( 5 4 ) Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/JP94/01453 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , W O95/06748, PCT Gazette nr 11/95 (11) (13) B1 (51) IntCl7 C07K 16/28 C12P 21/08 C12N 5/18 ( 5 4 ) Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał posiadających właściwość powodowania apoptozy (30) Pierwszeństwo: ,JP,5/ (73) Uprawniony z patentu: CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA, Tokio, JP (43) Zgłoszenie ogłoszono: (72) Twórcy wynalazku: BU P 13/96 Naoshi Fukushima, Shizuoka, JP (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: (74) Pełnomocnik: W UP 09/01 Rozbicka Eleonora, INTERPAT, Biuro Ochrony Własności Intelektualnej PL B1 (57) 1. Sposób wytarzania monoklonalnych przeciwciał posiadających właściwości powodowania apoptozy komórek szpiku kostnego, znamienny tym, że immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi od ssaka traktowanego rg-csf, stanowiącymi antygen, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, klonuje się otrzymane hybrydomy, wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące monoklonalne przeciwciała rozpoznające antygen, hoduje je i wyodrębnia monoklonalne przeciwciała, które selekcjonuje się na podstawie reaktywności wobec komórek szpiku kostnego, reaktywności wobec komórek białaczki szpikowej, próby hamowania proliferacji komórek NFS-60, typowania przeciwciał i zdolności hamowania transplantacji szpiku kostnego.

2 Sposób wytwarzania monoklonalnych przeciwciał posiadających właściwości powodowania apoptozy Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytarzania monoklonalnych przeciwciał posiadających właściwości powodowania apoptozy komórek szpiku kostnego, znamienny tym, że immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi od ssaka traktowanego rg-csf, stanowiącymi antygen, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, klonuje się otrzymane hybrydomy, wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące monoklonalne przeciwciała rozpoznające antygen, hoduje je i wyodrębnia monoklonalne przeciwciała, które selekcjonuje się na podstawie reaktywności wobec komórek szpiku kostnego, reaktywności wobec komórek białaczki szpikowej, próby hamowania proliferacji komórek NFS-60, typowania przeciwciał i zdolności hamowania transplantacji szpiku kostnego. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wyselekcjonowuje się hybrydomę zdeponowaną pod numerem FERM BP-4382 produkującą monoklonalne przeciwciało BMAP-1. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych monoklonalnych przeciwciał posiadających właściwość powodowania apoptozy komórek szpiku, użytecznych jako lek przeciw białaczce szpikowej. Ponieważ monoklonalne przeciwciała wytwarzane sposobem według wynalazku są użyteczne jako przeciwciała rozpoznające i identyfikujące antygeny powodujące apoptozę, zwłaszcza komórek szpiku, a poza tym mają właściwość powodowania apoptozy komórek szpiku, mogą być one stosowane jako lek użyteczny w dziedzinie leczenia białaczki szpikowej, dzięki wykorzystywaniu tej właściwości. Czynniki stymulujące powstawanie kolonii granulocytów, np. rekombinacyjne czynniki stymulujące powstawanie kolonii granulocytów (rg-csf) są znane głównie jako czynniki humoralne dla stymulowania różnicowania i proliferacji komórek granulocytowych, a w opisanym eksperymencie prowadzonym na myszach in vivo okazało się, że podawanie czynnika rg-csf zwiększa hematopoezę szpiku kostnego, a w dodatku powoduje znaczną pozaszpikową hematopoezę w śledzionie powodując proliferację macierzystych komórek krwiotwórczych i wszystkich krwiotwórczych komórek prekursorowych w śledzionie. Odnośnie pozaszpikowego mechanizmu powstawania krwinek w śledzionie sądzono, że hematopoeza następuje na skutek modyfikacji krwiotwórczego mikrośrodowiska śledziony na skutek stymulacji czynnikiem rg-csf w celu zwiększenia potencjału krwiotwórczego. Wynalazcy badali komórki zrębu śledziony potraktowane czynnikiem rg-csf w celu wyjaśnienia możliwości hematopoezy w śledzionie i określili linię krwiotwórczych komórek zrębu (komórki CF-1) pochodzących ze śledziony myszy, której podawano czynnik rg-csf, aby spróbować przeanalizować zwiększanie potencjału krwiotwórczego komórek zrębu potraktowanych czynnikiem rg-csf i zbadali potencjalny wpływ na hematopoezę stosując te krwiotwórcze komórki zrębu. W wyniku tych badań zaobserwowano aktywności stymulacji kolonii in vitro i możliwość wspierania macierzystych komórek krwiotwórczych in vivo [Blood, 80, 1914(1992)]. Tym niemniej, chociaż niektóre z komórek zrębu śledziony zostały określone jako linia komórkowa (komórki CF-1) i zbadano ich cytologiczne cechy charakterystyczne, nie otrzymano do tej pory żadnego swoistego przeciwciała rozpoznającego ich powierzchniowe antygeny, a cechy ich były jeszcze słabo znane.

