PCR PCR. Model replikacji semikonserwatywnej

Transkrypt

1 PCR Łańcuchowa reakcja polimerazy (Polymerase Chain Reaction) amplifikacja (namnożenie wielu kopii cząsteczki kwasu nukleinowego) w pierwotnej wersji wykorzystująca model replikacji semikonserwatywnej występującej in vivo w komórkach Eucaryota służy do powielania wybranych fragmentów kwasów nukleinowych in vitro Model replikacji semikonserwatywnej zakłada, że obie nici macierzystej cząsteczki DNA są matrycą dla nowych, dosyntetyzowywanych nici REPLIKACJA każda z dwóch cząsteczek DNA powstałych po replikacji zawiera jedną nić starą oraz jedną nić nową PCR 1950 opisanie pierwszej polimerazy (Kornberg) 1960 synteza pierwszych oligonukleotydów (Khorana) 1970 odkrycie termostabilnej polimerazy Taq otrzymanie pierwszej polimerazy, która nie ma właściwości nukleazy (buduje lecz nie niszczy)- (Klenow) 1980 opracowanie reakcji PCR (1984) i rozpowszechnienie jej przydatności 1993 Nagroda Nobla Brock & Freeze,

2 Nazewnictwo Matryca: (matrix) DNA/RNA/ssDNA, który ma zostać powielony Starter (primer) sens/antysens; forvard/reverse Denaturacja matrycy (denaturation) Hybrydyzacja starterów/ przyłączanie starterów do matrycy (annealing/ primer hybrydisation) Wydłużanie starterów- (extension) Synteza nowej nici- (amplification) Uzyskany produkt- amplikon (amplicon) PCR matryca DNA startery MgCl 2 Taq polimeraza DNA bufor dttp datp dgtp dctp 5 -trifosforany deoksyrybonukleozydów CYKL 1 denaturacja 94 C jednoniciowa matryca DNA 2

3 CYKL 1 przyłączenie startera do matrycy C starter F starter R CYKL 1 wydłużanie startera 72 C starter 1 starter 2 powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej CYKL 2 denaturacja matrycy 94 C matryca DNA, który powstał w cyklu 1 3

4 CYKL 2 przyłączenie startera do matrycy C CYKL 2 wydłużanie starterów 72 C powstają cząsteczki dłuższe od sekwencji docelowej powstają cząsteczki o długości sekwencji docelowej 4

5 94 C 94 C 94 C 94 C 72 C 72 C 72 C TEMPERATURA 55 C 55 C 55 C JEDEN CYKL CZAS NUMER CYKLU LICZBA KOPII DNA AMOUNT OF DNA PCR CYCLE NUMBER Wielkość amplifikowanego fragmentu będzie zależna od miejsca przyłączenia starterów do matrycy W reakcji PCR amplifikuje się fragment ograniczony położeniem starterów na obu niciach Forward Reverse Długość zamplifikowanego fragmentu= długość amplikonu 5

6 Startery- Oligonukleotydy Długość: zasad Procent zasad G/C: (optimum- 50) Temperatura topnienia (Tm) Melting Temperature to temperatura dysocjacji dupleksu starter-matryca- powinna być identyczna lub bardzo zbliżona Temperaturę topnienia oligonukleotydu można obliczyć wg różnych reguł: reguła 2+4 Tm=2 o C(A+T)+4 o C(G+C) 5 -ATA GGT CTA ACC TGG TTC CAG-3 A+T=11; G+C=10 Tm= 2*11+4*10=22+40=66 o C reguła fizyczna (termodynamiczna), uwzględniająca zjawiska entalpii i entropii oraz stężenie soli poszczególnych jonów (Na+) oraz % poszczególnych zasad 5 -ATA GGT CTA ACC TGG TTC CAG-3 Tm=59,5 o C Startery Dopasowanie do matrycy (maximum complementarity) Mamy 4 możliwe nukleotydy A,C,G,T Prawdopodobieństwo przyłączenia do matrycy każdego z nich wynosi tyle samo:0.25 (1/4) zdarzenie Prawdopodobieństwo A 0.25 = 0.25 AT 0.25 x 0.25 = ATA 0.25 x 0.25 x 0.25 = ATAGG (0.25) 5 = ATAGGTCTAAC (0.25) 11 = ATAGGTCTAACCTGGT (0.25) 16 = Wraz z wydłużaniem się sekwencji startera spada prawdopodobieństwo jego przyłączenia w miejscu innym, niż zaplanowane Startery Dopasowanie do matrycy (maximum complementarity) 5 -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC-3 3 -TCGCGAAGTAGGATTCTTCGTAGGCATAGCAC-3 oligonukleotyd matryca 5 -AGCACTTCATCCTACGAAGC-3 3 -TCGCGAAGT-GGATTCTTCGTAGGCATAGCAC-3 5 -AGCRCTTCATCCTAAGAAGC-3 3 -TCGC/TGAAGTGGATTCTTCGTAGGCATAGCAC-3 oligonukleotyd matryca oligonukleotyd zdegenerowany matryca 5 -AGCRCTTCATCCTAAGAAGC-3 5 -AGCACTTCATCCTAAGAAGC-3 5 -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC-3 6

