Ultrawirowanie analityczne uniwersalna technika hydrodynamicznych i termodynamicznych badań cząsteczek biologicznych

Transkrypt

1 Ultrawirowanie analityczne uniwersalna technika hydrodynamicznych i termodynamicznych badań cząsteczek biologicznych Anna Modrak-Wójcik Zakład Biofizyki Instytut Fizyki Doświadczalnej Wydział Fizyki UW

2 Ultrawirowanie analityczne Sedymentacja to proces opadania zawiesiny ciała stałego w cieczy w wyniku działania siły grawitacji lub sił bezwładności Przyspieszenie odśrodkowe osiągane we współczesnych wirówkach analitycznych wynosi ponad x g ( = rpm) Tak duże siły odśrodkowe są wstanie wywołać sedymentacje małych cząsteczek wielkości białek i kwasów nukleinowych (rozmiary ~10-8 m) Ultrawirówki analityczne wyposażone są w system optyczny umożliwiający śledzenie procesu sedymentacji Dostępne systemy detekcji: absorpcyjny UV/Vis ( nm) interferencyjny (laser 655 nm) fluorescencyjny (wzbudzenie 488 nm)

3 Możliwości Technika służąca do badania właściwości hydrodynamicznych i termodynamicznych makrocząsteczek (nie tylko) biologicznych w roztworze w wybranym środowisku biekty: białka i peptydy kwasy nukleinowe polisacharydy organelle komórkowe wirusy nanocząstki masy cząsteczkowe od 1000 Da (masa atomu wodoru = 1 Da)

4 Fizyka sedymentacji w ultrawirówce pis mikroskopowy F o F w F t 0 oś obrotu F t = - fv F w = - m w 2 r m v = s 2 r F o = m 2 r m(1 vρ) f v 2 ω r s współczynnik sedymentacji s: prędkość na jednostkę przyspieszenia 1 Svedberg (S) = sekundy

5 stężenie [a.u.] c(s) [AU/S] Fizyka sedymentacji w ultrawirówce pis makroskopowy równanie Lamma v = s 2 r Naczynko wirówkowe t c c r D sω r r r r c opisuje ewolucję czasową rozkładu stężenia sedymentujących cząsteczek r detekcja dno ciągły rozkład s równanie Svedberga t RTs M N A m D( 1 vρ ) s [S] 2 ( r ) D 6 t Einstein Smoluchowski RT fn A Einstein Sutherland odległość od osi obrotu, r [cm] analiza numeryczna Schuck, Biophys. J , 2000

6 stężenie stężenie Typy eksperymentów Szybkość sedymentacji metoda hydrodynamiczna Równowaga sedymentacji metoda termodynamiczna. odległość od osi obrotu (r) sedymentacja odległość od osi obrotu (r) sedymentacja dyfuzja wypadkowy ruch wielkość, kształt, (s, D, f, M) brak wypadkowego ruchu masa (stany asocjacyjne, K a )

7 Badania białka opiekuńczego ClpB pochodzącego z patogennej bakterii Leptospira interrogans leptospiroza choroba odzwierzęca wywołana przez bakterie Leptospira interrogans ciężkie uszkodzenia nerek, płuc i wątroby ponad 1 mln chorych rocznie ATP białka ClpB białka opiekuńcze (przywracanie prawidłowej struktury innym zagregowanym białkom) wiążą ATP (źródło energii w komórce) właściwości ClpB z Leptospira interrogans słabo poznane ClpB niezbędny w procesie infekcji przez bakterie Leptospira interrogans białko ClpB z E. coli ATP 857 aminokwasów, atomów, Da Carroni et al. elife 2014, PDB: 4CIU

8 Model procesu dezagregacji białek z udziałem ClpB monomer ClpB heksamer ClpB ClpB aktywność biologiczna w formie heksameru zagregowane białko przeciągane jest przez kanał wewnątrz heksamerycznego pierścienia ClpB białko po przejściu przez kanał przyjmuje prawidłową strukturę /konformację proces napędzany energią z hydrolizy ATP Carroni et al. elife , PDB: 4CIU, 4D2U Tyedmers et al. Nat. Rev. Mol. Cell Biol , 2010