3 3 Wynalazcy przeprowadzili pracochłonne badania, mające na celu opracowanie specyficznych przeciwciał zdolnych do rozpoznania komórek zrębu śledziony, na podstawie powyższych informacji o komórkach zrębu śledziony oraz wyników badań i przygotowali monoklonalne przeciwciała wykorzystując linie komórek zrębu śledziony jako antygeny do immumzacji. W wyniku otrzymano nowe monoklonalne przeciwciała, o których dotychczas nie było żadnych doniesień. W wyniku badania właściwości otrzymanych monoklonalnych przeciwciał wynalazcy niespodziewanie stwierdzili, że mają one właściwość powodowania apoptozy komórek szpiku, co doprowadziło do dokonania niniejszego wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych monoklonalnych przeciwciał posiadających właściwość powodowania apoptozy komórek szpiku kostnego i użytecznych jako lek przeciw białaczce szpikowej. Sposób według wynalazku polega na tym, że immunizuje się ssaka komórkami zrębu śledziony pochodzącymi do ssaka traktowanego rg-csf, stanowiącymi antygen, poddaje się immunizowane komórki ssaka fuzji z komórkami szpiczaka ssaka, klonuje się otrzymane hybrydomy, wyselekcjonowuje się komórki hybrydomy produkujące monoklonalne przeciwciała rozpoznające antygen, hoduje je i wyodrębnia monoklonalne przeciwciała, które selekcjonuje się na podstawie reaktywności wobec komórek szpiku kostnego, reaktywności wobec komórek białaczki szpikowej, próby hamowania proliferacji komórek NFS-60, typowania przeciwciał i zdolności hamowania transplantacji szpiku kostnego. Przykładową wyselekcjonowaną hybrydomą jest hybrydoma zdeponowana pod numerem FERM BP-4382 produkująca monoklonalne przeciwciało BMAP-1. Monoklonalne przeciwciało wytwarzane sposobem według wynalazku jest bardzo użyteczne jako przeciwciało rozpoznające antygeny powodujące apoptozę [zjawisko zwane również samobójstwem komórek, polegające na tym, że jądrowa chromatyna DNA jest trawiona na jednostki nukleosomowe (tak zwana formacja drabinkowa), co powoduje śmierć komórek] komórek szpiku i posiadające zdolność identyfikowania ich lub powodowania apoptozy na komórkach szpiku. Nawiasem mówiąc, komórki szpiku obejmują komórki inne niż komórki limfoidalne, takie jak krwinki białe obojętnochłonne, megakariocyty, mieloblasty, mielocyty, komórki tuczne, makrofagi, monocyty i erytroblasty, a komórki szpiku zgodnie z wynalazkiem oznaczają również to samo, co wymieniono powyżej. Dotychczas nie było znane żadne monoklonalne przeciwciało posiadające właściwość powodowania apoptozy komórek szpiku kostnego, a więc monoklonalne przeciwciała wytwarzane sposobem według wynalazku obejmują wszystkie monoklonalne przeciwciała posiadające właściwość powodowania apoptozy komórek szpiku. Zgodnie z wynalazkiem monoklonalne przeciwciała można zasadniczo otrzymać jak podano poniżej. Mianowicie, monoklonalne przeciwciało można otrzymać, na przykład, stosując jako antygeny komórki zrębu śledziony pochodzące od zwierzęcia, któremu podawano rg-csf, immunizując zwykłym sposobem immunizowania, przeprowadzając fuzję immunizowanych komórek zwykłym sposobem przeprowadzania fuzji komórek i klonując połączone komórki zwykłym sposobem klonowania. Korzystnym przykładem sposobu przygotowania monoklonalnego przeciwciała według wynalazku jest sposób obejmujący stosowanie komórek CF-1, komórek zrębu śledziony zwierzęcia, któremu podawano rg-csf, określonych jako hodowlana linia komórek przez wynalazców, w charakterze antygenu [Blood, Vol. 80, 1914 (1992)], przeprowadzenie fuzji komórek plazmatycznych (immunocytów) ssaka immunizowanego antygenem z komórkami szpiczaka ssaka, takiego jak mysz, klonowanie otrzymanych z fuzji komórek (hybrydom), selekcję klonów wytwarzających przeciwciało według wynalazku rozpoznające powyższą linię komórek oraz hodowanie ich w celu uzyskania zamierzonego przeciwciała. Jednakże sposób ten jest tylko przykładem i w tym przypadku, przykładowo, nie tylko powyższe komórki CF-1, ale również linie komórek wywodzące się od ludzkich komórek zrębu śledziony, otrzymane tak

