PORÓWNANIE BAKTERIOBÓJCZEGO DZIAŁANIA RÓŻNYCH TYPÓW MIODÓW I PROPOLISU NA BAKTERIE GRAMDODATNIE I GRAMUJEMNE

PORÓWNANIE BAKTERIOBÓJCZEGO DZIAŁANIA RÓŻNYCH TYPÓW MIODÓW I PROPOLISU NA BAKTERIE GRAMDODATNIE I GRAMUJEMNE Mika Bożena, Tynka Betina, Ziembińska-Buczyńska Aleksandra Studenckie Koło Naukowe Biotechnologów przy Centrum Biotechnologii Politechnika Śląska Ul. Krzywoustego 8 44-100 Gliwice Wprowadzenie Już od zarania dziejów człowiek wykorzystywał produkty, będące wynikiem pracy pszczół. Powstała też apiterapia (łac. apis-pszczoła, therapy- terapia), czyli naturalna metoda leczenia, w której wykorzystuje się produkty pszczele. Jedną z ważniejszych właściwości miodu jest działanie bakteriobójcze. Wykorzystywali to już starożytni Egipcjanie. Miód był dodawany do balsamu, który służył mumifikowaniu ciał faraonów [9]. Miód składa się z substancji organicznych i nieorganicznych. Łącznie, w różnych jego odmianach określono ponad 300 składników. Bakteriobójcze działanie wywołane jest m.in. wysokim ciśnieniem osmotycznym, które wynika z dużego stężenia cukrów. Naturalne cukry stanowią 70-80% jego masy, a do najważniejszych z nich należą fruktoza i glukoza. W zależności od rodzaju miodu stosunek fruktozy do glukozy może się różnić. Wiąże się z tym szybkość zachodzenia krystalizacji: miody z przewagą fruktozy krystalizują wolniej niż miody z przewagą glukozy, np. miód spadziowy. W miodzie znajdują się również niewielkie ilości dwucukrów, np. sacharozy, maltozy oraz trójcukrów i wielocukrów [3]. Rozwój wielu mikroorganizmów uniemożliwia obecność kwasów organicznych, dzięki którym miód ma kwaśne ph. Odczyn miodów wynosi ok. 3,8-4,9. Na szczęście dzięki dużej ilości cukrów nie jest odczuwalny jego kwaśny smak. W miodzie można znaleźć głównie kwasy: glukonowy (produkt reakcji enzymatycznej glukozy z tlenem), cytrynowy oraz jabłkowy. Dodatkowo występować w nim mogą kwasy: bursztynowy, malonowy, mlekowy, masłowy, mrówkowy, octowy i propionowy. Do nieorganicznych kwasów obecnych w miodzie, zaliczyć można kwas fosforowy i solny [3]. 1

Właściwości bakteriobójcze miodu wynikają również z aktywności enzymów wytwarzanych w gruczołach pszczół. Takim enzymem jest np. oksydaza glukozowa, która katalizuje utlenianie β-d-glukozy do glukonolaktonu, wykorzystując tlen cząsteczkowy jako akceptor elektronów. Glukonolakton po przyłączeniu cząsteczki wody przechodzi w kwas glukonowy (Rys. 1). Ubocznym produktem reakcji jest nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ), który hamuje rozwój mikroorganizmów. Po rozcieńczeniu miodu wodą, następuje wzrost działania bakteriobójczego nawet 220 krotnie w porównaniu z miodem nierozcieńczonym. Jednak pod wpływem promieni słonecznych i temperatury H 2 O 2 rozpada się. Również obecna w miodach nektarowych katalaza (pochodząca z pyłku kwiatowego) katalizuje rozpad nadtlenku wodoru na wodę i tlen, w związku z tym wykazują one mniejszą aktywność antybiotyczną [2, 3]. Rys.1. Przebieg reakcji katalizowanej przez oksydazę glukozową (GOD) [2]. Kolejnym enzymem znajdującym się w miodzie jest lizozym. Lizozym jest glikozydazą, która powoduje rozerwanie ściany komórkowej bakterii. Jej substratem jest polimer, składający się z na przemian występujących reszt N-acetyloglukozoaminy (NAG) i kwasu N- acetylomuraminowego (NAM), połączonych wiązaniami β-glikozydowymi. Wskutek działania enzymu, wiązanie glikozydowe ulega hydrolizie między węglem C-1 NAM i C-4 NAG (Rys. 2). W wyniku wysokiego, wewnętrznego ciśnienia osmotycznego, rozcięcie już niewielkiej ilości łańcuchów polisacharydowych powoduje rozerwanie ściany komórkowej bakterii i pęknięcie komórki [1, 3, 10]. 2

