KOSMOS P R O B L E M Y N A U K B I O L O G I C Z N Y C H. Tom 61, 2012 Numer 4 (297)

Transkrypt

1 KOSMOS P R O B L E M Y N A U K B I O L O G I C Z N Y C H Tom 61, 2012 Numer 4 (297)

2 DRODZY CZYTELNICY I PRENUMERATORZY KOSMOSU Na początku bieżącego roku pisałam do Państwa z radością, ale i z niepokojem o dalsze losy KOSMOSU (tego tradycyjnego, drukowanego! bo merytoryczna strona naszego kwartalnika nie budzi obaw, jest bowiem czytany, także on line, a teka redaktora wypełniona po brzegi artykułami, nadsyłanymi przez wiernych Autorów i Czytelników). Kończący się rok okazał się dla KOSMOSU dobry, są również uzasadnione nadzieje, że nadal będzie się ukazywał regularnie, co kwartał, zawierając na przemian zamawiane zeszyty tematyczne i VARIA, cieszące się dużym zainteresowaniem zarówno Autorów, jak i Czytelników. Podsumowując zatem ten pierwszy rok, kiedy po dłuższym czasie udało się nam wrócić do wydawania 4 pojedynczych zeszytów rocznie, chcę podziękować wszystkim tym osobom i instytucjom, które się do tego przyczyniły. W pierwszej kolejności są to Wydawnictwa Uniwersytetu Mikołaja Kopernika w Toruniu, które z inspiracji i przy poparciu JM Rektora UMK, prof. Andrzeja Tretyna, wzięły na siebie współodpowiedzialność za druk i kolportaż KOSMO- SU jako współwydawca pisma w tym roku ukazuje się już czwarty zeszyt, który powstał w tych warunkach. Wsparcie finansowe, jakie KOSMOS otrzymuje od Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego pokrywa tylko częściowo koszty wydawnicze, toteż stale poszukujemy dodatkowych sponsorów. W mijającym roku dwie instytucje wsparły finansowo dwa zeszyty tematyczne: Nr 1 (tom 61) traktujący o problemach alkoholu i alkoholizmu został przygotowany z udziałem finansowym Miejskiego Ośrodka Profilaktyki i Terapii Uzależnień (MOPiTU) im. Bł. Rafała Chylińskiego w Łodzi, zaś do wydania Nr 3, którego tematem wiodącym była ekotoksykologia, przyczyniła się Firma TIGRET, reprezentowana przez p. Grzegorza Piętowskiego, Wice prezesa Zarządu, wspierając wydanie drukiem swoich materiałów pokonferencyjnych w formie wykładów o charakterze artykułów przeglądowych. Odzew ze strony Czytelników, coraz obficiej napływające manuskrypty, wskazujące na chęć upowszechniania aktualnych osiągnięć nauki, a także wolno, acz sukcesywnie zwiększająca się liczba jednostek prenumerujących KOSMOS wszystkie te oznaki utwierdzają nas w przekonaniu, że przyjęliśmy słuszną drogę działania i istniejemy mimo trudności! Życząc tą drogą Czytelnikom oraz aktywnym w mijającym roku wydawcom i dobrodziejom, bardzo Szczęśliwych i Radosnych Świąt oraz spełnienia marzeń i oczekiwań, także tych, które dotyczą zawartości KOSMOSU raz jeszcze serdecznie dziękuję za dotychczasowe wsparcie i pomoc w ciężkich chwilach. Z wyrazami szacunku i najlepszymi życzeniami [-] prof. dr hab. Krystyna Skwarło-Sońta Redaktor Naczelna KOSMOSU

3

4 Tom Numer 4 (297) Strony NADZIEJA DRELA Zakład Immunologii Instytut Zoologii Wydział Biologii Uniwersytet Warszawski Miecznikowa 1, Warszawa ndrela@biol.uw.edu.pl NAGRODA NOBLA 2011: DWA RODZAJE ODPORNOŚCI TRUDNE POCZĄTKI ODKRYWANIA ODPORNOŚCI Klasyczne prace Miecznikowa i Ehrlicha z XIX w. wskazywały na istnienie u kręgowców dwóch rodzajów odporności, nazwanych dzisiaj odpornością wrodzoną i nabytą (wcześniej określanych jako nieswoista i swoista), które współpracują ze sobą oraz wykazują niezależne działania. Odporność nabyta opiera się na mechanizmie generowania ogromnej różnorodności receptorów rozpoznających antygeny i występuje jedynie u kręgowców. Odporność wrodzona, której wcześniej przypisywano mniejszą rangę, jest filogenetycznie starsza, występuje u kręgowców i bezkręgowców. Miecznikow wykrył ten rodzaj odporności u rozwielitki i rozgwiazdy i opisał występujące w nich komórki żerne, broniące rozwielitkę przed zarodnikami grzybów, a rozgwiazdę przed wnikaniem różnych ciał obcych. Prowadził odtąd intensywne badania nad zjawiskiem fagocytozy również u innych organizmów, w tym u człowieka. Według Miecznikowa, fagocytoza polegała na pochłanianiu drobnoustrojów oraz martwych krwinek czerwonych przez część krwinek białych i uznana została przez uczonego za mechanizm obronny. Ten pogląd spotkał się ze sceptyczną reakcją bakteriologów, także Ludwika Pasteura, którzy uważali, że proces fagocytozy bakterii przez leukocyty służy ich rozprzestrzenieniu w organizmie. Odkrycia Miecznikowa rozpoczęły erę badań nad odpornością wrodzoną (METCHNI- KOV 1884) i już niewiele później, w 1890 r., Massart i Bordet wykazali, że zakażone lub uszkodzone komórki wydzielają substancje chemiczne, które przyciągają makrofagi. Te obserwacje udowodniły, że w obronie organizmu przed mikroorganizmami biorą udział komórki odpornościowe, w tym przypadku makrofagi, które odbierają sygnały o infekcji nie tylko od samych patogenów, ale również od komórek tkanek uszkodzonych w wyniku infekcji. Paul Ehrlich opracował metody barwienia leukocytów, które umożliwiły rozróżnienie ich form morfotycznych i zwrócenie uwagi na limfocyty, odpowiedzialne za rozwój odporności nabytej. Za badania nad odpornością Ilija Miecznikow wraz z Paulem Ehrlichem otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny w 1908 r. Elementy składowe układu odpornościowego identyfikowano stopniowo w ciągu całego XX w., lecz dopiero odkrycia Beutlera, Hoffmanna i Steinmana umożliwiły zrozumienie mechanizmów rozpoznawania patogenów, rozwoju stanu zapalnego i sposobów komunikacji między komórkami uczestniczącymi w odporności wrodzonej i nabytej.

5 536 NADZIEJA DRELA U wszystkich zwierząt wielokomórkowych wykształciły się mechanizmy obronne przed patogenami. Wyróżnia się dwa rodzaje odporności: wrodzoną i nabytą (BŁACH-OL- SZEWSKA 2006, MAJEWSKA i SZCZEPANIK 2006). Odporność wrodzona jest uniwersalna, najszybsza w akcji i pod pewnymi względami najważniejsza. Odporność nabyta powstała u kręgowców jako dodatkowy, uzupełniający mechanizm odporności. Odporność wrodzona rozpoczyna się po kilku godzinach od infekcji i stanowi pierwszą linię obrony przed patogenami. Biorą w niej udział komórki żerne (makrofagi, monocyty, neutrofile), eozynofile, bazofile, komórki tuczne, komórki NK i komórki dendrytyczne oraz czynniki rozpuszczalne (głównie białka układu dopełniacza, interferony typu I produkowane przez komórki zakażone wirusami, peptydy i białka o aktywności przeciwbakteryjnej). Do elementów odporności wrodzonej zaliczane są również bariery anatomiczne jak skóra, błony śluzowe, nabłonek urzęsiony górnych dróg oddechowych oraz enzymy obecne w ślinie, łzach i śluzie, kwaśne ph skóry, soku żołądkowego, wydzieliny gruczołów potowych i łojowych. Receptory komórek odporności wrodzonej odpowiedzialne za roz- ODPORNOŚĆ WRODZONA I NABYTA Tabela 1. Charakterystyka odporności wrodzonej i nabytej. poznawanie patogenów mają ograniczoną różnorodność i wiążą cząsteczki wspólne dla różnych grup patogenów. Odporność wrodzona nie zmienia się w ciągu życia i nie pozostawia pamięci, co oznacza, że nie nasila się po kolejnej infekcji takim samym patogenem. Wydaje się, że receptory komórek odporności wrodzonej nie odgrywają roli w rozwoju chorób autoimmunizacyjnych, gdyż w tkankach gospodarza (człowieka, myszy, szczura, gatunków o najlepiej zbadanej funkcji układu odpornościowego) nie występują cząsteczki charakterystyczne dla patogenów. Odporność nabyta rozwija się później, po kilku dniach od infekcji i klasyfikowana jest jako druga linia obrony. W odporności nabytej również uczestniczą komórki (limfocyty T i B) i czynniki rozpuszczalne (przeciwciała). Receptory limfocytów T i B są różnorodne i swoiste (specyficzne) dla poszczególnych antygenów. Ten rodzaj odporności pozostawia pamięć, co oznacza, że kolejna infekcja takim samym patogenem wywoła silniejszą reakcję obronną. Receptory limfocytów T i B są specyficzne dla cząsteczek określonego patogenu, ale ze względu na szczególny sposób ich powstawania i rozpoznawania antygenów, mogą się przyczyniać do ułatwienia indukcji

6 Nagroda Nobla 2011: dwa rodzaje odporności 537 Ryc. 1. Skutki deficytu odporności wrodzonej i nabytej. chorób autoimmunizacyjnych. Główne cechy i typy komórek obu rodzajów odporności przedstawiono w Tabeli 1. Badania Beutlera i Hoffmanna można opisać jako historię odkrywania sensorów odporności wrodzonej. Jules Hoffmann rozpoczął pionierskie badania w 1996 r., gdy wraz z zespołem charakteryzował sposoby obrony muszki owocowej przed infekcją grzybiczą i bakteryjną oraz rolę w tej obronie białek Toll (LEMAITRE i współaut. 1996). Bruce Beutler badał receptory wiążące produkty pochodzenia bakteryjnego, głównie lipopolisacharydy (LPS) odpowiedzialne za indukcję szoku septycznego. W 1998 r., wraz z zespołem współpracowników, wykazał, że u myszy opornych na LPS występuje mutacja w genie podobnym do genu Toll muszki owocowej (BEUTLER 2000). W 1973 r. Ralph Steinman odkrył komórki dendrytyczne myszy i sformułował hipotezę, iż biorą one udział w aktywacji limfocytów Th (ang. T helper cells, limfocyty T pomocnicze), kluczowych komórek w rozwoju odporności nabytej (STEINMAN i COHN 1973, BANCHEREAU i STEINMAN 1998). Hipoteza okazała się słuszna, a sam Steinman stał się odkrywcą brakującego ogniwa łączącego dwa rodzaje odporności. Spór o to, która odporność jest ważniejsza trwał długo, aż doświadczenia z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych, potwierdzone przypadkami klinicznymi u ludzi, wykazały, że odporność nabyta nie rozwija się prawidłowo, gdy nie dochodzi do aktywacji komórek odporności wrodzonej (przede wszystkim komórek dendrytycznych i makrofagów). Ponadto infekcje wywołane patogenami stanowią zagrożenie dla życia w przypadku deficytu odporności wrodzonej (Ryc. 1). Aktualnie, nie ma wątpliwości, że to komórki odporności wrodzonej jako pierwsze rozpoznają inwazję patogenów. U kręgowców zasadnicza część komórek odporności wrodzonej to komórki pochodzenia mieloidalnego (neutrofile, monocyty, makrofagi). Są to komórki żerne, które potrafią wykonywać swoje funkcje niezależnie, in vitro, ale są znacznie bardziej skuteczne w obecności czynników humoralnych, przeciwciał, produkowanych przez limfocyty B, czyli komórki odporności nabytej. Przeciwciała opsonizują (opłaszczają) bakterie czyniąc je łatwiej dostępnymi dla komórek żernych. Do komórek mieloidalnych, oprócz wymienionych, należą również komórki dendrytyczne: komórki Langerhansa skóry, komórki dendrytyczne strefy grasiczozależnej węzłów chłonnych i śledziony, komórki dendrytyczne śródmiąższowe występujące w tkance łącznej większości narządów. Stanowią jednak zdecydowaną mniejszość wśród jednojądrzastych komórek mieloidalnych. Populacja najliczniejsza, makrofagi, oprócz funkcji żernej, pełni także funkcję nadzorczą: poprzez wydzielanie cytokin chemotaktycznych, wzbudza migrację leukocytów polimorfonuklearnych (neutrofili, bazofili, eozynofili) do miejsca objętego infekcją. Poza tym, makrofagi przetwarzają antygeny białkowe na krótkie peptydy i prezentują je limfocytom Th w formie kompleksów MHC klasy II-peptyd. Spośród leukocytów polimorfonuklearnych, neutrofile, komórki krótkożyjące (około 6 godzin) to wyspecjalizowani zabójcy, zdolni do fagocytozy i aktywności cytotoksycznej. Z kolei bazofile i eozynofile, poprzez wydzielane cytokiny tworzą prawidłowe środowisko dla rozwoju reakcji zapalnej i również za pośrednictwem cytokin komunikują się z limfocytami. Usunięcie nawet jednej populacji efektorowej spośród komórek odporności wrodzonej, np. neutrofili, skutkuje groźnym niedoborem odporności. Blokada prezentacji antygenu w pełniących tę funkcję komórkach odporności wrodzonej (komórki dendrytyczne czy makrofagi) i brak produkowanych przez nie cytokin powoduje, że komórki odporności nabytej stają się nieskuteczne w walce z patogenami czy nowotworami. Zatem istnieje ścisła zależność między obydwoma rodzajami odporności i jak widać nabyta jest podporządkowana wrodzonej. Wieloletnie badania nad mechanizmami rozpoznawania patogenów przybliżyły nas do odpowiedzi na pytanie: w jaki sposób komórki odporności wrodzonej odróżniają

7 538 NADZIEJA DRELA struktury własne od obcych, czyli w jaki sposób, przy zachowaniu tolerancji na elementy własnego organizmu, rozpoznają inwazję patogenów? Próbę odpowiedzi na to pytanie podjęło wielu badaczy, wśród nich Bruce Beutler, któremu udało się udzielić najpełniejszej odpowiedzi na tak zadane pytanie i odniósł sukces. STAN ZAPALNY POCZĄTEK ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ Patogeny, głównie mikroorganizmy, którym uda się pokonać bariery anatomiczne, zostają bardzo szybko otoczone przez nadzorujące tkanki i narządy gospodarza komórki odporności wrodzonej: makrofagi, komórki Ryc. 2. Ostry stan zapalny. 1. Lokalna infekcja bakteryjna wywołuje uszkodzenie tkanek, które skutkują indukcją surowiczych mediatorów stanu zapalnego jak bradykinina i fibrynopeptydy. Bakterie aktywują białka układu dopełniacza w drodze alternatywnej. 2. Komórki tuczne obecne w tkankach ulegają aktywacji pod wpływem anafilatoksyn (produktów aktywacji dopełniacza) i wydzielają mediatory stanu zapalnego, histaminę, prostaglandyny i leukotrieny, powodujące zwiększenie przepuszczalności włosowatych naczyń krwionośnych i zmniejszenie prędkości przepływu krwi. 3. Makrofagi aktywowane przez produkty pochodzenia bakteryjnego syntetyzują i wydzielają cytokiny prozapalne (IL-1, IL-6 i TNF- ), które indukują ekspresję adhezyn na komórkach śródbłonka, syntezę chemokin, prostaglandyn i leukotrienów. Bakterie sfagocytowane przez tkankowe makrofagi są niszczone w fagolizosomach, a produkty ich enzymatycznej degradacji są uwalniane na zewnątrz. Wśród produktów degradacji znajdują się cząsteczki pochodzenia bakteryjnego określone skrótem PAMP (ang. Pathogen-Associated Molecular Patterns, wzorce molekularne związane z patogenem). 4. Neutrofile migrują z włosowatych naczyń krwionośnych do miejsca objętego stanem zapalnym (miejsca infekcji). Migracja neutrofili przez komórki śródbłonka ułatwiona jest przez ekspresję cząsteczek adhezyjnych, działaniem chemokin i anafilatoksyn działających chemotaktycznie. Kolejnymi komórkami, które migrują do miejsca objętego infekcją są monocyty i znacznie później limfocyty. Główną funkcją neutrofili i monocytów migrujących z naczynia krwionośnego jest fagocytoza patogenów. tuczne i komórki dendrytyczne. Zespół reakcji zachodzących lokalnie w miejscu infekcji, z udziałem komórek odporności wrodzonej i wydzielanych przez nie rozpuszczalnych mediatorów, określany jest terminem stan zapalny. Rozpoczyna się natychmiast po wniknięciu patogenu do organizmu, zapoczątkowuje procesy eliminacji patogenu i reperacji tkanek oraz uczestniczy w przywróceniu homeostazy po zniszczeniu patogenu. Wczesna faza stanu zapalnego charakteryzuje się udziałem komórek tucznych i makrofagów tkankowych, wydzielających mediatory prozapalne (cytokiny prozapalne, aminy bioaktywne i mediatory lipidowe). Skutkiem ich działania jest między innymi zwiększenie przepuszczalności włosowatych naczyń krwionośnych i aktywna migracja leukocytów, głównie neutrofili krążących w krwi, do tkanki objętej stanem zapalnym. Niszczenie patogenów w początkowej fazie stanu zapalnego odbywa się przy udziale mechanizmów odporności wrodzonej (fagocytoza, aktywacja dopełniacza w drodze alternatywnej, aktywność cytotoksyczna komórek NK w przypadku infekcji wirusowej). Antygeny pato-

8 Nagroda Nobla 2011: dwa rodzaje odporności 539 genów lub całe patogeny (mikroorganizmy) endocytowane przez komórki dendrytyczne i makrofagi, transportowane są do węzłów limfatycznych drenujących tkankę, gdzie uczestniczą w aktywacji limfocytów T i B i rozwoju odporności nabytej. W ostrej reakcji zapalnej uczestniczą głównie komórki odporności wrodzonej, natomiast w chronicznym stanie zapalnym przeważają zależne od limfocytów T i B mechanizmy odporności na- bytej. Ostry stan zapalny dotyczy wczesnej fazy infekcji, w której uruchomione zostają mechanizmy niszczenia patogenu i naprawy tkanek w miejscu infekcji. Chroniczny stan zapalny z udziałem komórek odporności nabytej skutkuje rozwojem niektórych chorób autoimmunizacyjnych lub nowotworowych. Główne procesy zachodzące w ostrym stanie zapalnym przedstawia Ryc. 2. ROZPOZNAWANIE PATOGENÓW PRZEZ KOMÓRKI ODPORNOŚCI WRODZONEJ: HISTORIA ODKRYCIA TLR Kluczowe funkcje układu odpornościowego to: (i) rozpoznanie różnorodnych patogenów, (ii) jak najszybsze zniszczenie rozpoznanych patogenów oraz (iii) ochrona własnych tkanek (tolerancja na antygeny własne). Wynika z tego ogólny schemat reagowania organizmu na patogeny, składający się z dwóch faz: dośrodkowej (sensorowej) i odśrodkowej (efektorowej). Pierwsza opisuje sposoby rozpoznawania infekcji, druga - sposoby walki z infekcją. W każdej z tych faz rozróżniamy części składowe: humoralną i komórkową. Zgodnie z tym schematem opisywany jest rozwój zarówno odporności wrodzonej, jak i nabytej. Ważną funkcją komórek odpornościowych, decydującą o przetrwaniu organizmu, jest zdolność niszczenia patogenów, przy zachowanej tolerancji na własne tkanki. Komórki odporności wrodzonej nie mają zdolności rozpoznawania antygenów własnych głównego układu zgodności tkankowej, MHC (ang. major histocompatibility complex), poza komórkami NK (ang. natural killer), które rozpoznają cząsteczki MHC klasy I. Makrofagi, najlepiej do tej pory zbadane komórki odporności wrodzonej, nie rozpoznają, jak się obecnie wydaje, obcych przeszczepów pomiędzy gatunkami blisko spokrewnionymi, natomiast rozpoznają pierwotniaki, bakterie, wirusy, grzyby czy wielokomórkowe pasożyty. Właściwość rozpoznawania cząsteczek MHC posiadają limfocyty T, komórki odporności nabytej, co jak zostanie opisane w dalszej części artykułu, jest ściśle związane ze sposobem aktywacji tych komórek przez obce antygeny prezentowane przez komórki dendrytyczne, główne komórki prezentujące antygen. Komórki odporności wrodzonej mają receptory rozpoznające patogeny, ale ich liczba jest niezbyt duża. Jednakże ich swoistość nie jest ograniczona do rozpoznawania określonego epitopu antygenowego (fragmentu antygenu, który jest wiązany przez przeciwciało lub receptor dla antygenu limfocytów T, przy czym jedna cząsteczka antygenu może zawierać wiele epitopów), ale raczej do rozpoznawania cząsteczek, które występują w grupach patogenów. Stanowią one niezbędne składniki patogenów, zatem rzadko ulegają mutacji (KIMBRELL i BEUTLER 2001, BEUTLER 2004). Ponadto, receptory komórek odporności wrodzonej są niewrażliwe na obecność cząsteczek własnego organizmu, co stanowi podstawę odróżnienia substancji własnych od obcych. Dla określenia tych receptorów wprowadzono termin receptory rozpoznające wzorce, PRR (ang. pattern recognition receptors), co sugerowało, że wiążą one nie pojedynczą cząsteczkę, lecz kompleks różnych cząsteczek pochodzenia patogennego. Z kolei termin wzorce molekularne związane z patogenem, PAMP (ang. pathogen-associated molecular patterns), określający substancje związane z patogenami, wprowadzony został w 1989 r. przez Charlesa A. Janewaya, który zwrócił uwagę na istnienie zależności między odpornością wrodzoną i nabytą. Przedstawił także hipotezę zakładającą, że do aktywacji limfocytów T, oprócz sygnału pochodzącego od antygenu i przekazywanego do komórki przez receptory limfocytów T dla antygenów, TCR (ang. T cell receptor), konieczny jest jeszcze sygnał pochodzący od komórki prezentującej antygen. Ta z kolei jest zdolna do przekazania takiego sygnału dopiero po rozpoznaniu patogenu (pierwotnie uwzględniano jedynie mikroorganizmy) przez PRR, charakteryzujące się ograniczoną różnorodnością i kodowaniem w konfiguracji zarodkowej. Według Janewaya ligandy PRR to konserwowane ewolucyjnie cząsteczki występujące u wielu różnych grup mikroorganizmów, nieobecne w organizmie gospodarza