4 jak komórki CF-1, mogą być stosowane jako antygeny odpowiednie do wytwarzania przeciwciał wiążących się z ludzkimi komórkami szpikowymi w taki sam sposób jak w przypadku powyższych komórek CF-1. W tym sposobie przygotowania monoklonalnych przeciwciał nie istnieje specjalne ograniczenie jeśli chodzi o ssaki, które mają być poddane immunizacji powyższym antygenem. Korzystne jest dokonanie wyboru z u w z ględnieniem zgodności z komórkami szpiczaka, które będą używane w fuzji komórek, a korzystnie wybiera się tu mysz, szczura i chomika. Immunizację przeprowadza się według zwykłego sposobu, na przykład przez podawanie komórek zrębu śledziony, takich jak powyższe komórki CF-1 do jamy brzusznej ssaka przez wstrzyknięcie. Korzystne jest zwłaszcza podawanie ich zwierzęciu w postaci rozcieńczonej lub w zawiesinie we właściwej ilości PBS albo izotonicznego roztworu chlorku sodowego kilka razy w miesiącu. Korzystne jest stosowanie komórek śledziony usuniętych po ostatnim podaniu powyższych komórek jako immunocytów. Jako komórkę szpiczaka ssaka i jako inną komórkę macierzystą, łączoną przez fuzję z powyższymi immunocytami, można stosować korzystnie różne znane komórki, obejmujące P3 (P3X63Ag8.653) [J. Immunol., 123, 1548 (1978)], p3-ul [Current Topics in Micro-biology and Immunology, 81, 1-7 (1978)], NS-1 [Eur. J. Immunol., 6, (1976)], MPC-11 [Cell, 8, (1976)], Sp2/0-Agl4 [Nature, 276, (1978)], FO [J. Immunol, Meth., 35, 1-21 (1980)], S194 [J. Exp. Med., 148, (1978)] oraz R210 [Nature, 277, (1979)]. Fuzja komórkowa powyższego immunocytu i komórki szpiczaka może być realizowana zasadniczo według zwykłego sposobu, na przykład według sposobu Milstein i inni [Methods Enzymol., 73, 3-46 (1981)]. Powyższa fuzja komórek może być przeprowadzana na przykład w zwykłym medium odżywczym w obecności czynnika przyspieszającego fuzję. Jako czynnik przyspieszający fuzję można, w razie potrzeby, dodawać odpowiednio, w celu zwiększenia efektu łączenia, glikol polietylenowy (PEG) i wirus Sendai (HVJ), a ponadto adjuwanty, takie jak dimetylosulfotlenek. Jeśli chodzi o stosunki immunocytów i komórek szpiczaka, pierwsze z nich korzystnie są stosowane w ilości 1-10 razy większej niż drugie. Przykłady medium stosowanego w powyższej fuzji komórek obejmują medium RPMI-1640 i medium MEM, odpowiednie do powodowania proliferacji powyższej komórki szpiczaka i inne pożywki, zwykle stosowane do hodowania tego rodzaju komórki. Ponadto, może być stosowana uzupełniająca surowica, taka jak płodowa surowica bydlęca (FBS). Fuzję komórek przeprowadza się przez mieszanie przepisowych ilości powyższych immunocytów i komórek szpiczaka w powyższym medium, dodanie roztworu PEG podgrzanego do temperatury około 37 C, na przykład PEG o średnim ciężarze cząsteczkowym rzędu , do tego medium, zwykle do stężenia około 30-60% (wag./obj.) i zmieszanie ich. Następnie przez powtórzenie operacji dodawania właściwych pożywek jednej po drugiej, wirowanie mieszaniny reakcyjnej i usuwanie nadsączy można wytworzyć przedmiotowe hybrydomy. Wymienione hybrydomy są wybierane przez hodowanie w zwykłym selektywnym medium, na przykład w medium HAT (pożywka uzupełniona hipoksantyną, aminopteryną i tymidyną). Hodowanie w pożywce HAT jest kontynuowane przez czas wystarczający, by komórki inne niż przedmiotowe hybrydomy (komórki nie pochodzące z fuzji) obumarły, zwykle przez kilka dni do kilku tygodni. Następnie według zwykłej analizy granicznego rozcieńczenia przeprowadza się badanie przesiewowe i uzyskuje się pojedyncze hybrydomy wytwarzające przedmiotowe przeciwciała. Otrzymane hybrydomy wytwarzające monoklonalne przeciwciała sposobem według wynalazku mogą być dalej hodowane w zwykłym medium i przechowywane przez długi czas w ciekłym azocie Aby uzyskać monoklonalne przeciwciała z hybrydom, można stosować sposób obejmujący hodowanie hybrydom zwykłym sposobem i otrzymywanie ich z nadsączy lub sposób

5 5 obejmujący podawanie hybrydomy odpowiedniemu ssakowi w celu proliferacji i pozyskiwanie ich z płynu z jamy brzusznej tego ssaka. Pierwszy sposób nadaje się do otrzymywania przeciwciał o wysokiej czystości, a drugi nadaje się do masowej produkcji przeciwciał. Ponadto, przeciwciała otrzymane według powyższych sposobów mogą być oczyszczane w wysokim stopniu dzięki zastosowaniu zwykłych środków oczyszczania, takich jak wysalanie, filtrowanie żelowe i chromatografia powinowactwa. Monoklonalne przeciwciało otrzymane sposobem według wynalazku może być dowolne, jeśli tylko ma specyficzną właściwość opisaną zwłaszcza w następującym poniżej przykładzie, mianowicie właściwość powodowania apoptozy komórek szpikowych i przeciwciała monoklonalne posiadające tę cechę są objęte zakresem wynalazku. Monoklonalne przeciwciało według wynalazku może być stosowane jako użyteczny lek przeciw białaczce szpikowej, dzięki wykorzystaniu tej właściwości. Nie trzeba dodawać, że ustalenie swoistego systemu identyfikowania i rozpoznawania antygenów powodujących apoptozę komórek szpikowych z wykorzystaniem monoklonalnego przeciwciała wytwarzanego sposobem według wynalazku lub stosowania go jako leku przeciw białaczce szpikowej, dzięki wykorzystywaniu jego specyficznej właściwości, oraz modyfikowanie i wykorzystywanie go są objęte zakresem wynalazku, jeżeli są wprowadzane do praktyki zwykłym sposobem, oczywistym dla fachowca. Krótki opis rysunków. Figura 1 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna przy braku przeciwciała, komórka CF-1). Figura 2 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała GSPST-1 wobec komórek CF-1. Figura 3 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała BMAP-1 wobec komórek CF-1. Figura 4 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna przy braku przeciwciała, komórka szpiku kostnego). Figura 5 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała GSPST-1 wobec komórek szpiku kostnego. Figura 6 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała BMAP-1 wobec komórek szpiku kostnego. Figura 7 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna przy braku przeciwciała, NSF-60). Figura 8 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała GSPST-1 wobec komórek NFS-60. Figura 9 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna dla szczurzego przeciwciała IgG1, NFS-60). Figura 10 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała BMAP-1 wobec komórek NFS-60. Figura 11 przedstawia test dla monoklonalnego przeciwciała (BMAP-1) na hamowanie proliferacji komórki NFS-60. Figura 12 przedstawia test dla monoklonalnego przeciwciała (GSPST-1) na hamowanie transplantacji szpiku kostnego. Figura 13 przedstawia test dla monoklonalnego przeciwciała (BMAP-1) na hamowanie transplantacji szpiku kostnego. Figura 14 jest widokiem objaśniającym [mikrofotografia (barwiona przez H.E.) próbek szpiku kostnego (X400)] przedstawiającym martwe komórki szpiku kostnego (2) 6 dni od podania monoklonalnego przeciwciała BMAP-1 według przedmiotowego wynalazku i próbkę kontrolną (1) przy braku przeciwciała. Figura 15 jest widokiem objaśniającym (fotografia migracyjna wykonana sposobem chromatografii elektroforetycznej) przedstawiającym formację drabinkową DNA komórek szpiku kostnego obserwowaną kiedy podano monoklonalne przeciwciało BMAP-1 według przedmiotowego wynalazku.

