Czy użycie mikromacierzy DNA w badaniu raka piersi to rewolucja w klasyfikacji i określaniu rokowania pacjentek?

Transkrypt

1 Czy użycie mikromacierzy DNA w badaniu raka piersi to rewolucja w klasyfikacji i określaniu rokowania pacjentek? Badanie z pomocą mikromacierzy DNA pozwala na kompleksową identyfikację kluczowych markerów dla określenia rokowania pacjentek oraz skonstruowania celowanej terapii uderzającej w ścieżki ekspresji tysięcy genów ujawniających się w przebiegu raka. Badanie z pomocą mikromacierzy DNA pozwala na kompleksową identyfikację kluczowych markerów dla określenia rokowania pacjentek oraz skonstruowania celowanej terapii uderzającej w ścieżki ekspresji tysięcy genów ujawniających się w przebiegu raka. Profilowane badania inwazyjnych raków piersi za pomocą mikromacierzy potwierdzają różnice pomiędzy jego typami oraz sugerują konieczność utworzenia nowej klasyfikacji dla raków nie posiadających receptorów dla estrogenów. Rak piersi jest kompleksową chorobą genetyczną charakteryzująca się mnogością molekularnych zmian w komórkach nowotworowych. Rezultaty klinicznych badań nad heterogenicznością tego raka spowodowały stworzenie obecnych diagnostycznych i terapeutycznych schematów leczenia niemalże perfekcyjnie idealnych dla każdej pacjentki. Patologiczne i kliniczne czynniki są niewystarczające, aby zrozumieć kompleksowo kaskadę zdarzeń, które prowadzą do klinicznego ujawnienia się guzów. Obecnie próbki DNA poprzez symultaniczną i ilościową analizę ekspresji tysięcy genów zawartych w mrna stanowią nowe narzędzie w wykrywaniu i leczeniu raka piersi. Potencjalne zastosowanie analizy mikromacierzy sugeruje jej szerokie zastosowanie w onkologii. Ta potężna technologia jest wykorzystywana do wykrywania ekspresji genów w tkance sutka w skali określonej poprzez wcześniej wykryte geny. Umożliwia ona śledzenie biologicznej różnorodności nowotworów z towarzyszącymi jej różnicami w transkrypcji genów. Korzystać z matryc cdna relatywny poziom ekspresji dziesiątek tysięcy genów, spośród których konkretne fragmenty tkanek mogą być analizowane jednocześnie(1). Tkanka sutka jest heterogenna, składając się z komponentów nabłonkowych, mezenchymalnych oraz wyściółki naczyń krwionośnych i limfatycznych. Dzięki metodzie wykorzystującej mikromacierzy możliwe jest zbadanie wpływu, jaki ma pochodzenie tkankowe komórki ulegającej nowotworowej transformacji. Pozwalają one na całkowitą analizę trzymanego materiału oraz zapewniają utworzenie stabilnego portretu molekularnego guza. Tysiące oligonukleotydów lub klony cdna mogą być obserwowane na pojedynczej płytce mikromacierzy i większość genomu można teraz przebadać jako pojedynczą mikromacierz. Istnieją dwie ważne opracowania dotyczące metod analizy mikromacierzy na szkiełkach(3). Przełomowa praca Sorlie i wsp., którzy zaproponowali nowa klasyfikację raka piersi przejrzyście oddzielającą typy nowotworu reagującej i nie reagujące na leczenie hormonami na podstawie badań wykorzystujących mikromacierze. Sorlie i wsp. Potwierdzili swoje wyniki w niezależnej grupie guzów, definiując uprzednio subtypy guzów piersi które mogłyby scharakteryzować ścieżki ekspresji genów(4). Badanie przy użyciu mikromacierzy jest nową technologią, rozwijającą się z wielką prędkością. Jednakże musi ono być w pełni standaryzowane w celu odtwarzania go w wielu różnych Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 1/7

