probówki, w których otrzymacie Państwo ekstrakty. Oprócz wykonania testów czynnościowych (zbadania wpływu otrzymanych ekstraktów na konkretny proces lub reakcję enzymatyczną) każdy zespół jest zobowiązany do wykonania analiz otrzymanych ekstraktów, które będą wykonywane przy okazji testów czynnościowych, ale w raporcie powinny znaleźć się w oddzielnym rozdziale. Analizy ekstraktów: Oznaczenia jakościowe (analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej) Warunki rozdziałów i detekcji: Flawonoidy: Układ rozwijający: octan etylu : kwas mrówkowy : kwas octowy : woda (100 : 11 : 11 : 27 v/v) Detekcja swoista: ultrafiolet przy 365 nm, wcześniej płytkę należy spryskać odczynnikiem: 1% metanolowy roztwór 2-aminoetylofenyloboranu i po wysuszeniu 5% etanolowym roztworem PEG 4000. Detekcja nieswoista (dla obydwu grup): pary jodu sublimującego. Antocyjaniny: Układ rozwijający: octan etylu : kwas mrówkowy : kwas octowy : woda (100 : 11 : 11 : 27 v/v) Detekcja swoista: brak, związki są barwne. Detekcja nieswoista: pary jodu sublimującego. Oznaczenia ilościowe Całkowita zawartość związków polifenolowych Do probówki przenieść 250 μl badanej próbki, 250 μl odczynnika Folina-Ciocalteau (rozcieńczonego 1:1 wodą destylowaną, przygotowujemy taką ilość odczynnika, jaka zostanie zużyta do doświadczenia), 500 μl 14% roztworu węglanu sodowego i uzupełnić do 5 ml wodą destylowaną. Wymieszać. Po 25 minutach inkubacji w temp. pokojowej w ciemności próbki zwirować (jeżeli potrzebne) przez 5 min przy 7000 obrotów/min. Zmierzyć wartość absorbancji przy długości fali 720 nm wobec próby odczynnikowej (250 μl odczynnika Folina-Ciocalteau, 500 μl 14% roztworu węglanu sodowego, 0,4250 μl wody destylowanej). Ilość związków fenolowych wyrażoną w mg/ml ekstraktu obliczyć ze wzoru: A 720 x0,3707-0,0005. Otrzymany wynik przeliczyć na gram suchej masy materiału wykorzystanego do przygotowania ekstraktów (pamiętać o obliczeniu odchylenia standardowego). Całkowita zawartość flawonoidów Do probówki dodać 100 µl badanego ekstraktu, 1.5 ml metanolu, 100 µl 10 % roztworu AlCl 3 x 6 H 2 O, 100 µl 1 M roztworu CH 3 COONa i 2.8 ml H 2 O. Wymieszać. Pozostawić na stole laboratoryjnym na 40 minut. Po tym czasie zmierzyć absorbancję prób przy λ= 415 nm. Wiedząc, że 0.04 mg kwercetyny daje w warunkach testu A 415 =0.483 obliczyć ekwiwalent kwercetyny dla każdej próby badanej i podać w przeliczeniu na 1 g suchej masy poddanej ekstrakcji (pamiętać o obliczeniu odchylenia standardowego). 2

Całkowita zawartość antocyjanin Z ekstraktu pobrać po 0.1 ml do dwóch probówek, po czym do jednej dodać 1 ml buforu o ph=1 a do drugiej 1 ml buforu o ph=4,5. Odczytać absorbancję przy długości fali λ =526 nm używając jako próby odczynnikowej odpowiednich buforów. W celu wyeliminowania błędów wywołanych zakłóceniami dokonać odczytu również przy długości fali λ=700 nm. Obliczyć absorbancje prób korzystając z poniższego wzoru: A = (A 526nm ph1,0 A 700nm ph1,0 ) (A 526nm ph4,5 A 700nm ph4,5 ) Z krzywej standardowej (dane poniżej) odczytać ekwiwalent pelargonidyny-3 glukozydu dla każdego ekstraktu. Przeliczyć wyniki na 1 g suchej masy poddanej ekstrakcji (pamiętać o obliczeniu odchylenia standardowego). Pelargonidyny-3 glukozyd [mg] A 0,01 0,214 0,02 0,509 0,03 0,751 Całkowita zawartość kwasów fenolowych 1. Do probówki przenieść 100 µl badanego ekstraktu, 1.25 ml H2O, 250 µl 0.5 M roztworu HCl, 250 µl odczynnika Arnova (10% wodny roztwór azotynu sodowego i molibdenianu sodowego) i 250 µl 1 M NaOH. Wymieszać. Po 10 minutach zmierzyć absorbancję przy λ=490 nm. Wiedząc, że krzywa standardowa wykonana w analogicznych warunkach dla kwasu kawowego wyrażona była funkcją o równaniu y = 14,68x - 0,0109 (na osi 0X naniesiono mg kwasu kawowego) odczytać ekwiwalent kwasu kawowego dla każdego ekstraktu. Przeliczyć wyniki na 1 g suchej masy poddanej ekstrakcji (pamiętać o obliczeniu odchylenia standardowego). Ćwiczenie I: Enzymatyczna peroksydacja lipidów przez lipooksygenazy. WSTĘP Lipoksygenazy to grupa niehemowych enzymów z grupy oksydoreduktaz (EC 1.13.11.12), które utleniają wielonienasycone kwasy tłuszczowe zawierające 1,4-dienową strukturę do odpowiednich pochodnych. Głównymi produktami tej reakcji są sprzężone nienasycone kwasy tłuszczowe i wodoronadtlenki. Generowane przez lipooksygenazę wodoronadtlenki stanowią substraty działania kolejnych enzymów, takich jak: liazy, izomerazy wodoronadtlenkowe czy peroksygenazy. Początkowe produkty działanie LOX mogą być degradowane do różnych związków. W komórkach