6 Figura 16 przedstawia test cytotoksyczności przy użyciu komórek L929 przy TNFα. Figura 17 przedstawia test cytotoksyczności przy monoklonalnym przeciwciele (BMAP-1). Figura 18 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna ze szczurzym IgG2a, BWV1). Figura 19 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania antymysiego przeciwciała MHC klasy I wobec komórek BWV1. Figura 20 przedstawia analizę immunofluorescencyjną (próbka kontrolna ze szczurzym IgG1, BWV1). Figura 21 przedstawia analizę immunofluorescencyjną właściwości wiązania przeciwciała BMAP-1 wobec komórek BWV1. Objaśnienie symboli a: DNA grasicy myszy, której podawano BMAP-1 (24 godziny) b: DNA szpiku kostnego myszy, której podawano BMAP-1 (24 godziny) c: DNA szpiku kostnego myszy, której podawano BMAP-1 (8 godzin) d: DNA szpiku kostnego myszy, której podawano BMAP-1 (4 godziny) e: DNA szpiku kostnego myszy bez podawania tego środka (komórki szpiku kostnego) f: Znacznik ciężaru cząsteczkowego. Wynalazek będzie pisany bardziej szczegółowo w przykładzie odniesienia i przykładzie, przy czym wynalazek nie jest ograniczony do przykładu. Przykład odniesienia Uzyskanie komórek zrębu śledziony i ich właściwości 1) Uzyskanie komórek zrębu śledziony Linię komórek zrębowych śledziony uzyskano z pierwotnej hodowli komórek śledziony myszy C57BL/6J traktowanej rg-csf w ilości 100 μg/kg przez 5 dni. Mianowicie, śledzionę usuwano po podawaniu czynnika rg-csf w warunkach jałowych, hodowano w naczyniu plastikowym 25 cm2 (Corning Co.) przez 6 tygodni i w pożywce Isocove s modified Dulbecco s medium (IMDM) (Boehringer-Mennheim Co.) z 10% dezaktywowaną cieplnie bydlęcą surowicą płodową (FBS) (Sanko Junyaku, Tokio), 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny w inkubatorze w warunkach 37 C i 5% CO2, a medium to zmieniano na świeże medium wzrostowe dwa razy w tygodniu. W konfluentnej hodowli przyrośnięte populacje komórek (komórki zrębowe) zbierano z naczynia przy użyciu 0,05% trypsyny plus 0,02% EDTA (Sigma Chemical Co.) w PBS bez Ca i Mg i przenoszono do świeżych naczyń. Pasażowania te powtarzano w przybliżeniu raz lub dwa razy w tygodniu. We wczesnych pasażowaniach (pasażowania 1-10) stosunek podziału komórek był 1/4 do 1/8, a później stosunek ten był 1/16 do 1/32. Komórki zrębowe stawały się homogeniczne i fibroblastoidalne w przybliżeniu po dziesiątym posażowaniu. Przy dwudziestym posażowaniu te komórki zrębowe były zbierane jak opisano powyżej i kierowane do klonowania komórek przy zastosowaniu techniki granicznego rozcieńczania. Klonowanie komórek powtarzano dwukrotnie w celu ustalenia linii komórek zrębowych (linia komórek CF-1). Następnie komórki te utrzymywano w 5 ml IMDM uzupełnionego 10% dezaktywowanym termicznie FBS w naczyniu 25 cm2 (Corning Co.) i prowadzono następną hodowlę raz na 5 dni przy stosunku podziału 1/32. Linie śledzionowych komórek zrębowych można uzyskać od innych zwierząt niż myszy. Przykładowo, linie komórek zrębu śledziony ludzkiej można uzyskać stosując taki sam sposób jak pisano powyżej, przez transformowanie komórek wektorem adenowirusa SV-40 [J. Celi. Physiol., 148, 245 (1991)]. 2) Właściwości komórek CF-1 Komórki CF-1 uzyskane jako linia komórek, jak opisano powyżej, były badane na fosfatazę alkaliczną fosfatazę kwasową β-glukuronidazę, esterazę α-naftylooctanową oraz czerwień olejową 0 przy użyciu standardowych technik cytochemicznych. Komórki CF-1 były również charakteryzowane sposobami histochemii immunoenzymów przy zastosowaniu αμβ

