Struktura i właściwości biofizyczne polipeptydów z wydłuŝonym ciągiem glutaminowym Marta Narczyk
Choroby konformacyjne ang: protein folding diseases Zmiany struktury przestrzennej białka powodują utratę jego funkcji Degradacja białka mukowiscydoza, fenyloketonuria Agregacja białka mutacje punktowe choroba Alzheimera wydłuŝenia ciągu CAG Priony pląsawica Huntingtona choroba Creutzfeldta-Jakoba -2-
Choroby agregacyjne Zmiany struktury przestrzennej białka powodują, Ŝe zyskuje ono nową funkcję tendencję do tworzenia agregatów Agregacja zewnątrzkomórkowa amyloidozy Agregacja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie w ER stwardnienie zanikowe boczne(sla), choroba Parkinsona immunoglobulinopatie w jądrze choroby poliglutaminowe -3-
Choroby poliglutaminowe Grupa schorzeń związanych z obecnością mutacji dynamicznych, polegających na zwielokrotnieniu liczby powtórzeń kodonu CAG kodującego glutaminę (Gln, Q) choroba białko opuszkowo-rdzeniowy zanik mięśni (SBMA) zanik jąder zębatych, gałek bladych i ciał podwzgórzowych (DRPLA) receptor androgenu białko DRPLA ataksje rdzeniowo-móŝdŝkowe (SCA1,2,3) ataksyny 1, 2, 3 choroba Huntingtona Huntingtina poliq to jedyna cecha wspólna tych białek przebieg choroby i moment zapadnięcia na nią zaleŝy od długości poliq zatem struktura, zwijanie się, mechanizmy agregacji poliq mogą być kluczowe dla zrozumienia patofizjologii choroby i ewentualnych terapii -4-
Choroby poliglutaminowe mikrografia z transmisyjnego mikroskopu elektronowego włókniste agregaty w jądrze neuronu przedniej kory zakrętu obręczy młodej dziewczyny z młodzieńczą postacią HD pacjentka odziedziczyła po ojcu gen Htt zawierający 100 powtórzeń kodonu CAG Max Perutz TIBS 24 (1999) 58-63 -5-
Choroby poliglutaminowe mikrografia agregatów peptydów uzyskanych po enzymatycznym rozcięciu białka fuzyjnego GST-Htt(exon 1) Max Perutz et al. TIBS 24 (1999) 58-63 200nm -6-
Długość poliq a ryzyko zachorowania na HD Brinkman et al. Am. J. Hum. Genet. 60 (1997) 1202-1210 -7-
Mechanizm powstawania powtórzeń CAG w DNA zmiana liczby powtórzeń CAG moŝe zachodzić na skutek przesunięcia ramki odczytu rekombinacji model zaproponowany przez R. Holliday Max Perutz Curr. Opin. Struct. Biol. 6 (1996) 848 858-8-
Struktura poliq Max Perutz polar zipper 1993r Max Perutz et al. PNAS 91 (1994) 5355-5358 -9-
Pomiary dichroizmu kołowego (1) badania syntetycznych peptydów Asp 2 - Gln 15 -Lys 2 (poli-l-glutamina nie rozpuszcza się w wodzie) ph 3,0 widma dichroizmu kołowego w nadfiolecie pokazują, Ŝe peptydy mają strukturę β- kartki molar residue elipticity w 197nm niezaleŝny od stęŝenia białka, co oznacza, Ŝe monomery mają strukturę szpilki do włosów (β-hairpin), a agregaty ciasno ułoŝonych β-kartek (tightly linkedβsheets) Max Perutz et al. PNAS 91 (1994) 5355-5358 -10-
Pomiary dichroizmu kołowego (2) białka fuzyjne: GST-Htt(exon1), ph 6,5 wykres A widma CD GST ( ) GST-Q22 (--) GST-Q41 ( ) wstawka widma róŝnicowe Q22 ( ) Q41 (--) widma typowe dla białek nieustrukturowanych (random coil) Q22 Q41 Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002) 267-272 -11-
NMR (1) widma 1 H NMR ogólny wygląd widm podobny wysokie ostre piki dla widm GST-Q22 i GST-Q41 pochodzą od poliq dla Q41 około 2-krotnie wyŝsze niŝ dla Q22 to sugeruje, Ŝe wszystkie Q znajdują się w podobnym otoczeniu chemicznym Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002) 267-272 -12-
NMR (2) widma 2D NMR 1 H 15 N piki pochodzące od Q wyraźnie dominują uzyskane wartości przesunięć chemicznych są typowe dla peptydów nieustrukturowanych GST GST-Q22 Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002) 267-272 -13-
PoliQ w białkach oligomeryzacja (1) inhibitor chymotrypsyny (chymotrypsin inhibitor 2 CI2) wstawka poliq: G-Q 10 -G dwa mutanty: poliq zamiast nieustrukturowanej pętli poliq wstawiony w nieustrukturowaną pętlę ekspresja w E.Coli mieszanina monomeru, dimeru i trimeru Max Perutz TIBS 24 (1999) 58-63 -14-