zwierzęcych podstawowym substratem LOX jest kwas arachidonowy, uwalniany z cząsteczek fosfolipidów błonowych przez PLA 2. Kwas arachidonowy (C20:4) może być metabolizowany także przez cyklookygenazę lub monooksygenazę epoksygenazę. Cyklooksygenazy katalizują proces syntezy prostaglandyny H2 prekursora prostaglandyn, prostacyklin i tromboksanu. Lipooksygenazy katalizują przyłączenie tlenu w pozycjach 5, 12, 15 kwasu arachidonowego, w wyniku czego powstają hydroperoksydy (HPETE, wodoronadtlenki). Klasyfikacja Podstawą klasyfikacji lipoksygenaz jest pozycja utleniania przy określonym węglu występującym w substracie. W przypadku roślin klasyfikacja odnosi się do kwasu linolowego, natomiast w przypadku zwierząt odnosi się do kwasu arachidonowego. Kwas ten jest utleniany przy węglu 9 lub przy węglu 13. Oksydacje prowadzone są odpowiednio przez 9-lipoksygenazy i 13-lipoksygenazy, a produktami są 9S i 13S utlenione pochodne kwasu linolenowego. 3

U zwierząt klasyfikacja względem kwasu arachidonowego dzieli lipoksygenazy na pięć głównych grup enzymów: 1. 5-lipoksygenazy, które występują w leukocytach różnych gatunków, w pęcherzykach makrofagów, odpowiadają za biosyntezę leukotrienów, a katalizowana przez nie reakcja polega na utlenianiu substratu przy 5 atomie węgla. 2. 15-LOX typu retikulocytarnego, które wstawiają tlen przy 15 atomie węgla substratu, ekspresjonowane są w króliczych i ludzkich retikulocytach oraz w ludzkich komórkach nabłonkowych. 3. 12-LOX typu leukocytarnego, które prowadzą oksydację substratu przy 12 atomie węgla, występują w leukocytach świni oraz mysich makrofagach otrzewnowych. 4. 12-LOX typu płytkowego, posiadające właściwości enzymatyczne analogiczne do poprzedniego typu enzymów, znajdują się w trombocytach wielu gatunków. 5. LOX typu epidermalnego, występujące u ludzi i myszy. W skład tej grupy wchodzą zarówno 8, 12 i 15- lipoksygenazy. LOX te wykazują odmienną specyfikę względem substratu, jednak charakteryzują się znaczną homologią sekwencji aminokwasowej (nawet 99%), w tym również homologią aminokwasów budujących centrum aktywne. Występuje jeszcze jedno kryterium podziału, mianowicie enancjoselektywność. LOX mogą występować jako S-, lub R-lipoksygenazy. Zarówno wśród zwierząt, jak i roślin w większości występują S-LOX, które przeprowadzają insercję tlenu do pro-s rodnikowych intermediatów. Jednak w małych morskich organizmach, takich jak koralowce i rozgwiazdy występują R-LOX. Budowa Cząsteczki LOX zbudowane są z jednego łańcucha polipeptydowego o masie cząsteczkowej 75-81 kda ( 662-711 aa) u ssaków i 94-103 kda ( 838-923 aa) u roślin. Struktura czwartorzędowa LOX jest identyczna w enzymach pochodzenia ssaczego i roślinnego i zawiera dwie domeny: N-końcową -baryłkę (PLAT, Polycystin-1, lipoxygenase, Alpha-Toxin) lub domenę LH2 (Lipoxygenase homology) oraz część katalityczną zlokalizowana na C-końcu łańcucha polipeptydowego. LOX posiadają wysoce konserwatywną sekwencję aminokwasową odpowiedzialną za utrzymanie prawidłowej budowy centrum aktywnego i wiązanie jonu żelaza katalitycznego ("LOX motyw : His-X4-His-X4-His-X17- His-X8-His). Katalityczny atom żelaza jest umiejscowiony w otoczeniu 3 konserwatywnych reszt His, jednej reszty His/Asn/Ser i C-końcowej Ile ułożonych przestrzennie na kształt oktaedru. Substrat (kwas tłuszczowy) może lokalizować się w kieszeni substratowej zarówno grupa karboksylową na jej dnie, jak i u wylotu. Jest to zależne od rodzaju (a dokładniej- jonizacji) reszt aminokwasowych obecnych w obrębie części początkowej (wlotu) i końcowej kieszeni. Jak na razie kwestią niewyjaśnioną jest sposób transportu cząsteczek tlenu do wnętrza kieszeni substratowej. Sugeruje się, że dyfunduje on swobodnie wzdłuż kieszeni, jednak możliwe jest, że w strukturze przestrzennej enzymu istnieje specjalny kanał, mający na celu ułatwienie dotarcia O 2 w pobliże jonu Fe. 4