Rys. 2. Lizozym hydrolizuje wiązanie glikozydowe między NAM i NAG; R- reszta kwasu mlekowego należąca do NAM [10]. Naukowcom udało się wykazać w miodzie zawartość pszczelej defensyny-1, która umożliwia skuteczne działanie antybakteryjne miodów. Jest to białko wydzielane przez gruczoły znajdujące się w gardle pszczoły miodnej. Wcześniej obecność defenzyny-1 stwierdzono w mleczku pszczelim oraz w hemolimfie pszczół [6]. Działanie bakteriobójcze mogą zapewniać również substancje pochodzące z nektaru roślin olejkowych i ze spadzi drzew iglastych. Należą do nich: tymol, cyneol, α- bisabolol, α i β- pinen, kamfen, kadynen. Bakteriobójczo działają również związki flawonoidowe, garbniki katechinowe, kwas benzoesowy oraz antranilan metylu [3]. Miody wiosenne charakteryzują się niską aktywnością enzymatyczną oraz ubogą zawartością soli mineralnych. Natomiast miody letnie wykazują dużą aktywność enzymatyczną i zawierają najwięcej kwasów organicznych. Jeśli chodzi o miody jesienne, to charakteryzują się one również wysoką aktywnością enzymatyczną oraz zawierają najwięcej soli mineralnych [3]. Wysokie działanie antybakteryjne wykazują miody spadziowe z drzew iglastych, miód gryczany i lipowy. Dodatkowo, zainteresowanie wśród naukowców wzbudza miód Manuka, pochodzący z Nowej Zelandii, który słynie z bardzo wysokich właściwości bakteriobójczych. Wynikają one z obecności metyloglioksalu [7]. 3

Z czasem miód traci swoje cenne właściwości, obniża się jego aktywność enzymatyczna. Badania ograniczają się jedynie do wyznaczenia liczby diastazowej, czyli ilości cm 3 1% roztworu skrobi, która zostaje rozłożona przez enzymy zawarte w 1g miodu. Dzięki niej możliwe jest określenie aktywności enzymatycznej amylazy. W świeżym miodzie liczba ta wynosi średnio 17,9 jednostek, po roku może ona znacznie zmaleć. Na spadek aktywności enzymatycznej może wpływać ogrzewanie miodu powyżej 45 C oraz działanie promieni słonecznych. Dodatkowo wraz z długością przechowywania miodu (głównie w temperaturze większej niż 18 C) wzrasta w nim zawartość 5-HMF (5- hydroksymetylofurfural). Jest to produkt procesów dehydratacji monosacharydów w środowisku kwaśnym lub pośredni produkt cyklu reakcji Maillarda. Jego zawartość w miodzie zależy od odmiany, składu chemicznego i kwasowości miodu [3, 11]. Propolis to kit pszczeli, który jest kleistym, żywicznym, termoplastycznym materiałem. Pszczoły wykorzystują go jako substancję budulcową i izolacyjną ula. Zapewnia on ochronę przed przeciągami, wilgocią i mikroorganizmami. Powstaje dzięki wymieszaniu z woskiem i pyłkiem substancji zebranej przez pszczoły z żywicujących pąków i drzew, a ostatecznie podlegającej uelastycznieniu dzięki specjalnej wydzielinie pszczół. Propolis ma właściwości przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, a nawet przeciwgrzybiczne. Główną funkcją propolisu jest również ochrona pszczół przed infekcjami. Dla przykładu, pszczoły pokrywają warstwą propolisu komórki, w których mają zostać złożone jaja lub okrywają jego warstwą uśmiercone ich jadem szkodniki, których pszczoły nie są w stanie usunąć z ula, a których produkty rozkładu stanowiłyby zagrożenie dla całego roju [9]. Właściwości fizyczne i barwa (od ciemnożółtej do ciemnobrązowej) propolisu zależą od regionu pochodzenia i rodzaju roślin. Ze względu na ogromną ilość składników mineralnych, pierwiastków śladowych i witamin, jego właściwości lecznicze, tak jak miodu mają szerokie znaczenie [9]. Propolis składa się w około połowie z żywic i balsamów. 7,5-35% jego składu stanowi wosk, a w 18-34% inne składniki, np. olejki eteryczne, czy pyłek kwiatowy. Można w nim znaleźć też składniki mineralne, tj.: mangan, cynk, krzem, żelazo, itd.. Można w nim wyróżnić jeszcze wiele innych substancji [9]. Działania przeciwbakteryjne, przeciwgrzybiczne i przeciwwirusowe ekstraktu z propolisu pochodzącego z Polski oraz z pozostałych krajów europejskiego nie wykazują różnic. Naukowcom udało się dowieść, że działanie antybiotyczne ekstraktów propolisu zapewniają flawonoidy i estry kwasów fenolowych. Najsilniejsze działanie antybiotyczne ma m.in. galangina, która zaburza rozwój gronkowców poprzez agregację ich komórek oraz umożliwia 4

