(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (13) T3 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (51) Int. Cl. A61K38/16 ( ) (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej Europejski Biuletyn Patentowy 2010/19 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Leczenie zakażeń Aspergillus za pomocą tymozyny alfa 1 (30) Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/02 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 10/2010 (73) Uprawniony z patentu: Sciclone Pharmaceuticals, Inc., San Mateo, US (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 RASI Guido, Rome, IT GARACI Enrico, Rome, IT BISTONI Francesco, Perugia, IT ROMANI Luigina, Perugia, IT DI FRANCESCO Paolo, Rome, IT (74) Pełnomocnik: Jan Wierzchoń &Partnerzy Biuro Patentów i Znaków Towarowych rzecz. pat. Górczak Jolanta Warszawa skr. pocz. 709 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 11241/10/P-RO/JG EP Opis Odnośniki do zgłoszeń powiązanych Leczenie zakażeń Aspergillus za pomocą tymozyny alfa 1 [0001] Niniejsze zgłoszenie korzysta ze zgłoszenia tymczasowego 60/457,911 dokonanego 28 marca 2003 r. Dziedzina wynalazku [0002] Niniejszy wynalazek dotyczy leczenia zakażeń grzybiczych. W szczególności niniejszy wynalazek dotyczy leczenia i zapobiegania zakażeniom Aspergillus, takim jak inwazyjna aspergiloza towarzysząca przeszczepom szpiku kostnego. Tło wynalazku [0003] Inwazyjna aspergiloza (IA), charakteryzująca się zajęciem przez strzępki grzyba, zniszczeniem tkanki płucnej oraz rozprzestrzenieniem do innych narządów, jest główną przyczyną zarówno szpitalnego zapalenia płuc, jak i zgonów w przypadku allogenicznego przeszczepu szpiku kostnego (ang. BMT); częstość zakażenia szacuje się na 5 do 10%, zaś związaną z nim śmiertelność na 90 do 100%. W przeszłości najistotniejszym czynnikiem ryzyka IA była neutropenia, tak że odtworzenie szpiku za pomocą szpikowych komórek progenitorowych dawało ochronę przed IA w mysim modelu allogenicznego BMT. Najnowsze jednak badania dotyczące epidemiologii IA u biorców BMT wskazują na zmniejszenie zakażenia związanego z neutropenią i wzrost zakażenia o późnym początku z jednoczesnym występowaniem choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi. [0004] Istnieje w stanie techniki potrzeba opracowania metod leczenia zakażenia Aspergillus. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0005] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem zastosowanie medyczne w leczeniu i zapobieganiu zakażeniom Aspergillus u ssaka dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej ilość tymozyny alfa 1 (TA1) skuteczną przeciwgrzybiczo. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0006] Dane kliniczne i eksperymentalne wskazują na rolę reaktywności limfocytów Th1 w kontroli IA. Komórki dendrytyczne (DC) wywołują pierwotną reakcję Th1 w odpowiedzi na pojawienie się komórek grzyba in vivo i in vitro. Dane wskazują, że na zdolność DC w płucach do wywoływania odpowiedniej odpowiedzi limfocytów T na antygeny grzybów mogą wpływać miejscowe procesy regulujące odpowiedź odpornościową, w tym przekazywanie sygnału przez receptory Toll-podobne (TLR). DC mogą stanowić obiecujące obiekty docelowe w przypadku prac rozwojowych nad immunoterapią i szczepionkami, co zmienia główny punkt zainteresowania w przypadku interwencji farmaceutycznej w kierunku adiuwantu. Korzystny jest