2 laboratoriach na całym świecie. Z tego powodu wszelkie interesujące doniesienia powinny być niezależnie powielane, aby przed uzyciem ich w praktyce klinicznej zostały jak najdokładniej przebadane(5). Na początku mikromacierze cdna były wykorzystywane celu zidentyfikowania fizjologicznie właściwych genów. Eksperymenty in vitro były przeprowadzane z użyciem specjalnych hormonów dodawanych do nabłonkowych komórek sutka. Poprzez badanie komórek w różnych warunkach zidentyfikowanie konkretnych grup genów (,,clusters") stało się możliwe. Próbki mrna z wyizolowanych ludzkich nowotworów piersi były porównywane z mrna z hodowanych ludzkich komórek nabłonkowych (cultured human mammary epithelial cells, HMEC). Niektóre ze zidentyfikowanych grup genów z charakterystycznym zapisem nukleotydowym in vitro zasadniczo różniących się w swojej ekspresji konkretnych typach raka piersi. Dla niektórych grup genów ulegających ekspresji jednocześnie w normalnych warunkach, w próbkach nowotworowych ich ekspresja wydaje się być związana z innymi genami, znajdującymi się zdrowych komórkach, włączając komórek zrębu i limfocyty B. Aby badać ekspresje tych genów w pierwotnych guzach piersi jak w większości guzów litych jest skomplikowane z dwóch głównych powodów. Po pierwsze - tkanka raka piersi zawiera wiele różnych typów komórek - nie tylko nowotworowych, w tym dodatkowo komórki nabłonkowe, komórki zrębu, adipocyty, endotelium czy limfocyty. Po drugie,. Komórki raka piersi są morfologicznie i genetyczne zróżnicowane. Te aspekty badań mikromacierzy nowotworów piersi oraz i ich klasyfikacji sprawiają badaczom trudności(7). Niedawne badania Bertucci i wsp. DNA w raku piersi poprzez analizę różnych rodzajów raka obserwowano zmiany ekspresji genów w pojedyńczych komórkach nowotworowych wewnątrz tego samego guza w celu analizy ekspresji rodzin genów oraz analizy ekspresji w różnych komórkach różnych guzów(9). Punktem krytycznym tych badań jest izolacja wystarczającej ilości wysokiej jakości mrna ze świeżych lub mrożonych próbek guza. Porównanie ekspresji genów w pojedyńczej komórce raka jest możliwe dzięki użyciu kombinacji mikromacierzy z preparowaniem pod mikroskopem(3,10). Jednakże ograniczona ilość całkowitego RNA ( ng) spośród preparowanej pod mikroskopem tkanki wymaga użycia technik amplifikacji, aby zsyntetyzować i namnożyć cdna(11-17). Zhu i wsp. odkryli, że zmiany w ekspresji genów ze zmianami w mikroanatomicznej lokalizacji komórek raka mogą być wykryte wśród nawet bardzo malej masy rozwijającego się nowotworu. Porównanie zmian ekspresji genów pomiędzy komórkami położonymi peryferyjnie a znajdującymi się w centrum masy guza dotyczyło raka przewodowego In situ oraz raka inwazyjnego. Wykazano 22 geny, które zmieniły poziom ekspresji na obrzeżu guza w porównaniu do regionu centralnego: 15 uległo upregulacji a 7 downregulacji. Różnice w poziomach RNA zostały potwierdzone analizą ilościową jendoczasowego PCR dla 2 genów oraz poprzez zmiany poziomu białek stwierdzonego metoda immunohistochemiczne(11). Charakterystyka ekspresji oraz hierachiczne ułożenie "clusters" w przewodowym raku piersi pozwoliła na zdefiniowanie typów guzów z agresywnym klinicznie fenotypem i w konsekwencji złym rokowaniem. Proroczy model oparty na danych o ekspresji genów od pacjentek, u których węzły chłonne nie były miejscem przerzutu pozwala podzielić