Mechanizm reakcji katalizowanej przez lipoksygenazy Substratem enzymatycznej reakcji peroksydacji może być tylko kwas tłuszczowy posiadający w cząsteczce ugrupowanie (1Z,4Z)-penta-1,4-dienowe. Katalizowana przez lipoksygenazy reakcja składa się z trzech etapów: 1. oderwania atomu wodoru od allilowego atomu węgla i utworzenia rodnika pentadienylowego, 2. wewnątrzcząsteczkowej rearanżacji wolnego rodnika alkenylowego, to znaczy przeniesienia elektronu wolnorodnikowego w kierunku końca CH 3 lub końca karboksylowego cząsteczki, w każdym z tych przypadków przesunięcie wynosi 2 atomy węgla (stąd notacja [+2] lub [-2]) i zawsze dochodzi do zmiany położenia wiązania podwójnego z typu izolowanego na sprzężony, wynikiem tych przekształceń jest powstawanie dwu rodzajów produktów, różniących się miejscem przyłączenia tlenu, 3. przyłączenia cząsteczki tlenu atmosferycznego, które następuje zawsze w pozycji 1 lub 4 ugrupowania (1Z,4Z)- penta-1,4-dienowego. Reakcja peroksydacji lipidów przez lipoksygenazy jest możliwa dzięki obecności w cząsteczce enzymu łatwo zmieniającego stopień utlenienia atomu żelaza niehemowego (Fe 2+ Fe 3+ ). Znaczenie biologiczne reakcji LOX LOX roślinne konwertują kwas linolenowy i linolowy do postaci różnych aktywnych metabolicznie intermediatów zaangażowanych w obronę roślin, ich wzrost, wydawanie nasion i obumieranie (np. kwas jaśminowy). U zwierząt podstawową funkcją LOX jest przemian kwasu arachidonowego do eikozanoidów. Odgrywają one znaczącą rolę w utrzymywaniu homeostazy komórki oraz biorą udział w przebiegu wielu chorób, w tym przebiegających ze stanem zapalnym (przeziębienie, gorączka, artretyzm, astma, nowotwory). Wykazują również zdolność do peroksydacji lipidów kwasów tłuszczowych lipidów błonowych, pozwalając tym samym na lokalne zmiany struktury i funkcji błon biologicznych, bez których nie zachodziłyby procesy dojrzewania wielu komórek, w tym erytrocytów, komórek nabłonka soczewki i keratynocytów. Inhibitory aktywności LOX Jak w przypadku każdego enzymu, częściowa lub całkowita utrata aktywności przez LOX może być spowodowana wieloma czynnikami. Należą do nich czynniki zmieniające konformację białka, zmieniające konformację lub właściwości substratu, związki chemiczne oddziałujące z kieszenią substratową i/lub centrum aktywnym enzymu. Do inhibitorów LOX zaliczane są m.in. kwas kawowy (kwas 3,4-dihydroksycynamonowy), kurkumina (diferuilometan), ketokonazol (lek przeciwgrzybiczny) i niesteroidowe leki przeciwzapalne (np. ibuprofen). Ponieważ reakcja katalizowana przez LOX przebiega zgodnie z mechanizmem wolnorodnikowym, do w/w czynników inhibicyjnych dołączyć można drobnocząsteczkowe antyoksydanty (np. likopen, beta-karoten, luteinę, wit. C) oraz 5

związki chelatujące jony metali (EDTA czy EGTA). Wykazanie potencjalnych zdolności inhibicyjnych tych związków jest celem opisanych niżej doświadczeń. Przebieg ćwiczenia: I.1. Izolacja enzymu Odważyć w zlewkach po 10 g mąki sojowej, z grochu, fasoli białej, lnu lub soczewicy. Mąkę zalać acetonem (0.5 cm powyżej poziomu mąki) i ekstrahować 10 min (mieszając bagietką) w celu odtłuszczenia. Przesączyć. Mąkę obecną na sączku wysuszyć. Suchą, odtłuszczoną mąkę zalać wodą destylowaną i ekstrahować enzym przez 15 minut, mieszając zawiesinę mąki w wodzie. Zawiesinę przesączyć, a surowy, nieoczyszczony ekstrakt enzymu dodatkowo odwirować, co najmniej jednokrotnie, w wirówce stołowej przy maksymalnych obrotach. Supernatant przechowywać w lodówce. I.2. Przygotowanie substratu Do 7.1 ml 1% roztworu kwasu linolowego w metanolu dodać 0.25 ml detergentu Tween-20. Odparować rozpuszczalnik w wyparce próżniowej i zawiesić powstały film lipidowy w 100 ml 0.05 M Na 2 HPO 4. Doprowadzić ph roztworu do 9.0 używając 1 M NaOH (jako indykatora zmian używamy papierka wskaźnikowego). Do badań rozcieńczyć 10x. UWAGA: Proszę starannie opisać przygotowany substrat, grupa, która jako pierwsza wykonuje to ćwiczenie przygotowuje substrat dla wszystkich pozostałych grup. I.3. Badanie zależności aktywności lipoksygenazy od stężenia enzymu w próbie Produkt reakcji lipoksygenazy zawiera w cząsteczce układ wiązań sprzężonych (substrat posiada układ wiązań izolowanych), o maksimum absorpcji przy =233 nm. Obserwując wzrost absorbancji przy tej długości fali możemy wykreślić krzywą kinetyczną reakcji utlenienia lipidów przez lipoksygenazy oraz oznaczyć aktywność tych enzymów. Do kuwety spektrofotometrycznej dodać 2.4 ml roztworu substratu, aparat wyzerować dla =233 nm, reakcję zainicjować przez wstrzyknięcie kolejno od 20 do 100 l roztworu enzymu. Dla każdej dodanej ilości r-ru enzymu śledzić zmiany absorbancji przez 5 minut. Szybkość początkową reakcji obliczyć z nachylenia początkowego odcinka krzywej kinetycznej reakcji. Jako jednostkę aktywności enzymu przyjąć taką jego ilość, która powoduje w czasie 1 min wzrost absorbancji o 0.001 jednostki. Jednostka ta jest równa utlenieniu 0.12 mola kwasu linolowego. Podać aktywność enzymatyczną otrzymanego preparatu. Wybrać rodzaj enzymu (LOX sojowa, grochowa czy też inna) oraz jego ilość wykorzystywaną w dalszych eksperymentach. UWAGA: roztwór enzymu wykazuje stosunkowo duże pochłanianie światła przy