3 - 2 - adiuwant zdolny zarówno do stymulowania odpowiedniego rodzaju odpowiedzi, która będzie w najlepszy sposób zwalczała zakażenie, jak i skuteczny w warunkach immunosupresji. [0007] Tymozyna alfa 1 (TA1) jest występującym naturalnie peptydem wytwarzanym w grasicy. W postaci syntetycznego peptydu o długości 28 aminokwasów TA1 jest stosowana w badaniach klinicznych na całym świecie do leczenia niektórych zakażeń wirusowych w monoterapii lub w skojarzeniu z interferonem alfa. Leczenie niektórych niedoborów odporności, nowotworów złośliwych oraz HIV/AIDS stanowi dodatkowe wskazanie dla TA1. Mechanizm działania syntetycznego polipeptydu TA1 nie został całkowicie poznany, uważa się jednak, że jest związany z jego aktywnością immunomodulacyjną, ukierunkowaną głównie na zwiększenie czynności limfocytów T. Ze względu na działanie immunomodulacyjne na nieswoistą odpowiedź odpornościową, w tym zdolność do aktywacji kinaz białkowych aktywowanych mitogenami (MAPK) oraz ekspresję genów na makrofagach, zdecydowano się zastosować TA1 jako adiuwant zdolny do aktywacji DC kierującej odpowiedź Th1 przeciwko Aspergillus. Niniejszy wynalazek ujawnia metodę leczenia zakażeń Aspergillus, w której TA1 może aktywować DC, które wywołują reakcję Th1 przeciwko komórkom grzyba poprzez przekazywanie sygnału przez TLR. [0008] Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania medycznego w leczeniu ssaka zakażonego Aspergillus, przy czym wspomniane zastosowanie dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej ilość TA1 skuteczną przeciwgrzybiczo. W korzystnym przykładzie wykonania TA1 jest skuteczna przeciwko inwazyjnej aspergilozie (IA). Skuteczna dawka TA1 jest wystarczająca do aktywacji komórek dendrytycznych, tak by wytwarzały cytokiny zwiększające aktywność limfocytów Th1. Korzystna dawka w leczeniu zakażenia grzybiczego znajduje się w zakresie od 200 do 400 mikrogramów na kg masy ciała na dobę. W korzystnym przykładzie wykonania ssakiem jest żywiciel o obniżonej czynności układu odpornościowego, w szczególności człowiek. Kompozycja farmaceutyczna szczególnie nadaje się do leczenia pacjentów o obniżonej czynności układu odpornościowego, w szczególności pacjentów będących biorcami przeszczepu szpiku kostnego. [0009] Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto zastosowania medycznego w celu zapobiegania zakażeniu Aspergillus u ssaka, przy czym wspomniane zastosowanie dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej ilość TA1 skuteczną przeciwgrzybiczo. Wynalazek jest szczególnie użyteczny do zapobiegania IA u pacjentów o obniżonej czynności układu odpornościowego. W korzystnym przykładzie wykonania kompozycja farmaceutyczna zapobiega takiemu zakażeniu u pacjentów o obniżonej czynności układu odpornościowego, w szczególności u pacjentów będących biorcami przeszczepu szpiku kostnego. Skuteczna dawka TA1 jest wystarczająca do aktywacji komórek dendrytycznych, tak by wytwarzały cytokiny zwiększające aktywność limfocytów Th1. Korzystna dawka w zapobieganiu zakażeniu grzybiczemu znajduje się w zakresie od 200 do 400 mikrogramów na kg masy ciała na dobę. [0010] Bez ograniczania się do żadnej teorii uważa się, że niniejszy wynalazek wynika z odkrycia nowej aktywności TA1 regulującej czynność układu odpornościowego w leczeniu lub ochronie przed zakażeniem Aspergillus. Wydaje się, że TA1 sprzyja wytwarzaniu cytokin IL- 12 p70, IL-10 oraz IFN-alfa, które zwiększają aktywność Th1 w różnych rodzajach DC po-

4 - 3 - przez szlak zależny od MyD88. [0011] W komórkach transfekowanych TLR wydaje się, że TA1 aktywuje w sposób bezpośredni przekazywanie sygnału przez TLR9, ale nie przez TLR2; ten drugi zwiększa aktywność w odpowiedzi na odpowiednie ligandy. W związku z tym wydaje się, że TA1 aktywuje przekazywanie sygnału przez TLR bezpośrednio lub pośrednio. Dane te wskazują, że TA1 może wykorzystywać szlak zależny od TLR2 na mieloidalnych komórkach dendrytycznych (MDC) do wytwarzania IL-12 p70 oraz szlak zależny od TLR9 na plazmacytoidalnych komórkach dendrytycznych (PDC) do wytwarzania IFN-alfa i IL-10. [0012] Ponieważ wytwarzanie IL-10 przez DC może być elementem ochronnej przeciwgrzybiczej odporności pamięciowej, zrównoważenie wytwarzania IL-12/IL-10 na