9 540 NADZIEJA DRELA (zarówno kręgowców, jak i bezkręgowców), co umożliwia odróżnienie struktur własnych od obcych (JANEWAY 1989). PAMP, ligandy PRR, występujące w grupach patogenów, rzadko ulegają mutacji i pełnią ważną rolę w ich przeżywalności. Wydawało się wcześniej, że PAMP działają w drodze interakcji z PRR. To jednak nie wzorzec molekularny, lecz najzwyczajniej cząsteczka pochodzenia bakteryjnego reaguje z cząsteczką komórki obronnej gospodarza. Takie cząsteczki pochodzenia bakteryjnego znane były od lat 50. ubiegłego wieku: lipopolisacharydy (LPS), kwasy lipotejchojowe, peptydoglikany. Użycie terminu wzorzec sugerowało, iż mamy do czynienia ze specjalnym rodzajem oddziaływania, innym niż interakcja ligand-receptor. Wydawało się, że istnieje jakiś rodzaj przestrzennej organizacji grup cząsteczek rozpoznawanych przez PRR lub też konieczny jest udział wielowartościowych ligandów dla osiągnięcia interakcji o dużym powinowactwie. Wyniki późniejszych badań wykazały, że rozpoznawane są konkretne cząsteczki bakterii i to nie tylko patogennych, ale wszystkich, również komensalnych. Zatem oba terminy w świetle dzisiejszej wiedzy są nieprawidłowe, choć używane. W grupie cząsteczek rozpoznawanych przez receptory komórek odporności wrodzonej jest LPS, opisany ponad sto lat temu przez Pfeiffera (PFEIFFER 1892). LPS pobudza makrofagi do syntezy cytokin prozapalnych (TNF, IL-1, IL-6), co skutkuje objawami klinicznymi, takimi jak gorączka, zmniejszenie ciśnienia krwi, niedokrwienie narządów i ich uszkodzenie (BEUTLER 2001, BEUTLER i RIETSCHEL 2003). Długa historia badań nad produktami pochodzenia bakteryjnego (LPS, peptydoglikany, kwasy lipotejchojowe, niemetylowane DNA) lub wirusowego (dsrna) wskazuje, że nie wszystkie są toksynami, nie działają bezpośrednio, lecz rozpoznawane przez komórki odporności wrodzonej powodują kaskadę syntezy cytokin i innych związków biologicznie czynnych niezbędnych dla rozwoju stanu zapalnego i prawidłowej odpowiedzi immunologicznej, a w niesprzyjających warunkach, mogą spowodować objawy kliniczne prowadzące do śmierci organizmu. Historia LPS jest szczególna, długa i wskazująca na jego wielorakie właściwości: toksyczność w dużych stężeniach, efekt ochronny przed następną inwazją patogennych mikroorganizmów w małych stężeniach i działanie adjuwantowe, wspomagające powstawanie silnej odpowiedzi na antygen białko- wy wstrzyknięty łącznie z LPS. W latach 90. ubiegłego wieku zwrócono uwagę na inne, oprócz LPS, substancje, które nie mają cech antygenu i nie stymulują limfocytów T i B przez receptory dla antygenu, lecz wzmacniają odpowiedź tych komórek na antygen (ME- DZHITOV i JANEWAY 2002). Najlepiej zbadaną grupą PRR są receptory Toll-podobne, TLR (ang. toll-like receptors) (POLTORAK i współaut. 2000, ALEXOPOULU i współaut. 2001). Swoją nazwę zawdzięczają odkrytemu w larwach muszki Drosophila melanogaster genowi Toll, którego ekspresja decyduje o właściwej polaryzacji brzuszno- -grzbietowej i prawidłowym rozwoju embrionalnym larw muszki. Kolejne lata badań nad funkcją genu Toll wykazały jego rolę w odporności Drosophila melanogaster i doprowadziły do odkrycia białek Toll-podobnych, pełniących rolę receptorów komórek odporności wrodzonej u myszy i człowieka. Bezkręgowce pozbawione są odporności nabytej, zatem obrona przed patogenami zależna jest wyłącznie od komórek odporności wrodzonej. W 1996 r. Jules Hoffmann i Bruno Lemaitre zauważyli, że mutacje genu Toll wywołują u owada wrażliwość na letalną infekcję Aspergillus fumigatus (LEMAITRE i współaut. 1996). Dalsze badania J. Hoffmanna doprowadziły do opisania szlaku sygnałowego z udziałem białek Toll. Przynajmniej jeden z przedstawicieli rodziny receptorów Toll u Drosophila odpowiada za odporność na bakterie. Aktywacja receptorów Toll1 u Drosophila wywołuje syntezę peptydów o aktywności przeciwbakteryjnej (dipterycyny i defensyny) i przeciwgrzybiczej (drosomycyny). Białko Toll1 nie rozpoznaje substancji pochodzenia patogennego bezpośrednio, lecz jest aktywowane przez endogenny ligand, białko Spaetzle. W transdukcji sygnału od białka Toll1 biorą udział czynniki transkrypcyjne z rodziny NF- B. Spośród białek Toll zidentyfikowanych u Drosophila tylko jedno odgrywa rolę w odpowiedzi odpornościowej, co sugeruje, że nie jest to jego pierwotna funkcja tego białka. Większość białek Toll Drosophila związanych jest z rozwojem, natomiast u ssaków żaden TLR nie odgrywa znanej roli w rozwoju. Wykrycie u Drosophila melanogaster receptorów Toll zapoczątkowało wieloletnie badania ich odpowiedników u myszy i człowieka (DU i współaut. 2000, CHUANG i ULEVITCH, 2000). TLR wiążą również cząsteczki pierwotniaków i wirusów (HOEBE i współaut. 2003). Naturalnymi ligandami TLR są nie tylko substancje pochodzące

10 Nagroda Nobla 2011: dwa rodzaje odporności 541 od patogenów, lecz także endogenne ligandy powstające w komórkach gospodarza w stanie zagrożenia wywołanego infekcją, stresem lub w wyniku starzenia własnych komórek (GALLUCCI i MATZINGER 2001). Endogenne, fizjologiczne ligandy TLR określono terminem wzorce molekularne związane z sygnałem niebezpieczeństwa, DAMP (ang. danger-associated molecular patterns). W tym miejscu należy wrócić do historii LPS i sposobu jego rozpoznawania przez komórki odporności wrodzonej. W 1997 r. Ruslan Medzhitov i Charles Janeway odkryli ludzkie białko charakteryzujące się dużym stopniem homologii w domenie cytoplazmatycznej z białkiem Toll. Białko to, nazwane TLR4, zostało dokładnie scharakteryzowane przez Bruce a Beutlera i jego zespół, którzy opisali także szlak sygnałowy od TLR4 w makrofagach (BEUTLER 2000). TLR4 jest najlepiej poznanym receptorem, odpowiedzialnym za rozpoznanie lipolisacharydów ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. Nie wykazano homologów LPS w organizmach wielo- komórkowych. Wydawało się początkowo, iż mechanizm działania LPS jest bezpośredni i polega na bliżej nieokreślonych zaburzeniach funkcjonowania błony komórkowej komórek odpornościowych, aż wykazano, że TNF, czynnik martwicy nowotworu, syntetyzowany i wydzielany przez makrofagi, jest głównym mediatorem szoku septycznego (endotoksycznego), a jego synteza indukowana jest właśnie przez LPS (BEUTLER i współaut. 1985, FREUDENBERG i współaut. 1986). Wiązanie LPS przez TLR4 wspomagane jest przez błonową cząsteczkę CD14, która nie posiada domeny cytoplazmatycznej i nie bierze udziału w transdukcji sygnału, aczkolwiek uważana była początkowo za główny receptor dla LPS (WRIGHT i współaut. 1990). Kręgowce różnią się wrażliwością na LPS. Szczep myszy C3H/HeJ jest oporny na działanie LPS, zaś blisko spokrewnione myszy C3H/HeN wykazują normalną wrażliwość. Okazało się, że myszy oporne na LPS są bardzo wrażliwe na infekcje bakteriami Gram-ujemnymi: umierają po wstrzyknięciu bardzo małej liczby bakterii, Tabela 2. TLR i ich naturalne ligandy.

11 542 NADZIEJA DRELA U myszy, które nie posiadają białka LBP nie rozwija się prawidłowa reakcja zapalna na infekcje pneumokokami, gdyż brakuje białka wiążącego składniki ich ściany i transportującego je do TLR2. Zadziwiające jest podobieństwo TLR ssaków do receptorów Toll Drosophila, które również nie wiążą ligandów bezpośrednio, lecz przez białka powstające z prekursorów poprzez kaskadę proteolityczną zaindukowaną przez białka hemolimfy w wyniku ich oddziaływania z produktami pochodzenia bakteryjnego lub grzybiczego. Interakcja PAMP z TLR zapoczątkowuje przekazanie sygnału do jądra komórkowego. Podstawowa jednostka strukturalna receptora składa się z domeny zewnątrzkomórkowej na końcu aminowym, zawierającej powtarzające się motywy bogate w leucynę, LRR (ang. leucine rich repeats), domeny transbłonowej i globularnej domeny cytoplazmatycznej TIR (ang. Toll/interleukin-1 receptor motif), analogicznej do domeny receptora interleukiny 1. Za wiązanie PAMP odpowiada domena na końcu aminowym, zewnątrzkomórkowa w przypadku TLR powierzchniowych, a za przekazywanie sygnału do jądra komórkowego odpowiada cytoplazmatyczna domena TIR. Wiązanie PAMP prowadzi do dimeryzacji TLR i rekrutacji białek adaptorowych pośredniczących w transdukcji sygnału. Transdukcja sygnału do jądra komórkowego zależy od 4 białek adaptorowych: MyD88, MAL(TIktóra zupełnie nie jest szkodliwa dla myszy wrażliwych na LPS (SULTZER 1968; WATSON i współaut. 1977, 1978; POLTORAK i współaut. 1998). Obserwacje te spowodowały, iż wrażliwość na LPS zaczęto uważać za kluczową w obronie przeciwbakteryjnej, a obecnie przypisuje się tej cząsteczce także udział w indukcji supresji odpowiedzi immunologicznej. TLR należą do białek transbłonowych występujących w powierzchniowej błonie komórkowej lub w błonie endosomów. Wiążą jeden rodzaj cząsteczek pochodzenia patogennego (TLR4-LPS) lub kilka różnych (TLR2 peptydoglikany i kwasy lipotejchojowe), niektóre tworzą heterodimery (TLR1/TLR2, TLR6/TLR2) zwiększające spektrum rozpoznawanych ligandów (Tabela 2). TLR wiążące składniki ścian komórkowych bakterii i grzybów znajdują się w błonie powierzchniowej komórek, natomiast wiążące kwasy nukleinowe bakterii i wirusów zlokalizowane są w błonach fagolizosomów lub endosomów. Wewnątrzkomórkowe usytuowanie receptorów dla kwasów nukleinowych zapewnia ich rozpoznanie poprzedzone etapem endocytozy, co umożliwia również odebranie sygnału od własnych apoptotycznych komórek. Dotychczas zidentyfikowano 13 receptorów Toll-podobnych u myszy i człowieka, z których TLR1-TLR10 występują u obu gatunków, zaś TLR11-TLR13 jedynie u myszy. Najbardziej zróżnicowaną ekspresję TLR posiadają komórki dendrytyczne i makrofagi, komórki tuczne nie mają TLR3, TLR5, TLR7 i 8, neutrofilom brak TLR1, TLR 5 i TLR8. Aktualnie wiadomo, że receptory Toll-podobne występują również w limfocytach B (TLR1-TLR5), komórkach NKT (TLR2 i TLR4) i regulatorowych limfocytach T (TLR4, TLR5, TLR7, TLR8). Znane są również syntetyczne ligandy dla większości TLR. W wiązaniu ligandu przez niektóre TLR uczestniczą dodatkowe białka receptorowe, tak jak w przypadku wiązania LPS przez TLR4. Są nimi: surowicze białko wiążące LPS, LBP (ang. LPS-binding protein), błonowe białko CD14 i polipeptyd MD-2 połączony z zewnątrzbłonową domeną TLR4. CD14 uczestniczy również w wiązaniu kwasów lipotejchojowych bakterii Gram-dodatnich i lipoarabinomannanu Mycobacterium tuberculosis, a LBP wiąże również peptydoglikany. Dimery TLR2 i TLR6 wiążą lipoproteiny i kwasy lipotejchojowe przy udziale białka CD36. Rozpuszczalne receptory transportują cząsteczki do właściwego receptora. Ryc. 3 Schemat szlaku sygnałowego przez TLR.

12 Nagroda Nobla 2011: dwa rodzaje odporności 543 RAP), TRIF (TICAM-1) i TRAM (TICAM-2), które wiążą się bezpośrednio z TLR i rekrutują kolejne składniki szlaku sygnałowego. Analogiczne przebiega szlak sygnałowy wynikający z interakcji TLR i DAMP. W obu przypadkach, jak schematycznie pokazano na Ryc. 3, w interakcji może uczestniczyć TLR zewnątrz- i wewnątrzkomórkowy wiążący ligandy pochodzące ze środowiska zewnętrznego lub z wnętrza komórki. Zasadniczy szlak sygnałowy, homologiczny ze szlakiem Toll u Drosophila związany jest z cząsteczką adaptorową MyD88. Efektem końcowym transdukcji sygnału w tym szlaku jest fosforylacja i degradacja I B (inhibitor czynnika transkrypcyjnego NF- B), umożliwiająca translokację czynnika transkrypcyjnego NF- B do jądra komórkowego i aktywację genów kodujących cytokiny prozapalne. Jedynie transdukcja sygnału od TLR3 jest całkowicie niezależna od MyD88 i prowadzi do przemieszczenia czynnika transkrypcyjnego IRF-3 (ang. interferon regulatory factor 3) do jądra komórkowego i aktywacji syntezy interferonów typu I, głównie IFN-. TLR4 jest w znacznej części szlaku sygnałowego niezależny od MyD88. W szlaku tym bierze udział TRIF, inicjujący kaskadę reakcji prowadzącej do aktywacji IRF-3, skutkującej syntezą białek kostymulatorowych i indukcją syntezy IFN- (HOEBE i współaut. 2003). Cząsteczki bakteryjne oraz wirusowe rozpoznawane za pomocą właściwych TLR mogą wzbudzać podobne szlaki sygnalizacji, co może mieć złe i dobre konsekwencje. Złe, bo taka odpowiedź nie musi być jednakowo skuteczna w obronie przed wirusem lub bakterią. Dobre, bo jak już wykazano, używany przez TLR4 szlak sygnalizacji jest rozpowszechniony i część może być wykorzystywana do obrony przeciwbakteryjnej, część do przeciwwirusowej (HOEBE i współaut. 2003, YAMAMOTO i współaut. 2003). Rozpoznanie patogenu przez TLR to dopiero początek drogi prowadzącej do jego zniszczenia. W fagosomach makrofagów i neutrofili powstają reaktywne formy tlenu wykorzystywane do zabijania bakterii w wyniku reakcji z lipidami, białkami, DNA, niszczące często przy okazji własne komórki. Fagocytoza bakterii związana jest z migracją komórek żernych do miejsca infekcji. Do tego służą takie procesy jak adhezja (przyleganie leukocytów do komórek śródbłonka włosowatych naczyń krwionośnych), diapedeza (proces przechodzenia leukocytów przez śródbłonek naczyń z udziałem cząsteczek adhezyjnych) i chemotaksja (ukierunkowana migracja leukocytów zależna od gradientu stężeń czynników chemotaktycznych). W najbliższym otoczeniu ogniska zapalnego znajdują się, wydzielane przez komórki odporności wrodzonej, mediatory chemotaktyczne (chemokiny) oraz inne związki biologicznie czynne, jak histamina czy bradykinina. Te ostatnie powodują rozszerzenie naczyń, zwiększając w ten sposób objętość krwi przepływającej przez tkanki objęte stanem zapalnym. Mediatory stanu zapalnego wydzielane przez aktywowane komórki odporności wrodzonej indukują syntezę cząsteczek adhezyjnych w komórkach śródbłonka i leukocytach, co następnie umożliwia diapedezę. KOMÓRKI DENDRYTYCZNE BRAKUJĄCE OGNIWO MIĘDZY ODPORNOŚCIĄ WRODZONĄ I NABYTĄ Komórki dendrytyczne po raz pierwszy zostały opisane przez Steinmana (STEINMAN i COHN 1973), mimo że wcześniej zauważył je w skórze Paul Langerhans i dlatego okreslenie komórki Langerhansa utrzymuje się do dzisiaj. Jednakże to właśnie Steinmanowi zawdzięczamy odkrycie centralnej roli komórek dendrytycznych w rozwoju odporności nabytej. Prekursory komórek dendrytycznych podlegają różnicowaniu w niedojrzałe komórki dendrytyczne, które mają zdolność do endocytozy i przetwarzania antygenów do formy łatwo wiążącej się z białkami MHC. Pod wpływem stymulacji z udziałem TLR, komórki dendrytyczne dojrzewają do stadium funkcjonalnego komórek prezentujących antygen. Stymulacja niedojrzałych komórek dendrytycznych indukuje w nich syntezę cząsteczek kostymulatorowych i cytokin niezbędnych do aktywacji limfocytów Th i ich różnicowania w komórki efektorowe odporności nabytej. Markerami dojrzewania komórek dendrytycznych są cząsteczki kostymulatorowe CD80, CD86 i CD40, które za pośrednictwem swoich ligandów (CD28, CD40L) dostarczają dodatkowego sygnału aktywującego limfocyty Th. Opisano szereg populacji komórek dendrytycznych różniących się pochodzeniem, zdolnością do migracji do określonych tkanek i narządów limfoidalnych,

13 544 NADZIEJA DRELA Ryc. 4. Uproszczony schemat aktywacji limfocytów przez komórki dendrytyczne (wg BANCHEREAU i STEINMANA 1998). 1.Komórki dendrytyczne powstają w szpiku kostnym i zasiedlają tkanki organizmu. W tkankach występują w postaci niedojrzałej, ze słabą ekspresją powierzchniowych cząsteczek kostymulatorowych. W tkance objętej stanem zapalnym komórki dendrytyczne wychwytują mikroorganizmy i ulegają aktywacji w wyniku interakcji ich TLR z produktami pochodzenia bakteryjnego. Wówczas, naczyniami limfatycznymi drenującymi tkankę, migrują do najbliższego węzła limfatycznego podlegając wówczas procesowi dojrzewania. 2.W węźle limfatycznym ma miejsce bezpośredni kontakt komórek dendrytycznych (DC) z limfocytami T. Interakcja DC-T indukuje aktywację limfocytów T w wyniku oddziaływań między receptorami i ich ligandami w obszarze kontaktu między komórkami oraz działania cytokin wydzielanych przez dojrzałe DC. 3. Aktywowane limfocyty T migrują naczyniami limfatycznymi wyprowadzającymi, a następnie naczyniami krwionośnymi z powrotem do miejsca stanu zapalnego, gdzie wykonują swoje funkcje efektorowe (synteza cytokin przez limfocyty Th, cytotoksyczne przez limfocyty Tc). ekspresją charakterystycznych zestawów TLR i funkcją związaną z indukcją odpowiedzi immunologicznej lub tolerancji. Receptory limfocytów B wiążą antygeny natywne, natomiast dominująca populacja limfocytów T za pośrednictwem swoich receptorów TCR (ang. T cell receptor ) wiąże kompleksy cząsteczek MHC z peptydami pochodzącymi z degradacji białek patogenów. Zdolność do rozkładu tych białek, czyli ich przetwarzania do kilkunastoaminokwasowych peptydów, które następnie tworzą kompleksy z białkami MHC i są transportowane na powierzchnię, gdzie są prezentowane limfocytom T, mają komórki prezentujące antygen, za które wcześniej uważano głównie makrofagi. Rola makrofagów w rozwoju odporności nabytej opisywana jest od ponad 40 lat (HOFFMANN i DUTTON 1971, DUTTON i współaut. 1970). Jak już wspomniano powyżej, Charles Janeway sugerował niezbędny udział w aktywacji limfocytów T innych, dodatkowych sygnałów, niż ten pochodzący od TCR. Badania Ralpha Steinmana wskazały na główną rolę komórek dendrytycznych w procesie przetwarzania antygenów białkowych i prezentacji kompleksów MHC klasy II-peptyd limfocytom Th naiwnym, czyli stykającym się z antygenem po raz pierwszy. Skutki takiej prezentacji są kluczowe dla indukcji mechanizmów efektorowych odporności nabytej, związanych z syntezą przeciwciał czy aktywnością cytotoksycznych limfocytów T. Komórki dendrytyczne, jak wszystkie leukocyty, powstają w szpiku kostnym, a następnie migrują do określonych tkanek organizmu. Wyróżnia się następujące rodzaje komórek dendrytycznych: mieloidalne (ang. myeloid dendritic cell, mdc) występujące w narządach limfoidalnych, krwi i pozostałych tkankach, plazmacytoidalne (ang. plasmacytoid dendritic cell, pdc) w narządach limfoidalnych i krwi oraz folikularne (ang. follicular dendritic cell, FDC) w węzłach limfatycznych i śledzionie. Mieloidalne komórki dendrytyczne najefektywniej przetwarzają i prezentują antygeny limfocytom Th, pdc mało skutecznie prezentują antygen, natomiast aktywowane produkują interferony typu I, a FDC nie przetwarzają antygenu, lecz uczestniczą w tworzeniu pamięci immunologicznej. Wyniki badań prowadzonych przez zespół Steinmana zaowocowały w ubiegłym wieku dobrze dzisiaj znanym twierdzeniem, że komórki dendrytyczne kontrolują odporność, a ich rola w tym procesie w skrócie przebiega następująco: w tkance objętej stanem zapalnym

14 Nagroda Nobla 2011: dwa rodzaje odporności 545 Rys. 5. Skutki interakcji między komórką dendrytyczną i naiwnym limfocytem Th. Komórki dendrytyczne dostarczają limfocytom Th niezbędne sygnały aktywacji: sygnał 1 wynikający z interakcji między receptorem dla antygenu (TCR) limfocyta Th i kompleksem MHC II-peptyd prezentowanym przez DC; sygnał 2 pochodzący od cząsteczki CD28 po związaniu ligandu CD80/CD86; sygnał 3 przekazywany przez cytokiny syntezowane przez aktywowane komórki dendrytyczne. Skutkiem aktywacji limfocytów Th jest ich proliferacja i różnicowanie w populacje efektorowe (Th1 odpowiedzialne za rozwój odporności przeciwbakteryjnej i przeciwwirusowej, Th2 uczestniczące w odporności przeciwpasożytniczej, Treg o aktywności supresorowej i Th17 o aktywności prozapalnej). wychwytują i przetwarzają antygeny, zwiększają ekspresję cząsteczek kostymulatorowych i migrują do narządów limfoidalnych, gdzie wydzielają cytokiny i zapoczątkowują odpowiedź immunologiczną, w której komórkami efektorowymi są limfocyty (Ryc. 4). Ich rola polega nie tylko na aktywacji limfocytów T, lecz również na indukcji tolerancji tych komórek na własne i obce antygeny (BANCHEREAU i STEINMAN 1998). Komórki dendrytyczne dostarczają limfocytom T sygnały kostymulatorowe pochodzące od białek błonowych CD80, CD86, CD40. Interakcja między aktywowaną komórką dendrytyczną i naiwnym limfocytem Th skutkuje aktywacją tego ostatniego, na którą składa się proliferacja i różnicowanie w komórki efektorowe odporności nabytej odpowiedzialne za rozwój skutecznej obrony przeciw patogenom i komórkom nowotworowym, hamowanie nadmiernej aktywności limfocytów Th i cytotoksycznych, limfocytów B oraz utrzymywanie stanu zapalnego (Ryc. 5). PODSUMOWANIE Trzej Nobliści jednocześnie, chociaż każdy w innym zakresie, dostarczyli dowody na rolę receptorów rozpoznających substancje pochodzące od patogenów, PRR, w fazie sensorowej odporności wrodzonej oraz na kluczową rolę komórek dendrytycznych i ich receptorów w indukcji odporności nabytej. Zostały ostatecznie opisane i wyjaśnione procesy związane z odpornością, które przez wiele lat były elementem hipotezy badawczej. NAGRODA NOBLA 2011: DWA RODZAJE ODPORNOŚCI Streszczenie Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny w 2011 r. otrzymali Bruce A. Beutler i Jules A. Hoffmann za odkrycie mechanizmów indukcji odporności wrodzonej oraz Ralph M. Steinman za odkrycie komórek dendrytycznych i ich roli w rozwoju odporności nabytej. Wyniki wieloletnich badań uczonych oraz ich współpracowników zrewolucjonizowały poglądy na podstawy funkcjonowania układu odpornościowego i mechanizmy aktywacji komórek obronnych. Bruce Beutler i Jules Hoffmann scharakteryzowali białkowe receptory odpowiedzialne za rozpoznawanie patogenów i wykazali ich udział w aktywacji komórek odporności wrodzonej, a Ralph Steinman zidentyfikował komórki dendrytyczne i opisał ich unikatową zdolność do indukcji odporności nabytej.

