Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki nowotworowej: Ćwiczenie D Badanie procesu starzenia komórkowego indukowanego przez chemoterapeutyki w komórkach nowotworowych i prawidłowych WSTĘP Rozwój cywilizacji i medycyny zapewnia ludziom coraz dłuższe życie. O tym, że pojedyncze komórki starzeją się wiadomo od lat 60-tych ubiegłego wieku. Wykazali to Leonard Hayflick i Paul Moorhead, udowadniając, że komórki w hodowli, po przejściu określonej liczby podziałów przestają się dzielić, ale nie umierają i mogą żyć w hodowli kilka miesięcy. Komórki te nadal są aktywne metabolicznie i wydzielają do środowiska szereg czynników takich jak cytokiny prozapalne, proteazy, mitogeny, które mogą tworzyć środowisko wspierające wzrost komórek prenowotworowych. Od imienia głównego odkrywcy wyczerpanie zdolności replikacyjnych, czyli maksymalna liczba podziałów, jakim podlega komórka, nazywane jest limitem Hayflicka. Dla ludzi limit ten wynosi około 50 podziałów. Limit Hayflicka dotyczy komórek zróżnicowanych, komórki macierzyste czy nowotworowe mogą się dzielić bez ograniczeń. Rola starzenia komórkowego jest ściśle zależna od wieku organizmu i w okresie młodości pełni funkcje w ochronie przed nowotworami i w regeneracji tkanek, a w wieku podeszłym przyczynia się do dysfunkcji tkanek i narządów oraz do pojawiania się chorób związanych z wiekiem. Indukcja przyspieszonego starzenia komórkowego może być również jednym z efektów działania leków przeciwnowotworowych i mieć znaczący wpływ na efekt działania leku oraz na efekty uboczne chemioterapii. Rodzaje starzenia komórkowego i jego przyczyny Możemy wyróżnić dwa rodzaje starzenia komórkowego: replikacyjne i przyspieszone. Starzenie replikacyjne wynika z wyczerpania limitu podziałowego i dotyczy większości typów komórek somatycznych zarówno in vitro jak i in vivo. Jego przyczyną jest skracanie się telomerów. Telomery u człowieka składają się z tysięcy powtórzeń motywów zbudowanych z 6 par zasad TTAGGG. U człowieka jest to około 10 kpz. Są one swoistym replikometrem komórki (licznikiem podziałów). Ich funkcja polega na zabezpieczaniu zakończeń chromosomów przed łączeniem się. Dzięki temu w komórce zachowana jest integralność genomu. Uważa się, że do starzenia komórki dochodzi, gdy telomery ulegną skróceniu do 1
połowy swojej wyjściowej długości i dotyczy to większości typów komórek. Wykazano także, że do uruchomienia procesu starzenia komórkowego wystarczy skrócenie do krytycznej długości telomerów na 5 chromosomach. Skracanie telomerów ma miejsce z powodu nierównocennej replikacji obydwu nici DNA, tzw. problemu końca replikacji. Drugi rodzaj starzenia to starzenie przyspieszone, SIPS (ang. stress-induced premature senescence). Jest ono niezależne od skracania telomerów. Może być indukowane stresem oksydacyjnym, onkogenami lub czynnikami uszkadzającymi DNA, np. chemoterapeutykami, promieniowaniem jonizującym czy innymi związkami cytostatycznymi, nie tylko bezpośrednio działające na DNA. Zachodzi ono w dużo krótszym czasie niż starzenie replikacyjne (w hodowli na ogół w ciągu kilku dni), zarówno in vitro jak i in vivo, i nie wynika z wyczerpania potencjału podziałowego. Ten rodzaj starzenia obserwowany jest zarówno w komórkach prawidłowych pod wpływem działania związków prowadzących do powstawania podwójnych pęknięć nici DNA, jak i w komórkach nowotworowych, jako efekt np. chemioterapii. Starzenie przyspieszone może być również efektem działania onkogenów, OIS (ang. oncogene induced senescence), np. może być wynikiem ekspresji onkogenu Ras. Przyczyna