DC i (lub) różnych podgrupach DC może stanowić istotę działania TA1 jako adiuwantu w przypadku aspergilozy. [0013] W mysim modelu BMT podawanie TA1 po zakażeniu Aspergillus prowadziło do zwiększenia liczby limfocytów CD4 + i CD8 +, a także wzrostu całkowitej liczby neutrofili. Częstość występowania limfocytów Th1 (wytwarzających IFN-gamma) zwiększyła się, zaś limfocytów Th2 (wytwarzających IL-4) zmniejszyła się po podaniu TA1. [0014] Co ważne, podawanie TA1 myszom BMT zakażonym Aspergillus doprowadziło do zależnego od dawki zmniejszenia rozwoju grzyba w płucach, zaś w dawce większej umożliwiało całkowite wyleczenie zakażenia. TA1 umożliwiała ponadto zwiększenie skuteczności leczniczej amfoterycyny B. [0015] Wpływ TA1 na DC jest zgodny z jej aktywnością przeciwdziałającą apoptozie. Ponieważ DC mają podstawowe znaczenie w równowadze między immunopatologią, odpornością oraz autoimmunizacją, zaś PDC przekazujące sygnały przez TLR9 są obecne w grasicy, zdolność do modulowania czynności DC wskazuje, że TA1 jest endogennym regulatorem nieswoistej i swoistej odpowiedzi odpornościowej poprzez wykorzystanie TLR. Stanowi to uzasadnienie stosowania leczniczego TA1 w przypadku niektórych zakażeń wirusowych, w których uważa się, że PDC wytwarzające IFN-alfa odgrywają podstawową rolę. Do wytwarzania IFNalfa w tych PDC absolutnie niezbędne są TLR9. Ponadto wydaje się, że PDC uczestniczą także w odpowiedzi odpornościowej po przeszczepie komórek krwiotwórczych, co może między innymi wyjaśniać korzystny wpływ TA1 na przywrócenie odporności u ssaków po BMT. [0016] Wydaje się, że TLR aktywują nieswoistą odpowiedź odpornościową nie tylko, aby wspomagać odpowiedź odpornościową swoistą, ale także wywołują bezpośrednią przeciwdrobnoustrojową aktywność efektorową. Ponieważ wydaje się, że TA1 aktywuje DC kierujące odpowiedź Th1 przeciwko Aspergillus, a także neutrofile efektorowe działające przeciwgrzybiczo, także to potwierdza korzystny wpływ stosowania TA1 na zakażenia grzybicze. [0017] Aspergillus ma wyjątkowy charakter, ponieważ jest to grzyb saprofityczny kolonizujący żywicieli o obniżonej czynności układu odpornościowego. Niniejszy wynalazek dotyczy zamierzonego ukierunkowania komórek i szlaków odporności komórkowej i zwiększa odporność na Aspergillus, zaś TA1 jest adiuwantem, który programuje odpowiednią reaktywność Th1 przeciwko grzybowi dzięki wykorzystaniu szlaku TLR. [0018] Wynalazek zilustrowano poniżej za pomocą następujących przykładów, których nie

5 - 4 - należy uważać za ograniczające. Przykład 1 Zwierzęta [0019] Samice myszy BALB/c i C57BL6 w wieku 8 do 10 tygodni zakupiono w firmie Charles River. NOD/SCID zakupiono w firmie The Jackson. Rozmnażające się pary homozygotycznych myszy pozbawionych TLR2, TLR9 i MyD88, hodowanych w obecności C57BL6, oraz homozygotycznych myszy pozbawionych IFN-gamma i IL-4, hodowanych w obecności BALB/c, rozmnażano w określonych warunkach pozbawionych patogenów. Zakażenia drobnoustrojami i leczenie [0020] W celu zakażenia A. fumigatus myszom wstrzykiwano donosowo zawiesinę 2 x 10 7 konidiów/20 mikrolitrów roztworu chlorku sodu przez 3 kolejne dni. W celu oznaczenia ilościowego rozwoju grzyba w płucach przeprowadzono oznaczanie chityny. Zawartość chityny wyrażano w mikrogramach glukozaminy na narząd. Zawartość glukozaminy w płucach u myszy niezakażonych wykorzystano jako kontrolę ujemną, przyjmującą wartości od 0,80 do 2,25 mikrogramów glukozaminy na narząd. Płuca wycięto do analizy histologicznej i natychmiast utrwalono w formalinie. Skrawki (o wielkości 3 do 4 mikronów) tkanek osadzonych w parafinie barwiono korzystając z okresowej procedury Schiffa z użyciem kwasu. Tymozyna alfa 1 (TA1) oraz polipeptyd o przypadkowej kolejności aminokwasów miały postać oczyszczonych, jałowych, liofilizowanych, acetylowanych polipeptydów