15 546 NADZIEJA DRELA NOBEL PRIZE 2011: TWO TYPES OF IMMUNITY Summary Bruce Beutler, Jules Hoffmann and Ralph Steinman share the Nobel Prize in physiology and medicine. Beutler and Hoffmann elucidated the sensory branch of innate immunity. They discovered and characterized the receptors of innate immune cells involved in the recognition of invading pathogens and analyzed the intracellular signaling pathways leading to development of inflammation and mobilization of the front line of defense against patho- gens. Hoffmann concentrated on the role of Toll receptors in Drosophila melanogaster, Beutler on the role of Toll-like receptors in mammals. Steinman investigated mouse dendritic cells and their role in the induction of adaptive immunity, the second line of immune response that comes into play when innate immunity is not enough. The findings of Steinman established dendritic cells as a link between innate and adaptive immunity. LITERATURA ALEXOPOULOU L., HOLT A. C., MEDZHITOV R., FLAVELL R. A., Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature 413, BANCHEREAU J., STEINMAN R. M., Dendritic cells and the control of immunity. Nature 392, BEUTLER B, MILSARK I. W., CERAMI A., Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor (TNF) protects mice from the lethal effect of endotoxin. Science 229, BEUTLER B., Endotoxin, Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity. Curr. Opin. Microbiol. 3, BEUTLER B., Sepsis begins at the interface of pathogen and host. Biochem. Soc. Transact. 29, BEUTLER B., Innate immunity: an overview. Mol. Immunol. 40, BEUTLER B., RIETSCHEL E. T., Timeline: innate immune sensing and its roots: the story of endotoxin. Nat. Rev. Immunol. 3, BŁACH-OLSZEWSKA Z Mechanizmy kontroli odporności wrodzonej. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 60, CHUANG T. H., ULEVITCH R. J., Cloning and characterization of asub-family of human tolllike receptors: htlr7, htlr8 and htlr9. Eur. Cytokine Network 11, DU X., POLTORAK A., WEI Y., BEUTLER B., Three novel mammalian toll-like receptors: gene structure, expression, and evolution. Eur. Cytokine Network 11, DUTTON R. W., MCCARTHY M. M., MISHELL R. I., RAIDT D. J., Cell components in the immune response. IV. Relationships and possible interactions. Cell. Immunol. 1, FREUDENBERG M. A., KEPPLER D., GALANOS C., Requirement for lipopolysaccharide-responsive macrophages in galactosamine induced sensitization to endotoxin. Infect. Immunity 51, GALLUCCI S., MATZINGER P., Danger signals: SOS to the immune system. Curr. Opin. Immunol. 13, HOEBE K., JANSSEN E. M., KIM S. O., ALEXOPOULOU L., FLAVELL R. A., HAN J., BEUTLER B., Upregulation of costimulatory molecules induced by lipopolysaccharide and double-stranded RNA occurs by Trif-dependent and Trif-independent pathways. Nat. Immunol. 12, HOFFMANN J., DUTTON R. W., Immune response restoration with macrophage culture supernatants. Science 172, JANEWAY C. A. Jr Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 54, KIMBRELL D.A., BEUTLER B., The evolution and genetics of innate immunity. Nat. Rev. Genetics 2, LEMAITRE B., NICOLAS E., MICHAUT L., REICHHART J.-M., HOFFMANN J. A., The dorsoventral regulatory gene cassette spatzle/toll/cactus controls the potent antifungal response in Drosophila adults. Cell 86, MAJEWSKA M., SZCZEPANIK M., Rola receptorów Toll-podobnych w odporności wrodzonej i nabytej oraz ich funkcja w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej 60, MEDZHITOV R., JANEWAY C. A. Jr Decoding the patterns of self and nonself by innate immune system. Science 296, METCHNIKOV E., Uber eine sprosspilzkrankheit der daphnien. Beitragzur lehre uber den kampf der phagocyten gegen krankheitserreger. Virchows Archiv 96, PFEIFFER R., Untersuchungen über das Choleragift. Zeitsch. Hygiene 11, POLTORAK A., RICCIARDI-CASTAGNOLI P., CITTERIO A., BEUTLER B., Physical contact between lipopolysaccharide and Toll-like receptor 4 revealed by genetic complementation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, POLTORAK A., HE X., SMIRNOVA I., LIU M.-Y., VAN HUFFEL C., DU X., BIRDWELL D., ALEJOS E., SILVA M., GALA- NOS C., FREUDENBERG M. A., RICCIARDI-CASTAGNOLI P., LAYTON B., BEUTLER B., Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science 282, STEINMAN R. M., COHN Z. A., Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J. Exp. Med. 137, SULTZER B. M., Genetic control of leucocyte responses to endotoxin. Nature 219, WATSON J., KELLY K., LARGEN M., TAYLOR B. A., The genetic mapping of a defective LPS response gene in C3H/HeJ mice. J. Immunol. 120, WATSON J., RIBLET R., TAYLOR B. A., The response of recombinant inbred strains of mice to bacterial lipopolysaccharides. J. Immunol 118, WRIGHT S. D., RAMOS R. A., TOBIAS P. S., ULEVITCH R. J., MATHISON J. C., CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science 249, YAMAMOTO M., SATO S., HEMMI H., HOSHINO K., KAISHO T., SANJO H., TAKEUCHI O., SUGIYAMA M., OKABE M., TAKEDA K., AKIRA S., Role of adapter TRIF in the MyD88-independent Toll-like receptor signaling pathway. Science 301,

16 Tom Numer 4 (297) Strony MAGDALENA KĘDZIERSKA, BEATA OLAS Katedra Biochemii Ogólnej Uniwersytet Łódzki Pomorska 141/3, Łódź olasb@biol.uni.lodz.pl STRES OKSYDACYJNY W RAKU PIERSI WPROWADZENIE Stres oksydacyjny definiowany jest na wiele sposobów. Zjawisko to najczęściej określa się jako brak równowagi między powstającymi reaktywnymi formami tlenu czy azotu (RFT/RFA) (Tabela 1), a zdolnościami antyoksydacyjnymi organizmu (PUNNONEN i współaut. 1994, RAY i HUSAIN 2001, DELI- MARIS i współaut. 2007, OLAS i WACHOWICZ 2007, KULBACKA i współaut. 2009, NOWAK i współaut. 2010, OLAS i współaut. 2010). W warunkach fizjologicznych każdego dnia powstają pewne ilości reaktywnych form tlenu i azotu, jako wynik wielu procesów biochemicznych. Endogennym, naturalnym źródłem RFT/RFA jest normalny metabolizm komórkowy. Przyjmuje się, iż w zdrowym organizmie człowieka w przeciągu roku może powstać do 2 kg anionorodnika ponadtlenkowego. Egzogennymi źródłami RFT/RFA są: promieniowanie jonizujące czy UV oraz czynniki chemiczne (ZAREMBA i OLIŃSKI 2010). Okazuje się, że jako produkty uboczne metabolizmu komórkowego RFT/ RFA są nieodzownymi elementami, bez których niektóre procesy nie mogą zachodzić. Jednak ważne jest, aby ich stężenie było na optymalnym poziomie, ponieważ każda nadprodukcja skutkuje niepożądanymi konsekwencjami. Badania wykazują, że RFT/RFA mogą być strukturami groźnymi dla naszego organizmu, ale także mogą spełniać rolę obrońców organizmu dzięki zjawisko wybuchu oddechowego (OLAS i WACHOWICZ 2007, ERTEN-SENER i współaut. 2007, NOWAK i współaut. 2010). Już od wielu lat wiadome jest, że RFT i RFA są inicjatorami wielu szkodliwych zmian w komórkach, poprzez fakt, że jako czynniki wysoce reaktywne wchodzą w reakcję z białkami, lipidami, DNA, zmieniając przy tym ich strukturę oraz biologiczne funkcje. Peroksydacji ulegają przede wszystkim białka i lipidy. Zmiany oksydacyjne w białkach spowodowane przez RFT/RFA mogą obejmować: nitrowanie reszt aminokwasów aromatycznych, utlenianie grup tiolowych i przekształcanie niektórych reszt aminokwasowych w pochodne karbonylowe. Badania potwierdzają związek między obecnością zbyt dużej ilości RFT/RFA a rozwojem procesów patologicznych, stanów zapalnych oraz nowotworów (GONENC i współaut. 2006, DELIMARIS i współaut. 2007, ERTEN-SE- NER i współaut. 2007, KASAPOVIĆ i współaut. 2008, HAMO-MAHMOOD i współaut. 2009, KĘ- DZIERSKA i współaut. 2009). W sytuacji nadprodukcji RFT lub RFA organizm uruchamia mechanizmy, których zadaniem jest zmiatanie wolnych rodników. Można więc stwierdzić, że zanim dojdzie do powstania stresu oksydacyjnego czy nitracyjnego, RFT/RFA niszczone są przez naturalną tarczę obronną. Fizjologiczna produkcja wolnych rodników kontrolowana jest na drodze enzymatycznej oraz nieenzymatycznej. W walce ze skutkami reakcji między RFT a komponentami komórkowymi uczestniczy wiele związków. Poza tym, komórki są tak zbudowane, że istnieje izolacja miejsc z nadmierną produkcją RFT, a najważniejszym źródłem endogennych RFT

17 548 MAGDALENA KĘDZIERSKA, BEATA OLAS Tabela 1. Wybrane reaktywne formy tlenu i azotu (zmodyfikowano wg NOWAK i współaut. 2010, OLAS i WACHOWICZ 2007). Rodnikowe pochodne tlenu i azotu Nazwa Rodnik hydroksylowy Anionorodnik ponadtlenkowy Tlenek azotu Ditlenek azotu Rodnik wodoronadtlenkowy Rodnik alkoksylowy Rodnik nadtlenkowy Symbol OH O 2 - NO NO 2 - HO 2 RO ROO Tlen singletowy 1 O 2 Nierodnikowe pochodne tlenu i azotu Nadtlenek wodoru H 2 O 2 Nadtlenoazotyn ONOO - Kwas podchlorawy HOCl zjologicznych antyoksydantów. Świadczy to o zaburzeniach mechanizmów obronnych, które nie są w stanie zwalczyć nadprodukcji wolnych rodników indukowanej działaniem czynników chorobotwórczych oraz oddziaływań zewnętrznych (KULBACKA i współaut. 2009, ROBERTS i współaut. 2009). Wiele naukowych doniesień sugeruje, że zmiany w równowadze prooksydacyjnej/antyoksydacyjnej na korzyść strony prooksydacyjnej są jedną z przyczyn postępującego procesu nowotworzenia. Dotychczas pojawiły się sugestie, że działanie mutagenów biorących udział w inicjacji karcynogenezy, związane może być z wytwarzaniem wolnych rodników. Ze względu na swą wysoką reaktywność wolne rodniki reagują m.in. z DNA, efektem czego może być powstawanie mutacji. Oznacza to, że RFT mają właściwości musą mitochondria. W skład antyoksydacyjnej maszynerii enzymatycznej wchodzą m.in.: dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), katalaza (CAT), peroksydaza glutationowa (GPx) oraz reduktaza glutationowa (GP) (NOWAK i współaut. 2010). Każdy z tych enzymów odgrywa znaczącą rolę w obronie organizmu przed szkodliwym działaniem wolnych rodników. Sprawne funkcjonowanie enzymów antyoksydacyjnych pomaga w utrzymaniu równowagi pro- i antyoksydacyjnej w przypadku chorób, w których następuje zwiększenie wytwarzania wolnych rodników (RAY i HUSA- IN 2001, GONENC i współaut. 2006, NOWAK i współaut. 2010). Jednak ochrona organizmu przed szkodliwym działaniem reaktywnych form tlenu i azotu nie odbywa się tylko i wyłącznie poprzez katalityczny ich rozkład. Zmiatanie w sposób nieenzymatyczny, wolnych rodników obejmuje również działanie substancji niskocząsteczkowych, nazywanych antyoksydantami. Do grupy tych związków zalicza się: glutation, witaminę A, C, E, bilirubinę, kwas moczowy, flawonoidy, karotenoidy, itp. (KULBACKA i współaut. 2009, GONENC i współaut. 2006, OLAS i współaut. 2010, ŚCI- BOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). W przeciągu ostatnich lat stres oksydacyjny i nitracyjny stał się przedmiotem wielu badań i dyskusji. Skupiano się na jego udziale w powstawaniu niektórych stanów patologicznych, w tym również nowotworów. W różnych stanach patologicznych stwierdzono m.in.: podwyższone stężenie produktów peroksydacji lipidów, zmiany w aktywności enzymów antyoksydacyjnych oraz stężeń fi- Ryc. 1. Wybrane przyczyny i skutki wzrostu poziomu RFT/RFA w komórkach nowotworowych (wg ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009).

18 Stres oksydacyjny w raku piersi 549 tagenne i są czynnikami rakotwórczymi. Poza tym, badania wykazują, że komórki nowotworowe przejawiają permanentną obecność stresu oksydacyjnego, na skutek wyraźnie obniżonej aktywności niektórych enzymów antyoksydacyjnych. Dlatego uważa się, że zjawisko stresu zajmuje poważne miejsce w etiologii nowotworów oraz w innych jednostkach chorobowych, takich jak: miażdżyca, choroba Alzheimera, Parkinsona, AIDS oraz wielu innych (PUNNONEN i współaut. 1994, ERTEN-SE- NER i współaut. 2007, KASAPOVIĆ i współaut. 2008, ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009, BADID i współaut. 2010). Wybrane przyczyny i skutki stresu oksydacyjnego w komórkach nowotworowych przedstawiono na Ryc. 1. STRES OKSYDACYJNY W RAKU PIERSI Według wielokrotnych badań nad różnymi nowotworami, w tym nad rakiem piersi wykazano, że jednym z czynników indukujących transformację nowotworową komórek jest wzmożona produkcja RFT/RFA. Do tej pory nie poznano do końca mechanizmów wytwarzania RFT/RFA w komórkach nowotworowych. Sugeruje się, że powstają one jako konsekwencja stanów zapalnych, działania cytokin, zaburzeń w przekazywaniu sygnałów onkogennych, aktywnego metabolizmu towarzyszącego nieustannej proliferacji oraz mutacji w mitochondrialnym DNA (mtdna) (CHANDRAMATHI i współaut. 2009, ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). Stres oksydacyjny jest nieodłącznym elementem nie tylko inicjacji, ale również progresji nowotworu. Wczesna faza nowotworu rozpoczyna się od uszkodzeń łańcucha DNA oraz zaburzeń w przebiegu procesów replikacji i transkrypcji. Już na tym etapie RFT/RFA mają udział jako czynniki mutagenne. Powodują one modyfikacje oksydacyjne zasad azotowych, których konsekwencją są mutacje punktowe w protoonkogenach i antyonkogenach. Geny te są m.in. odpowiedzialne za wzrost, podział, różnicowanie oraz adhezję komórek. Inicjacja karcynogenezy rozpoczyna się od aktywacji onkogenów oraz dezaktywacji genów supresorowych pod wpływem RFT/RFA (LIN JOANN i współaut. 2007, HIM- METOGLU i współaut. 2009, LAHIRI i MARTIN 2009). Pod wpływem wzrastającego stężenia RFT/RFA komórki mogą nabyć zdolność do transformacji nowotworowej lub dotychczasowe ich funkcje biologiczne są tak zmienione, że wchodzą one na drogę programowanej śmierci - apoptozy. Umiarkowany wzrost poziomu niektórych reaktywnych form tlenu i azotu może spowodować nasilenie procesów związanych ze wzrostem komórki oraz jej niekontrolowaną proliferacją, a tym samym przyczynić się do rozwoju nowotworu. Istotną rolę odgrywa H 2 O 2, którego wzmożoną produkcję zaobserwowano w komórkach nowotworowych. W zależności od jego stężenia w komórce uruchamiane są mechanizmy proliferacyjne albo procesy prowadzące do jej apoptozy. Jeśli stężenie nadtlenku wodoru znacznie wzrośnie (powyżej 3 μm) komórka wchodzi na drogę nekrozy. Tlenek azotu również uczestniczy w procesie nowotworzenia. Istnieją dowody sugerujące, że NO ma swój udział niemal na każdym etapie tego procesu. Reguluje on ekspresję metaloproteinaz (NMPs), enzymów odpowiedzialnych za degradację macierzy zewnątrzkomórkowej. Enzymy te wykazują wzmożoną aktywację w komórkach nowotworowych. RFA mogą brać udział nie tylko w procesie przerzutowania, ale również przyczyniają się do rozwoju nowotworu poprzez obniżenie odpowiedzi immunologicznej oraz indukcję angiogenezy. W wyniku stresu oksydacyjnego czy nitracyjnego w komórkach nowotworowych zwiększa się niestabilność genetyczna, co indukuje kolejne mutacje w genach supresorowych czy onkogenach. Prowadzi to do zezłośliwienia raka i tworzenia przerzutów. Wielokrotne badania w warunkach in vitro, jak i in vivo wskazują na podwyższony poziom różnych biomarkerów stresu oksydacyjnego i nitracyjnego u kobiet z rakiem piersi (MANNELLO i współaut. 2009; OLAS i współaut. 2008, 2010). Zaobserwowano m.in. wzrost oksydacyjnych uszkodzeń DNA (znacznie podwyższony poziom 8-oksyguaniny (8-oksy-dG) w DNA z tkanki nowotworowej w porównaniu ze zdrową tkanką) w nowotworze piersi (COOKE i współaut. 2006, HIMMETOGLU i współaut. 2006). Ponadto, u pacjentek ze złośliwym rakiem piersi obserwuje się zmiany poziomu m.in. grup karbonylowych, tiolowych czy 3-nitrotyrozyny w białkach płytkowych oraz osoczowych, w porównaniu do poziomu tych biomarkerów we frakcjach białkowych osocza czy płytek krwi kobiet zdrowych (KĘDZIERSKA i współaut. 2010b, 2012b). Zaobserwowano również róż-

19 550 MAGDALENA KĘDZIERSKA, BEATA OLAS nice w ich poziomie pomiędzy grupą kobiet ze złośliwą i łagodną formą nowotworu piersi (KĘDZIERSKA i współaut. 2010b). Oprócz modyfikacji białkowych w czasie permanentnego stresu dochodzi też do uszkodzeń lipidów m.in. do ich peroksydacji (PUNNONEN i współaut. 1994, GONENC i współaut. 2006, ERTEN-SENER i współaut. 2007, KASAPOVIĆ i współaut. 2008). Produktami tej wieloetapowej reakcji są np. dialdehyd malonowy (MDA) i 4-hydroksyheksanal (4-HHE), których nagromadzenie w komórce może powodować zmiany w strukturze błony komórkowej, zaburzeń jej płynności oraz integralności komórek (ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). RAJNEESH i współaut. (2006) oraz KĘ- DZIERSKA i współaut. (2010a) stwierdzają, że w przypadku nowotworu piersi dochodzi również do wzmożonej peroksydacji lipidów, co określano poprzez reakcję jej produktów z kwasem tiobarbiturowym. Innym markerem tego procesu są izoprostany powstające na skutek utleniania kwasu arachidonowego na drodze nieenzymatycznej. Uważa się, że oznaczanie ich stężenia w moczu w różnych stanach patologicznych, w tym u pacjentek z rakiem piersi jest bardziej specyficzną i wiarygodną metodą określenia poziomu peroksydacji lipidów (MANELLO i współaut. 2007, KĘDZIERSKA i współaut. 2010a). Badania KĘDZIERSKIEJ i współaut. (2010a) wykazały, że w moczu pacjentek z tym nowotworem następuje znaczny wzrost 8-isoPGF 2 (8-izoprostoglandyna-F 2 ) w stosunku do kobiet zdrowych. Podobnych obserwacji dokonał ROSSNER i współaut. (2006), który w swoich doświadczeniach oznaczał poziom innych izoprostanów, z tym, że ich wzrost wiązano z wcześniejszą terapią pacjentek, co mogło wpłynąć na wzmożoną peroksydację lipidów (ROSSNER i współaut. 2006). Inne badania przeprowadzone nad pacjentkami z rakiem piersi również potwierdzają obserwacje, dotyczące stresu oksydacyjnego jako nieodłącznego elementu tej choroby. Przejawia się to m.in. zmianami w aktywności enzymów antyoksydacyjnych w komórkach nowotworowych. Zaobserwowano zmniejszoną aktywność np. dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), a co za tym idzie anionorodnik ponadtlenkowy, który jest prekursorem pozostałych RFT jest usuwany z mniejszą szybkością. Komórki nowotworowe charakteryzują się też wzmożoną produkcją nadtlenku wodoru, co tłumaczyć może obniżoną aktywnością katalazy (PUNNONEN i współaut. 1994, ŚCIBOR- -BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). Na obniżenie całkowitego statusu antyoksydacyjnego u pacjentek z rakiem piersi wpływa również obniżenie stężenia nieenzymatycznych antyoksydantów w osoczu, takich jak witamina A, E, C czy glutationu (BADID i współaut. 2010, SHAH i współaut. 2009). Aktywność osoczowych enzymów antyoksydacyjnych np. peroksydazy glutationowej była także niższa u osób chorych na raka piersi niż w grupie kontrolnej (HIMMETOGLU i współaut. 2006). U pacjentek z rakiem piersi zaobserwowano też hiperhomocysteinemię ważny element rozwoju chorób układu krążenia (GATT i współaut. 2008, OLAS i współaut. 2010). Warto zauważyć, że oksydacyjno-nitracyjne modyfikacje białek płytek krwi obserwowane u kobiet z rakiem piersi mogą powodować zmianę ich struktury i funkcji hemostatycznych, tj. aktywacji. Ponadto, oksydacja i nitrowanie białek osoczowych w tym białek hemostatycznych może modulować ich aktywność hemostatyczną i przyczyniać się do rozwoju schorzeń zakrzepowo-zatorowych (KĘDZIERSKA i współaut. 2012b). SPOSOBY LECZENIA NOWOTWORÓW A STRES OKSYDACYJNY Nowotwory są chorobami, w których stosuje się kilka metod terapeutycznych. W zależności od wielu czynników w leczeniu można stosować jedną z metod, albo łączyć kilka, aby zwiększyć możliwość wyleczenia. W doborze odpowiedniego sposobu leczenia należy uwzględnić: miejsce, w którym nowotwór się rozwija, stopień jego zaawansowania klinicznego, stopień złośliwości, ewentualne przerzuty oraz inne czynniki. Współcześnie do najczęściej stosowanych sposobów leczenia chorób nowotworowych należą: leczenie chirurgiczne, chemioterapia, hormonoterapia, radioterapia i immunoterapia. Rak piersi należy do nowotworów, w których wykorzystywane jest leczenie skojarzone. Oznacza to bardzo często, że jedna metoda nie jest wystarczająca, dlatego kojarzy się kilka z nich w odpowiedniej kolejności. Terapia kobiet z rakiem piersi uwzględnia metody miejscowe, takie jak chirurgię oraz radio-

20 Stres oksydacyjny w raku piersi 551 terapię oraz metody ogólnoustrojowe czyli chemioterapię, hormonoterapię i metody biologiczne. Chirurgia jest najstarszą i najczęstszą metodą leczenia nowotworów, w tym raka piersi. W zależności od stopnia zaawansowania guza podczas operacji usuwa się całą pierś pacjentki albo tylko guza wraz z sąsiadującymi tkankami. Radioterapia jest też uzupełnieniem leczenia pooperacyjnego, ponieważ napromieniowanie zmniejsza prawdopodobieństwo nawrotu choroby oraz wydłuża czas przeżycia. Rak piersi jest dość specyficzny, ponieważ u większości chorych kobiet pomimo zastosowania radykalnego leczenia dochodzi do pojawienia się przerzutów. Dlatego też chorobę tą zaczęto traktować jako ogólnoustrojową i rozpoczęto stosowanie terapii systemowej, która polega na włączeniu chemio- i hormonoterapii. Chemioterapia jest sposobem leczenia polegającym na podawaniu leków cytostatycznych, czyli takich, które działają niszcząco na komórki lub pozbawiają je możliwości dzielenia się. Jest to ryzykowna forma terapii ze względu na to, że cytostatyki działają zarówno na komórki nowotworowe, jak i zdrowe, dlatego bardzo często ich stosowanie wiąże się z uszkodzeniem komórek prawidłowych. Ogólny mechanizm działania cytostatyków polega na hamowaniu podziałów komórkowych. Konsekwencją tego jest wprowadzenie komórki na drogę apoptozy. Sugeruje się też, że działanie leków antynowotworowych może polegać m.in. na zwiększeniu stresu oksydacyjnego oraz obniżeniu aktywności enzymów antyoksydacyjnych (ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). Stwierdzono, że cytotoksyczność jednej z grup leków przeciwnowotworowych, inhibitorów topoizomeraz, do których należą antybiotyki antracyklinowe, polega m.in. na generowaniu wolnych rodników oraz indukowaniu uszkodzeń oksydacyjnych. Inny cytostatyk, doksorubicyna (z grupy antracyklin), wzmaga powstawanie nadtlenku wodoru oraz anionorodnika ponadtlenkowego, co stymuluje uszkodzenia w mitochondriach i prowadzi do apoptozy na drodze p53-zależnej. Podobny mechanizm wykazuje trójtlenek arsenu, który wytwarza zwiększone ilości RFT i doprowadza do utraty przepuszczalności zewnętrznej błony w mitochondriach (ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). We współczesnej onkologii klinicznej ważną rolę w chemioterapii odgrywają związki platyny, a wśród nich najpowszechniej stosowana cisplatyna (cis-diamminodichloroplatyna II, cisddp) (OLAS i WA- CHOWICZ 1997, DONATI i FALANGA 2001). Tworzy ona określone addukty z DNA komórki. Badania przeprowadzone zarówno w warunkach in vitro, jak i in vivo, wykazały wysoką mutagenność tego leku. Mechanizm działania cisplatyny polega na zahamowaniu cyklu mitotycznego w fazie G 2 +M oraz nieodwracalnym przyłączeniu białek niehistonowych do DNA. Właściwości przeciwnowotworowe tego związku polegają na możliwości tworzenia wiązań wewnątrzniciowych między dwiema resztami guaniny (OLAS i WACHOWICZ 1997). Jednak ze względu na wiele działań ubocznych, takich jak: neurotoksyczność, niedokrwistość, leukopenia, cisddp jest stosowana w terapii nowotworów z ograniczeniami (OLAS i WACHOWICZ 1997). Wykazano również wpływ tego leku na zjawisko stresu oksydacyjnego. W płytkach krwi pod wpływem działania cisddp zwiększa się poziom anionorodnika ponadtlenkowego oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych zostaje w tym czasie zahamowana (OLAS i WACHO- WICZ 1997). Chemioterapii z zastosowanie cisddp towarzyszy też małopłytkowość, co przyczynia się do częstych krwotoków. Sugeruje się, że lek ten hamuje proces aktywacji płytek krwi (OLAS i WACHOWICZ 1997). Badania in vivo potwierdzają także dodatkową właściwość cisplatyny, jaką jest aktywacja makrofagów, które generują duże ilości tlenku azotu i w ten sposób hamują aktywację płytek krwi, prowadząc tym samym do zaburzeń hemostazy (OLAS i WACHOWICZ 1997, DONATI i FALANGA 2001). Nie tylko cytostatyki są przyczyną wzmożonego stresu oksydacyjnego w terapii przeciwnowotworowej. Radioterapia także jest źródłem wolnych rodników. Promieniowanie jonizujące jest czynnikiem wywołującym nadmierną produkcję RFT/ RFA w komórkach nowotworowych, co skutkuje nieodwracalnymi zmianami w strukturach komórkowych oraz wyczerpaniem mechanizmów obronnych. Jednak niepożądanym skutkiem radioterapii stosowanej w walce z rakiem jest działanie na komórki zdrowe, które otaczają guz, co powoduje, że w nich także dochodzi do nadmiernego gromadzenia się RFT/RFA (ŚCI- BOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009).