7 Startery Komplementarność końców 3 (3 -maximum complementarity)- startery muszą wykazywać dopasowanie na końcu 3 do matrycy, ale nie mogą wykazywać dopasowania do drugiego startera z pary! Tworzą wtedy struktury dimeryczne (primer dimer) 5 -AGCGCTTCATCCTAAGAAGC-3 3 -TCGCGAAGTAGGATTCTTCTTAGGCATAGCAC-3 Starter F: 5 -GCTTAGCTTTGCATG-3 Starter R: 5 -AGCATGCAAAGCTTC-3 Starter R: 5 -AGCATGCAAAGCTTC-3 Starter F: 5 -GCTTAGCTTTGCATG-3 Startery Stabilność końców 3 (3 -terminal stability)- dotyczy pięciu ostatnich zasad od końca 3, które determinują dopasowanie startera do matrycy. Stabilność określa parametr δg (kcal/mol)- tabela parametrów termodynamicznych i pokazuje siłę wiązania się startera z matrycą. Koniec (GCGCG) będzie wykazywał zawsze ok 6x większą stabilność od końca (TATAT) i może wiązać się z matrycą niespecyficznie! Dlatego należy unikać nagromadzenia zasad G/C na końcach 3 starterów Startery nie mogą tworzyć struktur spinki do włosów (hairpin) 5 -AGCGCTTCCCCCCCCCAGCGCT-3 5 -AGCGCT CCCC C C 3 -TCGCGA CCC C Startery- modyfikacje MODYFIKATORY UŁATWIAJĄCE PRZYŁĄCZANIE Modyfikatory aminowe (koniec 5 ). Są stosowane do mocowania ligandów do oligonukleotydów i łączenia oligonukleotydów ze stałymi powierzchniami, powinny być łatwo usuwalne Dodatkowa grupa fosforanowa (koniec 5 ). 5'-fosforan stosuje się do ligacji, jako łącznik i adapter, i ułatwia pobieranie komórkowe oligonukleotydów MODYFIKATORY UŁATWIAJĄCE WIĄZANIE Biotyna (koniec 3 ), Digoxygenina (koniec 5 lub 3 ). Wiążą się ściśle ze streptawidyną lub aodpowiednimi przeciwciałami (stosowane w testach, takich jak ELISA) INNE Barwniki fluorescencyjne (koniec 5 ). Ich zadaniem jest emitowanie światła o określonej długości fali, które pozwoli na detekcję produktu PCR Analogi zasad (koniec 3 ). Ich zadaniem jest hamowanie polimerazy DNA lub topoizomerazy 7

8 PCR Song Lyrics The PCR Song by Scientists for Better PCR There was a time when to amplify DNA, You had to grow tons and tons of tiny cells. (Oooh) Then along came a guy named Dr. Kary Mullis, Said you can amplify in vitro just as well. Just mix your template with a buffer and some primers, Nucleotides and polymerases too. Denaturing, annealing, and extending, Well it s amazing what heating and cooling and heating will do. [Chorus] PCR when you need to detect mutation (detect mutation) PCR when you need to recombine (recombine) PCR when you need to find out who the daddy is (who s your daddy?) PCR when you need to solve a crime (solve a crime) 8