pacjentki na grupy o dobrej i złej prognozie. Jednakże inne badania stwierdziły wyraźnie droge ekspresji opartą na genach BRCA1 i BRCA2 (4,6). Niektórzy z badaczy sugerują różnice w ekspresji genów odpowiadających za nowotworzenie w zrazikowym i przewodowym raku piersi. Udowodniono, że inaktywacja mutacjami genów dla E-kadheryn jest bardzo częstą w naciekowym raku zrazikowym. Geny CDH1 dla ludzkich nabłonkowych ECD znajdują się na chromosomie 16q22.1 (22,23). Berx I wsp. przedstawili Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 2/7

3 obszerne dane uzyskane za pomocą PCR/SSCP dla ludzkich ECD. Odnaleźli oni jedno białko skrócone poprzez powstałe mutacje - trzy typu non sense oraz jedna typu ominięcie ramki odczytu ECD. w zewnątrzkomórkowej części. Każdy rak zrazikowy z tymi mutacjami wykazuje specyficzną heterozygotyczność w regionie 16q22.1, w locus ECD. Zgodnie z tym, ekspresja ECD nie została w tych guzach wykryta immunohistochemicznie (24). Asgeirsson i wsp. wykazali rózne mechanizmy związane ze zmianą ekspresji ECD w różnych podtypach raków piersi. Utrata ECD niezależnie do genetycznych powodów została uznana za niezależny czynnik prognostyczny nawrotu choroby, zwłaszcza przy jednoczesnym braku zmian w węzłach chłonnych, bez względu na tp histologiczny nowotworu(25). Pleomorficzny zrazikowy rak piersi jest rodzajem naciekającego nowotworu o złym rokowaniu. Wystąpienie zmian pleomorficznych stoi na przeszkodzie we właściwej identyfikacji oraz różnicowani z rakiem przewodowym. Palacious i wsp. Stwierdzili, ze w okresie inaktywacji genów dla ECD, Pleomorficzny rak zrazikowy jest identyczny z klasycznym naciekającym rakiem zrazikowym i i zdecydowanie odmienny od raków przewodowych. Dlatego tez powinien być zaliczany do raków zrazikowych pomimo agresywnego narastania(26). Rak zrazikowy in situ (lobular carcinoma in situ LCIS) sąsiadujący z inwazyjnym rakiem przewodowym lub nie również wykazuje brak ekspresji genów dla ECD, nie wiadomo,dlaczego Zarówno w postaci złośliwej i nie złośliwej występuje to zjawisko. Vos i wsp. dowiedli, że mutacje w obrębie genów dla ECD następuje w bardzo wczesnym momencie karcinogenezy oraz odgrywa rolę supresora guza, dodatkowo do poprzednio sugerowanej Oli w rozwijaniu inwazyjności. Ekspresja ECD nieobecna w przypadki LCIS i obecna w raku przewodowym in situ (ductal carcinoma in situ DCIS) w obu przypadkach nie powoduje przejścia w inwazyjną postać raka. Autorzy zademonstrowali obecność tych samych skracających mutacji oraz utratę pierwotnej heterozygotyczności ECD w LCIS oraz w sąsiadującym z nim inwazyjnym rakiem przewodowym (1). Genetyczna heterogenność jest cechą charakterystyczna inwazyjnego raka piersi odzwierciedloną w szerokiej gamie typów histologicznych raka oraz ich stopnia różnicowania we właściwy guz. DCIS i LCIS zostały określone jako bezpośrednie prekursory wielu inwazyjnych nowotworów. DCIS jest genetycznie zaawansowanym rakiem. Istnieje najmniej dwie genetyczne ścieżki, w wyniku których następuje ewolucja DCIS w zmianę złośliwą. W dodatku, udowodniono, że większość przypadków DCIS i LCIS ma wspólne pochodzenie związane z rakiem inwazyjnym. Jednakże, ostateczne genetyczne zmiany prowadzące do inwazyjności pozostają nieznane. Morfologicznie, DCIS przypomina i często występuje z przewodowym lub związanym (cewkowy, rdzeniasty, śluzotwórczy) typem raka inwazyjnego. LCIS