7 7 następujących przeciwciał monoklonalnych i poliklonalnych: mac I (Sero Tec.); antygen związany z czynnikiem VIII (Dakopatts); oraz kolagen typu I, kolagen typu III i fibronektyna (Chemnicon International Inc.). Fagocytozę badano przez wychwyt kulkami lateksowymi (średnica cząstek: 1,09 μm; Sigma), a zdolność komórek CF-1 do przemiany w adipocyty badano przez wystawienie na działanie 10-6 mol/l fosforanu hydrokortyzonu (Sigma) w naczyniu 25 cm2 przez 4 tygodnie po hodowli konfluentnej. W rezultacie komórki CF-1 były negatywne dla fosfatazy alkalicznej, antygenu związanego z czynnikiem VIII, mac I i fagocytozy, natomiast były pozytywne dla kolagenu typu I, kolagenu typu III i fibronektyny. Komórki CF-1 nie były przemieniane w adipocyty w ciągu 4 tygodni w konfluentnej kulturze z 10-6 mol/l hydrokortyzonu, chociaż komórki CF-1 miały tylko ślady lipidu. Z tych danych wynika, że komórki CF-1 nie miały właściwości preadipocytów, makrofagów i komórek śródbłonkowych, i dlatego stało się oczywiste, że pochodzą one z komórek zrębowych różniących się od nich. 3) Utrzymywanie krwiotwórczych komórek macierzystych przez komórki CF-1 W celu zbadania, czy krwiotwórcze komórki macierzyste są utrzymywane przez komórki CF-1, czy też nie, przeprowadzono testy CFU-S (testy komórek śledzionowych tworzących kolonie) techniką Till i McCulloch. Dziesięć myszy z grupy napromieniowano 900 cgy (MBR-1520R; Hitachi, Tokio) i wstrzyknięto im dożylnie jednojądrowe komórki szpiku kostnego (komórki BM) (1,0 x 105/głowę, 5,0 x 104/głowę lub 2,5 x 104/głowę) oraz komórki CF-1 (1,0 x 105/głowę), a kolonie w śledzionie liczono 12 dnia jako klony CFU-S (kolonie śledziony). W rezultacie, kiedy jednojądrowe komórki szpiku kostnego (komórki BM) i komórki CF-1 były transplantowane napromieniowanym myszom, liczba kolonii śledziony każdej grupy komórek BM zwiększyła się znacznie (1,4-1,8 razy) w porównaniu z myszami bez komórek CF-1, a 12 dnia od transplantacji współczynnik przeżycia myszy z przeszczepionymi komórkami BM i komórkami CF-1 był większy niż dla myszy tylko z komórkami BM, przy małym współczynniku śmiertelności, a zatem stało się oczywiste, że macierzyste komórki krwiotwórcze są utrzymywane przez komórki CF-1. Najlepszy sposób realizacji wynalazku Poniżej opisano szczegółowo przykład wynalazku. Przykład. Otrzymanie przeciwciał monoklonalnych 1) Antygeny i immunizacja Immunizację przeprowadzono przez zastosowanie komórek CF-1 otrzymanych w powyższym przykładzie odniesienia w charakterze antygenów. Komórki hodowano w inkubatorze w warunkach: 5% CO2 i 37 C, stosując pożywkę Isocove s modified Dulbecco s medium (IMDM) (Boehringer-Mannheim Co.) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; Sanko Junyaku). Komórki te potraktowano 1 mm EDTA/PBS i usunięto z naczynia hodowlanego przez pipetowanie. Komórki zawieszono w 1 mm EDTA/PBS przy liczbie komórek około 1 x 107/ml i podawano samicy szczura Wistar Imamich (wiek 7 tygodni; Animal Breeding Research Laboratory). 1 ml komórek o zawartości 1 x 107/ml wstrzyknięto w jamę brzuszną szczura przy początkowej immunizacji, a 1 ml komórek o zawartości około 1 x 107/ml podano dodatkowo miesiąc później. Ponadto, 1 ml komórek o zawartości około 1 x 107/ml podawano kilkakrotnie w odstępach miesięcznych, a po zaobserwowaniu oddziaływania pomiędzy przeciwciałami immunizowanego szczura a komórkami CF-1 podano 1 ml komórek o zawartości 1 x 108/ml jako końcową immunizację. Trzy dni po końcowej immunizacji szczura zabito, by wyjąć śledzionę. 2) Fuzja komórek Po rozdrobnieniu śledziony wyjętej ze szczura wyizolowane komórki śledzionowe odwirowano, zawieszono w medium IMDM (Boehringer-Mannheim Co.) i intensywnie przemyto. Z drugiej strony komórki otrzymane z hodowanej linii komórek szpiczaka myszy S p2/0-a g14 [Nature, 276, (1978)] w IMDM (Boehringer-M annheim Co.)