długości fali 233 nm. Dlatego należy eksperymentalnie dobrać ilość dodawanego enzymu, rozcieńczając go w taki sposób, aby po zakończeniu reakcji obserwowana A 233 mieściła się w zakresie wynikającym z prawa Lamberta-Beera!! I.4. Badanie wpływu inhibitorów na aktywność LOX. Przygotować serię probówek zawierających taką ilość roztworu substratu, aby po wymieszaniu z niewielkimi objętościami roztworów inhibitorów końcowa objętość próby wynosiła 2.4 ml. Inkubować 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym zainicjować oraz przeprowadzić reakcję enzymatyczną jak w doświadczeniu I.3. Podać procentową zależność szybkości reakcji enzymatycznej w obecności przeciwutleniacza w stosunku do szybkości reakcji w jego nieobecności. Jako inhibitory każdy zespół powinien wykorzystać otrzymane metanolowe ekstrakty z materiału biologicznego oraz dodatkowo jeden czynnik z następujących: EDTA, witamina E, witamina C, jeden z niesteroidowych leków przeciwzapalnych, świeżo przygotowany ekstrakt z wybranej herbaty. 6

Ćwiczenie II: Nieenzymatyczna peroksydacja lipidów jonami żelaza. Antyoksydanty prewentywne. Przed przystąpieniem do ćwiczeń proszę przeczytać publikację Metabolizm lipidów El Bahr S (http://www.biotech.uni.wroc.pl/wp-content/uploads/2014/09/metabolizm-lipid%c3%b3w-el-bahr-s.pdf). Podstawą metody jest powstawanie barwnego produktu reakcji kwasu tiobarbiturowego z niektórymi produktami peroksydacji lipidów (głównie z dialdehydem malonowym, powstającym z nietrwałych nadtlenków lipidów podczas ogrzewania mieszaniny reakcyjnej) w kwaśnym środowisku i podwyższonej temperaturze. Przebieg reakcji przedstawia Rys. 3. Rys. 3. Schemat reakcji dialdehydu malonowego z kwasem tiobarbiturowym Powstający produkt ma różowe zabarwienie, a jego stężenie oznacza się spektrofometrycznie lub spektrofluorymetrycznie. Reakcja ta charakteryzuje się dużą czułością, jest jednak mało specyficzna. Istnieje bowiem szereg związków, które reagują w podobny sposób, dając produkty pochłaniające światło o zbliżonej długości fali. Sama reakcja również może powodować peroksydację lipidów, dlatego, aby wykluczyć tę możliwość i dokonać pomiaru poziomu peroksydacji lipidów przed reakcją, należy prowadzić oznaczenia w obecności BHT (2,6-di-tbutylo-p-krezol), jako przeciwutleniacza prewentywnego, zapobiegającego utlenianiu lipidów przez odczynniki używane do oznaczeń. Przebieg ćwiczenia: II.1. Oznaczanie stopnia peroksydacji trójglicerydów. 5, 10, 15 l emulsyjnej postaci oleju lnianego dopełnić do 1 ml buforem 10 mm Tris-HCl, ph 7.4. Dodać 2 ml odczynnika A i dokładnie wymieszać. Próby ogrzewać 15 minut we wrzącej łaźni wodnej. Ilość powstałych produktów utleniania oznaczyć kolorymetrycznie przy =535 nm i obliczyć, ze wzoru: A= c l, gdzie: A-absorbancja próby, c- stężenie molowe próby, l- długość drogi optycznej, wiedząc, ze współczynnik ekstynkcji molowej ( ) dla MDA wynosi 1.56x10 5 M -1 cm -1. II.2. Badanie zależności peroksydacji lipidów od stężenia induktora. Do oznaczonej i wybranej z poprzedniego doświadczenia ilości emulsji dodać wzrastające ilości roztworu Fe 2+ (do stężenia końcowego 0.5-20 mm) w postaci siarczanu (VI) żelazowo (II)-amonowego (soli Mohra) i dopełnić do 1 ml buforem 10 mm Tris-HCl, ph 7.4. Inkubować przez 15 minut w temp. pokojowej. Po tym czasie oznaczyć ilość powstałych produktów peroksydacji jak w p. II.1. II.3. Badanie wpływu obecności antyoksydantów na peroksydację lipidów w obecności jonów żelaza. Do oznaczonej i wybranej z doświadczenia II.1. ilości emulsji dodać wzrastające stężenie roztworu przeciwutleniacza (otrzymane ekstrakty z produktów naturalnych oraz dodatkowo jeden czynnik z następujących: BHT (2,6-di-t-butylop-krezol), BHA (2(3)-t-butylo-4-hydroksyanizol), wit. C, benzoesan sodowy, orcyna do stężenia 0.5-50 mm) i dopełnić do (1-x) ml buforem 10 mm Tris-HCl, ph 7.4. Po 10 min inkubacji dodać do prób x l Fe 2+ do końcowego stężenia wyznaczonego w doświadczeniu II.2. i inkubować przez 15 minut w temp. pokojowej. Po tym czasie oznaczyć ilość powstałych produktów peroksydacji jak w p. II.1. UWAGA: niektóre ze stosowanych antyoksydantów wykazują właściwości prooksydacyjne. Powoduje to, że absorbancja próbek wykracza poza zakres prawa Lamberta-Beera i próbki wymagają rozcieńczania. Dlatego dla każdej serii badającej wpływ antyoksydantu należy przygotować kontrolę nie zawierającą go. Jeżeli absorbancja próby będzie za wysoka, należy w taki sam sposób rozcieńczać próby badane i kontrolę. 7