towarzyszy inwazyjnym rakom przewodowym, co sugeruje bliskie powiązania ze względu na jego postęp. Pomimo to pozostaje 15-25% pacjentek z DCIS towarzyszącym rakowi inwazyjnemu i ta sama ilość pacjentek, u których zdiagnozowano LCIS, u których następnie rozwija się inwazyjna postać raka przewodowego po latach. Potencjalny związek między tymi subtypami pomimo tego jest ciągle dyskutowany. Główną różnicą pomiędzy rakiem przewodowym a zrazikowym jest ekspresja ścieżki led ECD która niemal zupełnie jest nieobecna w LCIS oraz zrazikowych rakach inwazyjnych(1). Badania Buergera33 i wsp. sugerują, że inwazyjne raki piersi to choroba związana z wieloma klonami cytogenetycznymi obecnych już w stadiach preinwazyjnych. Bliski genetyczny związek pomiędzy zróżnicowanymi a podgrupą pośredni zróżnicowanych DCIS i LCIS prowadzi do hipotezy mówiącej, że LCIS i podgrupa DCIS są fenotypowo różnymi formami o wspólnym genotypie. Ci autorzy przebadali przypadki pacjentek z LCIS - cześć z nich jest związana z inwazyjnym rakiem zrazikowym, inne - pośrednio zróżnicowanym DCIS związanym z inwazyjnym rakiem zrazikowym oraz pozostałe z pośrednim i słabo zróżnicowanym DCIS z towarzyszącym inwazyjnym rakiem Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 3/7

4 przewodowym. Do potwierdzenia badan wykorzystano porównawczo hybrydyzacje genomową po preparacji pod mikroskopem i barwienie metoda immunohisotchemiczną w wyszukiwaniu genów ECD. LCIS charakteryzuje się mała liczbą błędów podczas transkrypcji, nie znaleziono dowodów na amplifikację genów lub wysoką liczbę strat materiału chromosomalnego w 1q i 16q. Wysoki stopień genetycznie homologii z dobrze zróżnicowanym DCIS jest oczywisty. Przypadki pośrednio zróżnicowanego DCIS z towarzyszącym zrazikowym rakiem inwazyjnym oraz zrazikowe zróżnicowanie ukazują uderzającą homologię oraz znamienna różnicę w ekspresji genów ECD. Nie zaobserwowano żadnej specyficznej przebudowy związanej z inwazją nowotworu(19). Praca Shen i wsp. sugeruje, ze progresja raka piersi jest bezapelacyjnie związana z niestabilnością chromosomów, lecz różne nowotwory piersi prezentują niejednolite profile wynikające z genetycznej heterogeniczności. I stopień inwazyjnego raka przewodowego posiada specyficzną ścieżkę aberracji genetycznych - pozostaje 1q a 16q (gencdh1) jest stracone. Ta ścieżka jest bardzo podobna do te obserwowanej w inwazyjnych rakach zrazikowych. Roylance i wsp. Badali, czy te same geny są odpowiedzialne za I stopień inwazyjnego raka przewodowego i inwazyjnego raka zrazikowego, używając analizy równowagi pomiędzy allelami, skrining mutacji oaz metody immunohistochemiczne. Wyniki wskazują, że poza wspólna ścieżką aberracji genetycznych obserwowanych w obu tych nowotworach, CDH1 nie jest genem docelowym w niskozróżnicowanych rakach przewodowych(20). Inne potencjalne geny Poza zmianami w ekspresji ECD, niewiele wiadomo o podłożu molekularnym pozwalającym wyróżniać raka przewodowego bądź zrazikowego. Istnieja przesłanki naukowe pozwalające stwierdzić, że udział kateniny p120 w kompleksie adhezyjnym ECD/p120 odgrywa ważna rolę w inwazji guzów. Sarrio i wsp. donoszą, ze niewłaściwą lokalizacja cytoplazmatyczna i jądrowa kateniny p120, która jest mediatorem podczas nieobecności ECD, charakterystycznie objawia się we wczesnych stadiach raka zrazikowego i pozostaje obecna podczas progresji guza w kierunku przerzutów. p120 może być bardzo ważnym mediatorem w onkogennych efektach inaktywacji ECD, włączając zwiększoną inwazyjność raka zrazikowego. Powyżsi autorzy analizowali mikromacierze pochodzące z materiałów biopsyjnych z sutka. 