obydwu typów starzenia jest inna, ale wiąże się z aktywacją tej samej ścieżki odpowiedzi na uszkodzenia DNA. W starzeniu replikacyjnym taki sygnał generują skrócone lub pozbawione szelteryn telomery, a w przyspieszonym pęknięcia podwójnej nici DNA. Do niedawna sądzono, że starzenie przyspieszone indukują silne uszkodzenia w DNA nietelomerowym, ale w 2012 roku wykazano, że aby doszło do starzenia komórkowego uszkodzenia muszą być zlokalizowane w odcinkach telomerowych. Pęknięcia nici DNA w odcinkach nietelomerowych są dość wydajnie naprawiane, a uszkodzenia nici tworzącej telomer, ze względu na specyficzną strukturę i białka chroniące, są niedostępne dla systemów naprawczych. Uszkodzenia nici DNA uruchamiają ścieżkę odpowiedzi na uszkodzenia, DDR (ang. DNA damage response), której kluczowym białkiem jest p53, określane mianem strażnika genomu. Białko p53 indukuje białko p21 WAF1 /CIP1 (p21), które jest inhibitorem kinaz zależnych od cyklin i odpowiada za zatrzymanie komórek w cyklu, czyli zahamowanie podziałów. Od białka p53 zależy: A. czy komórka czasowo przestanie się dzielić i w tym czasie naprawi uszkodzenia, B. czy zostanie uruchomiony szlak prowadzący do apoptozy, gdy uszkodzenia są zbyt duże, aby je naprawić, C. czy też komórka wejdzie na drogę starzenia, gdy uszkodzenia znajdują się w odcinkach telomerowych. 2
Drugim szlakiem istotnym w indukcji starzenia komórkowego jest ścieżka z udziałem białka Rb, będącego supresorem nowotworu. Odpowiada ono za rekrutację enzymów związanych z epigenetycznymi modyfikacjami chromatyny, takich jak metylazy i acetylazy. Hiperfosforylowane białko Rb, w wyniku działania kinaz zależnych od cyklin, jest nieaktywne. W stanie hipofosforylowanym wiąże się z czynnikiem transkrypcyjnym E2F, blokując jego aktywność, która jest niezbędna do przejścia komórki do fazy S. W ten sposób hipofosforylowane aktywne białko Rb hamuje podziały komórkowe. Poziom fosforylacji Rb jest zależny od białka p16 Ink4a (p16), które jest inhibitorem zależnych od cyklin kinaz cdk4/6 (tworzących kompleks z cykliną D1, charakterystyczną dla fazy G1 cyklu komórkowego). Do aktywacji p16 dochodzi na skutek uszkodzeń DNA oraz wzrostu poziomu wolnych rodników. Podobną rolę pełni również białko p21. Poprzez hamowanie tworzenia kompleksu cdk2/cyklina E zapobiega hiperfosforylacji białka Rb. Zarówno poziom p16 jak i p21 znacząco rośnie w starych komórkach. Uważa się, że p16 może być szczególnie odpowiedzialne za starzenie komórek pozbawionych p53. Znaczniki starzenia komórkowego Pierwszą podstawową i niezbędną cechą komórki starzejącej się jest utrata zdolności do proliferacji mimo zapewnienia optymalnych warunków do podziału. Innymi słowy, jeśli komórka przetrwa działanie czynnika wywołującego starzenie, np. chemoterapeutyku, to nie jest w stanie wrócić do proliferacji i tworzyć kolonii (test zdolności tworzenia kolonii, z ang. colony forming assay) nawet przy dobrych warunkach wzrostowych pozbawionych tego czynnika. Komórki starzejące się mają zmienioną morfologię. W hodowli in vitro takie komórki są powiększone i rozpłaszczone, a w ich cytoplazmie widać liczne ziarnistości. Ważnym markerem starzejącej się komórki jest wzrost aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy (SA-β-gal, ang. senescence associated β-galactosidase). Aktywność tego białka bada się dzięki zastosowaniu substratu enzymu, X-Gal, który rozkładany jest w ph=6,0 przez aktywną SA-β-gal do niebieskiego produktu obserwowanego pod mikroskopem świetlnym. W komórkach starzejących się zwiększa się liczba uszkodzeń DNA oraz pojawiają się skupiska heterochromatyny, co wiąże się z wyciszeniem ekspresji pewnych genów. Z drugiej strony dochodzi do wzmożonej ekspresji innych genów, przede wszystkim inhibitorów cyklu komórkowego, wspomnianych p21 i p16. Określenie poziomu tych dwóch białek jest niezwykle ważne przy badaniu procesu przyspieszonego starzenia komórkowego (badanie poziomu białek techniką western blot). W komórce starzejącej się pojawia się także specyficzny fenotyp wydzielniczy (SASP, ang. senescence associated secretory phenotype). 3