II.4. Oznaczanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej ekstraktów z materiału biologicznego metodą redukcji jonów żelaza (III). Antyoksydanty na ogół są związkami redukującymi, stąd metody oznaczania ich zawartości w jakimś materiale często opierają się na pomiarze redukcji jakiegoś indykatora przez antyoksydanty. Antyoksydanty mogą redukować jony Fe 3+ do Fe 2+, które tworzą barwny kompleks z 2,4,6- tripirydylo-s-triazyną (TPTZ). Przyrost absorbancji tego kompleksu przy 593 nm jest miarą zawartości antyoksydantów w badanej próbie. Dodatkowo, niektóre przeciwutleniacze fenolowe posiadają zdolność do chelatowania jonów metali przejściowych. Jon obecny w powstającym w tym procesie kompleksie jest niezdolny do zmiany stopnia utlenienia, co oznacza, że jest niezdolny do indukowania reakcji wolnorodnikowej. Przygotować roztwór roboczy: zmieszać 0.3 M bufor octanowy ph 3.6, 10 mm roztwór 2,4,6-tripirydylo-S-triazyny w 40 mm HCl i 20 mm roztwór FeCl 3 w proporcjach 10:1:1. Do probówek typu eppendorfa odpipetować po 1150 μl roztworu roboczego, do jednej dodać 50 μl wody (próba odnośnikowa), do pozostałych po 50 μl badanych próbek (ekstraktów metanolowych z materiału biologicznego), dokładnie wymieszać. Po 20 min zmierzyć absorbancję badanych próbek przy 593 nm względem próby odnośnikowej. W razie potrzeby testy powtórzyć zmieniając ilość ekstraktów użytą do doświadczeń oraz pamiętając, że końcowa objętość próby powinna wynosić 1.2 ml. Próby wykonujemy w trzykrotnym powtórzeniu dla dwóch różnych stężeń badanych ekstraktów/związków. Wykorzystując załączone dane (tabela poniżej) wykreślić krzywą standardową dla kwercetyny, przeliczyć uzyskane dla próbek wyniki na μmole kwercetyny i podać uśredniony odpowiednik kwercetyny (ekwiwalent kwercetyny) dla każdej z badanych substancji w przeliczeniu na 1 g suchej masy, pamiętając o obliczeniu wartości SD. Krzywą standardową dla kwercetyny oraz tabelę zbiorczą zawierającą przeliczenia należy dołączyć do sprawozdania. Kwercetyna [μmole] A 593 0,00132 0,1531 0,0026 0,2698 0,004 0,4076 0,0053 0,5489 0,0066 0,6368 Materiały i odczynniki Emulsja oleju lnianego: 15 mg seskwioleinianu sorbitanu, 50 mg oleju lnianego i 2 ml 10 mm buforu Tris-HCl, ph 7.4 poddać sonikacji przez 15 min. w 4ºC. UWAGA: jeżeli emulsja jest niestabilna i szybko ulega rozdziałowi na dwie fazy, należy poddawać ją mieszaniu przed każdym pobraniem próbki; Odczynnik A: 15 % TCA, 0.375 % TBA, 0.25 M NaCl. Odczynnik Folina-Ciocalteau rozcieńczony w stosunku 1:1 z wodą destylowaną odczynnik przygotowujemy kilka minut przed wykonaniem oznaczenia i w takiej ilości jaką zużyjemy w ciągu jednego dnia 14 % roztwór węglanu sodu 0.3 M bufor octanowy ph 3,6 10 mm roztwór 2,4,6-tripirydylo-S-triazyny (TPTZ) w 40 mm HCl 20 mm roztwór FeCl 3 (przygotowany tuż przed oznaczeniem) 8

Ćwiczenie III: Pomiar całkowitego potencjału antyoksydacyjnego wybranych antyoksydantów i naparów metodą redukcji rodnika DPPH (antyoksydanty interwentywne). Wpływ wolnych rodników na zdolność związków fluoryzujących do emisji światła. Zdolność antyoksydacyjna substancji lub ich mieszanin może być badana różnymi metodami. W zależności od zastosowanej techniki pomiarowej, zdolność zmiatania rodników definiowana i nazywana jest bardzo różnorodnie (ang. TAC total antioxidant capacity, FRAP ferric reducing ability of plasma, TRAP total peroxyl radical trapping antioxidant parameter, TRAP total redox antioxidant potential, ORAC oxygen radical absorbance capacity, TEAC Trolox-equivalent antioxidant capacity czy też TAR total antioxidant reactivity). Na potrzeby tego ćwiczenia przyjmiemy nazwę: całkowity potencjał antyoksydacyjny (CPA). Przedstawia on sumaryczną zdolność badanej substancji/mieszaniny substancji do wymiatania wolnych rodników. Jest to bardzo przydatny parametr, szczególnie w dietetyce, kiedy porównujemy potencjał antyoksydacyjny produktów żywnościowych. Bardzo często korzystniejsza jest znajomość sumarycznej wielkości całkowitej zdolności zmiatania rodników przez dany układ niż stężenia poszczególnych antyoksydantów, ponieważ współdziałanie między różnymi antyoksydantami daje większy potencjał antyoksydacyjny niż związki te badane osobno. W doświadczeniach opisanych poniżej wykorzystywana będzie metoda spektrofotometryczna polegające na badaniu zdolności ekstraktów do redukcji rodnika DPPH. DPPH (2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl) jest wolnym rodnikiem o stosunkowo dużej trwałości. Roztwór DPP (Rys. 1a) ma barwę purpurową (wg. niektórych ciemnofioletową) o maksimum absorbancji