88% guzów zrazikowych wykazała wyłączna cytoplazmatyczna lokalizację i 6% również wykazało jądrową obecność p120. cytoplazmatyczne p120 wyraźnie jest związane z kompletną utratą pozakomórkowych łańcuchów ECD oraz ßkatenin nie tylko w zrazikowym raku piersi i jego przerzutach, lecz również w atypowej zrazikowej hiperplazji. Jednakże utrata heterozygotyczności genów ECD była także obserwowana. W rakach przewodowych, przeciwnie, redukcja p120 i ECD na błonie komórkowej była bardzo powszechna (odpowiednio 57% i 53%), podczas gdy cytoplazmatyczne p120 rzadko bywało widoczne. Korkola i wsp. Donieśli o specyficznych zmianach w ekspresji genów, które różnią raki piersi: zrazikowy i przewodowy. Użyli oni mikromacierzy cdna do identyfikacji różnorodności ekspresji genów pomiędzy tymi dwoma nowotworami. Niekontrolowane grupy genów nie różniły się w dwóch podtypach. Przewidywana analiza mikromacierzy była w stwnie określić z dokładnością do 93,7%. Geny zdecydowanie różniące się pomiędzy tymi dwoma rakami piersi zidentyfikowano jako MaxT. Zidentyfikowano 11 genów należących do tej grupy kodujących - ECD, TPI1, SPRY1, SCYA14, TFAP2B, HLA-G, CHC1, trombospondynę 1, katepsyne B i survininę(1). Sorli i wsp. Próbowali sklasyfikować nowotwory piersi w oparciu o różne ścieżki ekspresji genów otrzymanych poprzez badanie mikromacierzy cdna oraz wiążąc to z charakterystycznym obrazem klinicznym guzów. Badanie to obejmowało raki, fibroadenoma i zdrowa tkankę sutka. Nowym Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 4/7

5 odkryciem były uprzednio scharakteryzowane powierzchniowe nabłonkowe/estrogenowe receptory pobudzające mogą być podzielne na co najmniej dwie grupy, każda ze swoim charakterystyczny profilem ekspresji grup genów. Profile ekspresji próbek cdna zredefiniowały klasyfikacje molekularna niektórych nowotworów(4). Pusztai i wsp. zasugerowali, że profile ekspresji mogą być wykorzystane w diagnostyce w celu tworzenia subklasyfikacji histologicznej, co w przyszłości może prowadzić do odkrycia nowych leków celowanych. To badanie analizowało bilateralna tkankę raka w różnych postaciach histologicznych w każdym sutku (wyłącznie inwazyjny rak śluzotwórczy w jednej z próbek, w drugiej - inwazyjny rak przewodowy). Typ śluzotwórczy był związany z ekspresją immunstymulatorów i genów inhibitorowych, konsekwentnie z komórkową infiltracja limfocytów oraz ekspresją enzymów związanych z produkcją śluzu. Panel macierzy metaloproteinaz był wyraźnie inny od śluzotwórczych i przewodowych raków, sugerując, że ta klasa enzymów powinna stać się celem terapii celowanej(15). Dla wielu guzów istnieją patologiczne subklasy, odkryte dzięki badaniom genetycznym w celu poprawy terapii i strategii follow-up. Badania z użyciem mikromacierzy cdna uzyskanej z tkanki guzów piersi pozwoliły na ich klasyfikacje opartą na ścieżkach ekspresji nowotworów. Porównując oczyszczoną normalna tkane nabłonkowa sutka oraz odpowiadające jeje komórki guza, jednie ekspresja niewielkiej ilości genów została określana jako jednoznacznie zmieniona. Podgrupy genów wielokrotnie znajdowane w zróżnicowanym stopniu ekspresji w tkankach raków piersi, ostały użyte jako elementy