21 552 MAGDALENA KĘDZIERSKA, BEATA OLAS ROLA ANTYOKSYDANTÓW W PROFILAKTYCE I LECZENIU RAKA PIERSI Tematem wielu badań poświęconych leczeniu nowotworów jest stosowanie antyoksydantów w trakcie chemioterapii czy radioterapii, których zadaniem jest zwiększenie skuteczności działania cytostatyków poprzez obniżenie poziomu różnych biomarkerów stresu oksydacyjnego. Dlatego też zalecana jest dieta bogata w antyoksydanty m.in. u kobiet chorych na raka piersi, u których występuje obniżony poziom witaminy A, E czy związków selenu (SZOSZKIEWICZ i ZAŁU- SKI 2003, GREENLEE i współaut. 2007, ADAMO- WICZ i współaut. 2008, ŚCIBOR-BENTKOWSKA i CZECZOT 2009). Doniesienia naukowe wskazują, że selen jest pierwiastkiem mającym swój udział w terapii antynowotworowej, który może chronić przed szkodliwym działaniem różnych cytostatyków, w tym cisplatyny (OLAS i WACHOWICZ 1997). Uwagę na selen zwrócono ze względu na peroksydazę glutationową, która jest enzymem selenobiałkowym, mającym za zadanie ochronę organizmu przed szkodliwym działaniem wolnych rodników (OLAS i WACHOWICZ 1997). Ponadto badania w warunkach in vivo potwierdzają, że dieta bogata w selen zmniejsza częstość zachorowań na nowotwory. Mechanizm działania związków selenowych polega na działaniu na DNA komórek nowotworowych, stymulowaniu układu odpornościowego oraz zmianie stanu redoks w komórce. Funkcja antynowotworowa spełniana jest także poprzez hamowanie podziałów komórkowych przez blokowanie translacji. Wykazano również, że do terapii cisplatyną powinno się włączać organiczne związki selenu, np. ebselen, co zmniejsza jej nefro- i neurotoksyczność, nie wpływając na działanie antynowotworowe (OLAS i WACHOWICZ 1997). Oprócz tego, związki selenu mogą konkurować z cisddp o grupy tiolowe białek, a z glutationem tworzyć kompleks selenoglutation. Jest wówczas mniejsze prawdopodobieństwo powstania kompleksu cisplatyny z glutationem, który to kompleks jest bardziej toksyczny niż sama cisddp (OLAS i WACHOWICZ 1997). Zainteresowanie w ostatnich latach w profilaktyce nowotworów, np. raka piersi, i terapii antynowotworowej wzbudzają też związki polifenolowe roślinne metabolity wtórne. Dotychczas zidentyfikowano ponad 8 tysięcy związków polifenolowych, a ich dzienne zalecane spożycie szacuje się na poziomie 0,5 1 g. Obecność polifenoli stwier- dzono m. in. w warzywach, owocach, a także w kawie, herbacie czy kakao. Korzystne działanie związków polifenolowych w mechanizmie obronnym organizmu przeciwko m.in. nowotworom przypisuje się głównie ich właściwościom przeciwutleniającym. Zaobserwowano np., że dieta bogata w izoflawony (jedna z grup związków polifenolowych) zmniejsza ryzyko wystąpienia raka piersi (MALIŃSKA i KIERSZTAN 2004, SHARHAR i współaut. 2008). Badania na modelach zwierzęcych potwierdzają hamujący wpływ tych związków na powstawanie nowotworów, rozrost guza oraz przerzutowanie. Mechanizm ich działania poznano na podstawie badań na liniach komórkowych, w których stwierdzono, że hamują one proliferację komórek nowotworowych oraz mogą indukować ich apoptozę. Oprócz tego, związki polifenolowe okazują się być dobrą linią obrony przed stresem oksydacyjnym towarzyszącym chorobom nowotworowym. Wynika to z obecności w ich strukturze grup hydroksylowych, które reagują z wolnymi rodnikami, dając jako produkt rodnik mniej szkodliwy, a bardziej stabilny (MALIŃSKA i KIERSZTAN 2004). Związki polifenolowe neutralizują też procesy sprzyjające powstawaniu reaktywnych form tlenu i azotu poprzez hamowanie aktywności odpowiednich enzymów (MALIŃSKA i KIERSZTAN 2004). Badania OLAS i współaut. (2008) oraz KĘDZIERSKIEJ i współaut. (2009, 2010b) wykazują, że antyoksydacyjną funkcję u pacjentek z rakiem piersi może spełniać ekstrakt z owoców aronii (Aronia melanocarpa) bogaty w związki polifenolowe. Ekstrakt ten redukuje uszkodzenia oksydacyjne i nitracyjne oraz zmniejsza poziom anionorodnika ponadtlenkowego w płytkach krwi zarówno u kobiet zdrowych, jak i chorych na nowotwór piersi. Zaobserwowano również zwiększenie zawartości niskocząsteczkowych tioli, w tym glutationu w osoczu pacjentek z rakiem piersi w obecności ekstraktu z owoców aronii (OLAS i współaut. 2010, KĘDZIERSKA i współaut. 2012a). Należy także wspomnieć o chemoprewencyjnym (antykancerogennym), jak i przeciwnowotworowycm (cytostatycznym, proapoptotycznym) działaniu kurkuminy (polifenolu znajdującego się w różnych składnikach diety) w przypadku guzów piersi (KUT- TAN i współaut. 2007, SURH i CHUN 2007, WOLANIN i PIWOCKA 2008, SIKORA-POLACZEK i współaut. 2011).

22 Stres oksydacyjny w raku piersi 553 Dlatego też naukowcy sugerują, że dieta bogata w związki polifenolowe czy inne związki o aktywności antyoksydacyjnej może przyczyniać się do ograniczenia uszkodzeń oraz modyfikacji wywołanych stanem stresu oksydacyjnego. Ponadto dzięki dostarczaniu organizmowi egzogennych przeciwutleniaczy można zmniejszać ryzyko wystąpienia wielu chorób, w tym raka piersi (MALIŃSKA i KIERSZTAN 2004, TAS i HANSEL 2005). STRES OKSYDACYJNY W RAKU PIERSI STRESZCZENIE Stres oksydacyjny definiowany jest jako zachwianie równowagi pomiędzy powstawaniem (nadprodukcją) wolnych rodników, a zdolnościami indywidualnych mechanizmów obronnych. Produkcja wolnych rodników jest stałym elementem metabolizmu tlenowego komórki. Jest powszechnie wiadomo, że stres oksydacyjny wywołuje wiele stanów patologicznych i chorób. Stres oksydacyjny jest przyczyną uszkodzeń wielu ważnych makromolekuł, do których zaliczamy: DNA, białka i lipidy. Wzrost poziomu wolnych rodników wpływa też na transformację nowotworową komórki. Procesowi formowania i rozwojowi nowotworu towarzyszy zachwianie równowagi redox w komórce, nadprodukcja reaktywnych form tlenu i azotu. Obecnie rak piersi jest najczęstszym nowotworem złośliwym u kobiet w Polsce i na świecie. Biologia tego nowotworu i jego kliniczny obraz jest bardzo heterogenny. Stres oksydacyjny i zmia- ny oksydacyjno-nitracyjne są często obserwowane u chorych z rakiem piersi, ale nadal mechanizmy relacji między stresem oksydacyjnym czy nitracyjnym a rakiem piersi są niejasne. Stres oksydacyjny i nitracyjny obserwowany u pacjentów chorych na raka piersi może również indukować zmiany strukturalne i zmiany funkcji różnych elementów układu hemostazy. Organizm człowieka wyposażony jest w kilka sposobów ochrony przed atakiem oksydacyjnym. Mechanizmy obrony obejmują różne enzymy antyoksydacyjne, do których zaliczamy: peroksydazę glutationową, katalazę, dysmutazę ponadtlenkową i inne substancje, takie jak niskocząsteczkowe tiole: glutation, cysteinę, witaminę E, C i A, które eliminują wolne rodniki. Jest to bardzo istotne szczególnie dla chorych z rakiem piersi podczas chemioterapii wielolekowej, czy przed- lub pooperacyjnej radioterapii. OXIDATIVE STRESS IN BREAST CANCER Summary Oxidative stress may be defined as an imbalance between reactive oxygen species and the individual antioxidant defense system. Reactive oxygen species formation is a constant element of a cell s oxygen metabolism. It is now known that oxidative stress is involved in most of pathological states and diseases. Oxidative stress causes damage to important macromolecules, such as DNA, proteins, and lipids. Growing evidence indicates the participation of free radicals in the cancerous transformation of cells. The process of cancer formation and development is associated with loss of redox balance in the cell and with overproduction of reactive oxygen and nitrogen species. Actually breast cancer is the most common malignant neoplasm in women both in Poland and worldwide. It is biologically and clinically very heterogenous disease. Oxidative stress and oxidative-nitrative changes in the cells are frequently observed in breast cancer patients, but until now mechanisms involved in the relationship between oxidative stress and breast cancer are still unclear. Oxidative stress species may also induce changes to the structure and function in hemostatic elements. Human organisms have developed several ways to protect themselves from oxidant attacks. The defense mechanisms include a variety of antioxidant enzymes like glutathione peroxidase, catalase and superoxide dismutase and other substances such as low-molecular-weight thiols, such as glutathione, cysteine and vitamins E, C and A, which provide to eliminate free radicals are very important for the development of breast cancer and during multichemotherapy with different anti-cancer drugs or pre- and postoperative radiation therapy. LITERATURA ADAMOWICZ K., MARCZEWSKA M., JASSEM J., Kojarzenie radioterapii i chemioterapii u chorych na raka piersi. Onkologia Prakt. Klin. 4, BADID N., BABA A. F. Z., MERZOUK H., BELBRAOUET S., MOKHARTI N, MERZOUK S. A., BENHABIB R., HAMAZAOUI D., Oxidant/Antioxidant status, lipids and hormonal profile in overweight women with breast cancer. Pathol. Oncol. Res. 16, CHANDRAMATHI S., SURESH K., ANITA Z. B., KUPPUSAMY U. R., Comparative assessment of urinary oxidative indices in breast and colorectal cancer patients. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 135, COOKE M. S., OLINSKI R., EVANS M. D., Does measurement of oxidative damage to DNA have

23 554 MAGDALENA KĘDZIERSKA, BEATA OLAS clinical significance? Clin. Chim. Acta 365, DELIMARIS I., FAVIOU E., ANTONAKOS G., STATHOULOU E., ZACHARI A, DIOYSSIOU-ASERIOU A., Oxidized LDL, serum oxidizability and serum lipid levels in patients with breast and ovarian cancer. Clin. Biochem. 40, DONATI M. B., FALANGA A., Pathogenetic mechanisms of thrombosis in malignancy. Acta Haematol. 106, ERTEN-SENER D., GOENENC A., AKINCI M., AKINCI M., TORUN M., Lipid peroxidation and total antioxidant status in patients with breast cancer. Cell Biochem. Funct. 25, GATT A., MAKRIS A., CLADD H., BURCOMBE R. J., SMITH J. M., COOPER P., THOMSON D., MAKRIS M., Hyperhomocysteinemia in women with advanced breast cancer. Int. J. Lab. Hematol. 29, GONENC A., ERTEN D., ASLAN S., AKINCI M., SIMSEK B., TORUN M., Lipid peroxidation and antioxidant status in blood and tissue of malignant breast tumor and benign breast disease. Cell. Biol. Int. 30, GREENLEE H., HERSHMAN D. L., JACOBSON J. S., Use of antioxidant supplements during breast cancer treatment: a comprehensive review. Breast Cancer Res. Treat. 115, HAMO-MAHMOOD I., ABDULLAH K. S., ABDULLAH M. S., Total antioxidant status in women with breast cancer. Pak. J. Med. Sci. 4, HIMMETOGLU S., DINCER Y., ERSOY Y. E., BAYRAKTAR B., CELIK V., AKCAY T., DNA oxidation and antioxidant status in breast cancer. J. Invest. Med. 57, KASAPOVIĆ J., PEJIĆ S., TODOROVIĆ A., STOJILIJKOVIC V., PAJOVIC S. B., Antioxidant status and lipid peroxidation on the blood of breast cancer patients in different ages. Cell Biochem. Funct. 26, KĘDZIERSKA M., OLAS B., WACHOWICZ B., STOCHMAL A., OLESZEK W., JEZIORSKI A., PIEKARSKI J., GŁOWAC- KI R., An extract from berries of Aronia melanocarpa modulates the generation of superoxide anion radicals in blood platelets from breast cancer. Planta Med. 75, KĘDZIERSKA M., OLAS B., WACHOWICZ B., JEZIORSKI A., PIEKARSKI J., 2010a. The lipid peroxidation in breast cancer patients. Gen. Physiol. Biophys. 29, KĘDZIERSKA M., OLAS B., WACHOWICZ B., STOCHMAL A, OLESZEK W., JEZIORSKI A., PIEKARSKI J., 2010b. The nitrative and oxidative stress in blood platelets isolated from breast cancer patients; the protectory action of Aronia melanocarpa extract. Platelets 21, KĘDZIERSKA M., OLAS B., WACHOWICZ B., GŁOWACKI R., BALD E., CZERNEK U., SZYDŁOWSKA-PAZERA K., PO- TEMSKI P., PIEKARSKI J., JEZIORSKI A., 2012a. Effects of the commercial extract of aronia on oxidative stress in blood platelets isolated from breast cancer patients after the surgery and various phases of the chemotherapy. Fitoterapia 83, KĘDZIERSKA M., OLAS B., WACHOWICZ B., JEZIORSKI A., PIEKARSKI J., 2012b. Relationship between thiol, tyrosine nitration and carbonyl formation as biomarkers of oxidative stress and changes of hemostatic function of plasma isolated from breast cancer patients before surgery. Clin. Biochem. 45, KULBACKA J., SACZKO J., CHWIŁKOWSKA A Stres oksydacyjny w procesach uszkodzenia komórek. Polski Merkuriusz Lekarski 157, KUTTAN G., KUMAR K. B., GURUVAYOORAPPAN C., KU- TAN R., Antitumor, anti-invasion, and an- timetastatic effects of curcumin. Adv. Exp. Med. Biol. 595, LAHIRI M., MARTIN J. H. J., Nitric oxide decreases motility and increases adhesion in human breast cancer. Oncol. Rep. 21, LIN JOANN J., MANSON E., SELHUB J., BURING J. E., ZHANG S. M., Plasma cysteinoglycine levels and breast cancer risk in women. Cancer Res. 67, MALIŃSKA D., KIERSZTAN A., Flawonoidy- charakterystyka i znaczenie w terapii. Postępy Biochem. 50, MANELLO F., TONTI G. A. M., PAGLIARANI S., BENE- DETTI S., CANESTRARI F., ZHU W., QIN W., SAUTER E., The 8- epimer of prostaglandin F 2, a marker of lipid peroxidation and oxidative stress is decreased in the nipple aspirate fluid of women with breast cancer. Int. J. Cancer 120, MANNELLO F., TONTI G. A., MEDDA V., Protein oxidation in breast microenvironment: nipple aspirate fluid collected from breast cancer women contains increased protein carbonyl concentration. Cell. Oncol. 31, NOWAK P., OLAS B., WACHOWICZ B., Stres oksydacyjny w przebiegu hemostazy. Postępy Biochem. 3, OLAS B, WACHOWICZ B., Selen a cytotoksyczność cis- diamminodichloroplatyny. Postępy Hig. Med. Dośw. 51, OLAS B., WACHOWICZ B., Role of reactive nitrogen species in blood platelet functions. Platelets 18, OLAS B., WACHOWICZ B., NOWAK P., KĘDZIERSKA M., TOMCZAK A, STOCHMAL A, OLESZEK W., JEZIORSKI A., PIEKARSKI J., Studies on antioxidant properties of polyphenol-rich extract from berries of Aronia melanocarpa on blood platelets. J. Physiol. Pharmacol. 59, OLAS B., KĘDZIERSKA M., WACHOWICZ B., STOCHMAL A., OLESZEK W., JEZIORSKI J., PIEKARSKI J., GŁOWACKI R., Effect of aronia on thiol in plasma of breast cancer patients. Eur. J. Cell. Biol. 5, PUNNONEN K., AHOTUPA M., ASAISHI K., HYOTY M., KUDO R., PUNNONE R., Antioxidant enzyme activities and oxidative stress in human breast cancer. J. Cancer Res. Oncol. 120, RAJNEESH C. P., MANIMORAN A., SASIKALA K. R., ADAI- KAPPAN P., Lipid peroxidation and antioxidant status in patients with breast cancer. Singapore Med. J. 49, RAY G., HUSAIN S. A., Role of lipids, lipoproteins and vitamins in women with breast cancer. Clin. Biochem. 34, ROBERTS R. A., LASKIN D. L., SMITH C. V., ROBERTSON F. M., ALLEN E. M. G., DOOM J. A., SLIKKER W., Nitrative and oxidative stress in toxicology and diseases. Toxicol. Sci. 112, ROSSNER P., GAMMON M. D., TERRY M. B., AGRAWAL M., ZHANG F. F., TEITELBAUM S. L., ENG S. M., GAUDET M. M., NEUGUT A. I., SANTELLA R., Relationship between urinary 15-F 2t -isporostane and 8-oxodeoxyguanosine levels and breast cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 15, ŚCIBOR-BENTKOWSKA D., CZECZOT H., Komórki nowotworowe a stres oksydacyjny. Postępy Hig. Med. Dośw. 63, SHAH F. D., PATEL J. B., SHUKLA S. N., SHAH P. M., PA- TEL P. S., Evaluation of plasma non- enzymatic antioxidants in breast cancer etiology. Asian Pac. J. Cancer Prev. 10, SHARHAR S., NORMAH H., FATIMAH A., FADILAH R. N., ROHI G. A., AMIN I., CHAM B. G., RIZAL R. M., FAIR- ULNIZAL M. N., Antioxidant intake and

24 Stres oksydacyjny w raku piersi 555 status, and oxidative stress in relation to breast cancer risk: a case- control study. Asian Pac. J. Cancer Prev. 9, SIKORA-POLACZEK M., BIELAK-ŻMIJEWSKA A., SIKORA E., Molekularne i komórkowe mechanizmy działania kurkuminy dobroczynny wpływ na organizm. Postępy Biochem. 57, SURH Y. J., CHUN K. S., Cancer chemopreventive effects of curcumin. Exp. Med. Biol. 595, SZOSZKIEWICZ R., ZAŁUSKI J., Analiza skuteczności chemioterapii neoadjuwantowej zawierającej docetaxel w skojarzeniu z doksorubicyną u chorych z miejscowo zaawansowanym rakiem piersi. Współcz. Onkol. 7, TAS F., HANSEL H., Oxidative stress in breast cancer. Med. Oncol. 22, WOLANIN K., PIWOCKA K., Kurkumina od medycyny naturalnej do kliniki. Kosmos 57, ZAREMBA T., OLIŃSKI R., Oksydacyjne uszkodzenia DNA ich analiza oraz znaczenie kliniczne. Postępy Biochem. 2,

25

26 Tom Numer 4 (297) Strony BARTŁOMIEJ MATEJKO Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum Katedra i Klinika Chorób Metabolicznych Kopernika 15, Kraków b.matejko@yahoo.com TERAPIA OSOBISTĄ POMPĄ INSULINOWĄ U KOBIET W CIĄŻY CHORUJĄCYCH NA CUKRZYCĘ TYPU 1 WPROWADZENIE W XXI w. obserwujemy epidemie chorób cywilizacyjnych takich jak choroba wieńcowa, nadciśnienie, otyłość czy cukrzyca. Ta ostatnia dotyka już niemal 300 mln dorosłych na całym świecie i liczba ta stale wzrasta, zwłaszcza wśród osób w młodym wieku (GARDNER i współaut. 1997, YACH i współaut. 2006). Cukrzyca to grupa chorób metabolicznych charakteryzujących się zmniejszeniem tolerancji glukozy, wynikająca z defektu wydzielania i/lub działania insuliny (WHO 1999). W czasie ciąży jest ona najczęstszym powikłaniem metabolicznym. Cukrzyca może występować u kobie- ty przed ciążą w postaci cukrzycy typu 1 (ang. type 1 diabetes mellitus, T1DM) lub 2 (T2DM) oraz jako cukrzyca ciążowa, rozpoznana w czasie ciąży (ang. gestational diabetes mellitus, GDM). W zależności od kryteriów diagnostycznych stwierdzono, że cukrzyca ciążowa dotyka od 1,3% do 19,9% wszystkich ciąż (SIMMONS 2010). W Polsce natomiast dotyczy ona 3,4% kobiet w ciąży (WÓJCIKOWSKI 2004). W GDM leczenie rozpoczyna się dietą, dopiero w sytuacji braku jej skuteczności wprowadza się leczenie insuliną. WPŁYW CUKRZYCY NA WYNIK PORODU Ciąża powikłana cukrzycą typu 1 stanowi ciążę wysokiego ryzyka zarówno dla matki, jak i płodu (SHEFFIELD i współaut. 2002). Jej znaczenie należy rozpatrywać w kilku aspektach: wpływu hiperglikemii na przebieg ciąży, rozwój płodu oraz progresji powikłań cukrzycy u matki z T1DM. Wynik położniczy uzależniony jest od występującego wyrównania metabolicznego w okresie zarówno przed, jak i w trakcie ciąży. Hiperglikemia w okresie przed koncepcyjnym zwiększa ryzyko poronień, w I trymestrze zwiększa ryzyko wystąpienia wad wrodzonych dziecka, a w dalszych trymestrach wpływa na ryzyko przedwczesnego porodu i wystąpienia powikłań okołoporodowych (GARNER 1995, BALAJI i SESHIAH 2011). Tymi powikłaniami może być makrosomia, która jest silnie powiązana z częstszą śmiercią płodu, uraz porodowy czy zespół niewydolności oddechowej (YESSOUFOU i MOUTAIRO 2011).