PoliQ w białkach oligomeryzacja (2) dysocjacja dimeru i trimeru niemoŝliwa bez całkowitej denaturacji białek oligomery mutantów CI2-Q 10 powstają na skutek wymiany domen (domain swapping), a nie na skutek tworzenia sieci wiązań wodorowych pomiędzy glutaminami model polar zipper Max Perutz TIBS 24 (1999) 58-63 -15-
Krystalizacja CI2-Q 4 i inhibitor chymotrypsyny (CI2) wstawka: G-Q 4 -G-M ekspresja w E.Coli mieszanina monomeru, dimeru i trimeru krystalizacja dimeru temp: 4 ºC bufor: 30% w/v PEG400, 1M Li 2 SO 4, 1mM CaCl 2, 0,1M TrisHCl ph 7,5 kryształy rosły przez 4 tygodnie rozdzielczość 1,8Å grupa przestrzenna P622 Chen et al. PNAS 96 (1999) 1257-1261 -16-
Krystalizacja CI2-Q 4 i -17-
Krystalizacja CI2-Q 4 i ciąg poliq pozostaje nieustrukturowany nawet w krysztale wstawka znajduje się między Met59 i Glu60 Chen et al. PNAS 96 (1999) 1257-1261 -18-
Struktura agregatów mikroskopia elektronowa mikrografia agregatów peptydów poliq Asp 2 -Gln 15 -Lys 2 agregaty mają kształt robakowaty, grubość 70 120 Å bardzo róŝne długości Max Perutz et al. PNAS 91 (1994) 5355-5358 -19-
Struktura agregatów dyfrakcja rentgenowska wiązka promieni X równoległa do płytki z agregatami zdjęcie przedstawia β-krzyŝ refleksy w płaszczyźnie południkowej: 8,4, 4,8, 4,2Å refleksy w płaszczyźnie równikowej: 3,6, 3,2Å obraz taki jest charakterystyczny dla struktury włóknistej równikowy refleks w 3,2 Å odpowiada odległości pomiędzy poszczególnymi residuami β-kartki Max Perutz et al. PNAS 91 (1994) 5355-5358 -20-
Stabilność i agregacja Białka fuzyjne GST-Q22, GST-Q41, kontrola GST Badania NMR białek w roztworze wykazały, Ŝe oba fragm. poliq mają postać kłębka statystycznego (random coil) Przez 3 miesiące inkubowano białka w 25ºC, monitorawanie: co 7 dni NMR nie zauwaŝono Ŝadnych zmian Badania CD w zakresie temperatur 10 50ºC wykazały wyjątkową stabilność białek co prawdopodobnie wynika z własności GST Dopiero powyŝej temp. 50ºC białka zaczęły się nieodwracalnie wytrącać GST-Q41 zaczynało się wytrącać ok. 0,5h wcześniej niŝ GST-Q22 Inkubacja białek przez 1h w temp 52ºC oraz przez 0,5h w temp. 70ºC GST-Q41 agregaty więcej i większe (ponad 1mm) niŝ w próbce GST-Q22 Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002) 267-272 -21-
Podsumowanie krótkie ciągi poliq (<41Q) jako osobne peptydy są nierozpuszczalne w wodzie flankuje się je aminokwasami (Gly, Lys, Asp) bada w niskich ph w takich warunkach powstają struktury β-kartki, szpilki do włosów podobne ciągi poliq wstawiane do białek, lub doczepiane na ich końcu wykazują strukturę kłębka statystycznego (random coil) u Drosophili białka zawierające ciągi ponad 20 Q pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych brak dowodów potwierdzających hipotezę struktury polar zipper -22-
Bibliografia Daniel Bąk, Michał Milewski Choroby związane z agregacją białek Postępy Biochemii 51 (2005) 297-307 Max Perutz et. al. Glutamine repeats as polar zipper: Their possible role in inherited neurodegenerative diseases PNAS 91, 5355-5358, 1994 Max Perutz Glutamine repeats and inherited neurodegenerative diseases: molecular aspects Curr. Opin. Struct. Biol. 6 (1996) 848 858 Max Perutz Glutamine repeats and neurodegenerative diseases: molecular aspects TIBS 24 (1999) 58-63 Masimo et al. Solution structure of polyglutamine tracts in GSTpolyglutamine fusion proteins FEBS Letters 513 (2002) 267-272 Brinkman et al. The Likelihood of Being Affected with Huntington Disease by a Particular Age, for a Specific CAG Size Am. J. Hum. Genet. 60 (1997) 1202-1210 Chen et al. Crystal structure of a dimeric chymotrypsin inhibitor 2 mutant containing an inserted glutamine repeat PNAS 96 (1999) 1257-1261 -23-