w roztworze metanolowym przy długości fali λ = 515 nm, w czasie redukcji barwa ta stopniowo zmienia się na żółtą. W reakcji z substancją, która może oddać atom wodoru, tworzy formę zredukowaną DPPH (Rys. 1b) i wówczas zanika fioletowe zabarwienie roztworu. Spadek absorbancji po dodaniu antyoksydantów jest proporcjonalny do ilości formy utlenionej DPPH, jaka pozostaje w roztworze i jest miarą zdolności przeciwutleniaczy do zmiatania wolnych rodników. Porównania zdolności antyoksydacyjnej substancji lub ich mieszanin (np. ekstraktów) dokonuje się przez określenie procentu zmiatania wolnych rodników zgodnie ze wzorem: CPA (% zmiatania DPPH) = 100 (A próby kontrolnej A próby badanej ) / A próby kontrolnej lub przeliczeniu na podstawie krzywej standardowej (dane poniżej), jaka ilość mikromoli Troloxu wywiera podobny efekt, jak obserwowany dla badanego przeciwutleniacza lub ich mieszaniny. Metoda ta nie jest tożsama z TEAC, ponieważ stosowana jest tu zupełnie inna metodyka badawcza. Aby wyznaczyć TEAC (czasami nazywane skrótowo jako TE- Trolox-equivalent), zgodnie z normami międzynarodowymi, należy posługiwać się fluoresceiną w roli sondy fluorescencyjnej poddawanej wygaszaniu. Trolox- nazwa handlowa kwasu 6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochromano- 2-karboksylowego, rozpuszczalnej w wodzie pochodnej witaminy E. Jest to związek przyjęty jako umowny standard substancji o właściwościach antyoksydacyjnych, do której porównuje się wszystkie badane substancje o podobnych właściwościach, niezależnie od ich budowy chemicznej. Fluorescencja, fluorescencja opóźniona i fosforescencjamechanizm kwantowy i warunki zachodzenia, diagram Jabłońskiego i umiejętność jego interpretacji i rysowania- proszę przypomnieć sobie z poprzednich wykładów (Metody fizyczne w biologii i Chemia biofizyczna). Wpływ wolnych rodników na fluorescencję. Wolne rodniki z racji swoich właściwości chemicznych atakują głównie ugrupowania wieloelektronowe związków obecnych w środowisku, dlatego związki wykazujące naturalną fluorescencję są na takie ataki szczególnie narażone. Rodniki niszczą molekuły fluorescencyjne, intensywność fluorescencji spada w miarę postępowania procesu utleniania, ostatecznie dochodzi do całkowitego zaniku fluorescencji. 9

Przebieg ćwiczenia: III.1. Pomiar całkowitego potencjału antyoksydacyjnego wybranych antyoksydantów i naparów metodą redukcji rodnika DPPH. Roztwór DPPH: otrzymany 0.15 mm roztwór metanolowy rozcieńczyć metanolem do otrzymania A 515 0.8. Antyoksydanty: otrzymane metanolowe ekstrakty z materiału biologicznego (2 różne stężenia w trzech powtórzeniach każde) i dodatkowo jeden z następujących czynników: 1 mm kwas askorbinowy (roztwór wodny), 1 mm alfa-tokoferol (roztwór metanolowy), świeżo przygotowany ekstrakt z wybranej herbaty. Pomiar: Do szeregu probówek eppendorfa przenieść niewielkie ilości badanych antyoksydantów lub ekstraktów. Uzupełnić roztworem DPPH do 1.5 ml. Inkubować 60 min w ciemności. Aparat wyzerować na metanol. Po zakończeniu inkubacji odczytać A 515 próby kontrolnej (metanolowy roztwór DPPH) oraz prób badanych. Obliczyć wartość CPA dla każdej próby badanej. Wykorzystując załączone dane (tabela poniżej) wykreślić krzywą standardową dla Troloxu, przeliczyć uzyskane dla próbek wyniki CPA na μmole troloksu i podać uśredniony odpowiednik troloksu (ekwiwalent troloksu) dla każdej z badanych substancji, pamiętając o obliczeniu wartości SD. Krzywą standardową dla troloksu należy dołączyć do sprawozdania. Trolox [μmole] CPA 9,2 10,7 24,1 24,2 51,6 51,4 79,7 78,3 9,2 10,7 III.2. Badanie wpływu wolnych rodników na zdolność związków fluoryzujących do emisji światła Sondy fluorescencyjne: wodne roztwory piraniny (0.1 ml/ml) lub kalceiny (0.05 mm). Induktor utleniania: AAPH (wodny roztwór o stężeniu 30 mg/ml). W kuwecie spektrofotometrycznej umieścić 2.5 ml 10 mm buforu Tris-HCl ph 7.4 i znaną ilość sondy fluorescencyjnej (ilość dobieramy eksperymentalnie). Dodać znane stężenie roztworu AAPH i przeprowadzić pomiary fluorescencji co 30 sekund przez 5 minut. Następnie pomiar powtórzyć dla zmniejszających się stężeń (mniejszych objętości) AAPH. Wykreślić wykres zależności fluorescencji w funkcji czasu dla różnych stężeń induktora. Wykres przekształcić do postaci umożliwiającej odczytanie wartości IC 50. Doświadczenie powtórzyć, zamiast fluorescencji badając zmiany absorpcji sondy fluorescencyjnej. III.3. Badanie wpływu ekstraktów na wygaszanie fluorescencji piraniny przez AAPH. W kuwecie spektrofotometrycznej umieścić 2.5 ml 10 mm buforu Tris-HCl ph 7.4 i znaną objętość sondy fluorescencyjnej (stosowaną w poprzednim doświadczeniu). Dodać znaną ilość badanego ekstraktu i dokonać pomiaru fluorescencji (Ex 454, Em 520) co 30 sekund przez 5 minut. Następnie dodać do tej samej próby taką objętość roztworu AAPH, która w poprzednim doświadczeniu powodowała połowiczne wygaszenie piraniny. Dokonać pomiaru fluorescencji (Ex 454, Em 520) co 30 sekund przez 5 minut. Opracowanie wyników: Sposób opracowania wyników zostanie przedstawiony podczas ćwiczeń. 10