Oprócz markerów uniwersalnych istnieją również markery komórkowo- oraz tkankowo-specyficzne, CESP (ang. cell-type exclusive senescent phenotype) charakterystyczne dla danego rodzaju i pochodzenia komórki. Rys. 1 Komórki H460: kontrolne, niepodlegające starzeniu komórkowemu (zdjęcie po lewej) oraz starzejące się, traktowane związkiem C-1311 (zdjęcie po prawej) (badania własne) Rola starzenia komórkowego W przeciwieństwie do starzenia organizmu, starzenia komórkowego nie można uważać tylko za proces destrukcyjny, prowadzący do pogorszenia funkcjonowania całego organizmu. Rola starzenia komórkowego i jego funkcja zmienia się wraz z wiekiem. U osobników młodych odgrywa istotną rolę w procesie regeneracji tkanek. Jest niezbędne w zachowaniu homeostazy organizmu. Komórki z uszkodzonym materiałem genetycznym przestają się dzielić i ulegają starzeniu, dzięki czemu nie dochodzi do procesu nowotworzenia. Co więcej, komórki takie charakteryzują się specyficznym fenotypem sekrecyjnym, SASP i wydzielają cytokiny, które są rozpoznawane przez komórki żerne układu odpornościowego i eliminowane. Procesowi temu towarzyszy przejściowy stan zapalny. Starzenie komórkowe zostało zaobserwowane również podczas rozwoju zarodkowego. Jest ono, prawdopodobnie tak jak apoptoza, niezbędnym elementem służącym do przemodelowania struktur zarodka oraz prawidłowej organogenezy. U osób w podeszłym wieku spada zdolność do regeneracji tkanek i jednocześnie rośnie liczba komórek starych. Wyczerpuje się również pula komórek macierzystych niezbędnych do zastępowania uszkodzonych komórek. Usunięcie komórek starych wiązałoby się z ubytkiem tkanki, więc nie jest już możliwe. Zwiększający się udział komórek starych przyczynia się do utrzymania w organizmie chronicznego stanu zapalnego (tu fenotyp SASP odgrywa już negatywną rolę) i stwarza warunki sprzyjające rozwojowi chorób wieku podeszłego oraz powstawania nowotworów. Proces przyspieszonego starzenia komórkowego odgrywa ważną rolę także w chemioterapii. Wiele ze stosowanych w klinice leków przeciwnowotworowych prowadzi do indukcji starzenia, dzięki czemu komórki nowotworowe przestają się dzielić. W konsekwencji 4
guz przestaje rosnąć, a starzejące się komórki mogą być lepiej widoczne dla układu odpornościowego. Z drugiej strony komórki starzejące się wydzielają białka sekrecyjne, które mają właściwości sprzyjające rozwojowi guza nowotworowego (w tym nowych ognisk) oraz nowych naczyń krwionośnych (angiogeneza). Co więcej, leki przeciwnowotworowe oddziaływają również na komórki nienowotworowe i w nich mogą prowadzić do indukcji przyspieszonego starzenia komórkowego. Jest to jeden z negatywnymi efektów ubocznych działania leków przeciwnowotworowych prowadzący do dysfunkcji narządów i szybszego pojawienia się chorób związanych z podeszłym wiekiem. Starzenie komórkowe w procesie nowotworzenia oraz chemiotorepii ogrywa zatem ważną, ale skomplikowaną rolę i jest przedmiotem wielu badań. CZĘŚĆ PRKTYCZNA Celem ćwiczenia jest obserwacja mikroskopowa zmian w morfologii komórek