9 Badania oligomeryzacji białka ClpB z patogennej bakterii Leptospira interrogans Wiadomo, że dla ClpB z E.coli zachodzi odwracalna, zależna od ATP, oligomeryzacja Czy ma to miejsce dla ClpB z Leptospira interrogans? ultrawirowanie analityczne? ATP

10 Stężenie [a.u.] c(s) [S -1 ] Badania oligomeryzacji ClpB z bakterii Leptospira interrogans monomer heksamer ClpB obecność ATP--S * i ADP ma wpływ na rodzaj i ilość oligomerów tworzonych przez ClpB ClpB + ATP--S wpływ jest inny dla ATP--S i ADP ATP--S indukuje powstawanie heksamerów ClpB ClpB + ADP w obecności ADP widoczne są niższe formy oligomeryczne niż heksamer r [cm] s 20,w [S] *niehydrolizowany analog ATP

11 Inicjacja biosyntezy białek (translacji) x BIAŁK utworzenie kompleksu białka eif4e z kapem rozpoczyna proces biosyntezy białek w komórce białko 4E-BP potrafi zablokować translację wiąże się do kompleksu eif4e-kap i uniemożliwia przyłączanie kolejnych czynników translacyjnych w wielu komórkach nowotworowych mamy do czynienia z podwyższonym stężeniem eif4e, więc zahamowanie aktywności eif4e może okazać się efektywną metodą w terapii przeciwnowotworowej eif4e mrna kap 4E-BP H 2 N N N H N N + CH 3 H P P P B H H kompleks potrójny eif4e, 4EBP i kapu struktura kapu mrna mrna

12 Badania kompleksów z udziałem eif4e, 4E-BP i kapu Czy miejsca wiązania kapu i 4E-BP działają niezależnie? eif4e: 4E-BP: kap : 25 kda, 3500 atomów 13 kda, 1700 atomów 0,5 kda, 50 atomów analiza termodynamiczna tworzenia kompleksów podwójnych eif4e/4e-bp i kap/eif4e/ oraz potrójnych kap/eif4e/4e-bp A + B K a AB K a [AB] [A][B] G RTlnK a ultrawirowanie analityczne i spektroskopia fluorescencyjna

13 Ultrawirowanie eif4e i 4E-BP (+/- kap) A(280) Res stężenie [a.u.] : równowaga sedymentacji mieszanina eif4e : 4E-BP =20000 rpm = rpm = rpm 1 : 2 1 : r [cm] Globalna analiza uzyskanych rozkładów radialnych dla różnych stężeń eif4e i 4E-BP oraz trzech prędkości kątowych stałe asocjacji (K a ) Modrak-Wojcik et al., FEBS Letters 587, , 2013

14 Parametry termodynamiczne oddziaływania eif4e z 4EBP1 i kapem (m 7 GTP) ligand receptor K a [µm -1 ] G [kcal/mol] ultrawirowanie 4E-BP eif4e eif4e/kap kap T=20C, ph 7.2 spektroskopia fluorescencyjna eif4e eif4e/4e-bp stała asocjacji 4E-BP z eif4e wzrasta 10-krotnie w obecności kapu obecność 4E-BP powoduje spadek stałej asocjacji kapu o połowę (ułatwienie dysocjacji kapu) miejsca wiązania kapu i 4EBP w eif4e, choć przestrzennie odległe, nie są niezależne widzą się nawzajem Modrak-Wojcik et al., FEBS Letters 587, , 2013

15 soby Zakład Biofizyki IFD WF UW Ryszard Stolarski Agnieszka Bzowska Joanna Żuberek Anna Niedźwiecka Elżbieta Bojarska Michał Górka Katarzyna Niedźwiecka Środowisko Laboratorium Analitycznego Ultrawirowania Wydział Biologii, Uniwersytet Gdański Sabina Kędzierska-Mieszkowska Joanna Krajewska Kansas State University Michał Żółkiewski Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Konrad Zdanowski ProteomeLab XL-I (Beckman Coulter)