o zawartości endotoksyn poniżej 0,03 pg/ml, określonej za pomocą standardowego testu z krwią skrzypłocza. Sekwencje były następujące: Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-IIe-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu- Lys-Lys-Glu-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-O (tymozyna alfa 1) oraz Ac-Ala-Lys-Ser-Asp-Val- Lys-Ala-Glu-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Asp-Thr-Thr-Glu-Leu-Asp-Glu-Lys-Val-Glu-Val-Lys-Ala- Asn-Glu-OH (stymozyna alfa 1). Odpowiednie liofilizowane proszki rozpuszczono w jałowej wodzie. [0021] Postępowanie w badaniu było następujące: u myszy po BMT TA1 podawano w różnych dawkach dootrzewnowo, stymozynę alfa w dawce 400 mikrogramów/kg podawano dootrzewnowo lub ludzki rekombinowany G-CSF w dawce 250 mikrogramów/kg podawano dożylnie; wszystkie preparaty podawano raz na dobę począwszy od dnia infuzji doszpikowej i wraz z rozwojem zakażenia; podawanie kontynuowano przez dodatkowe 3 dni. Amfoterycynę B podawano raz na dobę dootrzewnowo przez 3 dni wraz z rozwojem zakażenia w dawce 4000 mikrogramów/kg. Taka dawka spowodowałaby wyleczenie IA u myszy leczonych cyklofosfamidem. Cyklofosfamid w dawce 150 mg/kg podawano dootrzewnowo na dzień przez zakażeniem. Myszom, którym podawano cyklofosfamid, podawano dootrzewnowo 400 mikrogramów/kg TA1 przez 5 kolejnych dni poczynając od dnia zakażenia. [0022] Zmniejszenie liczby neutrofili uzyskano przez podawanie dożylne 1 mg przeciwciała RB6-8C5 neutralizującego Gr-1 na dzień przed i po zakażeniu. Postępowanie to w sposób dramatyczny zmniejszyło liczbę neutrofili w płucach, jednak nie liczbę DC (od 5 do 6 x 10 5 komórek z CD11c +, MHC klasy II +, F480 przed i po podaniu). Myszy kontrolne otrzymały równoważną ilość oczyszczonego szczurzego IgG2b. Analiza FA-

6 - 5 - CS komórek płuc następnego dnia po podaniu cyklofosfamidu wykazała znaczną i długo utrzymującą się (do 5 dni) leukopenię. Postępowanie to nie wpłynęło na odsetek komórek F480 + (około 20%) oraz DC z CD11c +, MHC klasy II +, F480 (<3%). Ligandy TLR [0023] Zymosan otrzymano z Saccharomyces cerevisiae, kwas lipoteichowy (LTA) otrzymano ze Staphylococcus aureus, zaś lipopolisacharyd (LPS) otrzymano z Salmonella Minnesota Re 595. Oligonukleotydy CpG 1826 i 2006 stanowiły potwierdzone sekwencje immunostymulujące. Uzyskanie myszy BMT [0024] Myszy C57BL6 poddano ekspozycji na dawkę śmiertelną 9 Gy i podano infuzję z komórek dawcy pozbawionych limfocytów T z myszy BALB/c. Ponadto 95% myszy przeżyło wykazując trwały chimeryzm komórek krwiotwórczych typu dawcy, potwierdzony ekspresją antygenów MHC klasy I typu dawcy na komórkach śledziony. Izolacja i hodowla komórek dendrytycznych [0025] Mieloidowe DC CD11c + z krwi (MDC) uzyskano z komórek jednojądrzastych CD14 + za pomocą magnetycznego sortowania komórek i hodowano przez 5 dni w zmodyfikowanej pożywce Iscove a zawierającej 10% cielęcej surowicy płodowej, 2-merkaptoetanol w stężeniu 50 mikromoli, pirogronian sodu (1 mm), 2 mm L-glutaminy, HEPES (10 mm) oraz 50 mikrogramów/ml gentamycyny w obecności 50 ng/ml rekombinowanego ludzkiego GM-CSF i 200 U/ml rekombinowanego ludzkiego IL-4. Niedojrzałe MDC hodowano przez 24 godziny z 1000 ng/ml trimerycznego białka fuzyjnego ligand CD40-leucyna-zamek w celu uzyskania dojrzałych DC. Plazmacytoidalne CD CD123 + (PDC) wyizolowano za pomocą zestawu do izolacji BDCA-4. Czystość komórek CD123 + wynosiła > 96%. [0026] W celu uzyskania dojrzałych PDC niedojrzałe DC hodowano z trimerycznym ludzkim ligandem CD40 zgodnie z opisem powyżej i 10 ng/ml IL-3. Analiza FACS wykazała, że PDC były CD123 bright, CD4 +, CD45RA + i CD11c- w przeciwieństwie do MDC, które scharakteryzowano jako CD1a +, CD11c +, CD11b +, CD4 +, CD14 low oraz CD8 -. Ekspresja HLA klasy II, CD80 i CD86 była wysoka