27 558 BARTŁOMIEJ MATEJKO METODY LECZENIA Osiągnięcie normoglikemii przed ciążą i w jej trakcie jest głównym celem leczenia cukrzycy. Cukrzyca typu 1 spowodowana jest głównie przez autodestrukcję immunologiczną komórek trzustki (KORZENIOWSKA i JA- BŁECKA 2008), charakteryzuje się bezwzględnym niedoborem insuliny i koniecznością stałego podawania tego hormonu z zewnątrz. Leczenie insuliną może być prowadzone w sposób zachowawczy z utrzymaniem relatywnie stałych dawek insuliny, powtarzalnego trybu dnia, powtarzalnego wysiłku fizycznego. Nowocześniejszym podejście do leczenia cukrzycy typu 1 jest tak zwana funkcjonalna insulinoterapia, gdzie każdorazowo dawka insuliny uzależniona jest od wyjściowej glikemii, wielkości i kompozycji posiłku, przewidywanego wysiłku fizycznego itp. Funkcjonalna insulinoterapia może być realizowana za pomocą wielokrotnych wstrzyknięć insuliny przy użyciu wstrzykiwaczy piórowych (ang. multiple daily injection, MDI) lub za pomocą osobistej pompy insulinowej (ang. continuous subcutaneous insulin infusion, CSII) (HARTEMANN-HEURTIER i współaut. 2003). OSOBISTA POMPA INSULINOWA Pompa insulinowa to urządzenie wynalezione blisko 40 lat temu, wielkości telefonu komórkowego, które w sposób ciągły za pomocą zestawu infuzyjnego podaje podskórnie insulinę (PICKUP i KEEN 2002). Terapia za jej pomocą umożliwia bardziej fizjologiczny sposób dostarczania insuliny w dążeniu do naśladowania podstawowego (baza) i okołoposiłkowego wydzielania insuliny (bolusy) (PHILLIP 2007). W licznych badaniach klinicznych w T1DM wykazano wyższą skuteczność CSII niż MDI w osiągnięciu normalizacji glikemii i obniżeniu poziomu hemoglobiny glikowanej (DCCT 1993, PICKUP i współaut. 2002, JEITLER i współaut. 2008, PICKUP i SUTTON 2008, BRUTTOMESSO i współaut. 2009) lub porównywalną skuteczność przy zmniejszonym zapotrzebowaniu na insulinę i mniejszej liczbie przypadków ciężkiej hipoglikemii (JAKISCH 2008). Metaanalizy badań klinicznych dowodzą skuteczności terapii pompowej u osób z chwiejnym przebiegiem cukrzycy, z częstymi nieuświadomionymi hipoglikemiami, małym dobowym zapotrzebowaniem na insulinę oraz z nieregularnym trybem życia (WEISSBERG-BENCHELL i współaut. 2003, NIMRI i współaut. 2006, WITTLIN i współaut. 2008). Stosowanie terapii pompowej ma również swoje ograniczenia. Mogą ją stosować osoby tylko wysoce zmotywowane, często kontrolujące poziom glikemii we krwi, które są osobami dobrze wyedukowanymi w zakresie cukrzycy i zdolnymi intelektualnie do technicznej obsługi pompy oraz zrozumienia zasady jej działania (PRAŠEK i współaut. 2003). Współczesne pompy insulinowe pozwalają nie tylko na zaprogramowanie podstawowego, bazalnego wlewu insuliny, bolusów posiłkowych i korekcyjnych, okresowe wstrzymywanie pracy pompy, czasowej zmiany wlewu bazalnego, ale także dodatkowo dają możliwość zaprogramowania bolusów złożonych (w sytuacji posiłków bogatych w białko i tłuszcz) oraz zawierają narzędzia ułatwiające szacowanie dawki insuliny potrzebnej na zmetabolizowanie posiłku oraz na korektę hiperglikemii (kalkulator bolusa, KB). Terapia za pomocą osobistej pompy insulinowej podlega ciągłemu rozwojowi i ewolucji, jedną z nowych opcji technologicznych jest powiązanie CSII z ciągłym monitorowaniem glikemii (ang. continuous glucose monitoring, CGMS). CGMS pozwala na monitorowanie poziomu glikemii w czasie rzeczywistym (pomiar co 5 minut przez całą dobę) wraz z możliwością zaprogramowania opcji różnych alarmów i obserwacją trendów zmian glikemii (GARG 2008). Wszystkie dane dotyczące wykorzystania narzędzi pompy oraz funkcji CGMS zapisywane są w pamięci urządzenia co umożliwia ich późniejszą analizę po przesłaniu do odpowiedniego programu komputerowego (HIRSCH i współaut. 2008, MATEJKO 2011a).

28 Terapia osobistą pompą insulinową u kobiet w ciąży chorujących na cukrzycę typu TERAPIA OSOBISTĄ POMPĄ INSULINOWĄ LECZENIEM Z WYBORU? W czasie ciąży dochodzi do istotnych zmian metabolicznych i hormonalnych, w wyniku których, szczególnie w drugiej połowie ciąży, pojawiają się insulinooporność i zwiększone zapotrzebowanie na insulinę. W III trymestrze ciąży zapotrzebowanie na insulinę jest nawet 100% wyższe niż w okresie poprzedzającym ciążę (WÓJCIKOWSKI 2004). Uważa się, że wzrost insulinooporności i zaburzenia wydzielania insuliny może u części kobiet w ciąży prowadzić do wzrostu stężenia glukozy we krwi. Po ciąży zapotrzebowanie na insulinę ulega zmniejszeniu i następuje wyrównanie glikemii (WÓJCIKOWSKI 2004). Współczesna opieka diabetologiczna w okresie przed ciążą oraz w czasie ciąży wpływa na zmniejszenie umieralności okołoporodowej matek chorych na cukrzycę typu 1, która jest obecnie zbliżona do obserwowanej w populacji ogólnej oraz spowodowała, że ciąża nie skraca ich oczekiwanego czasu przeżycia (BUHLING 2005). Zastosowanie terapii CSII u pacjentek w ciąży pomaga potencjalnie w łatwiejszym dawkowaniu insuliny przy porannych nudnościach i niepowstrzymanych wy- miotach ciężarnych, dużych wahaniach glikemii oraz epizodach hipoglikemii, zjawisku hiperglikemii o brzasku. Badania wykazują, że CSII pomaga lepiej kontrolować glikemię w okresie okołoporodowym, kiedy charakterystyczne są wahania zapotrzebowania na insulinę (KITZMILLER i współaut. 2008). W Polsce ten rodzaj terapii staje się coraz popularniejszy, a wprowadzona w 2011 r. NFZ refundacja na wkłucia dla osób chorych na cukrzycę do 26 roku życia przyczyni się do jeszcze większego jej upowszechnienia. Z zakupem pomp insulinowych związana jest działalność Wielkiej Orkiestry Świątecznej Pomocy (WOŚP), która od 2001 r. wspiera tę inicjatywę. Od początku działalności WOŚP zakupiła ponad 3000 pomp insulinowych, w tym 290 dla kobiet ciężarnych. W 2011 r. po raz pierwszy Fundacja zakupiła sprzęt umożliwiający ciągłe monitorowanie glikemii u matek podczas ciąży i w czasie porodu. W 2012 r. ponownie jej głównym celem była pomoc w zakupie pomp insulinowych dla przyszłych matek (WOŚP 2012, patrz MATEJKO 2011b). WNIOSKI Z uwagi na zalety terapii pompowej logicznym jest więc zastosowanie terapii pompą insulinową u pacjentek w ciąży powikłanej cukrzycą, kiedy szczególnie istotne staje się idealne wyrównanie metaboliczne. Warunkiem stosowania pompy insulinowej jest wysoki i ciągle podnoszony poziom wyszkolenia pacjentek oraz ciągły kontakt z ośrodkiem diabetologicznym prowadzącym terapię. Uznaje się, że ta metoda jest polecana każdemu choremu, który akceptuje ten rodzaj terapii. Ostatnie doniesienie wykazało, że jest ona równie efektywna i bezpieczna u osób młodych, jak i starszych (MATEJKO i współaut. 2011). PODSUMOWANIE Problem cukrzycy ciążowej ma obecnie wymiar społeczny, dlatego tak istotne jest wdrożenie programu właściwego prowadzenia ciąży powikłanej zaburzeniami tolerancji glukozy oraz opieki nad kobietą po ciąży. Jedną z najlepszych i polecanych obecnie metod leczenia pacjentek z cukrzycą typu 1 będących w ciąży jest terapia za pomocą osobistych pomp insulinowych.

29 560 BARTŁOMIEJ MATEJKO TERAPIA OSOBISTĄ POMPĄ INSULINOWĄ U KOBIET W CIĄŻY CHORUJĄCYCH NA CUKRZYCĘ TYPU 1 Streszczenie Dwie główne metody terapii są używane do osiągnięcia docelowego wyrównania metabolicznego u kobiet w ciąży z cukrzycą typu 1: leczenie za pomocą osobistej pompy insulinowej lub za pomocą wielokrotnych wstrzyknięć insuliny. Podawanie insuliny za pomocą pompy jest metodą bardziej fizjologiczną i precyzyjną niż podawanie jej za pomocą strzykawki czy penów insulinowych. Celem intensywnego leczenia insuliną podczas planowania ciąży jak i w jej trakcie jest osiągnięcie normoglikemii. Osiąganie optymalnych wartości glikemii redukuje ryzyko powikłań w czasie ciąży. Terapia osobistą pompą insulinową pomaga osiągać bardzo dobre wyniki leczenia. Studia kliniczne wykazały, że leczenie osobistą pompą insulinową jest szczególnie przydatne u osób z niestabilną cukrzycą, z nieuświadomionymi hipoglikemiami, u których występuje objaw brzasku, posiadających bardzo małą dobową dawkę insuliny lub prowadzących nieregularny tryb życia. Głównymi zaletami leczenia osobistą pompą insulinową są: możliwość indywidualizacji ustawień urządzenia oraz możliwość elastycznego modyfikowanie wlewu bazalnego i bolusów, co pozwala zredukować ryzyko ciężkich hipoglikemii. INSULIN PUMP THERAPY DURING PREGNANCY IN TYPE 1 DIABETES Summary Two regimens are used to achieve excellent glycemic control during pregnancy in type 1 diabetes mellitus (T1DM): continuous subcutaneous insulin infusion (CSII) and multiple daily injections (MDI). An insulin delivery via pump is more consistent and precise than a delivery by syringe or injection pen. The purpose of intensive insulin therapy during pregnancy planning and after conception is to achieve the target level of normoglycemia. Achiving normoglicemia can decrease the risk of unfavorable pregnancy outcomes. CSII therapy model may provide excellent glycemic control. Clinical studies have proven that pump therapy was especially effective in individuals with unstable diabetes, dawn phenomenon, hypoglycemia unawareness, and small daily insulin requirement or in those who lead an irregular lifestyle. The main benefit from insulin pump therapy is customized, flexible basal and bolus dosing to meet patients individual insulin requirements while reducing the risk of severe hypoglycemia. LITERATURA BALAJI V., SESHIAH V., Management of diabetes in pregnancy. J. Assoc. Physicians India 59 (Suppl.), BRUTTOMESSO D., COSTA S., BARITUSSIO A., Continuous subcutaneous insulin infusion (CSII) 30 years later: still the best option for insulin therapy. Diabetes-Metab Res. 25, BUHLING K., WINKE T., WOLF C., KURZIDIMB., MAHMO- UDI M., WOHLFARTH K., WASCHER C., SCHINK T., DUDENHAUSEN J., Optimal timing for postprandial glucose measurement in pregnant women with diabetes and a non-diabetic pregnant population evaluated by the Continuous Glucose Monitoring System (CGMS). J. Piernat. Med. 33, DCCT (Diabetes Control and Complications Trial), The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long- -term complications in insulin dependent diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 329, GARDNER S. G., BINGLEY P. J., SAWTELL P. A., WEEKS S., GALE E. A., Rising incidence of insulin dependent diabetes in children aged under 5 years in the Oxford region: time trend analysis. BMJ 315, GARG S. K., 2008.Glucose monitoring: an important tool for improving glucose control and reducing hypoglycemia. Diabet. Technol. Therapeut. 10, S1 S4. GARNER P., Type 1 diabetes mellitus and pregnancy. Lancet 346, HARTEMANN-HEURTIER A., SACHON C., MASSEBOEUF N., CORSET E., GRIMALDI A., Functional intensified insulin therapy with short-acting insulin analog: effects on HbA1c and frequency of severe hypoglycemia. An observational cohort study. Diabet. Metabol. 29, HIRSCH I. B., ARMSTRONG D., BERGENSTAL R. M., BUC- KINGHAM B., CHILDS B. P., CLARKE W. L., PRTERS A., WOLPERT H., Clinical application of emerging sensor technologies in diabetes management: consensus guidelines for continuous glucose monitoring (CGM). Diabet. Technol. Therapeut. 10, JAKISCH B. I., WAGNER V. M., HEIDTMANN B., LEPLER R., HOLTERHUS P. -M., KAPELLEN T. M., Comparison of continuous subcutaneous insulin infusion (CSII) and multiple daily injections (MDI) in paediatric Type 1 diabetes: a multicentre matched-pair cohort analysis over 3 years. Diabet. Med. 25, JEITLER K., HORVATH K., BERGHOLD A., GRATZER T. W., NEESER K., PIEBER T. R., Continuous subcutaneous insulin infusion versus multiple daily insulin injections in patients with diabetes mellitus: systematic review and meta-analysis. Diabetologia 51, KITZMILLER J., BLOCK J., BROWN F., CATALANO P., CON- WAY D., COUSTAN D., GUNDERSON E., HERMAN W., HOFFMAN L., INTURRISI M., JOVANOVIC L., KJOS S., KNOPP R., MONTORO M., OGATA E., PARAMSOTHY P., READER D., ROSENN B., THOMAS A., KIRKMAN S., Managing pre-existing diabetes for

30 Terapia osobistą pompą insulinową u kobiet w ciąży chorujących na cukrzycę typu pregnancy. Summary of evidence and consensus recommendations for care. Diabet. Care 31, KORZENIOWSKA K., JABŁECKA A., Cukrzyca (Część I i II). Farmacja Współczesna 1, MATEJKO B., 2011a. Analiza danych generowanych ze sczytanej pompy insulinowej z wykorzystaniem środowiska programistycznego LabVIEW. Praca dyplomowa. AGH. MATEJKO B., 2011b. Nowoczesne technologie w leczeniu cukrzycy typu 1. Zeszyty Naukowe Towarzystwa Doktorantów UJ 3, MATEJKO B, CYGANEK K., KATRA B., GALICKA-LATALA D., GRZANKA M., MALECKI M.T., KLUPA T., Insulin Pump Therapy is Equally Effective and Safe in Elderly and Young Type 1 Diabetes Patients. Rev. Diabeł. Stud. 8, NIMRI R., WEINTROB N., BENZAQUEN H., OFAN R., FAY- MAN G., PHILLIP M., Insulin Pump Therapy in Youth With Type 1 Diabetes: A Retrospective Paired Study. Pediatrics 117, PHILLIP M., BATTELINO T., RODRIGUEZ H., DANNE T., KAUFMAN F., Use of insulin pump therapy in the pediatric age-group: consensus statement from the European Society for Paediatric Endocrinology, the Lawson Wilkins Pediatric Endocrine Society, and the International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes, endors. Diabet. care 30, PICKUP J., KEEN H., Continuous subcutaneous insulin infusion at 25 years: evidence base for the expanding use of insulin pump therapy in type 1 diabetes. Diabet. Care 25, PICKUP J., SUTTON A. J., Severe hypoglycaemia and glycaemic control in Type 1 diabetes: meta-analysis of multiple daily insulin injections compared with continuous subcutaneous insulin infusion. Diabet. med. 25, PICKUP J., MATTOCK M., KERRY S., Glycaemic control with continuous subcutaneous insulin infusion compared with intensive insulin injec- tions in patients with type 1 diabetes: meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ 324, 1 6. PRAŠEK M., BO T., Continuous Subcutaneous Insulin Infusion (CSII). Diabetol. Croatica 2, SHEFFIELD J., BUTLER-KOSTER E., CASEY B., MCINTIRE D., LEVENO K., Maternal diabetes mellitus and infant mallformations. Obster Gynecol. 11, SIMMONS D., Epidemiologic context of diabetes in pregnancy. [W:] A practical manual of diabetes in pregnancy. MCCANCE D., MARESH M. (red.). Blackwell Publishing, London, WEISSBERG-BENCHELL J., ANTISDEL-LOMAGLIO J., SESHADRI R., Insulin pump therapy: a meta-analysis. Diabet. Care 26, WHO, Report of a WHO Consultation, Definition, Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus and its Complications, Geneva. WITTLIN S., MARCUS A., WENG W., HOWARD C., SCHORR A., The Control Study Group: Evaluation of Treatment Satisfaction Associated with the Use of Insulin Aspart in Continuous Subcutaneous Insulin Infusion. Diabet. Tech. Therapeut. 10, WOŚP (Wielka Orkiestra Świątecznej Pomocy), [ ]. WÓJCIKOWSKI C., Rozwój zaburzeń tolerancji węglowodanów po ciąży powikłanej cukrzycą ciążową. Diabetologia Praktyczna 5, YACH D., STUCKLER D., BROWNELL K. D., Epidemiologic and economic consequences of the global epidemics of obesity and diabetes. Nat. med. 12, YESSOUFOU A., MOUTAIRO K., Maternal Diabetes in Pregnancy: Early and Long-Term Outcomes on the Offspring and the Concept of Metabolic Memory. Exp. Diabet. Res. doi: /2011/

31

32 Tom Numer 4 (297) Strony ANNA SULIKOWSKA-DROZD Katedra Zoologii Bezkręgowców i Hydrobiologii Uniwersytet Łódzki Banacha 12/16, Łódź sulik@biol.uni.lodz.pl EWOLUCJA STRATEGII ROZRODCZYCH BEZKRĘGOWCÓW ŻYWORODNOŚĆ I PRZETRZYMYWANIE JAJ Żyworodność i przetrzymywanie jaj to strategie rozrodu związane z wysoką inwestycją w każdy z organizmów potomnych. Można je traktować jako jeden z typów szeroko rozumianej opieki nad potomstwem, obejmującej według CLUTTON-BROCKA (1991) zarówno przygotowanie nor i gniazd, wytwarzanie dużych jaj zawierających znaczną ilość materiałów zapasowych, opiekę nad jajami wewnątrz lub na zewnątrz ciała, dostarczanie pokarmu młodym przed i po urodzeniu, jak i zapewnienie bezpieczeństwa potomstwu, niezależnemu pod względem pokarmowym. Strategia rozrodu polegająca na inkubacji rozwijających się zarodków wewnątrz ciała samicy zwiększa szanse przeżycia potomstwa, ale ze względu na ograniczone zasoby energii, które mogą być przeznaczone na funkcje rozrodcze, doprowadza do ograniczenia liczby produkowanych młodych (ROFF 1992). U zwierząt żyworodnych obok niższej płodności, w porównaniu z pokrewnymi gatunkami jajorodnymi, można oczekiwać spadku przeżywalności ciężarnych samic. A zatem strategia opieki nad jajami lub młodymi wewnątrz ciała rodzica zwiększa jego dostosowanie tylko w sytuacji, kiedy pozbawione opieki na najwcześniejszym etapie roz- WSTĘP woju młode mają nikłe szanse na osiągnięcie dojrzałości i wydanie potomstwa. Żyworodność i przetrzymywanie jaj wyewoluowały wielokrotnie w świecie zwierząt, w tym ponad 140 razy u kręgowców. Na podstawie badań gadów łuskonośnych (Squamata), wysunięto przypuszczalnie, że zatrzymanie rozwijających się jaj wewnątrz ciała samicy było adaptacją do zimnego klimatu (BLACKBURN 2006). Także w większości grup zwierząt bezkręgowych znane są przynajmniej pojedyncze gatunki, które odniosły sukces ewolucyjny inkubując młode w swoim ciele (CLUTTON-BROCK 1991, MCGHEE 2011) (Tabela 1). Ze względu na różnorodność taksonomiczną i ekologiczną bezkręgowców, a także z powodu nieporównanie słabszego poznania biologii tych zwierząt, wielokrotne i niezależne powstanie szeroko rozumianej żyworodności i jej adaptacyjne znaczenie nie jest dostatecznie wyjaśnione. Poniżej przedstawiono wybrane przykłady strategii rozrodczych stawonogów, mięczaków i szkarłupni chroniących jaja bądź młode wewnątrz ciała oraz spotykane w literaturze interpretacje dotyczące czynników selekcyjnych odpowiedzialnych za ewolucję żyworodności i przetrzymywania jaj w tych grupach zwierząt. ZRÓŻNICOWANIE ZJAWISKA ŻYWORODNOŚCI Terminologia dotycząca zjawiska przetrzymywania jaj bądź embrionów w ciele rodzica jest niejednoznaczna. W dotychczasowych podziałach często stosowanym kryterium było miejsce wylęgu młodych (wewnątrz rodzica bądź już po złożeniu jaj) (BLACKBURN 1994). Nowy podręcznik zoologii pod redakcją BŁASZAKA (2011) definiuje żyworodność

33 564 ANNA SULIKOWSKA-DROZD Tabela 1. Grupy zwierząt bezkręgowych, u których występuje żyworodność lub przetrzymywanie jaj. Grupa zwierząt Opieka nad potomstwem* Miejsce inkubacji jaj/młodych Przykłady Parzydełkowce Cnidaria ++ jama gastro-waskularna, kieszenie żołądka, płaty gębowe; komory lęgowe w parasolu Stygiomedusa fabulosa Actinia equina Płazińce Platyhelminthes ++ jajowód Gyrodactylus fairporti Nereis limnicola Pierścienice Annelida ++ celoma; rozszerzenia nefrydiów; komora lęgowa na zewnątrz ciała Pygospio elegans Ślimaki Gastropoda ++ jajowód; jama płaszczowa; torba lęgowa w nodze Viviparus viviparus Małże Bivalvia ++ skrzela Sphaerium corneum Głowonogi Cephalopoda + jajowód Ocythoe tuberculata Rozgwiazdy Asteroidea ++ gonady, przestrzeń między tarczą centralną a ramionami, między papillami na stronie aboralnej Parvulastra vivipara Asterias groenlandica Amphiura carchara Wężowidła Ophiuroidea ++ zagłębienia na stronie oralnej tarczy centralnej Ophionotus hexactis Strzykwy Holoturoidea ++ Jeżowce Echinoidea ++ gonady; interradialne zagłębienia zewnętrznej ściany ciała (marsupia); celoma zagłębienia ściany ciała przy otworze gębowym, odbycie lub rejonie petaloidu Cucumaria georgiana Abatus shackletoni Liliowce Crinoidea ++ jajniki; marsupia w ramionach i u podstawy pinnuli Amphipholus squamata Skorpiony Scorpionoidea +++ uchyłki macicy (diverticula) Euscorpius carpathicus Roztocza Acari ++ jajowód; jama ciała Astigmata, mechowce Oribatida Zaleszczotki Pseudoscorpionidea ++ worek lęgowy przyczepiony do ciała samicy Chelifer cancroides Skrzelonogi Branchiopoda +++ komora lęgowa pod pancerzem Daphnia magna Widłonogi Copepoda +++ worki jajowe przyczepione do ciała Cyclops strenuus Małżoraczki Ostracoda ++ komora lęgowa pod pancerzem Darwinula stevensoni Pancerzowce Malacostraca ++ komora lęgowa pod pancerzem lub między wyrostkami odnóży Oniscus asellus Muchówki Diptera ++ jajowód Glossina palpalis Pluskwiaki Homoptera ++ jajowód Lecanium hesperidium