Wyznaczanie wartości IC 50. Istnieje cały szereg doświadczeń, których wyniki przedstawia się w postaci graficznie wyznaczonej wartości IC50 (IH50, EH50), czyli takiego stężenia działającego czynnika, w którym obserwowany parametr przyjmuje wartość 50%. Umożliwia to porównywanie wpływu różnych czynników na badane zjawisko. Przykładem takich eksperymentów może być badanie zdolności detergentów do solubilizacji błony erytrocytarnej, przeżywalności komórek w hodowlach tkankowych, czy wygaszanie fluorescencji przez wzrastające stężenia wolnych rodników. W przypadku tego doświadczenia IC50 będzie to takie stężenie induktora (AAPH, nadtlenku wodoru), w którym fluorescencja badanej sondy spada o połowę względem wartości początkowej. W jaki sposób możemy wyznaczyć tę wartość? 1. Fluorescencja sondy bez AAPH wynosi 20. Jest to nasze 100%. 2. Wybieramy czas, po upływie którego odczytujemy wyniki, jest to moment na wykresie, kiedy dochodzi do całkowitej utraty fluorescencji przez sondę, na naszym wykresie jest to 420s. 3. Dla tego czasu określamy poziom fluorescencji przy wszystkich badanych stężeniach induktora i obliczamy procent obserwowanej fluorescencji początkowej: 5 mg AAPH 0 jednostek, czyli 0 %, 4 mg AAPH 5 jednostek, czyli 25%, 2 mg AAPH 14 jednostek, czyli 70%. 4. Następnie obliczamy stopień wygaszenia fluorescencji: dla 5 mg AAPH jest to 100 %, dla 4 mg 75 %, dla 2 mg 30%. 5. Rysujemy wykres zależności stopnia wygaszenia fluorescencji od stężenia induktora. Na tym wykresie Legenda: znajdujemy punkt, który odpowiada 50% wygaszeniu fluorescencji i czarny kontrola (sonda bez AAPH) znajdujemy stężenie, dla którego taka zależność występuje. Dla każdej czerwony 5 mg AAPH niebieski 4 mg AAPH badanej sondy i badanego induktora wykonujemy oddzielny wykres. zielony 2 mg AAPH 6. Zebrane wartości IC50 przedstawiamy w tabeli. Uwaga: Wszystkie wartości stężeń zostały wymyślone na potrzeby tego zadania i nie mają nic wspólnego z rzeczywistością. 11

Przykładowe zadanie do ćwiczenia I. I. Przeprowadzono badania aktywności wstępnie oczyszczonego preparatu LOX sojowej. W teście zależności aktywności enzymu od jego ilości w próbie otrzymano następujące wyniki: Czas [s] A 233 5 μl 10 μl 30 μl 0 0,24 0,5 1 30 0,3 0,7 1,3 60 0,36 0,63 1,5 90 0,35 0,76 1,55 120 0,37 0,83 1,61 150 0,39 0,96 1,6 180 0,41 0,98 1,59 210 0,5 0,94 1,62 240 0,43 0,97 1,65 270 0,44 0,98 1,59 300 0,46 1 1,58 Zilustruj je wykresami. II. Wykreślono zależność tg kąta nachylenia wykresów do osi 0X od stężenia enzymu i do dalszych eksperymentów wybrano 20 μl LOX. Narysuj wykres, na podstawie którego dokonano takiego wyboru. III. Badano wpływ wzrastających ilości ekstraktu ze szpinaku na aktywność 20 μl preparatu LOX. Uzyskane wyniki zebrano w tabeli: Czas [s] 20 μl 30 μl 50 μl 0 0,46 0,45 0,4 30 0,55 0,5 0,45 60 0,7 0,6 0,5 90 0,9 0,7 0,55 120 1,13 0,8 0,6 150 1,24 0,9 0,65 180 1,4 1,02 0,7 210 1,43 1,07 0,73 240 1,44 1,08 0,75 270 1,44 1,09 0,77 300 1,45 1,1 0,8 Ekstrakcja: 50 g szpinaku zalano 100 ml etanolu, po 30 min próbkę przesączono i etanol odparowano do sucha. Uzyskano 56 mg suchej masy, którą rozpuszczono w 550 μl etanolu. Narysuj procentowy wykres zależności szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia suchej masy ekstraktu (podawanego w mg%) w próbie. 12

Przykładowe zadania na obliczanie wartości IC50 1. Badano reakcję hemolizy erytrocytów pod wpływem dodawanego detergentu. Sposobem detekcji był pomiar ilości uwolnionej hemoglobiny przy =540 nm. Uzyskane wyniki zebrano w tabeli. Wiedząc, że podczas całkowitej hemolizy erytrocytów w wodzie destylowanej otrzymano A 540 =0.49 wyznacz graficznie wartość IC 50 oraz stężenie detergentu powodującą całkowitą lizę erytrocytów (c sol ). (12 M, 25-30 M) Stężenie A 540 detergentu [ M] 1 0.03 2 0.07 5 0.13 10 0.22 15 0.3 20 0.36 30 0.46 50 0.48 2. Przygotowano liposomy z lecytyny jajecznej znakowane 1 mol% NBD- PE. Ponieważ sondę włączono do dwuwarstwy przed jej uwodnieniem, otrzymano liposomy