hamowanie replikacji u wirusów i bakterii gramdodatnich. W badaniach wykazano również, że ester fenetylowy kwasu kawowego, kwas kawowy, naryngenina i kwercetyna uniemożliwiają ruch rzęsek u bakterii, głównie gramujemnych. Dodatkowo wywołają zaburzenia w przepuszczalności bakteryjnych błon cytoplazmatycznych dla jonów metali, co wiąże się z zahamowaniem funkcji życiowych i śmiercią tych komórek. Również pinostrobina, apigenina, myrycetyna, luteolina, ester etylowy kwasu kawowego, pinocembryna oraz kwas galusowy zapewniają bakteriobójcze działanie wyciągu z propolisu [5]. Badania miały na celu porównanie działania bakteriobójczego miodów i wyciągu z propolisu na bakterie gramdodatnie i gramujemne. Charakterystyka mikroorganizmów, które wybrano do badania bakteriobójczego działania substancji Do analiz w tym projekcie wybrano przedstawicieli bakterii gramdodatnich i gramujemnych, odpowiednio: Bacillus subtilis oraz Escherichia coli. Komórka wszystkich bakterii jest osłonięta błoną komórkową. Komórki bakterii są otoczone leżącą na zewnątrz od błony, sztywną ścianą komórkową. U bakterii gramujemnych na zewnątrz ściany komórkowej leży błona zewnętrzna. Śluzy otoczkowe pełnią ważną rolę u bakterii, chroniąc je m. in. przed antybiotykami. Ściana komórkowa jest zbudowana inaczej u bakterii gramdodatnich, a inaczej u gramujemnych. Odmienność w budowie osłon komórkowych jest powodem zasadniczej odmienności fizjologicznej tych dwóch grup bakterii. Bacillus subtilis to gramdodatnie tlenowe laseczki tworzące spory i zasiedlające glebę. B. subtilis nazywana jest laseczką sienną, ponieważ bardzo łatwo wyizolować ją z siana. Powoduje śluzowacenie pieczywa [1]. Jej materiał otoczkowy zbudowany jest z mieszaniny izomerów D i L kwasu glutaminowego [5]. Escherichia coli należą do gramujemnych, względnie beztlenowych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. E. coli zamieszkuje jelita, lecz potrafi żyć także poza układem pokarmowym, a jej obecność można łatwo wykazać, np. w wodzie [1]. E. coli wytwarza enterotoksynę działającą na cyklazy nukleotydowe, wtórnie wpływając na gospodarkę wodną komórki i zwiększając sekrecję elektrolitów do jelita. Większość szczepów E. coli występujących w przewodzie pokarmowym pełni funkcję symbiontów lub komensali. Biorą one udział w rozkładzie substancji pokarmowych i syntetyzują witaminy z grupy B, K i C. 5