8 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS; Sanko Junyaku) przemyto w powyższym medium IMDM w taki sam sposób i 1 x 108 tych komórek oraz 2 x 108 powyższych komórek śledzionowych wprowadzono do probówki służącej do wirowania i mieszano w celu przeprowadzenia fuzji komórek przez glikol polietylenowy 400 (Nakarai Kagaku), zgodnie ze zwykłym sposobem postępowania [Clin. Exp. Immunol., 42, (1980)]. Następnie, komórki otrzymane po fuzji dozowano na płytkę z 96 zagłębieniami z medium IMDM uzupełnionym 20% FBS i hodowano w inkubatorze w warunkach 37 C i 5% CO2. Przenoszono je stopniowo do selektywnego medium HAT od następnego dnia i kontynuowano hodowlę. Po rozpoczęciu hodowli nadsącza przenoszono do nowego medium HAT dwa razy w tygodniu, by kontynuować hodowlę i utrzymywać proliferację. Następnie komórki otrzymane z fuzji klonowano według zwyczajnej procedury, stosując sposób granicznego rozcieńczenia. Mianowicie, tylko klony mające silne właściwości wiązania antygenów były klonowane według zwyczajnej procedury z wykorzystaniem analizy granicznego rozcieńczenia przez badanie właściwości ich wiązania z antygenami, przy czym wykorzystywano przeciwciała w nadsączach powyższych komórek z fuzji. 3) Badanie przesiewowe Badanie przesiewowe komórek z fuzji (hybrydom) przeprowadzono techniką pośredniej immunofluorescencji przy zastosowaniu przepływowej cytometrii. Badanie przesiewowe klonów wytwarzających przedmiotowe przeciwciała przeprowadzano z zastosowaniem komórek CF-1 jako komórek docelowych. Mianowicie, komórki w zawiesinie w buforze z reakcyjnym (PBS uzupełniony przez 2% FBS i 0,02% NaN3) wirowano i odzyskiwano w postaci granulek, po czym dyspergowano w 100 μ1 (nadsączy hodowli hybrydom (około 1 x 106/100 μl) i przeprowadzono reakcję przy 4 C przez 1 h. Po jednokrotnym płukaniu powyższym roztworem buforowym dodano do tego znakowane FITC kozie przeciwciało antyszczurze IgG (FC) (Chemicon) i inkubowano przez 1 h. Po jednorazowym płukaniu poddano je analizie metodą przepływowej cytometrii (FACScyn, Becton Dickinson). 4) Oczyszczanie przeciwciał Komórki z fuzji poddane analizie przesiewowej sposobem podanym w punkcie 3) hodowano zgodnie z normalnym sposobem postępowania, a przeciwciała wytworzone w nadsączach były oddzielane według zwyczajnej procedury i oczyszczane. Mianowicie, hybrydomy pozyskiwano z zagłębień z dużymi mianami przeciwciał dla antygenów, rozprowadzano na plastikowej płytce do hodowli tkanek (Corning Co.), hodowano w warunkach 5% CO2 i 37 C, doprowadzano do proliferacji i oczyszczano zwykłym sposobem, by otrzymać monoklonalne przeciwciała GSPST-1 i BMAP-1. Jeśli chodzi o przeciwciało GSPST-1, otrzymane komórki wstrzyknięto w jamę brzuszną nagiej myszy BALB/cAJcl-nu (samiec, osiem tygodni, Nippon Kurea). Ciecz powstałą w jamie brzusznej pobrano po dniach, wysolono za pomocą 33% siarczanu amonowego i dializowano z PBS. Jeśli chodzi o przeciwciało BMAP-1, było ono hodowane na dużą skalę w pożywce Iscove s modified MEM medium uzupełnionym 10% FBS, a nadsącza zatężano, wysalano 33% siarczanem amonowym, dializowano z PBS, oczyszczano ponownie za pomocą zestawu kolumnowego proteiny A (Amersham) i dializowano z PBS. W powyższym przykładzie opisano przypadek, w którym komórki CF-1 były użyte jako antygeny do immunizacji. Jednakże możliwe jest uzyskanie monoklonalnego przeciwciała w taki sam sposób również w przypadku stosowania innych zrębowych komórek posiadających zdolność wspomagania macierzystych komórek krwiotwórczych, a wynalazek nie jest ograniczony do powyższych przeciwciał monoklonalnych, lecz obejmuje wszystkie monoklonalne przeciwciała mające takie same właściwości i wszystkie hybrydomy wytwarzające te monoklonalne przeciwciała.