zarówno w niedojrzałych, jak i dojrzałych DC. DC CD11c + z płuca myszy (5 do 7% CD8alfa pozytywnych i od 30 do 35% Gr-1 pozytywnych) wyizolowano za pomocą magnetycznego sortowania komórek. [0027] W celu określenia fagocytozy DC poddano wstępnemu działaniu 100 ng/ml TA1 przez 60 minut i następnie inkubowano w temperaturze 37 C z konidiami Aspergillus przez dodatkowych 60 minut. Obliczono odsetek internalizacji i wykonano fotografie. W celu oceny dojrzewania czynnościowego i oznaczenia zawartości cytokin oczyszczone DC zawieszono w pożywce Iscove a (bez surowicy, ale z dodatkiem polimiksyny B w celu uniknięcia nieswoistej aktywacji przez składniki surowicy i endotoksyny) oraz traktowano impulsowo 100 ng/ml TA1 przez 24 godziny samodzielnie lub z ligandami TLR bądź z nieopsonizowanymi konidiami Aspergillus. Analiza fenotypu

7 - 6 - [0028] Fenotyp na powierzchni komórek określano przeprowadzając reakcję próbek ze szczurzymi antymysimi przeciwciałami sprzężonymi z FITC lub PE. Jako kontrolę wykorzystano niespokrewnione przeciwciała o odpowiednim izotypie. Przeciwgrzybicza aktywność efektorowa [0029] W celu określenia fagocytozy makrofagi oskrzelowo-pęcherzykowe oraz neutrofile obwodowe poddano wstępnemu działaniu 100 ng/ml TA1 przez 60 minut i inkubowano w temperaturze 37 C z nieopsonizowanymi konidiami Aspergillus przez 60 minut. Ponadto dokonano oceny aktywności konidiobójczej przez określenie liczby jednostek tworzących kolonię oraz odsetka inhibicji jednostek tworzących kolonię (średnia ± SE), określanego jako aktywność konidiobójcza. Test z użyciem komórek transfekowanych HEK293 [0030] Linię ludzkich komórek zarodkowych nerki HEK293, typu dzikiego lub w sposób stabilny transfekowanych ludzkimi TLR2, TLR9 i TLR4/CD1427 hodowano w pożywce Eagle a w modyfikacji Dulbecco o niskim stężeniu glukozy, do której dodano 10% FCS, HEPES (10nM), L-glutaminę (2 mikrogramów/ml) i gentamycynę (50 mikrogramów/ml). Do transfektantów dodatkowo dodano puromycynę (100 mikrogramów/ml). W eksperymentach ze stymulacją komórki hodowano przez noc przy gęstości 3 do 5 x 10 5 komórek na dołek w 12- dołkowych płytkach do hodowli tkankowych. Komórki przemywano i stymulowano 100 ng/ml TA1 czystego lub wraz z ligandami TLR przez 5 h, a następnie dokonywano oceny wytwarzania IL-8 w supernatantach. Oznaczanie cytokin i test immunoenzymatyczny ELISPOT [0031] Stężenie TNF-alfa, IL-10, IL-12 p70, IFN-alfa i IL-8 w supernatantach z hodowli określano za pomocą testów ELISA z zestawów. Granice wykrywalności (pg/ml) testów wynosiły < 3 (ludzkie) i < 32 (mysie) w przypadku TNF-alfa, < 12 (mysie) i < 5 (ludzkie) w przypadku IL-10, < 16 (mysie) i < 3 (ludzkie) w przypadku IL-12 p70 i < 25 (ludzkie) w przypadku IL-8; w przypadku ludzkich IFN-alfa < 3 ng/ml. W celu wyszczególnienia komórek wytwarzających cytokiny wykorzystano test ELISPOT na oczyszczonych limfocytach T CD4 + oraz DC z płuc. Test proliferacji za pomocą analizy metodą cytometrii przepływowej [0032] Proliferację limfocytów T CD4 + z płuc stymulowanych za pomocą 10 mikrogramów/ml Con A lub konidiów inaktywowanych wysoką temperaturą w obecności DC z płuc oceniano przez znakowanie CFSE estrem sukcynoimidylowym dioctanu 5(6)-karboksyfluoresceiny. PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) [0033] Całkowity RNA wyekstrahowano z niedojrzałych DC poddanych wstępnemu działaniu 100 ng/ml TA1 przez 60 minut, a następnie poddano działaniu nieopsonizowanych konidiów Aspergillus przez 60 minut, zgodnie z wynikami początkowych eksperymentów. Syntezę i PCR cdna przeprowadzono za pomocą starterów lewego i prawego do PCR, zaś zastosowane cykle dostosowano do mysich i ludzkich TLR i HPRT. Zsyntetyzowane produkty PCR rozdzielono za pomocą elektroforezy na 2% żelu agarozowym i wizualizowano przez barwienie bromkiem etydyny.