Dzięki wytwarzaniu bakteriocyn są także konkurentami dla bakterii chorobotwórczych. Oprócz szczepów E. coli będących komensalami istnieją także patogenne szczepy, które powodują zatrucia pokarmowe i są odpowiedzialne za powstawanie poważnych chorób, niekiedy śmiertelnych. Także niepatogenne szczepy pałeczki okrężnicy mogą być przyczyną infekcji w przypadku obniżenia odporności organizmu. Bakterie te stają się chorobotwórcze tylko wtedy, gdy dostaną się do tkanek poza przewodem pokarmowym, zwłaszcza dróg moczowych i żółciowych, płuc, otrzewnej, opon mózgowych, wywołując procesy zapalne [8]. Celem projektu było porównanie działania bakteriobójczego miodów (dwóch lipowych, trzech wielokwiatowych, spadziowego oraz miodu Manuka) i wyciągu z propolisu na bakterie gramdodatnie i gramujemne: Bacillus subtilis oraz Escherichia coli. Materiały i metodyka Charakterystyka wybranych miodów i propolisu Właściwości i zastosowanie miodów zależy od jego rodzaju (w dużym stopniu z jakiego surowca został wytworzony i jak zachodził proces jego dojrzewania w ulu). Miody różnią się od siebie smakiem, aromatem, barwą, konsystencją i nawet przypisywanymi im właściwościami leczniczymi. Wszystko zależy od zawartego w nich nektaru lub spadzi [9]. W tym eksperymencie wykorzystano zarówno miody: lipowy, wielokwiatowy i spadziowy, pochodzące z pasieki z okolic Rudy Śląskiej - Halemby (woj. śląskie), jak i miody dostępne w sprzedaży (miód Manuka, i miody wielokwiatowe). Propolis w formie stałej oraz użyty do stworzenia wyciągu, pochodził również z tej samej pasieki. Miód Manuka to produkt naturalny, produkowany przez pszczoły, zbierające nektar z krzewu Manuka, pochodzącego z Nowej Zelandii i południowo-wschodniej Australii [12]. Działanie bakteriobójcze zapewnia mu m.in. metyloglioksal, którego stężenie jest istotną cechą odróżniającą miody Manuka od innych miodów, a także od samych siebie pod względem siły właściwości antybakteryjnych i leczniczych. Wyróżnia się miody o następujących stężeniach MGO 1 : 30+, 100+, 250+, 400+, 550+. Miód Manuka działa korzystnie na układ pokarmowy, oddechowy - nawilża, tonizuje błony śluzowe oraz łagodzi podrażnienia, pozytywnie wpływa na mechanizmy obronne organizmu, zwiększa liczbę 1 Metoda badania miodów polegająca na pomiarze stężenia methylglyoxalu w miodzie [13]. 6