9 9 Hybrydoma wytwarzająca monoklonalne przeciwciało BMAP-1 sposobem według wynalazku jest nową komórką pochodzącą z fuzji, przygotowaną z komórki śledziony szczura Wistar Imamich i linii komórek szpiczaka myszy SP2/0-Ag14 jako komórek macierzystych i została zdeponowana 9 sierpnia 1993 pod nazwą BMAP-1 (hybrydoma szczur-mysz) pod numerem akcesyjnym FERM-BP-4382 w National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, w Japonii [adres: 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki 305, Japonia], który jest międzynarodowym organem depozytowym, zgodnie z Traktatem budapesztańskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu mikroorganizmów dla celów procedury patentowej. 5) Właściwości przeciwciał (i) Reaktywność przeciwciał Reaktywność wobec komórek CF-1 Wyniki badania reaktywności otrzymanych monoklonalnych przeciwciał GSPST-1 i BMAP-1 wobec komórek CF-1 zgodnie z analizą immunofluorescencyjną pokazano na fig Figura 1 przedstawia wyniki analizy próbki kontrolnej przy braku przeciwciała, figura 2 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania GSPST-1 wobec komórek CF-1, a figura 3 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania BMAP-1 wobec komórek CF-1. Na rysunkach osie pionowe przedstawiają względną liczbę komórek, a osie poprzeczne natężenie fluorescencji. Jak wynika z figury 1-3, monoklonalne przeciwciała GSPST-1 i BMAP-1 mają właściwości wiązania się z komórkami CF-1 i rozpoznają powierzchniowe antygeny komórek CF-1. Reaktywność wobec komórek szpiku kostnego Następnie wyniki analizy reaktywności GSPST-1 i BMAP-1 wobec normalnych komórek szpiku kostnego metodą cytometrii przepływowej (FACScan, Becton Dickinson) są pokazane na figurach 4-6. Figura 4 pokazuje tu wyniki analizy próbki kontrolnej przy braku przeciwciała, figura 5 wyniki analizy właściwości wiązania GSPST-1 wobec komórek szpiku kostnego, a figura 6 wyniki analizy właściwości wiązania BMAP-1 wobec komórek szpiku kostnego. Na rysunkach osie pionowe przedstawiają względną liczbę komórek, a osie poprzeczne natężenie fluorescencji. Jak pokazano na figurach 4-6, okazało się, że GSPST-1 nie ma w ogóle właściwości wiązania wobec komórek szpiku kostnego, oraz że BMAP-1 ma właściwości wiązania do wszystkich komórek szpiku kostnego. Reaktywność wobec linii komórek białaczki granulocytowej (NFS-60)) Wyniki analizy reaktywności GSPST-1 i BMAP-1 wobec komórek NFS-60 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, (1985)) sposobem cytometrii przepływowej (FACScan, Becton Dickinson) przedstawiono na figurach Figura 7 pokazuje tu wyniki analizy próbki kontrolnej przy braku przeciwciała, figura 8 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania GSPST-1 do komórek NFS-60, figura 9 przedstawia wyniki analizy próbki kontrolnej przy zastosowaniu szczurzego IgG1 na rynku (Zymed), a figura 10 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania BMAP-1 wobec komórek NFS-60. Na rysunkach osie pionowe podają względne liczby komórek, a osie poprzeczne natężenie fluorescencji. Jak pokazano na figurach 7-10, okazało się, że GSPST-1 nie reaguje z komórkami NFS-60, oraz że BMAP-1 ma właściwości wiązania z komórkami NFS-60. Próbka dla BMAP-1 powstrzymania proliferacji komórek NFS-60 Wyniki badania działania BMAP-1 na komórki NFS-60 w obecności G-CSF 100 ng/ml i cykloheksaimidu 10-9 M według metody testowania MTT (pokazano na figurze 11). Przy stosowaniu płytek do hodowli z 96 dołkami dodano 10 μl na dołek roztworu BMAP-1 o stężeniach 0, 10, 100 ng/ml oraz 1, 10, 100 μg/ml do 4 x 103 na dołek na 100 μl komórek NFS-60 i po dwóch dniach zmierzono liczby żywych komórek metodą MTT. Okazało się, jak pokazano na fig. 11, że proliferacja komórek NFS-60 została znacznie zahamowana przez BMAP-1.

10 (ii) Typowanie przeciwciał Następnie w wyniku typowania podklasy IgG otrzymanych monoklonalnych przeciwciał [przy zastosowaniu szczurzego zestawu Mono Ab-ID-Sp (Zymed) i znakowanego biotyną mysiego przeciwszczurzego przeciwciała IgG1 (Zymed)] okazało się, że GSPST-1 jest IgG2a, a BMAP-1 jest IgG1. (iii) Zdolność hamowania transplantacji szpiku kostnego Następnie przeprowadzono test na hamowanie transplantacji szpiku kostnego przy użyciu tych przeciwciał, by zbadać ich właściwości. Wyniki pokazano na figurach 12 i 13. Jak wynika z figury 12 i 13, podczas gdy BMAP-1 ma działanie hamujące transplantację szpiku kostnego, nie stwierdzono tego działania w przypadku GSPST-1. Mianowicie, powyższe wyniki otrzymane były przez podawanie 1,0 x 105 na głowę komórek szpiku kostnego i monoklonalnych przeciwciał myszom C57BL/6J, które otrzymały śmiertelną dawkę promieniowania (900 cgy), poprzez żyły ogonowe i określenie liczby powstałych kolonii śledzionowych. Przypadkowo, Bez leczenia na fig. 13 oznacza przypadek niepodania komórek szpiku kostnego. Jak pokazano na fig. 13, potwierdzone zostało, że ponieważ BMAP-1 reaguje z komórkami szpiku kostnego powodując apoptozę, monoklonalne przeciwciało hamuje transplantację całkowicie w teście na hamowanie transplantacji szpiku kostnego. Mianowicie, kiedy hybrydomę wytwarzającą BMAP-1 podawano do jamy brzusznej nagiej myszy, okazało się, mysz ta umarła w czasie, kiedy jej wodobrzusze było utrzymywane w małej ilości. Ponadto okazało się, że wszystkie komórki szpiku kostnego obumarły przy dożylnym podawaniu 50 μg na głowę BMAP-1 normalnej myszy C57BL/6J, a na fig. 14 pokazano mikrofotografię przedstawiającą fakt, że komórki szpiku kostnego obumarły po 6 dniach od dożylnego podania BMAP-1. Jak wynika z tej mikrofotografii, zaobserwowano, że obumierały nie tylko komórki limfatyczne, ale również krwinki białe obojętnochłonne, megakariocyty, mieloblasty, mielocyty, komórki tuczne, makrofagi, monocyty i erytroblasty (tak zwane komórki szpikowe). Ponadto, w wyniku badania DNA komórek szpiku kostnego myszy, której podano 30 μg na głowę BMAP-1, zaobserwowano wyraźną formację drabinkową, jaka jest pokazana na fig. 15, i okazało się, że powyższa reakcja BMAP-1 na komórki szpiku kostnego jest spowodowana przez apoptozę. Obszar Fc w IgG przeciwciała BMAP-1 był trawiony pepsyną (Sigma) i czyszczony za pomocą kolumny GPC jako F (ab) 2, przy czym podawano dożylnie do 33,5 μg na głowę myszy C57BL/6J (co odpowiadało 50 μg na głowę całości IgG). W rezultacie zaobserwowano, że obumierały komórki w szpiku kostnym. Z powyższego faktu wynika, że ani zależna od przeciwciała cytotoksyczność komórek, ani zależna od dopełniacza cytotoksyczność komórek nie mają udziału w obumieraniu komórek szpiku kostnego powodowanym przez BMAP-1. Jako antygen powodujący apoptozę podano antygen Fas proteiny powierzchniowej komórek. Odnośnie antygenu Fas ekspresje jego mrna rozpoznawane są w grasicy, sercu, wątrobie, płucach i w jajniku, ale niewiele jego mrna wykrywa się w szpiku kostnym [J. Immunol., 148, (1992)], a zatem jest oczywiste, że antygeny rozpoznawane przez BMAP-1 są inne niż konwencjonalnie znany antygen Fas. Ponadto, aby wyjaśnić czy antygen rozpoznawany przez BMAP-1 będzie receptorem TNF, czy też nie, badano działanie BMAP-1 przy użyciu komórek L-929 reagujących z TNF, by powodować śmierć komórek Końcowe stężenia TNF a myszy (Genzyme) były 0, 1, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml i 1 μg/ml, a stężenia BMAP-1 były 0, 10, 100 pg/ml, 1, 10, 100 ng/ml oraz 1, 10 μg/ml, a liczby żywych komórek L-929 mierzone były według metody MTT na drugi dzień po dodaniu TNFα i BMAP-1. W wyniku tego, jak pokazano na fig. 15, fig. 17, chociaż liczba komórek L-929 była znacznie zmniejszona przez TNFα, BMAP-1 nie miał wpływu na komórki L-929. Stało się zatem oczywiste, że antygen rozpoznawany przez BMAP-1 nie jest receptorem TNF. Wyniki badania, czy antygeny rozpoznawane przez BMAP-1 są antygenami MHC klasy I, czy też nie, według cytometrii przepływowej (FACScan, Becton Dickinson) podano na fig