8 - 7 - Analiza aktywacji p38 i NF-KB [0034] P38 i NF-kB aktywowano w DC z płuc przez ekspozycję na konidia Aspergillus przez 20 minut w temperaturze 37 C i (lub) 100 ng/ml TA1. Odciski lizatów komórkowych inkubowano z króliczymi Ab poliklonalnymi rozpoznającymi niefosforylowaną formę p38 MAPK lub formę podwójnie fosforylowaną (Thr-180/Tyr-182) p38 MAPK bądź Ab swoistymi wobec Rel A, podjednostki wiążącej ludzkiego NF-kB o masie 65 kda DNA, a następnie z kozim antykróliczym IgG sprzężonym z peroksydazą chrzanową zgodnie z zaleceniami producenta. Odciski wywołano za pomocą zestawu do detekcji Enhanced Chemiluminescence. Prążki wizualizowano po ekspozycji odcisków na błonie Kodak RX. Aby zagwarantować podobną ilość białka na każdej ścieżce odciski fosforanowe usunięto i membrany sondowano powtórnie za pomocą Ab przeciwko p38 i NF-kB. Tymozyna alfa 1 (TA1) aktywuje komórki dendrytyczne (DC) [0035] Wykazano wcześniej, że mysie DC fagocytują Aspergillus in vitro oraz w miejscu zakażenia. TA1, ale nie peptyd o przypadkowej kolejności aminokwasów, aktywuje DC z płuc do fagocytozy nieopsonizowanych konidiów (bardziej niż strzępki), ekspresję antygenów kostymulujących oraz wytwarzanie cytokin. W przeciwieństwie do tego same konidia Aspergillus nie stanowią wystarczającego bodźca, aby indukować aktywację DC, ale jednoczesna ekspozycja na TA1 w znaczny sposób zwiększała ekspresję antygenów MHC klasy II, cząsteczek CD86 i CD40 oraz częstość występowania DC wytwarzających IL-12 p70. Co ciekawe, liczbę DC wytwarzających IL-12 p70 zwiększa także sama tymozyna. TA1 aktywuje ponadto ludzkie podgrupy MDC i PDC. Zarówno niedojrzałe, jak i dojrzałe podgrupy DC fagocytują konidia. TA1 zwiększała aktywność fagocytującą niedojrzałych DC, wpływa na morfologię DC (w niedojrzałych MDC wykrywa się więcej wypustek cytoplazmatycznych) oraz powoduje zwiększenie liczby antygenów HLA klasy II oraz ekspresji cząsteczek kostymulujących w odpowiedzi na konidia. TA1 w sposób znaczący zwiększa uwalnianie IL-12 p70 w odpowiedzi na konidia i na zymosan przez niedojrzałe MDC oraz uwalnianie IL-10 w odpowiedzi na konidia przez niedojrzałe PDC. IFN-alfa może być wytwarzany przez PDC w odpowiedzi na ligand TLR9 CpG, którego wytwarzanie znacznie się zwiększa pod wpływem TA1. W przeciwieństwie do tego peptyd o przypadkowej kolejności nie zwiększał liczby antygenów klasy II oraz ekspresji cząsteczek kostymulujących i indukcji wytwarzania cytokin przez DC w odpowiedzi na konidia. [0036] Dane te łącznie wskazują na nowe, wcześniej nieopisywane znaczenie immunoregulacyjne TA1 w aktywacji i czynności DC. TA1 aktywuje szlak zależny od MyD88 poprzez przekazywanie sygnału przez TLR [0037] Przekazywanie sygnału przez TLR, które pośredniczy w odpowiedzi czynnościowej na grzyba, występowało w odpowiedzi na konidia Aspergillus. TA1 w znaczny sposób aktywuje ekspresję TLR2, TLR5 i TLR9 na mysich DC. TLR2 i TLR9 nadal pozostają aktywowane przy jednoczesnej ekspozycji na konidia i TA1, zaś ekspresja TLR5 jest hamowana. Ponownie peptyd o przypadkowej kolejności aminokwasów nie doprowadził do aktywacji ekspresji TLR2 i TLR9 samodzielnie lub w odpowiedzi na konidia.