probiotycznych bakterii jelitowych oraz poprawia stan skóry [13]. W badaniach użyto miód Manuka MGO 400+. Miód lipowy w lecznictwie wykorzystywany jest ze względu na jego działanie napotne, łagodzące oraz pobudzające apetyt. Dlatego jego stosowanie zaleca się w przypadku braku łaknienia, przeziębienia, kaszlu, zapalania zatok czołowych oraz przy bólach głowy [9]. W doświadczeniu wykorzystano miód pochodzący z miodobrania z lipca 2012 r. (badano go w formie skrystalizowanej- miód lipowy 1) oraz z czerwca 2013 r. (miód lipowy 2). Miód wielokwiatowych pochodzi z nektaru różnych gatunków roślin kwitnących w danym sezonie [3]. W badaniu wykorzystano ten rodzaj miodu pochodzący z czerwcowego miodobrania 2013 roku oraz dwa miody wielokwiatowe zakupione w hipermarkecie. Do pierwszych dwóch powtórzeń wykorzystano artykuł z logo podniesionego kciuka. Producent zapewniał, że była to mieszanka miodów pochodzących z państw członkowskich Unii Europejskiej i spoza Unii Europejskiej. Drugi to miód pszczeli nektarowy wielokwiatowy firmy Złota Pasieka. Była to mieszanka miodów pochodzących z państw UE i spoza UE (Polska, Rumunia, Bułgaria, Ukraina) Miód spadziowy powstaje ze spadzi, czyli słodkiej cieczy wydalanej przez owady pasożytnicze (mszyce, czerwce i koliszki), dla których sok roślinny stanowi pożywienie [3]. Wykorzystano miód spadziowy z wrześniowego miodobrania 2013 r. Propolis zastał przetestowany w postaci stałej, rozdrobnionej, nieoczyszczonej oraz jako jego etanolowy wyciąg. Został on przygotowany we wrześniu 2012 r. wg przepisu: 50 g rozdrobionego propolisu zalano w słoiku 0,25 l spirytusu. Następnie odstawiono słój, aby nastąpiło oddzielenie osadu, a kit uległ całkowitemu rozpuszczeniu. Tylko od czasu do czasu potrząsano słojem, aby wymieszać jego zawartość. Jednak nie oddzielono ciekłej formy od osadu, tak jak zalecają książki, tylko podczas badań pobierano odpowiednią ilość wyciągu znad osadu. Wykorzystano również alkohol etylowy w stężeniu 96% (Stanlab). Miody badano w postaci naturalnej oraz rozcieńczonej 1:2. Stężony miód testowano poprzez odważenie 0,4 g miodu i umieszczenie tej ilości w studzience o średnicy 8 mm. Natomiast rozcieńczenia (wagowo/objętościowe) miodów 1:2 wykonano poprzez odważenie 1 g miodu i rozpuszczenie go w 2 ml wody destylowanej. 50 µl substancji wprowadzono do studzienki. W badaniach do studzienek wprowadzano również po 50 µl etanolowego wyciągu z propolisu. Jego działanie porównano ze skutecznością suchego, nieoczyszczonego 7

propolisu oraz etanolu. Do studzienek zostało wprowadzonych 0,25 g suchego propolisu oraz 50 µl etanolu. Ilość testowanych substancji przypadającą na jedną szalkę Petriego zawarto w tabeli nr 1. Tabela 1. Ilości substancji zastosowanych do badania bakteriobójczego działania przypadających na jedną płytkę Petriego Badana substancja Miód Manuka Miód lipowy Miód wielo- kwiatowy - naturalny Miód wielokwiatowy - zakupiony w sklepie Miód rozcieńczony 1:2 Etanolowy wyciąg propolisowy Propolis Suchy, nieoczyszczony 96% Etanol Ilość badanej substancji przypadają ca na jedną szalkę Petriego 0,4 g 0,4 g 0,4 g 0,4g 50 µl 50 µl 0,25 g 50 µl Posiewy bakteryjne W badaniach (powtórzenie nr I i II) wykorzystano podłoże stałe: agar odżywczy (BTL Łódź). Natomiast podczas trzeciego powtórzenia wykorzystano stałe podłoże: agar wzbogacony z glukozą (BTL Łódź). W centralnej części gotowych płytek z podłożem, zrobiono studzienki za pomocą sterylnej końcówki do pipet automatycznych o średnicy 8 mm. Następnie z czystych szczepów bakterii Escherichia coli i Basillus subtilis stworzono zawiesiny bakteryjne w soli fizjologicznej. Z ich wykorzystaniem wykonano posiewy murawowe na płytkach ze studzienkami w podłożu. Kolejnym krokiem było umieszczenie w studzienkach odpowiedniej ilości każdej z badanych substancji (Tab. 1). Inkubacja płytek trwała 24 oraz 48 godzin w temperaturze 37 C. Na podstawie obecności i wielkości strefy zahamowania wzrostu drobnoustrojów określono bakteriobójczość miodów oraz etanolowego wyciągu z propolisu w porównaniu z suchym propolisem i etanolem. Wielkość strefy zahamowania wzrostu mierzono od studzienki. Ze względu na nierównomierną dyfuzję substancji w podłożu agarowym, strefa zahamowania wzrostu nie miała jednolitego kształtu. Jej wielkość określono poprzez uśrednienie czterech pomiarów (Rys. 3) 8