11 11 Figura 18 przedstawia wyniki analizy próbki kontrolnej na szczurzej IgG1 (Zymed). Figura 19 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania antymysiego przeciwciała MHC klasy I (szczurza IgG2a, BMA) wobec komórek BWV1 (chłoniak myszy pochodzący z komórek BM5147). Figura 20 przedstawia wyniki analizy kontrolnej z wykorzystaniem szczura IgG1 (Zymed), a figura 21 przedstawia wyniki analizy właściwości wiązania BMAP-1 wobec komórek BWV1. Na rysunkach osie pionowe przedstawiają względne liczby komórek, a osie poprzeczne natężenie fluorescencji. W rezultacie BMAP-1 nie rozpoznał komórek BWV1, ale przeciwciało MHC klasy I reagowało z komórkami BWV1. Jak opisano powyżej, potwierdzone zostało doświadczalnie, że BMAP-1 powoduje apoptozę komórek szpikowych. Według aktualnej wiedzy wynalazców dotychczas nie było żadnej wzmianki o monoklonalnym przeciwciele posiadającym właściwość powodowania apoptozy komórek szpikowych, jak opisano powyżej, a zatem monoklonalne przeciwciała mające taką właściwość są nowymi przeciwciałami wynalezionymi przez twórców niniejszego wynalazku. Ponadto, ponieważ uważa się, że monoklonalne przeciwciała reprezentowane przez BMAP-1 mogą powodować śmierć komórek białaczki szpikowej, uważanych za posiadające silną ekspresję ich antygenów przy wykorzystaniu działania monoklonalnego przeciwciała wywołującego apoptozę komórek szpiku kostnego, monoklonalne przeciwciało według wynalazku, posiadające właściwość powodowania apoptozy komórek szpikowych, jest użyteczne jako lek przeciw białaczce szpikowej. Monoklonalne przeciwciała wytwarzane sposobem według wynalazku zostały opisane szczegółowo w przykładzie powyżej. Jako monoklonalne przeciwciała mające właściwość powodowania apoptozy komórek szpikowych zgodnie z wynalazkiem można przykładowo traktować przeciwciała wspomniane w specyficznych przykładach powyżej, ale nie zawsze są one do nich ograniczone, lecz obejmują wszystkie monoklonalne przeciwciała mające takie same właściwości i działanie, otrzymane w taki sam sposób, niezależnie od rodzaju antygenów. Możliwość przemysłowego zastosowania Ponieważ monoklonalne przeciwciała wytwarzane sposobem według wynalazku są szczególnie użyteczne jako przeciwciała rozpoznające i identyfikujące antygeny powodujące apoptozę komórek szpikowych, a ponadto mają one właściwość powodowania apoptozy komórek szpikowych, mogą być stosowane jako lek użyteczny w dziedzinie środków przeciw białaczce szpikowej, dzięki wykorzystaniu tej właściwości.

12

13 Fig. 20 Fig. 21

14 Fig. 18 Fig. 19

15 Fig. 17

16 Fig. 16

17 Fig. 15

18 Fig. 14

19 Fig. 13

20 F ig. 12

21 Fig. 1

22 Fig. 9 Fig. 10

23 Fig. 7 Fig. 8

24 Fig. 5 Fig. 6

25 Fig. 3 Fig. 4

26 Fig. 1 Fig. 2 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz. Cena 4,00 zł.