9 - 8 - [0038] Zdolność TA1 do aktywacji przekazywania sygnału zależnego od TLR potwierdzają badania na komórkach HEK293 transfekowanych TLR2, TLR9 i TLR4/CD14 za pomocą wyznaczania wytwarzania IL-8 w odpowiedzi na TA1 sam lub wraz z odpowiednimi ligandami TLR. W takich komórkach HEK293 TA1 w znaczny sposób zwiększała wytwarzanie IL-8 przez komórki transfekowane TLR9 samodzielnie lub w odpowiedzi na ligand TLR9 CpG. TA1 nie powodowała jednak stymulacji wytwarzania IL-8 przez same komórki transfekowane TLR2, ale w niewielki sposób zwiększała wytwarzanie IL-8 w tych komórkach w odpowiedzi na zymosan. Ponadto TA1 nie indukowała IL-8 w komórkach transfekowanych TLR4/CD14 samodzielnie lub w odpowiedzi na ligand TLR4 LPS. Ponadto TA1 wpływa na zdolność mysich DC do wytwarzania IL-12 p70 i IL-10 w odpowiedzi na te ligandy TLR drobnoustrojów. TA1 nie wpływała na wytwarzanie cytokin w odpowiedzi na poli(i:c) lub LPS (TLR4), TA1 w znaczny sposób zwiększała wytwarzanie IL-12 p70 i zmniejsza wytwarzanie IL-10 po stymulacji zymosanem oraz LTA (TLR2) i CpG (TLR9). W związku z tym wydaje się, że TA1 jest zdolna do przekazywania sygnału bezpośrednio przez TLR9 i nasilania przekazywania sygnału przez TLR2 za pomocą odpowiedniego liganda. [0039] Aktywacja zarówno NF, jak i p38 MAPK stanowi wczesne procesy wywoływania ekspresji genów indukowanej przez TLR, przy czym wiadomo było już wcześniej, że TA1 indukuje szlaki przekazywania sygnałów przez MAPK. TA1 indukuje przemieszczanie NF-kB do jądra, a także fosforylację p38 (która nie jest stymulowana przez same konidia, peptyd o przypadkowej kolejności aminokwasów lub peptyd o przypadkowej kolejności aminokwasów i konidia, co potwierdza udział TA1 w szlakach indukowanych przez TLR. Ponadto inhibitory przemieszczania NF-kB do jądra (SN50) lub p38 MAPK (SB202190) znoszą oddziaływanie TA1 na DC. [0040] Mieloidowy czynnik różnicowania 88 (MyD88) jest jednym z białek adaptorowych niezbędnych do aktywacji NF-kB i MAPK oraz wytwarzania IL-12 p70 po przekazaniu sygnału przez TLR. Wpływ TA1 i konidiów na wytwarzanie IL-12 p70 oraz oddziaływanie TAI1 na wytwarzanie IL-10 są w sposób dramatyczny znoszone u myszy pozbawionych MyD88. W związku z tym wydaje się, że szlak zależny od MyD88 ma podstawowe znaczenie w mechanizmie działania TA1 in vitro. Należało stwierdzić, czy szlak zależny od MyD88 ma także zasadnicze znaczenie w działaniu TA1 in vivo. Miejscowy wzrost grzyba oceniano po zakażeniu myszy typu dzikiego, pozbawionych TLR2, TRL9 lub MyD88 przez Aspergillus. Wzrost grzybów u myszy pozbawionych TLR2 i TRL9 był porównywalny do wzrostu u myszy typu dzikiego i w podobny sposób zmniejsza się po traktowaniu tymozyną. Wzrost grzybów jest także porównywalny u myszy pozbawionych MyD88, ale u tych myszy nie zmniejsza się on w wyniku traktowania TA1. W związku z tym mimo pewnego stopnia nadmiarowości w wykorzystaniu TLR wydaje się, że szlak przekazywania sygnału zależny od MyD88 jest niezbędny do aktywności TA1 in vitro i in vivo. TA chroni myszy po BMT przed IA [0041] Wydaje się, że podawanie TA1, ale nie peptydu o przypadkowej kolejności aminokwasów, powodowało wyleczenie myszy po BMT z IA, co potwierdza zwiększony czas przeżycia, której towarzyszył zmniejszony wzrost grzyba w płucach. Wpływ na ten wynik stanowi uzy-

10 - 9 - skana pełna ochrona zależna od dawki (czas przeżycia > 60 dni) u myszy, którym podawano 200 i 400 mikrogramów/kg TA1, który to wynik jest lepszy niż w przypadku amfoterycyny B. Ponadto TA1 zwiększa skuteczność leczniczą amfoterycyny B, co potwierdza zwiększony czas przeżycia i zmniejszone obciążenie grzybem u myszy traktowanych obiema substancjami. Ponadto TA1 zmniejsza także patologiczny stan płuc. Skrawki płuca z myszy zakażonych wykazują obecność wielu strzępków Aspergillus naciekających zrąb płucny, przy objawach ciężkiego uszkodzenia ściany oskrzeli i martwicy oraz niewielkiej liczbie zmobilizowanych komórek zapalnych. W przeciwieństwie do tego cech tych nie stwierdza się u myszy leczonych TA1, których płuca charakteryzują się naciekaniem komórek zapalnych prowadzących do poprawy stanu bez dowodów na wzrost grzyba