Rys. 3. Sposób pomiaru strefy zahamowania wzrostu bakterii W trzecim powtórzeniu, dodatkowo określono bakteriobójczy wpływ etanolu poprzez stworzenie dwóch zawiesin bateryjnych (E. coli oraz B. subtilis) osobno w 10 ml sterylnej soli fizjologicznej, które następnie zworteksowano. Do dwóch probówek wprowadzono po 0,5 ml zawiesiny. Do każdej z nich wprowadzono po 0,5 ml etanolu. Próbki zworteksowano i po 10 minutach inkubacji posiano murawowo w trzech powtórzeniach. Pozostałą objętość zawiesiny bakteryjnej potraktowano jako kontrolę, z której również wykonano posiew powierzchniowy w trzech powtórzeniach na płytkach z podłożem stałym z agarem wzbogaconym z glukozą. Inkubacja płytek również trwała 24 oraz 48 godzin w temperaturze 37 C. Na podstawie różnic wzrostu kolonii drobnoustrojów określono bakteriobójczość etanolu. Wyniki i dyskusja wyników Z przeprowadzonych badań wynika, że wyciąg z propolisu oraz wszystkie miody, z wyjątkiem miodów wielokwiatowych pochodzących ze sklepu, mają działanie bakteriobójcze. Po użyciu miodów wielokwiatowych zakupionych w sklepie w żadnej z prób nie zaobserwowano obecności strefy zahamowania wzrostu bakterii (Rys. 4A). Propolis w formie stałej oraz 96% roztwór etanolu również nie wykazał takiego działania. Działania bakteriobójczego etanolu nie potwierdziła również próba, podczas której stworzono próbki z etanolem i zawiesiną bakteryjną w stosunku 1:1. Na wszystkich płytkach zaobserwowano niepoliczalną liczbę bakterii. Optymalne stężenie dla etanolu, aby wykazał bakteriobójcze działanie, wynosi 70-80%. Większe jego stężenie powoduje silne odwodnienie bakterii, przez co etanol wykazuje słabsze właściwości antybakteryjne [14]. Powodem jego nieskutecznego działania może być również duża lotność, przez co nie występuje w próbkach 9

na tyle długo, aby wykazać działanie bakteriobójcze. Natomiast badane miody tylko w formie stężonej działały bakteriobójczo, przy czym zdecydowanie lepiej na bakterie Bacillus subtilis (gramdodatnie). We wszystkich powtórzeniach, po użyciu miodów pochodzących z pasieki zaobserwowano strefy zahamowania wzrostu bakterii. Na Escherichia coli działał bakteriobójczo we wszystkich powtórzeniach wyłącznie miód Manuka. Natomiast miody lipowe (tylko trzecie powtórzenie), miód spadziowy (trzecie powtórzenie - jedyne) oraz etanolowy wyciąg propolisowy (podczas drugiej i trzeciej próby) wykazały bakteriobójcze właściwości względem bakterii gramujemnych. Uśrednione wyniki ze wszystkich trzech powtórzeń przedstawiono na rysunku nr 5. A B C Rys. 4. Strefy zahamowania wzrostu bakterii po 24-godzinnej inkubacji w temperaturze 37 C, po użyciu: A- miodu wielokwiatowego zakupionego w sklepie na bakterie gramdodatnie (powtórzenie I), B- miodu Manuka na bakterie gramdodatnie (powtórzenie I), C- miodu Manuka na bakterie gramujemne (powtórzenie I) 10

średnia wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii [mm] średnia wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii [mm] A Powtórzenie nr I 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Bacillus subtilis Escherichia coli badane substancje B Powtórzenie nr II 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Bacillus subtilis Escherichia coli badane substancje 11