34 Ewolucja strategii rozrodczych bezkręgowców żyworodność i przetrzymywanie jaj 565 Karaczany Blattodea ++ kokony jajowe przyczepione do odwłoka; jajowód Diploptera punctata Jętki Ephemeroptera + jajowód Cloeon dipterum Widelnice Plecoptera + jajowód Capnia bifrons Chrząszcze Coleoptera ++ jajowód Chrysomela varians Gryzki Psocoptera + jajowód Archipsocus parvulus Motyle Lepidoptera + jajowód Tinea vivipara Wachlarzoskrzydłe Strepsiptera ++ jama ciała Stylops melittae Skorki Dermaptera + jajowód Hemimerus talpoides *+++opieka nad potomstwem dominuje; ++występuje często; +występuje bardzo rzadko jako rodzaj reprodukcji polegający na tym, że zapłodnione komórki jajowe pozostają w obrębie układu rozrodczego samicy i rozwój zarodkowy przebiega w jej organizmie. W przypadku odżywiania zarodka przez organizm matki, czyli matrotrofii, wyróżniono łożyskowce (przekazywanie substancji odżywianie przy pomocy łożyska), żyworodność adenotroficzną (za pomocą struktur podobnych do łożyska) lub żyworodność hemoceliczną, inaczej aparię (rozwój kosztem hemocelu i narządów wewnętrznych organizmu matczynego). Znanym przykładem żyworodnych bezkręgowców są skorpiony, których zarodki rozwijają się w rozgałęzieniach macicy, zrastających się z uchyłkami jelita i tworzącymi powierzchnię absorpcyjną, analogiczną do łożyska (WARBURG 2010). Kolejnym typem rozrodu jest żyworodność lecytotroficzna (=jajożyworodność) polegająca na inkubacji jaj wewnątrz organizmu rodzicielskiego aż do zakończenia rozwoju zarodkowego, ale zarodki odżywiają się tylko żółtkiem zawartym w jaju. W przypadku ślimaków lądowych operuje się terminem retencja jaj dla określenia przetrzymywania zarodków w jajowodzie przez pewien czas, zwykle krótszy niż całkowity rozwój embrionalny (TOMPA 1979, BAUR 1994). Po okresie wewnętrznej inkubacji jaj ślimaki składają je do gleby, mchu, w szczeliny skalne, gdzie następuje dalszy rozwój embrionalny aż do wylęgu. U niektórych gatunków retencja jaj może zachodzić fakultatywnie, w zależności od panujących warunków atmosferycznych, np. u rozmnażającego się cały rok tropikalnego ślimaka Limicolaria martensiana (Achatinidae) wewnętrzna inkubacja jaj ograniczona jest do pory suchej, podczas gdy w porze deszczowej jaja są składane wkrótce po uformowaniu (OWINY 1974). W entomologii zawęża się znaczenie terminu żyworodność adenotroficzna do sytuacji, w której larwa karmiona jest wydzieliną wytwarzaną przez samicę i wyróżnia dodatkowo żyworodność pseudołożyskową, kiedy embrion otrzymuje pożywienie przez specjalnie uformowaną strukturę (tzw. pseudołożysko) (KLOWDEN 2007). U muchówek w obrębie gatunków żyworodnych wyróżnia się formy o strategii określanej jako larworodność oraz poczwarkorodność (MEIER i współaut. 1999). W pierwszym przypadku inkubacja jaj odbywa się w pochwie i tam wylęgają się larwy. Poczwarkorodność, czyli formowanie poczwarki jeszcze w drogach rodnych samicy,

35 566 ANNA SULIKOWSKA-DROZD występuje tylko u pasożytujących na nietoperzach przedstawicielach rodziny Streblidae. Termin żyworodność w szerokim sensie stosuje się niekiedy do zwierząt, które inkubują rozwijające się jaja w obrębie ciała, ale poza układem rozrodczym. Dotyczy to przede wszystkim małży, u których komory lęgowe (marsupia) tworzą się w skrzelach (KORNIUSHIN i GLAUBRECHT 2002, 2003; GLAUBRECHT i współaut. 2006). U Sphaeriidae zapłodnione jaja trafiają do przestrzeni międzyblaszkowych skrzeli, tam otaczane są tkanką nabłonkową pochodząca z nitek skrzelowych. Po osiągnięciu większych rozmiarów (0,7 1,1 mm) zarodki przerywają ścianę komór lęgowych i rozwijają się dalej w przestrzeni wewnątrzskrzelowej (PIECHOC- KI i DYDUCH-FALNIOWSKA 1993). U małży z rodziny Corbiculidae (np. Corbicula australis i C. fluminalis) krótkotrwałą inkubację larw w skrzelach matki (do stadium pediveliger lub stadium młodocianego z muszlą ok. 0,25 0,4 mm) określa się jako jajożyworodność, a przedłużoną inkubację i rozwój stosunkowo dużych, oskorupionych młodych (>1 5 mm u Neocorbicula limosa) jako żyworodność (GLAUBRECHT i współaut. 2006). W wielu grupach zwierząt jaja i młode ochraniane są w komorach lęgowych położonych pomiędzy wyrostkami odnóży bądź pod pancerzem (skorupiaki: torboraki Peracarida, wioślarki Cladocera), w uchyłkach ściany ciała (strzykwy Holoturoidea), a także w torbach lęgowych i kokonach przyczepionych okresowo do samicy (widłonogi Copepoda, zaleszczotki Pseudoscorpionidea) (MCCLIN- TOCK 2008, BŁASZAK 2011). W ścisłym znaczeniu gatunki te nie są żyworodne, ale długa inkubacja embrionów wewnątrz specjalnych struktur pozwala na wypuszczenie do środowiska młodych zaawansowanych w rozwoju. W literaturze anglojęzycznej, dla określenia strategii rozrodu obejmujących inkubację jaj i młodych poza strukturami układu rozrodczego, np. u płazów w obrębie żołądka lub worków głosowych, używany jest szeroki termin brooding (BLACKBURN 1994), dla którego brak utrwalonego odpowiednika z języku polskim. Ograniczeniem stosowania podanego rozróżnienia miedzy żyworodnością i jajożyworodnością jest niepełny stan wiedzy o anatomii i fizjologii bezkręgowców. Nieznajomość histologii i histochemii poszczególnych gatunków powoduje, że organizmy bywają zaklasyfikowane do organizmów żyworodnych jedynie na podstawie dużej różnicy w wielkości pomiędzy zapłodnionym jajem a wylęgającym się osobnikiem młodocianym, świadczącej o dodatkowym zaopatrywaniu zarodków w substancje odżywcze przez organizm rodzicielski. W takich przypadkach stosowany jest termin matrotrofia, oznaczający przekazywanie rozwijającym się zarodkom substancji odżywczych, zarówno w formie wydzieliny i/lub poprzez struktury przypominające łożysko, pierwotnie wprowadzony dla ryb przez WOURMSA (1981). Zjawisko matrotrofii występuje m.in. u małży Sphaeriidae, Unionidae i Corbiculidae (GLAU- BRECHT i współaut. 2006). Zarodki zaleszczotków noszone w workach lęgowych przyczepionych do ciała samicy wytwarzają organ ssący, przy pomocy którego pobierają pokarm od matki (BŁASZAK 2011). U lądowych równonogów z grupy stonóg (Oniscidea) opisywano specjalne wyrostki zwane kotyledonami, które produkują śluzowaty płyn, w którym rozwijają się zarodki inkubowane w komorze jajowej. Według WARBURGA (2012) ich funkcja jest nie w pełni udokumentowana. Wśród żyworodnych Diptera wytwarzających pojedyncze larwy dominuje zaopatrywanie embrionów w substancje odżywcze pochodzące wyłącznie z żółtka zawartego w jaju (lecytotrofia), ale u niektórych muchówek z rodziny Hippoboscidae (np. Melophagus sp.) czy Glossinidae (mucha tse-tse) larwy wykluwające się w macicy odżywiane są wydzielinami produkowanymi przez gruczoły dodatkowe uchodzące do pochwy, a także materiałem znajdującym się w zbiorniku nasienia (MEIER i współaut. 1999, RESH i CARDÉ 2003). Wśród opiekujących się potomstwem ślimaków Thiaridae również występują dwa typy odżywiania zarodków (GLAUBRECHT 2006). U Melanoides tuberculatus embriony dorastają do wielkości 5-7 skrętów muszli, gdyż korzystają prawdopodobnie z substancji odżywczych wydzielanych przez nabłonek wyściełający komorę lęgową (matrotrofia), natomiast u innych gatunków (np. Tiara amarula) w komorze lęgowej brak tkanki odżywczej, a zarodki rozwijają się tylko do stadium larwy veliger (lecytotrofia). O znaczeniu substancji zapasowych zawartych w jaju w odżywianiu zarodków świadczą duże rozmiary jaj u większości szkarłupni przejawiających opiekę nad potomstwem (BOSCH i SLATTE- RY 1999). Jaja Neosmilaster georgianus są ok. tysiąc razy cięższe (średnica 2,17 mm) niż u gatunków z larwą planktotroficzną (samodzielnie odżywiającą się w środowisku zewnętrznym), a zarodki tej rozgwiazdy przekształcają się bezpośrednio w formy młodociane bez stadiów pośrednich nawiązujących do fazy

36 Ewolucja strategii rozrodczych bezkręgowców żyworodność i przetrzymywanie jaj 567 wolnopływającej larwy. Tą samą zależność ilustrują przykłady ślimaków z rodziny Pachychilidae (Cerithioidea), gdzie formy opiekujące się potomstwem (z rodzajów Brotia, Jagora) produkują jaja o średnicy ok. 1 mm, trzykrotnie większej niż ślimaki jajorodne (Melanatria sp. 0,25 0,3 mm) (KÖHLER i współaut. 2004). Trzecią drogą pozyskania pokarmu przez rozwijające się w komorze lęgowej zarodki może być adelfofagia, czyli rodzaj kanibalizmu, polegający na odżywianiu się osobnikami z tego samego miotu. Dowody na adelfofagię istnieją u rozgwiazd Paririella vivipara i P. parvivipara, które przetrzymują rozwijające się potomstwo w jajnikach (BYRNE i CERRA 1996); inkubowane młode wynicowując żołądek trawiły mniejsze rodzeństwo. U wspomnianych gatunków z rodzaju Paririella jaja są wyjątkowo małe w porównaniu z jajami innych szkarłupniami, które opiekują się lęgami (średnica jaj μm), a kanibalistyczne młode przed opuszczeniem ciała rodzica miały średnicę 1 5 mm. BOSCH i SLATTERY (1999) odnotowują podobne zjawisko u wężowidła Ophionotus hexactis, gdzie zarodki podczas rozwoju w komorze lęgowej powiększają się nawet 560 razy, a także u rozgwiazdy Leptasterias, u której na skutek kanibalizmu ginie ponad 70% embrionów. Z kolei w rozwoju rozgwiazdy N. georgianus adelfofagia ma marginalne znaczenie; na skutek kanibalizmu embriony przyrastają tylko o ok. 10% (BOSCH i SLATTERY 1999). W komorze lęgowej tego gatunku obserwowano grube, cylindryczne wypustki łączące osobniki ze sobą; zarodki w stadium atrofii (zróżnicowane, ale z zapadniętą ścianą ciała i pozbawione wewnętrznych substancji zapasowych) połączone były ze zdrowymi embrionami. Na ewolucję i utrzymywanie się adelfofagii może wpływać wieloojcostwo jednego miotu (np. u N. georgianus kopulacja następuje z 2 3 partnerami równocześnie) i możliwość rozpoznawania pokrewieństwa w lęgu (BOSCH i SLATTERY 1999). Kanibalizm wewnątrz komory lęgowej występuje też prawdopodobnie u żyworodnych ślimaków Melanoides tuberculatus (BEN-AMI i HODGSON 2005). ADAPTACYJNE ZNACZENIE ŻYWORODNOŚCI Nieruchome stadia w cyklu życiowym, takie jak jaja, łatwo mogą zostać zniszczone przez drapieżniki, pasożyty czy czynniki abiotyczne (np. susza, zmiany temperatury). Inkubacja wczesnych stadiów rozwojowych wewnątrz ciała rodzica zmniejsza te zagrożenia, a stadia młodociane bezpośrednio po urodzeniu zdolne są do poruszania się i samodzielnego poszukiwania pożywienia. Teoretyczne przewidywania dotyczące przystosowawczego znaczenia żyworodności testowano porównując przeżywalność embrionów przetrzymywanych w komorze lęgowej morskich ślimaków pobrzeżków, Littorina saxatilis, z embrionami jajorodnego gatunku L. arcana rozwijającymi się w środowisku zewnętrznym (HUGHES 1995). W warunkach deficytu wilgoci jaja L. arcana w większości ginęły (65% śmiertelności), podczas gdy nie notowano śmiertelności młodych w komorze lęgowej L. saxatilis narażonej na wysychanie. Embriony gatunku żyworodnego miały wyższą przeżywalność także przy niewielkim podniesieniu temperatury i obniżeniu zasolenia wody z 32 do 15, ale znaczny wzrost temperatury powodował stratę całego lęgu, prawdopodobnie ze względu na słabą wentylację komory. Z kolei larwy żyworodnych muchówek z rodzaju Sarcophaga, żywiące się padliną, mają dodatkową przewagę nad konkurentami z gatunków jajorodnych, ponieważ nie tylko są zdolne do odżywiania się bezpośrednio po opuszczeniu organizmu matki, ale także mogą aktywnie niszczyć jaja i larwy innych padlinożerców (MEIER i współaut. 1999). Znane są też przypadki, kiedy larwy Sarcophagidae wylegające się z samicy zabitej lub unieruchomionej przez odrętwiacza Oxybelus sparideus (grzebaczowate Sphecidae) zabiły potomstwo tego parazytoida. Niektóre żyworodne owady (biegacz Pseudomorpha, kłusaki Corotoca i in.) są pasożytami żyjącymi w koloniach termitów lub mrówek, a więc w środowisku, gdzie inkubacja zarodków w ciele samicy eliminuje potencjalną śmiertelność z powodu rozpoznania jaj przez gospodarzy (LIEBHERR i KAVA- NAUGH 1985). W innych przypadkach larworodność ułatwia transmisję pasożyta między gospodarzami (CLUTTON-BROCK 1991). Wśród ślimaków lądowych jajożyworodność spotykana jest szczególnie często u niewielkich gatunków z podrzędu Orthurethra, u których średnica i wysokość muszli nie przekraczają 3 5 mm (HELLER i współaut.

37 568 ANNA SULIKOWSKA-DROZD 1997). Ze względu na budowę układu wydalniczego wczesne stadia embrionalne ślimaków z tej grupy są mało odporne na okresowe podtapianie. W siedliskach narażonych na powodzie, na przykład na brzegach rzek, przetrzymywanie embrionów w macicy do czasu pełnego rozwoju nerek ma dużą wartość adaptacyjną. W odniesieniu do morskich bezkręgowców wysunięto przypuszczenie, że niewielkie osobniki nie są w stanie zagwarantować swojego sukcesu rozrodczego poprzez produkcję dużej liczby jaj, które rozwijają się w planktotroficzne larwy, swobodnie unoszące się i odżywiające w toni wodnej. A zatem w ich przypadku korzystną strategią jest inwestowanie w mniejszą liczbę potomstwa, przy jednoczesnym zwiększaniu szansy młodych na osiedlenie się w odpowiednim siedlisku i uniknięcie planktonożernych drapieżników (STRATHMANN i STRATHMANN 1982). W literaturze można też spotkać hipotezę, że przetrzymywanie potomstwa w komorze lęgowej może być szczególnie adaptatywne dla organizmów rozmnażających się partenogenetycznie, a więc wyjątkowo wrażliwych na akumulację szkodliwych genów (LIVELY i JOHNSON 1994). Zwracano przede wszystkim uwagę na częstość występowania partenogenezy u opiekujących się lęgami parzydełkowców i mięczaków. Zwierzęta inkubujące młode mogą prawdopodobnie przeciwdziałać akumulacji groźnych mutacji poprzez rozpoznawanie i aktywne usuwanie uszkodzonych embrionów z komory lęgowej. Doświadczalnie hipotezę tę próbował weryfikować PINTO i współautorzy (2007), którzy obserwowali przedwczesne usuwanie jaj i embrionów z komór lęgowych małżoraczków Darwinulidae. Określono, że ok. 30% potomstwa Penthesilenula brasiliensis było usuwane bez inkubacji, większość usuniętych jaj wylegało się i dalej rozwijało, ale żadne nie osiągnęło dojrzałości, co może wskazywać na zdolność rodzica do oceny jakości potomstwa. KOSZTY ŻYWORODNOŚCI Żyworodność związana jest z dodatkowymi wydatkami energetycznymi w okresie inkubacji embrionów, a ponadto może prowadzić do modyfikacji zachowania zwierzęcia, która zmniejsza jego dostosowanie. Zazwyczaj ogranicza zdolność do ucieczki lub ukrycia się. Zaobserwowano na przykład, że prędkość ucieczki ciężarnych samic skorpionów jest istotnie niższa niż pozostałych osobników (SHAFFER i FORMANOWICZ 1996). Z kolei u rozwielitek samica z wypełnioną komorą lęgową jest lepiej widoczna w toni wodnej niż pozostałe osobniki i staje się łatwym łupem dla ryb planktonożernych posługujących się wzrokiem (PIJANOWSKA 1985). Czasem opieka nad potomstwem upośledza zdolność pozyskiwania pokarmu w tak dużym stopniu, że w okresie inkubacji młodych możliwe jest korzystanie tylko z wcześniej nagromadzonych rezerw energetycznych. Dla przykładu u Leptasterias hexactis i Neosmilaster georgianus (Asteroidea) samice umieszczają jaja w jamie podgębowej i przestają się odżywiać: na ponad dwa miesiące w przypadku pierwszego z wymienionych gatunków i do ponad roku u drugiego (BOSCH i SLATTERY 1999). Ograniczenie pobierania pożywienia zmniejsza alokację energii do tkanek układu rozrodczego i opóźnia kolejne okresy rozrodu; gatunki rozgwiazd nie przetrzymujące embrionów rozmnażają się w warunkach polarnych co rok, a te opiekujące się potomstwem rzadziej, co powoduje obniżenie sukcesu reprodukcyjnego osobników w skali całego życia. Zmniejszenie płodności obserwuje się również u jajożyworodnych ślimaków lądowych, które mają mniejsze lęgi niż gatunki jajorodne (BAUR 1994). W niektórych przypadkach rodzenie dużych młodych może powodować uszkodzenie ciała samicy. U roztoczy z grupy mechowców (Oribatida) rozwijające się w hemocelu larwy odżywiają się tkankami matki (aparia), a jej pancerz chroni potomstwo; samica ginie zanim młode opuszczą jej ciało (BŁASZAK 2011). Ewolucja opieki nad lęgiem związana była u niektórych zwierząt z rozwojem dodatkowych struktur morfologicznych. U skorupiaków z grupy Peracarida (należą tu m.in. równonogi i obunogi) komora lęgowa powstaje na tułowiu, jako zagłębienie otoczone 2 7 parami owalnych płytek, oostegitów, będących wyrostkami członów biodrowych odnóży tułowiowych (BŁASZAK 2011). Według GLAUBRECHTA (2006) u większości żyworodnych Gastropoda komora lęgowa tworzona jest przez zmodyfikowany jajowód (u Littorina saxatilis, Viviparus viviparus, Potamopyrgus antipodarum), jednak u niektórych

38 Ewolucja strategii rozrodczych bezkręgowców żyworodność i przetrzymywanie jaj 569 grup struktury służące do inkubacji młodych powstawały poza kanałami układu rozrodczego. Thiaridae (przykładowo Melanoides tuberculatus) przetrzymują zarodki w komorze utworzonej w przedniej części nogi i sięgającej do okolicy karkowej. Ta wewnętrznie podzielona komora mogła powstać poprzez inwaginację organu służącego do składania jaj u pokrewnych grup Cerithioidea. Jeszcze inne rozwiązanie stwierdzono u endemicznych filipińskich ślimaków Jagora (Pachy- chiliidae) tu funkcję komory lęgowej pełni jama płaszczowa. Wśród muchówek żyworodność wyewoluowała co najmniej 61 razy niezależnie (MEIER i współaut. 1999). Jednak prawie wszystkie muchówki żyworodne należą do grupy Schizophora, co można wiązać z morfologią układu rozrodczego samicy. Występuje tu długa pochwa, która może przejmować funkcję torby lęgowej w obrębie ciała. ŻYWORODNOŚĆ A ŚRODOWISKO ŻYCIA Zgromadzone dotychczas dane o strategiach życiowych bezkręgowców sugerują, że szeroko rozumiana żyworodność jest szczególnie częsta w surowych i nieprzewidywalnych środowiskach (CLUTTON-BROCK 1991). Na przykład BAUR (1994) podaje, że wśród ślimaków lądowych obserwowana jest u wielu gatunków zamieszkujących ściany skalne lub mury, gdzie brak odpowiednich miejsc do składania jaj, a także w rejonach z rozpoczynającą się nieregularnie porą deszczową. Wysoki odsetek gatunków przetrzymujących rozwijające się zarodki obserwowano wśród mięczaków i szkarłupni w morzach polarnych. BOSCH i SLATTERY (1999) podają, że wśród płytkowodnych rozgwiazd w regionach polarnych 18 z 34 gatunków o znanym rozwoju opiekuje się potomstwem. Odsetek jeżowców o takiej strategii rozrodu u wybrzeży antarktycznych przekracza 70% (PO- ULIN i FERAL 1996). Wśród małży większość gatunków morskich z wód umiarkowanych jest jajorodna, a żyworodność była wiązana z kolonizacją siedlisk słodkowodnych i/lub specjacją w tych siedliskach (por. GLAUBRECHT i współaut. 2006). U groszkówkowatych (Sphaeriidae) i korbikulowatych (Corbiculidae) gatunki zamieszkujące wody estuariów i zbiorniki słonawe nie inkubują jaj i wypuszczają wolnopływające larwy typu veliger. Natomiast całkowicie słodkowodne gatunki zwykle inkubują potomstwo w torbach lęgowych położonych w skrzelach i uwalniają zaawansowane w rozwoju, oskorupione młode. Według dotychczasowej wiedzy, żyworodność u Corbiculidae powstała trzykrotnie w oddzielnych liniach filogenetycznych występujących w wodach słodkich Ameryki Południowej, Madagaskaru i Sulawesi (GLAUBRECHT i współaut. 2006). W obrębie ślimaków Cerithioidea grupy rozwijające się w wodach słodkich także wielokrotnie zyskały zdolność do przedłużonej retencji jaj, podczas gdy przytłaczająca większość taksonów morskich pozostała ściśle jajorodna (KÖHLER i współaut. 2004). Uważa się, że jedną z adaptacji do życia w wodach słodkich było powiększenie rozmiarów jaj w porównaniu z blisko spokrewnionymi formami słonowodnymi. Wolnopływające w planktonie larwy w warunkach śródlądowych narażone są na trudniejsze i bardziej zmienne warunki wynikające z małej objętości i nietrwałości zbiorników wodnych i zmiennej dostępności pokarmu. W wodach płynących dodatkowym zagrożeniem jest przenoszenie larw poza preferowane siedliska. Z tych powodów przejście od rozwoju złożonego, obejmującego planktoniczną larwę, do prostego, odbywającego się wewnątrz osłon jajowych, miało najprawdopodobniej duże znaczenie adaptacyjne dla słodkowodnych ślimaków. Wzrost zarodka odbywa się tu kosztem materiałów zapasowych zawartych w jaju, a zatem konieczność dostarczenia odpowiednich ilości żółtka musiała się wiązać z produkcją większych kapsuł jajowych, a to z kolei pociągnęło za sobą zmniejszenie liczby produkowanych jaj. KÖHLER i współautorzy (2004) postawili tezę, że właśnie zmiany wielkości i liczby jaj związane z przejściem ślimaków na rozwój prosty w wodach słodkich stały się czynnikiem sprzyjającym wielokrotnemu powstaniu żyworodności u Pachychilidae (Cerithoidea). Założyli oni, że przy wzroście inwestycji w pojedyncze jajo, każda, nawet częściowa strata lęgu staje się dla rodzica bardziej dotkliwa, tj. silniej wpływa na jego sukces reprodukcyjny. Zatem przetrzymywanie jaj lub rozwijających się młodych w ciele samicy zwiększało szanse na