pozwalające na klasyfikacje złośliwych guzów piersi. Te podgrupy genów został nazwane grupami klasy A, którą następnie podzielona na A1 i A2. Korelacja pomiędzy klasycznym kliniczno-patologicznym podziałem nowotworów piersi a podgrupą A1 została scharakteryzowana jako high nodo-positive tumors ( niemal guzy posiadają przerzuty do węzłów chłonnych (15-17).W tej grupie nieproporcjonalna grupa pacjentek, z odległymi przerzutami w trakcie diagnozy (25% w tej podgrupie, odpowiednio 5% pacjentek z pozostałych badanych próbek). Podsumowując, rak piersi jako choroba o podłożu genetycznym, pomimo odmiennego obrazu klinicznego, może prezentować niemal identyczny obraz histopatologiczny. Heterogenność genetyczna inwazyjnych raków piersi jest odzwierciedlona w szerokim spektrum typów histologicznych oraz różnorodnym stopniu zróżnicowania guzów. Badanie z pomocą mikromacierzy DNA pozwala na kompleksową identyfikację kluczowych markerów dla określenia rokowania pacjentek oraz skonstruowania celowanej terapii uderzającej w ścieżki ekspresji tysięcy genów ujawniających się w przebiegu raka. Profilowane badania inwazyjnych raków piersi za pomocą mikromacierzy potwierdzają różnice pomiędzy jego typami oraz sugeruja koniecnośc utworzenia nowej klasyfikacji dla raków nie posiadających receptorów dla estrogenów. Dowiedziono, że specyficzne zmiany w ekspresji genów odróżniają raki przewodowe od zrazikowych. Mutacje inaktywujące geny E - kadheryn SA bardzo częste tylko w inwazyjnych rakach zrazikowych. Poza ekspresją ECD niewiele widomo na temat podłoża biologicznego inwazyjnych raków piersi. Przyszłe badania z pewnością będą łączyły możliwości badania mikromacierzy z coraz bardziej widoczną kliniczna przydatnością danych z tego wynikających. Pomimo tego, że wyniki badań z użyciem mikromacierzy są bardzo obiecujące, na odpowiedź na pytanie zawarte w tytule artykułu przyjdzie nam jeszcze trochę poczekać. Niemniej jednak technologia ta wydaje się bardzo pomocna w rozwikłaniu molekularnych zagadek rozwoju nowotworów. Bibliografia 1. Gulisa Turashvilia*, Jan Bouchala, George Burkadzeb, Zdeněk Kolářa Differentiation of tumor from ductl and lobuar origin: II Genomics of invasive ductal ad lobular carcinomas. Biomed. Papers 149(1), (2005) Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 5/7

6 2. Jeffrey SS, Fero MJ, Borresen-Dale AL, Botstein D. (2002) Expression array technology in the diagnosis and treatment of breast cancer. Mol Interv 2, Sotiriou C, Neo SY, McShane LM, Korn EL, Long PM, Jazaeri A, Martiat P, Fox SB, Harris AL, Liu ET. (2003) Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc Natl Acad Sci USA 100, Sorlie T, Perou CM, Tibshirani R, Aas T, Geisler S, Johnsen H,Hastie T, Eisen MB, van de Rijn M, Jeffrey SS, Thorsen T, Quist H,Matese JC, Brown PO, Botstein D, Eystein Lonning P, orresen- Dale AL. (2001) Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumour subclasses with clinical implications. Proc NatlAcad Sci USA 9, Sřrlie T, Tibshirani R, Parker J, Hastie T, Marron J, Nobel A, Deng S, Johnsen H, Pesich R, Geisler S, Demeter J, Perou C, Per E. Lřnning, Brown P, Břrresen-Dale A, Botstein D. (2003) Repeated observation of breast tumour subtypes in independent gene expression data sets. Medical Sciences 100, van't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ He YD, Hart AAM, Bernards R, Friend SH. (2003) Expression