średnia wielkość strefy zahamowania wzrostu bakterii [mm] C 6 5 4 3 2 1 0 Powtórzenie nr III Bacillus subtilis Escherichia coli badane substancje Rys. 5. Uśrednione wyniki wielkości strefy zahamowania wzrostu Escherichia coli oraz Bacillus subtilis po użyciu miodów, wyciągu etanolowego oraz suchego propolisu i 96% etanolu: A-powtórzenie I, B-powtórzenie II, C-powtórzenie III. Największe działanie bakteriobójcze wykazał miód Manuka. Również etanolowy wyciąg propolisowy charakteryzował się wysokim działaniem bakteriobójczym. Brak tej właściwości suchego propolisu świadczy o tym, że dopiero po wykonaniu wyciągu, okazywane są jego właściwości bakteriobójcze. Można by założyć, że to głównie alkohol działa antybakteryjnie, jednak nieskuteczne działanie bakteriobójcze 96% etanolu może wskazywać, że faktyczne działanie bakteriobójcze ma dopiero mieszanina alkoholu i propolisu. Dodanie etanolu umożliwia,,aktywację odpowiednich substancji wykazujących działanie antybakteryjne w wyciągu z propolisu. W I powtórzeniu (Rys. 5A) bakteriobójcze działanie w stosunku do E. coli wykazał tylko miód Manuka (Rys. 4C). Jednak zdecydowanie wyższą aktywność antybakteryjną wykazał dla B. subtilis (Rys. 4B). Etanolowy wyciąg z propolisu również działał silnie bakteriobójczo na bakterie gramdodatnie. Pomimo tego, że miód lipowy 1 pochodzi z miodobrania z roku 2012, a miód wielkokwiatowy naturalny z 2013 r., to po użyciu miodu lipowego 1 zaobserwowano większą strefę zahamowania wzrostu bakterii niż po wykorzystaniu miodu wielokwiatowego. Świadczy to o silniejszym działaniu antybakteryjnym miodów lipowych wynikającym z ich składu. W wynikach drugiego 12

powtórzenia badania zaobserwowano spadek wartości strefy zahamowania wzrostu bakterii przy użyciu stężonych miodów i wyciągu w porównaniu z pierwszą próbą (Rys. 5B). Może to świadczyć o niewielkim spadku aktywności enzymatycznej miodów, prawdopodobnie wynikający z przechowywania słoików w złych warunkach (w pomieszczeniu o temperaturze pokojowej). Zauważono również ponownie zarośniętą strefę zahamowania wzrostu bakterii przy użyciu miodu wielokwiatowego, pochodzącego z pasieki po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C (nie przedstawiono w wynikach). Dodatkowo etanolowy wyciąg z propolisu wykazał w tym powtórzeniu bakteriobójcze działanie w stosunku do E. coli. Wyniki z trzeciego powtórzenia (Rys. 5C) wykazują pewne rozbieżności w stosunku do poprzednich powtórzeń (m.in. nie spadła wartość strefy zahamowania wzrostu bakterii). Powodem tego mogło być użycie innego podłoża niż w poprzednich dwóch testach. Jednak to badanie potwierdziło najsilniejsze działanie przeciwbakteryjne miodu Manuka na bakterie gramdodatnie (największe) oraz gramujemne. Następnie silne właściwości antybakteryjne wykazał etanolowy wyciąg z propolisu, przy czym silniej działał na E. coli niż B. subtilis. W trzecim powtórzeniu użyto również miodu spadziowego oraz lipowego 2. Wykazały one silniejszą aktywność antybakteryjną niż miód wielokwiatowy naturalny i lipowy 1 na bakterie gramdodatnie. Może to mieć związek ze świeżością miodów, gdyż miód spadziowy pochodził z wrześniowego miodobrania 2013 r., a miód lipowy 2 z czerwcowego 2013 r. Jednak w przypadku miodu wielokwiatowego pochodzącego z wiosennego miodobrania z 2013 r. zaobserwowano wyższe jego działanie bakteriobójcze w stosunku do bakterii gramujemnych niż działanie miodu spadziowego i lipowego 2. Podczas 48 godzinnej inkubacji zmiana wielkości strefy wzrostu nie nastąpiła w żadnej z prób z etanolowym wyciągiem propolisowym, a z miodem Manuka tylko podczas powtórzenia nr I i II. Natomiast w pozostałych próbkach strefa zahamowania ponownie zarosła przez bakterie. Może to świadczyć o dłuższym działaniu bakteriobójczym etanolowego wyciągu propolisowego, niż pozostałych miodów pochodzących z pasieki. Wnioski Na podstawie przeprowadzonych badań wyciągnięto następujące wnioski: Największe działanie bakteriobójcze, zarówno na bakterie gramdodatnie, jak i gramujemne, ma miód Manuka. 13