39 570 ANNA SULIKOWSKA-DROZD pomyślny rozwój potomstwa i wzmacniało jej dostosowanie. Opieka nad potomstwem u ślimaków ewoluowała głównie, ale nie wyłącznie w wodach słodkich. Nie był to też dla mięczaków warunek kolonizacji tego biotopu (STRONG i GLAUBRECHT 2007). Dużą różnorodność jajożyworodnych ślimaków stwierdzono w starych jeziorach. Początkowo dominowało przypuszczenie, że brak wolnopływających larw hamuje przepływ genów między populacjami i ułatwia specjację (COHEN i JOHNSON 1987). Hipotezy tej nie potwierdziły późniejsze badania STRONG i GLAUBRECHTA (2007). Niektóre rodzaje ślimaków przetrzymujących embriony są bogate w gatunki (Lavigeria), a inne nie (Tiphobia i Tanganyicia). Co więcej, przetrzymywanie embrionów spotykane jest u gatunków bardzo zróżnicowanych morfologicznie i zamieszkujących odmienne siedliska: od strefy oprysku na brzegach skalistych po muliste dno na większych głębokościach. Kolejną prawidłowość zauważono analizując siedliska życia larw muchówek; żyworodność spotyka się przede wszystkim w cyklach życiowych z larwami żywiącymi się nietrwałymi częściami roślin, ślimakami, odchodami, bądź padliną (por. MEIER i współaut. 1999). Żyworodność może mieć w tych przypadkach dużą wartość adaptacyjną, ponieważ niewielkie i szybko rozkładające się źródła pokarmu muszą być wykorzystane szybko i mogą stanowić zaopatrzenie tylko dla niewielkiej liczby potomstwa. Trzeba podkreślić, że strategia ta nie skraca trwania cyklu życiowego, lecz tylko redukuje okres samodzielnego odżywiania się larwy. Z drugiej strony, każdy z tych substratów wykorzystywany jest także przez larwy gatunków jajorodnych, a zatem nie można wiązać specjalizacji pokarmowej z pojawieniem się opieki nad potomstwem; preferencje pokarmowe wyewoluowały wcześniej niż żyworodność. W opinii MEIERA i współautorów (1999) żyworodność jest prawdopodobnie korzystna, gdy larwy żyją w środowiskach nietrwałych, ale nacisk selekcyjny na zmianę pierwotnych strategii rozrodu nie jest zbyt silny. Występowanie żyworodności u muchówek hematofagicznych (np. mucha tse-tse, rodzina Glossinidae) interpretowano jako efekt obfitego i wysokoenergetycznego pokarmu samic. Żyworodne pobrzeżki Littorina saxatilis zasiedlają niestabilne siedliska litoralne, takie jak estuaria, słonawiska, żwirowe lub muliste brzegi o ruchomym podłożu (HUGHES 1995). Takie miejsca nie stwarzają warunków do deponowania masy jajowej i dlatego wybiera je niewiele gatunków ślimaków. Natomiast na podłożach twardych L. saxatilis musi konkurować z gatunkami jajorodnymi. Opieka nad potomstwem uważana jest za element biologii gatunku predestynujący niektóre bezkręgowce do kolonizacji nowych obszarów (STATZNER i współaut. 2008). Przykładów dostarczają rozprzestrzeniające się w naszym kraju inwazyjne mięczaki Potamopyrgus antipodarum i Corbicula fluminalis, u których wrażliwe stadia larwalne chronione są przed czynnikami środowiskowymi w ciele rodzica, a ponadto rozród może odbywać się na drodze partenogenezy. EWOLUCYJNY KOMPROMIS PŁODNOŚĆ A STOPIEŃ ROZWOJU POTOMSTWA W KOMORACH LĘGOWYCH Ze względu na ograniczoną pojemność komór lęgowych u blisko spokrewnionych gatunków można zaobserwować wyraźną negatywną zależność pomiędzy płodnością (liczba młodych w miocie) a maksymalnym stopniem rozwoju zarodków. GLAUBRECHT i współautorzy (2006) opisali to zjawisko w rodzinie Corbiculidae. Gatunki z rodzaju Corbicula (z wyjątkiem C. japonica) inkubują zwykle dużą liczbę zarodków (>10 000) wewnątrz dwóch niezmodyfikowanych, wewnętrznych płatów skrzelowych. Po krótkim okresie inkubacji uwalniane są późne veligery bądź pediveligery ( μm średnicy), a inkubacja jest prawie zawsze synchroniczna. Gatunki z rodzaju Neocorbicula z Ameryki Południowej rozwijają torby lęgowe w wewnętrznych płatach skrzelowych, z pojedynczym embrionem w każdej kieszeni i całkowitą liczbą zarodków (maksymalnie 45), reprezentujących różne kohorty (inkubacja sekwencyjna). Młode są zazwyczaj wypuszczane, kiedy osiągają wielkość 1,1 mm, ale czasem pozostają w torbach dłużej i osiągają rozmiary nawet 4 5 mm. Niektóre ślimaki lądowe z rodziny świdrzykowatych (Clausiliidae) przetrzymują rozwijające się zarodki w rozszerzonym jajowodzie. Blisko spokrewnione gatunki z rodzaju Vestia inkubują jednorazowo od 5 do 15 embrionów (maksymalnie 21). U V. gulo, gdzie stwierdzano najwięcej embrionów,

40 Ewolucja strategii rozrodczych bezkręgowców żyworodność i przetrzymywanie jaj 571 dorastały one tylko do wielkości 1,3 skręta muszli, podczas gdy u V. turgida, gatunku mającego najniższą płodność w lęgu, osiągały nawet 2,9 skrętów muszli (SULIKOWSKA- -DROZD 2009). Wśród larworodnych Diptera wyróżnia się gatunki wytwarzające larwy pojedyncze, nieliczne (2 12) i liczne, można więc tu mówić o pewnym kontinuum strategii rozrodczych (MEIER i współaut. 1999). Najrzadziej spotykane są gatunki przetrzymujące jednorazowo nieliczne larwy. Ekstremalny przykład opieki nad pojedynczą larwą znany jest u Pachylophus proximus (rodz. niezmiarkowate Chloropidae), gdzie rozwijające się w macicy jajo jest prawie tak długie jak odwłok samicy. Na drugim krańcu kontinuum sytu- ują się strzykaczowate (Oestridae) i rączycowate (Tachinidae), u których stwierdzano olbrzymie liczby inkubowanego potomstwa (nawet wiele tysięcy larw). Pojawienie się żyworodności i przetrzymywania jaj nastąpiło u różnych grup zwierząt równoległe i niezależnie (MCGHEE 2011). Przytoczone przykłady wskazują, że selekcja w kierunku większej ochrony lęgu odbywająca się kosztem redukcji liczby potomstwa i zmniejszenia przeżywalności rodziców działała w wielu typach środowisk. Zrozumienie tego zjawiska mogą pogłębić systematyczne badania morfologiczne, ekologiczne i obserwacje cykli życiowych blisko spokrewnionych gatunków o zróżnicowanych strategiach rozrodu. EWOLUCJA STRATEGII ROZRODCZYCH BEZKRĘGOWCÓW ŻYWORODNOŚĆ I PRZETRZYMYWANIE JAJ Streszczenie Żyworodność oraz przetrzymywanie rozwijających się jaj w macicy, lub innej wyspecjalizowanej komorze lęgowej, są rozprzestrzenione u bezkręgowców i wyewoluowały niezależnie w wielu grupach taksonomicznych. Strategie te wiążą się ze zróżnicowanymi sposobami dostarczania pożywienia dla rozwijających się młodych (lecytotrofia, matrotrofia lub adelfofagia), jak również szeregiem przystosowań anatomicznych i morfologicznych, które zwiększają wprawdzie przeżywalność młodych, ale mogą obniżać płodność rodzica. Ewolucyjny kompromis pomiędzy liczbą młodych w miocie a ich wielkością, która określa inwestycję rodzica w pojedynczy organizm potomny, wynika z ograniczonej objętości komór inkubacyjnych. U bezkręgowców związek pomiędzy czynnikami siedliskowymi a powstaniem żyworodności nie jest dobrze poznany, ale strategia ta jest bardziej powszechna w niektórych środowiskach np. u gatunków z mórz polarnych (szkarłupnie, małże) i wód słodkich (ślimaki, małże). Natomiast wśród owadów żyworodność obserwowano równolegle z koprofagią, pasożytnictwem lub malakofagią stadiów larwalnych, a także hematofagią lub myrmekofilią imagines. THE EVOLUTION OF REPRODUCTIVE STRATEGIES IN INVERTEBRATES VIVIPARITY AND EGG RETENTION Summary Viviparity and short retention of developing eggs in uterus or other specialised brood chambers are widespread in invertebrate taxa and evolved many times independently. Strategy of brood protection involves different mechanisms of providing nourishment for developing embryos (lecithotrophy, matrotrophy or adelphophagy), as well as the array of anatomical and morphological adjustment. Brood protection increases offspring survival, but may reduce maternal fecundity. Evolutionary trade-off between fecundity of viviparous and egg retaining animals and the parental investment per offspring depends on the limited space of incubatory structures. Ecological correlates of parental care in invertebrates are still under debate but brood protecting species are more common in polar seas (Echinodermata, Bivalvia) and freshwater habitats (Gastropoda, Bivalvia). Among insects viviparity is frequently associated with coprophagy, parasitism or malacophagy of larvae and hematophagy or myrmekophily of imagines. LITERATURA BAUR B., Parental care in terrestrial gastropods. Experientia 50, BEN-AMI F., HODGSON A. N., Ovoviviparity and the structure of the brood Pouch in Melanoides tuberculata (Gastropoda: Prosobranchia: Thiaridae). J. Morphol. 263, BLACKBURN D. G., Review: discrepant usage of the term ovoviviparity in the herpetological literature. Herpetol. J. 4, BLACKBURN D. G., Squamate reptiles as model organisms for the evolution of viviparity. Herpetol. Monog. 20,

41 572 ANNA SULIKOWSKA-DROZD BŁASZAK C., Zoologia. Stawonogi. Szczękoczułkopodobne, skorupiaki. Tom 2 część 1. PWN, Warszawa. BOSCH I., SLATTERY M., Costs of extended brood protection in the Antarctic sea star, Neosmilaster georgianus (Echinodermata: Asteroidea). Marine Biol. 134, BYRNE M., CERRA A., Evolution of intragonadal development in the diminutive asterinid sea stars Patiriella vivipara and P. parvivipara with an overview of development in the Asterinidae. Biol. Bull. 191, CLUTTON-BROCK T. H., The evolution of parental care. Princeton University Press, Princeton. COHEN A. S., JOHNSTON M. R., Speciation in brooding and poorly dispersing lacustrine organisms. Palaios 2, GLAUBRECHT M., Independent evolution of reproductive modes in viviparous freshwater Cerithioidea (Gastropoda, Sorbeoconcha) a brief review. Basteria 3 (Suppl.), GLAUBRECHT M., FEHER Z., RINTELEN T. VON, Brooding in Corbicula madagascariensis (Bivavia, Corbiculidae) and the repeated evolution of viviparity in corbiculids. Zool. Scripta 35, HELLER J., SIVAN N., HODGSON A. N., Reproductive biology and population dynamics of an ovoviviparous land snail Lauria cylindracea (Pupillidae). J. Zool. 243, HUGHES R. N., Resourse allocation, demography and the radiation of life histories in rough periwinkles (Gastropoda). Hydrobiologia 309, KLOWDEN M. J., Physiological systems in insects. Academic Press, San Diego. KÖHLER F., RINTELEN T. VON, MEYER A., GLAUBRECHT M., Multiple origin of viviparity in Southeast Asian gastropods (Cerithioidea: Pachychilidae) and its evolutionary implications. Evolution 58, KORNIUSHIN A. V., GLAUBRECHT M., Phylogenetic analysis based on the morphology of viviparous freshwater clams of the family Sphaeriidae (Mollusca, Bivalvia, Veneroida). Zool. Scripta 31, KORNIUSHIN A. V., GLAUBRECHT M., Novel reproductive modes in freshwater clams: brooding and larval morphology in Southeast Asian taxa of Corbicula (Mollusca, Bivalvia, Corbiculidae). Acta Zool. (Stockholm) 84, LIEBHERR J. K., KAVANAUGH D. H., Ovoviviparity in carabid beetles of the genus Pseudomorpha (Insecta: Coleoptera). J. Nat. History 19, LIVELY C. M., JOHNSON S. G., Brooding and the evolution of parthenogenesis strategy models and evidence from aquatic invertebrates. Proc. Royal Society of London, Series B-Biological Sciences 256, MCCLINTOCK J., Brooding in Echinoderms. Sci- Topics, pobrane z MCGHEE G. R., Convergent evolution. Limited forms most beautiful. Massachusetts Institute of Technology. MEIER R., KOTRBA M., FERRAR P., Ovoviviparity and viviparity in the Diptera. Biol. Rev. 74, O LOUGHLIN P. M., EICHLER J., ALTOFF L., FALCONER A., MACKENZIE M., WHITFIELD E., ROWLEY C., Observations of reproductive strategies for some dendrochirotid holothuroids (Echinodermata: Holothuroidea: Dendrochirotida). Memoirs of Museum Victoria 66, OWINY A. M., Some aspects of the breeding biology of the equatorial land snail Limicolaria martensiana (Achatinidae: Pulmonata). J. Zool. 172, PIECHOCKI A., DYDUCH-FALNIOWSKA A., Mięczaki. Małże. Fauna Słodkowodna Polski, zeszyt 7A, PWN Warszawa. PIJANOWSKA J., Mechanizmy obrony przed drapieżnikami u zwierząt planktonowych. Wiadomości Ekol. 31, PINTO R. L., ROCHA C. E. F., MARTENS K., Early release of eggs and embryos in a brooding ancient asexual ostracod: brood selection or a gambling strategy to increase fecundity? Hydrobiologia 585, POULIN E., FERAL J. P., Why are there so many species of brooding Antarctic Echinoids? Evolution 50, RESH V. H., CARDÉ R. T., Encyclopedia of insects. Academic Press, San Diego. ROFF D. A The evolution of life histories: theory and analysis. Chapman & Hall, New York. SHAFFER L. R., FORMANOWICZ D. R., A cost of viviparity and parental care in scorpions: reduced sprint speed and behavioural compensation. Animal Behav. 51, STATZNER B., BONADA N., DOLEDEC S., Biological attributes discriminating invasive from native European stream macroinvertebrates. Biol. Invasions 10, STRATHMANN R. R., STRATHMANN M. F., The relationship between adult size and brooding in marine invertebrates. Am. Nat. 119, STRONG E., GLAUBRECHT M., The morphology and independent origin of ovoviviparity in Tiphobia and Lavigeria (Caenogastropoda: Cerithioidea: Paludomidae) from Lake Tanganyika. Organisms Diver. Evol. 7, SULIKOWSKA-DROZD A., Egg retention and ovoviviparity in clausiliids of the genus Vestia P. Hesse (Gastropoda: Clausiliidae). J. Molluscan Stud. 75, TOMPA A. S., Oviparity, egg retention and ovoviviparity in pulmonates. J. Molluscan Studies 45, WARBURG M. R., The scorpion female s reproductive system; a partial review. Anatom. Record 293, WARBURG M. R., The oniscid isopod female reproductive system and gestation, with a partial review. Invertebr. Reprod. Develop. 56, WOURMS J. P., Viviparity: the maternal-fetal relationship in fishes. Am. Zool. 21,

42 Tom Numer 4 (297) Strony CEZARY SEMPRUCH Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej Wydział Przyrodniczy Akademia Podlaska Prusa 12, Siedlce cezar@uph.edu.pl INTERAKCJE MIĘDZY MSZYCAMI A ROŚLINAMI WE WSTĘPNYCH ETAPACH WYBORU ŻYWICIELA WPROWADZENIE Wybór roślin żywicielskich przez mszyce jest procesem złożonym, uzależnionym od wielu czynników, spośród których ważną rolę odgrywają biomolekuły roślinne, mogące wpływać na behawior i/lub fizjologię owadów. Ze względu na brak możliwości ucieczki przed atakiem roślinożerców, rośliny w toku ewolucji rozwinęły zróżnicowane mechanizmy chemicznej obrony, rezultatem których jest obecność w ich tkankach zdecydowanie większej liczby biomolekuł niż ma to miejsce u zwierząt. Szacuje się, że w tkankach roślin występuje ponad metabolitów, a ich liczba w poszczególnych gatunkach oscyluje na poziomie ok (FERNIE 2007). Wiele z nich uczestniczy w konstytucyjnych mechanizmach obronnych roślin i/lub w reakcjach indukowanych atakiem roślinożernych owadów. Biomolekuły roślinne, oddziaływujące na owady w okresie wyboru i akceptacji żywiciela, warunkują behawioralną stronę powiązań między tymi dwiema grupami organizmów i stanowią podłoże mechanizmu antyksenozy. Przed zasiedleniem uskrzydlone dzieworódki zataczają ruchem spiralnym kręgi wokół rośliny, a o lokalizacji żywiciela decydują bodźce wzrokowe i zapachowe, jako efekt odziaływania barwników roślinnych i związków lotnych. W momencie kontaktu z powierzchnią roślin ważną rolę odgrywają z kolei włoski powierzchniowe, kutikula i woski epikutikularne, które mogą być źródłem bodźców dotykowych, stanowić barierę ograniczającą dostępność tkanek roślinnych dla owadów roślinożernych, lub wytwarzać specyficzne allelozwiązki. Z drugiej strony, roślinne związki lotne, wydzieliny włosków gruczołowych oraz skład i mikrostruktura kutikuli i wosków epikutikularnych oddziałują na zachowanie się parazytoidów i drapieżców mszyc, co stanowi podstawę tzw. obrony pośredniej. Niniejsza praca ma na celu przegląd informacji na temat interakcji zachodzących między mszycami a zasiedlanymi przez nie roślinami we wczesnych etapach wyboru żywiciela. BARWA ROŚLIN Wrażliwość na barwę jest wynikiem specyficznych adaptacji mszyc do odnajdywania żywiciela w oparciu o bodźce wzrokowe. Od dawna wiadomo, że mszyce wykazują preferencję w stosunku do barwy żółtej, która pozytywnie wpływa nie tylko na behawior, ale także na fizjologię owadów. Podświetlenie sztucznych diet światłem o barwie żółtej, zwiększało bowiem przeżywalność i reprodukcję mszyc (DÖRING i CHITTKA 2007). Ist-

43 574 CEZARY SEMPRUCH nieje jednak w tym względzie pewna zmienność między- i wewnątrzgatunkowa. Osobniki mszycy zbożowej (Sitobion avenae F.), mszycy kukurydzianej (Rhopalosiphum maidis Fitch.) i Shizaphis graminum (Rond.) preferowały w teście wyboru kolor żółty, natomiast dwudomna mszyca czeremchowo- -zbożowa (Rhopalosiphum padi L.) wykazywała większe preferencje w stosunku do zieleni. W przypadku mszycy burakowej (Aphis fabae Scop.) oraz R. padi stwierdzono zmiany w preferencji barwy żółtej i zielonej w ciągu roku, natomiast dla mszycy wierzbowo- -marchwiowej (Cavariella aegopodii Scop.), mszycy kapustnicy wielożernej (Lipaphis erysimi Kalt.) i S. avenae, zmienność taka nie występowała. LESZCZYŃSKI (1987) wykazał, że w okresie migracji wiosennych uskrzydlone dzieworódki mszycy zbożowej chętniej zasiedlały liście odmian pszenicy o barwie żółto- -zielonej niż niebiesko-zielonej. W przypadku zbóż barwa jest wynikiem proporcji w zawartości takich barwników roślinnych jak: zielone chlorofile, żółte flawonole i ksantofile oraz pomarańczowe karoteny. Zdaniem PROKOPY (1972) liście zawierające wysokie stężenia żółtych barwników emitują fale świetlne o podobnej długości, co liście ciemnozielone, lecz o większej energii. Dzięki temu, stanowią one silniejsze super bodźce dla nalatujących migrantek (PROKO- PY i OWENS 1983). DÖRING i CHITTKA (2007), opierając się na wynikach badań nad oddziaływaniem podłoża o barwie pomarańczowej, żółtej, zielonej, czerwonej i niebieskiej na osobniki mszycy brzoskwiniowej (Myzus persicae Sulz.) i A. fabae stwierdzili najwyższą wrażliwość mszyc na barwę żółtą. Ponieważ wiele gatunków owadów (w tym mszyce) posiada receptory wzrokowe wrażliwe na barwę zieloną, niebieską oraz na promieniowanie ultrafioletowe (UV), autorzy ci doszli do wniosku, iż promieniowanie pobudzające receptory zakresu światła zielonego stanowi bodziec stymulujący, natomiast zakres niebieski i UV, bodźce o charakterze odstraszającym. Względne pobudzenie owada w wyniku takiego mechanizmu przeciwnego oddziaływania barw wyraża równanie: E opp = ae U E B + ce G gdzie: E opp pobudzenie owada; E U, E B i E G pobudzenie receptorów wrażliwych odpowiednio na promieniowanie UV, światło niebieskie i zielone; a, b i c współczynniki przeliczeniowe. Zgodnie z wyżej przedstawioną zasadą, zabarwienie żółte odbierane jest przez receptory światła zielonego, słabo pobudzając receptory barwy niebieskiej i promieniowania UV, natomiast zabarwienie niebieskie wpływa silniej na receptory odbierające światło niebieskie i UV niż na receptory barwy żółtej. Stąd, w ostatecznym rezultacie, barwy te odbierane są przez mszyce jako bodźce wzrokowe o przeciwstawnym charakterze. Stwierdzono, że M. persicae posiada trzy rodzaje receptorów: wrażliwe na promieniowanie o długości fali 530 nm (zielone) i 490 nm (niebieskie) oraz w zakresie nm (UV) (KIRCHNER i współaut. 2005). Podobna sytuacja ma miejsce u wielu innych gatunków owadów, chociaż znane są także przypadki występowania czterech i większej liczby receptorów wrażliwych na różne zakresy promieniowania, w tym także na barwę czerwoną, co stwierdzono u niektórych gatunków z rzędów Odonata, Hymenoptera, Lepidoptera i Coleoptera (SCHAEFER i WILKINSON 2004, DÖRING i CHIT- TKA 2007). Pomimo braku receptorów światła czerwonego wiele mszyc odznacza się wrażliwością na promieniowanie o takiej barwie, co uwidacznia się głównie u gatunków dwudomnych podczas migracji jesiennych. Mechanizm negatywnego oddziaływania tego koloru na wybór drzew przez mszyce powracające jesienią na żywicieli pierwotnych można również wyjaśniać w oparciu o zjawisko opisane przez DÖRING i CHITTKA (2007) z założeniem, że światło czerwone słabo stymuluje owadzie receptory barwy zielonej, przy zbliżonym do zieleni oddziaływaniu na receptory barwy niebieskiej i promieniowania UV. Jednak zdaniem ARCHETTI (2000) większą rolę odgrywać tu może względna intensywność zabarwienia postrzegana przez owady bardziej kontrastowo w stosunku do tła, które stanowią słabiej zabarwione (zielone) drzewa w danym zbiorowisku. Podobny efekt wywoływało umieszczenie białej, aluminiowej lub czarnej otoczki wokół pułapek, prowadząc do redukcji liczby odławianych mszyc. Aluminiowa otoczka obniżała także porażenie roślin przez wirusy przenoszone przez te owady (DÖRING i CHITTKA 2007). AR- CHETTI i współaut. (2009) podają, że czerwone zabarwienie liści wpływało negatywnie na jesienne zasiedlanie klonu palmowego (Acer platanum Thunb.), brzozy omszonej (Betula pubescens Ehrh.), czeremchy zwyczajnej (Prunus padus L.), nibybuka Alessandriego (Nothofagus alessandrii Espinosa), jarząbu