symetryczne, tzn. sonda obecna była w obydwu monowarstwach. Sonda ta jest wrażliwa na status oks-red środowiska. Pod wpływem dodanego do roztworu tiosiarczanu sodowego dochodzi do nieodwracalnych zmian chemicznych w NBD i związek ten przestaje fluoryzować. Jeżeli tiosiarczan sodowy dodany będzie z zewnątrz liposomów, wygasi fluorescencję całej puli NBD obecnego w zewnętrznej monowarstwie (otrzymujemy liposomy asymetryczne ). Objętość tiosiarczanu sodowego (c p =0.8 mm) Fluorescencja [AU] 2 μl 420 4 μl 380 6 μl 320 8 μl 200 10 μl 120 15 μl 50 25 μl 20 Tiosiarczan sodowy posiada zdolność dyfuzji biernej poprzez błonę lipidową, dlatego w miarę upływu czasu obserwujemy także stopniowe wygaszania fluorescencji sondy zlokalizowanej w wewnętrznej monowarstwie. Posługując się poniższą tabelą wyznacz graficznie IC 50 procesu wygaszania NBD-PE obecnego w liposomach symetrycznych, wiedząc że przed dodaniem tiosiarczanu sodowego zarejestrowano fluorescencję o wartości 450 AU, próba miała objętość 2.5 ml, zaś wygaszanie wewnętrznej puli NBD wskutek dyfuzji związku przez błonę (w trakcie trwania doświadczenia) można oszacować na ok. 15% obserwowanych zmian. 3. Piranina jest związkiem, którego fluorescencja (Ex 460 nm, Em 510 nm) ulega zmniejszeniu podczas kontaktu z wolnymi rodnikami. W opisywanym doświadczeniu wolne rodniki uszkadzające strukturę piraniny były generowane podczas rozpadu AAPH. Przygotowano próbę kontrolną zawierającą 10 μl piraniny z roztworu 0,1 mg/ml oraz 250 μl AAPH z roztworu 32,6 mg/ml. Całość dopełniono buforem fosforanowym o ph 7,0 do 3 ml. Próby badane zawierały 10 μl piraniny (stężenie 0,1 mg/ml) oraz wzrastające stężenia ekstraktów etanolowych z oleju lnianego. Po 5 minutach preinkubacji dodawano 250 μl AAPH o stężeniu 32,6 mg/ml i prowadzono pomiar z użyciem spektrofluorymetru SFM 25 Kontron. Odczytu dokonywano co 30 s, aż do całkowitego zaniku fluorescencji próby kontrolnej. Na postawie powyższego wprowadzenia oraz załączonego wykresu oblicz IC 50 (w g/l) procesu hamowania wygaszania piraniny przez wolne rodniki w obecności ekstraktów z oleju (F 0 - fluorescencja samej piraniny, F- fluorescencja piraniny w obecności AAPH lub AAPH i ekstraktów z oleju). 13

F0/F 4. Badano wpływ ekstraktu z oleju lnianego na peroksydację kwasu linolowego indukowaną jonami żelaza. Do emulsji z kwasu linolowego (25 μl) dodano wzrastające stężenia ekstraktów olejowych i dopełniono do 900 μl 10 mm buforu Tris-HCl ph 7,4. Próbki inkubowano 10 minut, po czym dodano 100 μl roztworu soli Mohra, tak by końcowe stężenie jonów żelaza w 3 ml wynosiło 2,5 mm. Po 15 minutach inkubacji dodano 2 ml odczynnika A i przeniesiono próbki do wrzącej łaźni wodnej na 10 minut. Po wystudzeniu probówek wirowano je przez 10 minut w temperaturze 40C przy 2 500 rpm. Po odwirowywaniu wszystkich prób ilość produktów utleniania oznaczano kolorymetrycznie przy długości fali 535 nm. Znając powyższe dane oraz wyniki eksperymentu zobrazowane na rysunku obok oblicz różnicę pomiędzy wartościami IC 50 procesu perosydacji w obecności oraz nieobecności jonów żelazowych. 5. Jedną z metod badania zmian konformacyjnych białek podczas ich oddziaływania z ligandami jest pomiar wewnętrznej fluorescencji reszt Trp białka lub pomiar jej wygaszania przez wygaszacze. Do wygaszania kolizyjnego dochodzi, gdy cząsteczki wygaszacza swobodnie przemieszczają się w roztworze, wygaszanie takie jest zatem zależne od stężenia wygaszacza. Użycie substancji wygaszających o różnych właściwościach pozwala określić typ środowiska, w jakim znajdują się w warunkach eksperymentu reszty Trp. Silniejsze wygaszanie fluorescencji reszt tryptofanowych przez wygaszacze o charakterze hydrofilowym (KI, akrylamid) niż hydrofobowym (TCE) świadczyć może o ekspozycji reszt Trp do środowiska polarnego i odwrotnie. Ponadto, zmiana profilu wygaszania fluorescencji pod wpływem jakiegoś czynnika, np. przyłączanego liganda, świadczyć może o zmianach konformacyjnych białka zachodzących pod wpływem tego oddziaływania. 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0 100 200 300 400 500 600 stężenie KI [mm] Na rysunku powyżej przedstawiono wygaszanie fluorescencji reszt Trp enolazy przez KI (tzw. krzywe Sterna- Volmera) w obecności liposomów zbudowanych z PC/PI 96:4 w zależności od molowego stosunku lipid/białko. Na podstawie danych odczytanych z powyższego wykresu proszę sporządzić kolejny wykres obrazujący zależność wartości IC 50 procesu wygaszania fluorescencji Trp przez KI od stosunku molowego lipid/białko. 14