i niszczenie ściany oskrzeli. W związku z tym TA1 może mieć skuteczność leczniczą w przypadku IA i może być korzystna w połączeniu z lekami przeciwgrzybiczymi, o których wiadomo, że ich aktywność w warunkach BMT jest zmniejszona. TA1 zwiększa regenerację szpiku i komórek Th1 u myszy z IA [0042] Bezwzględna liczba krążących limfocytów i neutrofili znacznie zwiększa się przy stosowaniu TA1. Jest to tym ważniejsze, że poziom neutrofili we krwi nie pozwala na przewidywanie podatności na aspergilozę. W wyniku analizy cytofluorymetrycznej stwierdzono jednak, że liczba komórek CD4 + i CD8 + oraz neutrofili w płucach znacznie się zwiększyła w wyniku podawania TA1 myszom po BMT. Te limfocyty T CD4 + w płucach są aktywne czynnościowo, na co wskazuje proliferacja swoista wobec antygenu oraz wytwarzanie IFN-gamma. Odsetek limfocytów Th1 (wytwarzających IFN-gamma) wytwarzających komórki potomne jest wyższy, zaś limfocytów Th2 (wytwarzających IL-4) jest niższy u myszy po podaniu TA1. Ponadto w odniesieniu do aktywności przeciwgrzybiczej fagocytów efektorowych, aktywność konidiobójcza zarówno makrofagów, jak i neutrofili jest wyższa u myszy, którym podawano TA1. W związku z tym wydaje się, że TA1 nie tylko wspomaga dojrzewanie DC, ale także aktywuje lokalne komórki efektorowe do szybkiej fagocytozy i niszczenia grzyba. [0043] Powrót do prawidłowego stanu po neutropenii, na przykład dzięki podawaniu dawki G- CSF, o której wiadomo, że przyspiesza regenerację neutrofili u myszy, nie wystarcza do wywołania odporności na grzyba porównywalnej do uzyskiwanej dzięki TA1. Podobnie mimo znacznej regeneracji neutrofili skuteczność lecznicza TA1 u myszy pozbawionych limfocytów T lub limfocytów Th1 wytwarzających IFN-gamma nie jest tak wysoka. Ponadto zwiększoną skuteczność leczniczą TA1 uzyskuje się w obecności zwiększonej liczby limfocytów Th1, na przykład występującej u myszy pozbawionych IL-4. W związku z tym, jakkolwiek neutrofile odgrywają zasadniczą rolę w pośredniczeniu w odporności na grzyba przy braku odporności swoistej zależnej od Th1, uzyskanie stanu pełnej ochrony przeciwko grzybowi, którą, jak się wydaje, uzyskuje się dzięki podawaniu TA1, może wynikać ze skoordynowanego działania pomiędzy nieswoistymi fagocytami efektorowymi a ochronnymi limfocytami Th1. Sporządziła i zweryfikowała Jolanta Górczak

11 Zastrzeżenia patentowe 1. Zastosowanie tymozyny alfa 1 (TA1) w ilości skutecznej przeciwgrzybiczo do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia lub zapobiegania zakażeniu Aspergillus u ssaka. 2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kompozycja zawiera wspomnianą TA1 w ilości wystarczającej do aktywacji komórek dendrytycznych, tak by wytwarzały cytokiny zwiększające aktywność limfocytów Th1. 3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym wspomniana ilość TA1 skuteczna przeciwgrzybiczo wynosi 200 do 400 mikrogramów na kg masy ciała na dobę. 4. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym wspomnianym ssakiem jest żywiciel o obniżonej czynności układu odpornościowego. 5. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym wspomnianym ssakiem jest człowiek. 6. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym wspomniany człowiek jest biorcą przeszczepu szpiku kostnego. 7. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym wspomniana TA1 aktywuje komórki dendrytyczne, tak by wytwarzały cytokiny zwiększające aktywność limfocytów Th1. 8. Zastosowanie według zastrz. 5, w którym wspomniana ilość TA1 skuteczna przeciwgrzybiczo wynosi 200 do 400 mikrogramów na kg masy ciała na dobę. 9. Zastosowanie według zastrz. 1, w skojarzeniu z co najmniej jednym dodatkowym lekiem przeciwgrzybiczym. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, w którym dodatkowym lekiem przeciwgrzybicznym jest amfoterycyna B. 11. Zastosowanie według zastrz. 10, w którym wspomniana amfoterycyna B jest stosowana w dawce 4000 mikrogramów na kg masy ciała na dobę. 12. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym wspomniane zakażenie Aspergillus stanowi inwazyjna aspergiloza. Sporządziła i zweryfikowała Jolanta Górczak Rzecznik patentowy