Etanolowy wyciąg propolisowy także ma duże działanie bakteriobójcze na oba typy bakterii, zarówno po 24 jak i po 48 godzinach inkubacji w temperaturze 37 C. Przy czym propolis w formie stałej, nieoczyszczonej nie wykazuje takiej właściwości. Miody wielokwiatowe zakupione w sklepie nie wykazują żadnego działania bakteriobójczego. Wszystkie miody naturalne w większości przypadków wykazują wyższą bakteriobójczość w stosunku do bakterii gramdodatnich niż do gramujemnych, co najprawdopodobniej wynika z obecności dodatkowej osłony komórkowej w postaci błony zewnętrznej bakterii gramujemnych. Miody tracą swoją aktywność antybakteryjną wraz z długością jego przechowywania w temperaturze pokojowej. 14

Bibliografia [1] Alberts B. i inni, Podstawy biologii komórki, część 1, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009. [2] Bankar Sandip B., i in.: Glucose oxidase An overview, Biotechnology Advances, 2009, 27, 489 501; źródło internetowe: www.sciencedirect.com/science/article/pii/s0734975009000536#bib9 [3] Gałuszka Halina: Miód pszczeli, powstawanie, wartość odżywcza, zastosowanie, Sądecki Bartnik, Nowy Sącz, 1998. [4] Kędzia B., Hołderna-Kędzia E.: Aktywność antybiotyczna propolisu krajowego i europejskiego, Wydawnictwo Borgis, Warszawa,2013, 2, 97-107; źródło internetowe : www.czytelniamedyczna.pl/4404,aktywnosc-antybiotyczna-propolisu-krajowego-ieuropejskiego.html [5] Kunicki-Goldfinger W.: Życie bakterii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 1998. [6] Kwakman PHS. i inni: How honey kills bacteria, The FASEB Journal, 2010, 24, 2576-2582; źródło internetowe: www.fasebj.org/content/24/7/2576.abstract [7] Mavric E, Wittmann S, Barth G, Henle T.: Identification and quantification of methylglyoxal as the dominant antibacterial constituent of Manuka (Leptospermum scoparium) honeys from New Zealand; źródło internetowe: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18210383 [8] Satora Paweł: Escherichia coli charakterystyka i wykrywanie w żywności. Część I., Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej, Akademia Rolnicza w Krakowie. [9] Stangaciu S., Hartenstein E., tł. z jęz. niem. Floriańczyk B.: Leki z pszczelej apteki, Klub dla Ciebie, Warszawa 2007. [10] Stryer L., przełożone pod redakcją Augystyniaka J.: Biochemia, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003. [11] Śliwińska A., Przybylska A., Bazylak G.: Wpływ zmian temperatury przechowywania na zawartość 5-hydroksymetylofufuralu w odmianowych i wielokwiatowych miodach pszczelich.; źródło internetowe: www.ptfarm.pl/pub/file/bromatologia/2012/3/271-279.pdf [12] www.leczeniemiodem.pl/badania-naukowe/ocena-dzialania-miodu-manuka-w-leczeniugrzybiczego-alergicznego-zapalenia-zatok-przynosowych/ 15

[13] www.miodymanuka.pl [14] www.am.wroc.pl/stom/plany_zajec/iii_rok/sterylizacja.pdf 16