i ich zdolności do rozkładu substratu X-Gal do niebieskiego produktu, które są markerem procesu przyspieszonego starzenia komórkowego. Materiały: Sprzęt: płytki Petriego 60 mm i 35 mm, szkiełka podstawowe i nakrywkowe, komórki dowolnej linii nowotworowej rosnącej w postaci zawiesiny lub monowarstwy, pożywka hodowlana z dodatkiem 10% FBS i antybiotyków, trypsyna, wyjściowy roztwór badanego związku, PBS ph = 7,2, PBS ph = 6,0, Roztwór utrwalający (Fixative Solution), Roztwór barwiący (Staining Solution), X-Gal (10 mg/ml w DMF). inkubator CO 2, licznik komórek Coulter, mikroskop świetlny, pipety automatyczne, rękawiczki jednorazowe, vortex, cieplarka. 5
WYKONANIE ĆWICZENIA 1. Komórki będące w logarytmicznej fazie wzrostu zaszczepić na 60 mm płytki Petriego ze szkiełkiem nakrywkowym w odpowiedniej ilości, a następnie inkubować w atmosferze 5% CO 2 w temperaturze 37 C przez 24 godziny, celem przyklejenia się komórek do podłoża (dla komórek rosnących w postaci monowarstwy). przygotowuje Prowadzący 2. Po 24 godzinnej preinkubacji dodać badany związek, a następnie inkubować określoną długość czasu (stężenie i czas ekspozycji danego związku określa Prowadzący ćwiczenie). wykonuje Prowadzący WYKONUJĄ STUDENCI: 3. Po zakończonej inkubacji komórek z badanym związkiem odessać pożywkę znad komórek. 4. Powierzchnię komórek dwukrotnie przepłukać 5 ml ciepłego roztworu PBS ph = 7,2. 5. Po przepłukaniu i odessaniu PBS-u znad komórek, zalać powierzchnię komórek 5 ml mieszaniny roztworu utrwalającego (Fixative Solution). Inkubować komórki przez 5 min w temperaturze pokojowej. Fixative Solution: 0,5 ml 2% glutaraldehyd (stężenie końcowe: 0,2%) 0,5 ml 20% formaldehyde (stężenie końcowe: 2%) 4,0 ml PBS ph = 7,2 6. Odessać roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki ciepłym roztworem PBS ph = 6,0. 7. Po przepłukaniu komórek przenieść szkiełko nakrywkowe z przyklejonymi komórkami na płytkę Petriego 35 mm. 8. Zalać komórki mieszaniną roztworu barwiącego Staining Solution zawierającego 1 mg/ml X-Gal i inkubować przez około 12-16 h w temperaturze 37 C. Mieszanina X-Gal: 0,2 ml roztworu X-Gal + 1,8 ml Staining Solution Staining Solution: (V = 10 ml) 500 µl 100 mm K 3 Fe(CN) 6 (stężenie końcowe 5 mm) 500 µl 100 mm K 4 Fe(CN) 6 (stężenie końcowe 5 mm) 20 µl 1 M MgCl 2 (stężenie końcowe 2 mm) 300 µl 5 M NaCl (stężenie końcowe 150 mm) 4 ml 0,1 M Kwas cytrynowy/bufor Na 2 HPO 4 (stężenie końcowe 40 mm) 4,68 ml H 2 O 6
9. Kolejnego dnia po zakończonej inkubacji komórki przemyć ciepłym roztworem PBS ph = 7,2. Szkiełko nakrywkowe przenieść na szkiełko podstawowe komórkami do dołu i oglądać pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 200x. PRZYGOTOWANIE SPRAWOZDANIA 1. Podać cel i opisać w sposób zwięzły przebieg ćwiczenia wraz z wyjaśnieniem zasad postępowania. 2. Na podstawie otrzymanych zdjęć preparatów mikroskopowych opisać morfologię komórek i określić, czy w badanych komórkach dochodzi do indukcji przyspieszonego starzenia komórkowego. Porównać wyniki uzyskane dla komórek traktowanych i nietraktowanych chemoterapeutykiem. LITERATURA 1. A Bielak-Żmijewska, W Grabowska, D Przybylska Rola starzenia komórkowego w starzeniu organizmu i chorobach związanych z wiekiem. Postępy Biochemii, 2014. 2. IB Roninson, EV.Broude, B-D Chang If not apoptosis, then what? Treatment-induced senescence and mitotic catastrophe in tumor cells Drug Resistance Updates, 2001. 3. M Demaria, MN O'Leary, J Chang, L Shao, S Liu, F Alimirah, et al. Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse Cancer Discovery, 2017. 7