profiling predicts outcome in breast cancer. Breast Cancer Res 5, Perou CM, Jeffrey SS, van de Rijn M. Rees CA, Eisen MB, Ross DT, Pergamenschikov A, Williams CF, Zhu SX, Lee JC, Lashkari D, Shalon D, Brown PO, Botstein D. (1999) Distinctive gene expression patterns in human mammary epithelial cells and breast cancers. Proc Natl Acad Sci USA 96, Tavassoli FA, Schnitt SJ. Pathology of the Breast. Elsevier, New York Bertucci F, Viens P, Hingamp P, Nasser V, Houlgatte R, Birnbaum D. (2003) Breast cancer revisited using DNA array-based gene expression profiling. Int J Cancer 103, Bertucci F, Houlgatte R, Granjeaud S, Nasser V, Loriod B, Beaudoing E, Hingamp P, Jacquemier J, Viens P, Birnbaum D, Nguyen C.(2002) Prognosis of breast cancer and gene expression profiling using DNA arrays. Ann N Y Acad Sci 975, Zhu G, Reynolds L, Crnogorac-Jurcevic T, Gillett CE, Dublin EA, Marshall JF, Barnes D, D'Arrigo C, Van Trappen PO, Lemoine NR, Hart IR, Dimbleby R. (2003) Combination of microdissection and microarray analysis to identify gene expression changes between differentially located tumour cells in breast cancer. Oncogene 22, Reinholz M, Iturria SJ, Ingle JN, Roche PC. (2002) Differential gene expression of TGF-beta family members and osteopontin in breast tumour tissue: analysis by real-time quantitative PCR. Breast Cancer Res Treat 74, Mackay A, Jones C, Dexter T, Silva RL, Bulmer K, Jones A, Simpson P, Harris RA, Jat PS, Neville AM, Reis LF, Lakhani SR,O'Hare MJ. (2003) cdna microarray analysis of genes associated 68 G. Turashvili, J. Bouchal, G. Burkadze, Z. Kolář with ERBB2 (HER2/neu) overexpression in human mammary luminal epithelial cells. Oncogene 22, Barsky SH. (2003) Myoepithelial mrna expression profiling reveals a common tumour-suppressor phenotype. Exp Mol Pathol 74, Pusztai L, Sotiriou L, Buchholz TA, Meric F, Symmans WF, Esteva FJ, Sahin A, Liu ET, Hortobagi GN. (2003) Molecular profiles of invasive mucinous and ductal carcinomas of the breast: a molecular case study. Cancer Genet. Cytogenet 141, Dressman MA, Baras A, Malinowski R, Alvis LB, Kwon I, Walz TM, Polymeropoulos MH. (2003) Gene Expression Profiling Detects Gene Amplification and Differentiates Tumour Types in Breast Cancer. Cancer Res 63, Nyante S, Devries S, Chen Y, Hwang S. (2004) Array-based comparative genomic hybridization of uctal carcinoma in situ and synchronous invasive lobular cancer. Human Pathology 35, Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 6/7

7 18. Aoyagi K, Tatsuta K, Nishigaki M, Akimoto S, Tanabe C, Omoto Y, Hayashi S, Sakamoto H, Sakamoto M, Yoshida T, Terada M, Sasaki H. (2003) A faithful method for PCR-mediated global mrna amplification and its integration into microarray analysis on lasercaptured cells. Biochem Biophys Res Comm 300, Buerger H, Simon R, Schafer KL, Diallo R, Littmann R, Poremba C, van Diest PJ, Dockhorn-Dworniczak B, Bocker W. (2000) Genetic relation of lobular carcinoma in situ, ductal carcinoma in situ, and associated invasive carcinoma of the breast. Mol Pathol 53, Shen CY, Yu JC, Lo YL, Kuo CH, Yue CT, Jou YS, Huang CS, Lung JC, Wu CW. (2000) Genome-wide Search for Loss of Heterozygosity Using Laser Capture Microdissected Tissue of Breast Carcinoma: An Implication for Mutator Phenotype and Breast Cancer Pathogenesis. Cancer Res 60, Activeweb Medical Solutions. Wszelkie prawa zastrzeżone. str. 7/7