44 Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela 575 Ryc. 1. Zgodność barwy ciała z zabarwieniem roślin żywicielskich na przykładzie trzech gatunków mszyc: grochowianki (a), zbożowej (b) i czeremchowo-zbożowej (c) (fot. G. Chrzanowski). zy. Przechwytują bowiem nadmiar kwantów promieniowania absorbowanego przez cząsteczki chlorofilu b w procesie fotoinhibicji oraz zmiatają wolne rodniki, zapobiegając uszkodzeniom tkanek roślinnych biorących udział w fotosyntezie (SCHAEFER i WILKINSON 2004). Jesienne zabarwienie liści może także oddziaływać pośrednio, zakłócając mimikrę na skutek kontrastu między barwą rośliny i ciała mszyc, co w konsekwencji ułatwia wrogom naturalnym ich odnalezienie (LEV-YADUN i GOULD 2007). Zielona barwa ciała wielu mszyc, gąsienic motyli i innych owadów roślinożernych stanowi optymalny kamuflaż przystosowujący je do bytowania na roślinach żywicielskich, które stanowią nie tylko źródło pokarmu, lecz także środowisko życia tych niewielkich roślinożerców (Ryc. 1). Tego typu adaptacje mają miejsce w przypadku roślin o zróżnicowanym zabarwieniu (np. górna powierzchnia liści zielona, a dolna niebieska, brązowa, czerwona lub jakakolwiek inna; miąższ zielony, a ogonki, nerwy, łodygi, gałęzie, kwiaty, owoce o innej kolorystyce), na których barwa ciała przystosowuje owady do występowania na określonym organie rośliny, a nawet jedynie na pewnej jego części. Ponieważ jednym z częstych objawów żerowania mszyc jest chloroza związana z obniżeniem poziomu chlorofilu, zmiany w zawartości zielonych barwników, stanowią użyteczny wskaźnik tolerancji roślin na żerowanie tych owadów. NI i współaut. (2002) podają, że żerowanie Diuraphis noxia (Kord.) na pszenicy powodowało początkowo spadek zawartości chlorofilu a i b oraz karotenoidów w miejscu ataku oraz wzrost aktywności Mg-chelatazy, a po pewnym czasie spadek wartości proporcji chlorofil a/b. R. padi również przyczyniała się do zmniejszenia zawartości karotenoidów, przy równoczesnym braku zmian w zawartości chlopospolitego (Sorbus aucuparia L.) oraz dębu skalnego (Querqus coccifera L.) przez mszyce, a wiosną redukowało uszkodzenia powodowane przez wykluwające się z jaj larwy. Mając na uwadze wrażliwość owadów roślinożernych na czerwoną barwę liści, dotyczącą zwłaszcza mszyc dwudomnych, dla których migracje jesienne są ważnym elementem cykli życiowych, Hamilton na początku poprzedniej dekady sformułował hipotezę, iż zmiana zabarwienia liści drzew jesienią jest wynikiem procesu koewolucji (ARCHETTI 2000). Zakłada ona, że zabarwienie intensywne (zwłaszcza czerwone) jest dla owadów sygnałem ostrzegawczym o zdolności żywiciela do uruchomienia skutecznych reakcji obronnych, natomiast mniej kontrastowe (zielone) świadczy raczej o słabszym potencjale obronnym. Czerwona barwa uzależniona jest m.in. od zawartości antocyjanów, których przemiany są bezpośrednio związane z metabolizmem związków fenolowych, należących do znanych biomolekuł obronnych roślin. Na podstawie wieloletnich badań z wykorzystaniem wielu różnych roślin drzewiastych, KA- RAGEORGOU i współaut. (2008) wykazali, że intensywność czerwonego zabarwienia starzejących się liści była dodatnio skorelowana z zawartością fenoli ogólnych w przeważającej większości badanych gatunków. Czerwona lub żółta barwa liści może ponadto sygnalizować ich niską wartość pokarmową, związaną z niedostateczną zawartością substancji odżywczych. Wykazano, że mszyce lepiej rozwijały się wiosną na drzewach, które później zrzucały liście jesienią (były to przeważnie rośliny utrzymujące w tym okresie zieloną barwę), a tym samym dłużej zachowywały zdolność fotosyntezy (ARCHETTI i współaut. 2009). Ponadto karotenidy i antocyjany, nagromadzane jesienią w liściach drzew zabarwionych na żółto lub czerwono, mogą pozytywnie wpływać na przebieg fotosynte-

45 576 CEZARY SEMPRUCH rofili. Straty te były jednak kompensowane poprzez zwiększanie zawartości barwników w nieuszkodzonych bezpośrednio regionach zaatakowanych organów, co było m. in. wynikiem tolerancji pszenicy na żerowanie tych dwóch gatunków mszyc. Innym przykładem oddziaływania mszyc na zawartość barwników w zaatakowanych tkankach może być powstawanie czerwonych plam na dojrza- łych liściach Sorghum halefense (L.) zaatakowanych przez Sipha flava (Forb.), związane z lokalnym nagromadzaniem antocyjanów (COSTA-ARBULÚ i współaut. 2001, GONZÁLES i współaut. 2002). Jednak udział tego procesu w mechanizmach odporności indukowanej żerowaniem mszyc nie został dotychczas wyjaśniony. ROŚLINNE ZWIĄZKI LOTNE Kolejną grupą biomolekuł, które mogą wpływać na kierunek przemieszczania się mszyc przed bezpośrednim kontaktem z żywicielem są niskocząsteczkowe związki lotne (ang. volatile organic compounds, VOCs) (PICKET i współaut. 1992). CIEPIELA i współaut. (1990) stwierdzili, że VOCs z liści względnie odpornej odmiany pszenicy były repelentami dla S. avenae, podczas gdy w przypadku odmiany podatnej substancje te wykazywały właściwości atraktantów. Według BERNASCONI i współaut. (1998) jednoczesne zranienie roślin kukurydzy i potraktowanie wymiocinami gąsienic w miejscach zranień, wywoływało emisję VOCs, które odstraszały uskrzydlone samice R. maidis. Autorzy sugerują, że powstający w ten sposób zapach mógł być odbierany przez mszyce jako informacja o (i) produkcji związków toksycznych, (ii) obecności na roślinie potencjalnych konkurentów lub o (iii) wabieniu przez roślinę parazytoidów i drapieżców. Nowsze prace dowodzą jednak, iż udział VOCs w biochemicznych interakcjach środowiskowych jest zdecydowanie bardziej złożony, dotyczyć może bowiem komunikacji roślin nie tylko z roślinożercami i ich wrogami naturalnymi, ale także innymi elementami ekosystemu. Według UNSICKER i współaut. (2009), roślinne VOCs mogą przekazywać sygnały pomiędzy poszczególnymi częściami tej samej rośliny (komunikacja wewnątrzgatunkowa) oraz między różnymi roślinami, a także uczestniczyć w oddziaływaniach allelopatycznych i w obronie roślin przed stresem termicznym i oksydacyjnym oraz atakiem patogenów i roślinożerców. KELLNER i współaut. (2010) podają, iż VOCs emitowane przez jęczmień (Hordeum vulgare L.), redukowały jego akceptację przez R. padi, a siła tego oddziaływania uzależniona była od wieku roślin. Ponadto mszyce były wrażliwe na zmiany zachodzące w tkankach jęczmienia, indukowane przez VOCs pochodzące z innych roślin, zaatakowanych wcześniej przez te owady (NINKOVIC i ÅHMAN 2009). Dotychczasowe badania wskazują, że udział VOCs w tych procesach rozpoczynać się może już na poziomie transkrypcyjnym, w powiązaniu ze szlakiem sygnalizacyjnym lotnego fitohormonu etylenu (ET). VOCs, a zwłaszcza tzw. związki lotne zielonych liści (ang. green leaf volatiles, GLVs) emitowane w następstwie żerowania roślinożerców indukowały w tkankach niezaatakowanych roślin transkrypcję genów kodujących niektóre białka PR (ang. pathogenesis related): -1,3-glukanaza (PR-2) i chitynaza (PR-3), białka enzymatyczne biorące udział w reakcjach obronnych roślin: np. amoniakoliaza L-fenyloalaniny (PAL), lipoksygenaza (LOX) i syntetaza fernazylopirofosforanowa (FPS) oraz enzymy biosyntezy ET: syntaza S-adenozylometioniny (SAM), oksydaza kwasu 1-aminocyklopropano-1-karboksylowego (ACO) oraz dekarboksylaza SAM (SAMDC) (BALDWIN i współaut. 2002). Ponadto, związki lotne generowane w uszkodzonych przez roślinożerców tkankach roślinnych mogą nie wywoływać bezpośrednich odpowiedzi obronnych u innych roślin, ale przygotować ich metabolizm do późniejszych reakcji, uruchamianych dopiero w następstwie ataku kolejnych roślinożerców (ang. priming) (UNSICKER i współaut. 2009). Roślinne VOCs stanowią grupę ponad niskocząsteczkowych związków, przy czym jednorazowo emitowane mogą być mieszaniny nawet ponad 100 różnych składników, spośród których większość występuje w śladowych ilościach (ARIMURA i współaut. 2005). Badania nad jakościowym i ilościowym składem mieszanin VOCs, uczestniczących w interakcjach rośliny-owady dowiodły, że główne ich składniki to monoterpeny, o strukturze opartej na łańcuchach dziesięciowęglowych (C 10 ), seskwiterpeny (C 15 ) oraz GLVs, takie jak: aldehydy (C 6 ) oraz alkohole i estry pochodzące z przemian kwasów tłusz-

46 Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela 577 czowych, przebiegających z udziałem lipoksygenazy (Ryc. 2). Przykładowo, (E)-b-fernazen (EBF), emitowany przez transgeniczne rośliny rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana L.) był repelentem M. persicae (UNSICKER i współaut. 2009). Seskwiterpen ten, jako feromon alarmowy, wytwarzany jest przez wiele gatunków mszyc i stanowi dla osobników znajdujących się w pobliżu sygnał do zaprzestania żerowania i ucieczki. Według VANDERMOTEN i współaut. (2012), EBF może indukować także długoterminowe procesy zmierzające do zmian w strukturze populacji mszyc, jak np. tworzenie morf uskrzydlonych (uskrzydlanie się). Przykładem repelentu zapobiegającego składaniu jaj przez kłująco-ssącego wciornastka zachodniego (Frankliniella occidentalis Pergande) jest nikotyna (UNSIC- KER i współaut. 2009). Z kolei GLINWOOD i PETTERSON (2000) podają, że czeremcha zwyczajna emitowała lotny ester metylowy kwasu salicylowego (Me-SA) o właściwościach repelentnych w stosunku do letnich migrantek R. padi, którego efektywność zależała jednak od wieku mszyc. Me-SA był także repelentem dla innych gatunków mszyc zbożowych i dla A. fabae (CHAMBERLEIN i współaut. 2001). Ponadto, rośliny czarnej porzeczki (Ribers nigrum L.), jako pierwotnego żywiciela mszycy sałatowej (Nasonovia ribisnigri Mosley), intensywnie emitowały lotny cis-jasmon w okresie migracji wiosennych (Ryc. 2). Związek ten był repelentem dla migrantek tego gatunku oraz dla mszyc zbożowych i mszycy śliwowo-chmielowej (Phorodon humuli Schr.), co wskazuje na możliwość udziału roślinnych VOCs w biochemicznych uwarunkowaniach zmiany żywiciela przez mszyce dwudomne. Emisja roślinnych związków lotnych stanowi ważny mechanizm odporności indukowanej roślin przeciwko owadom roślinożernym. W niektórych przypadkach występuje ona lokalnie, w wyniku uszkodzeń kompartymentów komórek roślinnych, w których nagromadzane są VOCs, jak wakuola czy włoski wydzielnicze (BALDWIN i współaut. 2002). Inne spośród tych związków syntetyzowane są de novo, zarówno w reakcjach lokalnych, jak i systemicznych, a ich poziom i emisja są ściśle kontrolowane. Skład mieszaniny VOCs zależy od sposobu uszkodzenia (np. pojedyncze bądź powtarzające się zranienia), charakteru bodźca (żerowanie lub składanie jaj przez owady) i ulega modyfikacji pod wpływem takich czynników abiotycznych, jak: dostępność azotu i fosforu, wilgotność gleby i powietrza, nasłonecznienie i temperatura (MAFFEI i współaut. 2007). Przykładowo, zranienie liści bylicy trójzębnej (Artemisia tridentata Nutt.) wywoływało emisję znacznych ilości niestabilnego termodynamicznie i aktywnego biologicznie enancjomeru estru metylowego kwasu jasmonowego (Me- -JA) (Ryc. 2). Żerowanie zdobniczki orzechowej większej (Panaphis juglandis Goetze) Ryc. 2. Przykłady roślinnych związków lotnych.

47 578 CEZARY SEMPRUCH powodowało zmiany w składzie związków lotnych emitowanych przez liście orzecha włoskiego (Juglans regia L.), obejmujące syntezę de novo czterech składników, wzrost zawartości siedmiu i spadek dwóch (KRZY- ŻANOWSKI i LESZCZYŃSKI 2011). Wśród VOCs emitowanych przez liście orzecha w następstwie żerowania mszyc, występowały monoterpeny ( - i -pinen, -myrcen, limonen, trien santoliny), seskwiterpeny ( -fernasen, (Z,E)- -fernasen, naftalen), alkohole ((E)- terpineol, farnesol) oraz węglowodory alifatyczne (octan (Z)-3-heksenylu). Badania z wykorzystaniem modelowej rośliny A. thaliana dowiodły, że emisja VOCs należy do reakcji obronnych powiązanych ze szlakiem sygnalizacyjnym kwasu jasmonowego (JA). Według DEGENHARDT i współaut. (2010) egzogenny JA wywoływał emisję VOCs u pomidora oraz podtrzymywał wydzielanie tych związków, zapoczątkowane zranieniami tkanek przez gąsienice zawisaka tytoniowego (Manduca sexta L.). Z kolei MAFFEI i współaut. (2007) wykazali że skład mieszaniny VOCs może być efektem oddziaływań krzyżowych między jonami Ca 2+, reaktywnymi formami tlenu (ROS), JA, kwasem 12-oksofitodienowym, salicylanem (SA) i ET. O złożonym charakterze przedstawionych interakcji na poziomie molekularnym oraz pod względem efektu biologicznego, świadczyć może indukcja biosyntezy (E)- -ocimenu w fasoli limnijskiej pod wpływem żerowanie mączlika ostroskrzydłego (Bemisia tabaci Genn.), powiązana ze wzrostem odporności na przędziorka chmielowca (Tetranychus urticae Koch.) (DE VOS i JANDER 2010). Znaczenie VOCs w mechanizmach odporności indukowanej wiąże się także z ich udziałem w pośrednich mechanizmach obronnych roślin, przebiegających na trzech poziomach troficznych. Udowodniono bowiem, że związki te wpływały na orientację drapieżnych biedronek i pasożytniczych błonkówek z rodzin Chrysopidae i Syrphidae, przy czym w niektórych specyficznych interakcjach pełniły one dwojakie funkcje, jednocześnie odstraszając roślinożerców i wabiąc ich wrogów naturalnych (DE VOS i JANDER 2010). Przykładowo, VOCs emitowane przez A. thaliana w następstwie spryskania roztworem JA odstraszały M. persicae i wabiły ośćca mszycowego (Aphidius ervi Haliday). Z kolei cis-jasmon, obok odstraszania mszycy sałatowej, wykazywał aktywność atraktantną w stosunku do biedronki siedmiokropki (Coccinella septempunctata L.) i A. ervi (CHAMBERLAIN i współaut. 2001). Jednak udział jasmonidów w opisywanych oddziaływaniach może być w rzeczywistości bardziej złożony, gdyż oprócz bezpośredniego oddziaływania na zachowanie się mszyc i ich wrogów naturalnych, substancje te pełnią funkcje biomolekuł sygnalizacyjnych w mechanizmach systemicznej odporności indukowanej (ang. Induced Systemic Resistance, ISR). Według GIRLING i współaut. (2008) wabienie pasożytniczej błonkówki Diaeretiella rapae (Mc Intosch) przez mszyce M. persice, indukowane przez VOCs emitowane przez A. thaliana, powiązane było z syntezą JA poprzez szlak oktodekanowy, podczas gdy sygnalizacja zależna od salicylanu negatywnie wpływała na orientację parazytoida. Ponadto żerowanie mszycy śliwowo-chmielowej na chmielu zwyczajnym (Humulus lupulus L.) indukowało emisję Me-SA, który wykazywał właściwości repelentne w stosunku do P. humuli i R. padi, będąc równocześnie atraktantem dla złotooków i biedronek. POWELL i współaut. (1998) zasugerowali jednak, że profil związków lotnych emitowanych przez rośliny bobu (Vicia faba L.), w odpowiedzi na żerowanie A. fabae, różni się od tych, które wykorzystywane są przez mszyce do lokalizacji żywiciela. Osobniki A. ervi wykazywały zdolność rozróżniania VOCs bobu indukowanych przez A. pisum od tych, które wydzielane były w efekcie żerowania nieżywicielskiego gatunku A. fabae. Dodatkowo zaobserwowano tu swoiste uczenie się parazytoida, polegające na wykształcaniu wrażliwości na inne związki lotne, w następstwie wcześniejszego kontaktu z VOCs emitowanymi przez rośliny w następstwie ataku żywicielskiego gatunku mszycy. Pod wpływem żerowania A. fabae na bobie wzrastała zawartość takich związków lotnych, jak: octan (Z)-3-heksenylu, (Z)-3-heksen-1-ol, linalol i EBF, oraz syntetyzowany był de novo 6-metylo-5-hepten-2-on. Związek ten wywoływał reakcje elektrofizjologiczne u samic A. ervi, umożliwiając im lokalizację żywicielskich mszyc (DU i współaut. 1998). W odnajdowaniu żerujących na kapuście mszyc z polifagicznych i wyspecjalizowanych gatunków Brevicoryne brassicae (L.), M. persicae i L. erysimi przez D. rapae, ważną rolę odgrywają VOCs uwalniane w następstwie przemian glukozynolatów z udziałem mirozynazy, jak np. allil izotiocyjanianowy (POPE i współaut. 2008). Według VANDERMOTEN i współaut. (2012), w przypadku mszyc żerujących na kapuście, izotiocyjaniany wykazywały efekt

48 Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela 579 Ryc. 3. Przykłady związków wydzielanych przez włoski gruczołowe roślin. synergistyczny w stosunku do EBF, a ponadto mogły być toksyczne dla ich wrogów naturalnych. Niektóre owady drapieżne lokalizują żywicielskie mszyce z wykorzystaniem feromonów ich komunikacji wewnątrzgatunkowej. Wykazano, że samice A. ervi i Aphidius eadyi (Stary, Gonzales & Hall) oraz osobniki złotooków Chrysopa cognata (McLachlan) i Chrysopa oculata (Say) wabione były przez nepetalakton, który jest naturalnym feromonem płciowym u wielu gatunków mszyc (DE VOS i JAN- DER 2010). Feromony płciowe wytwarzane są jednak tylko w okresie reprodukcji płciowej mszyc, który jest stosunkowo krótki w całym ich cyklu rozwojowym. Stąd możliwość ich wykorzystania, jako atraktantów drapieżców i parazytoidów jest ograniczona. Zdecydowanie efektywniejsze są feromony alarmowe, które obok odstraszania mszyc, są często atraktantami ich wrogów naturalnych. Składnikiem feromonu alarmowego wielu gatunków mszyc, w tym M. persicae i A. pisum, jest EBF (VAN- DERMOTEN i współaut. 2012). Składnik ten wykazywał właściwości atraktantne w sto- sunku do parazytoidów z gatunków Aphidius uzbenistanicus (Luz.), A. ervi, D. rapae oraz drapieżnych biedronek, bzygowatych i biegaczowatych. W przypadku Therioaphis riehmi (Börn.) składnikiem feromonu alarmowego jest inny seskwiterpeny, germakren A, natomiast dla mszycy wykowej (Megoura viciae Buck.) funkcję tą spełniają takie monoterpeny jak: - i -pinen oraz -limonen. Innym ciekawym przykładem udziału VOCs w wielopoziomowych intearakcjach środowiskowych może być manipulowanie ich emisją przez roślinne wirusy, których wektorami są mszyce. Wykazano, że VOCs, emitowane przez rośliny porażone wirusami liściozwoju ziemniaka, żółtej karłowatości jęczmienia oraz mozaiki grochu i ogórka, były atraktantami dla M. persicae, R. padi, A. pisum i mszycy ogórkowej (Aphis gossypi Glov.), wpływając jednak negatywnie na ich żerowanie, wzrost i rozwój (DE VOS i JANDER 2010). Takie oddziaływanie sprzyjało częstym zmianom rośliny żywicielskiej przez mszyce, w następstwie których następowało szybsze rozprzestrzenianie się wirusów. WŁOSKI GRUCZOŁOWE I OKRYWOWE Włoski (trychomy) są niewielkimi wytworami pochodzenia epidermalnego. Różnią się rozmiarami, liczbą komórek oraz morfologią i składem chemicznym. Ze względu na pełnione funkcje dzielone są na niewydzielnicze (okrywowe) lub wydzielnicze (gruczołowe).

49 580 CEZARY SEMPRUCH W interakcjach rośliny-owady włoski okrywowe oddziałują w sposób mechaniczny, utrudniając poruszanie się roślinożerców i zapobiegając dostępowi do odżywczych tkanek roślinnych. Włoski gruczołowe wydzielają natomiast różne składniki chemiczne, m.in. wysoce toksyczne wtórne metabolity jak: terpeny, związki fenylopropenowe, acylosacharydy, długołańcuchowe ketony metylowe i flawonoidy (Ryc. 3), które negatywnie wpływają na żerowanie, wzrost i rozwój roślinożernych owadów (SCHILMILLER i współaut. 2008). Przykładem roślin o stosunkowo dobrze udokumentowanej budowie i funkcjach trychomów jest rodzaj Lycopersicon, gdzie dzieli się je na siedem klas (I-VII), wśród których typy I, IV, VI i VII pełnią funkcje wydzielnicze (SIMMONS i współaut. 2005). Odporność dzikich gatunków pomidora na roślinożerne stawonogi wynikała m.in. z obecności związków lotnych, takie jak 2-tridekanon i 2-undekanon w wydzielinie włosków typu VI (Ryc. 3). Według MUSETTI i NEAL (1997) wysoka odporność Lyocpersicon hirsutum f. glabratum (Mull.) na mszycę różano-szczecinową (Macrosiphum euphorbiae Thom.) wiązała się z podwyższonym zagęszczeniem włosków I, IV i VI typu. W wydzielinach tych trychomów występowały lepkie acylosacharydy, utrudniające poruszanie się roślinożernym owadom oraz długołańcuchowe ketony metylowe o właściwościach toksycznych. SIMMONS i współaut. (2005) podają, że skrzyżowanie pomidora zwyczajnego (Lycopersicon esculentum Mill.) z dzikimi gatunkami prowadziło do wzrostu liczby włosków, a w efekcie do zwiększenia odporności na owady roślinożerne. Przykładowo, hybryda L. pennelli L. esculentum, dzięki wyższemu zagęszczeniu włosków gruczołowych IV typu (wydzielających arestanty o strukturze acylosacharydów), była odporniejsza na M. euphorbiae i M. persicae od roślin z rodzicielskiego gatunku L. esculentum. Ponadto wysoka śmiertelność mszycy brzoskwiniowej na hybrydach L. pennelli L. esculentum i L. cheesmanii f. minor L. esculentum wiązała się z zagęszczeniem włosków wydzielniczych typów I i VII oraz niewydzielniczego typu III. Według WANG i współaut. (2004) w wydzielinach włosków tytoniu szlachetnego (Nicotiana tabacum L) występowały toksyczne dla mszyc diterpeny z grupy cembranoidów ( - i -cembratrienediole i ich prekursory) i labdanoidów (cis-abienol i labdenediol) oraz ich estry cukrowcowe (Ryc. 3). Wzrost stężenia a-cembratrieneolu (CBTolu), na skutek wyciszenia genu CYP71D16 kodującego hydroksylazę cytochromu P450, transformującą CBTol do -cembratrienediolu (CBTdiol) w tkankach roślin transgenicznych, negatywnie korelował z zagęszczeniem populacji Myzus nicotiana (Black.). Liście opornych na mszycę złocieniową (Macrosiphoniella sanbourni Gill.) odmian chryzantemy (Chrysanthemum grandiflorum Ramat.), pokryte były długimi i gęstymi włoskami wydzielniczymi oraz zawierały duże, wypełnione komórki gruczołowe (HE i współaut. 2011). Z kolei, XUE i współaut. (2008) podają, że na żerowanie A. gossypii na roślinach bawełny wpływała głównie bariera fizyczna tworzona przez wszystkie rodzaje włosków powierzchniowych, spośród których najefektywniej oddziaływały typy silnie rozgałęzione. Według autorów, wyższa podatność transgenicznych roślin tego gatunku na A. gossypii wynikała z insercji genu bt i jego oddziaływania na ekspresję innych genów, w tym na gen kodujący białko MYB, kontrolujące rozwój trychomów. W wydzielinach włosków gruczołowych mogą także występować białka obronne. W przypadku roślin z gatunku Solanum berthaultii (Hawk.) była to oksydaza polifenolowa, która może uczestniczyć w regulacji przebiegu interakcji z fitofagami (SHEPHARD i WAGNER 2007). W tkankach włosków N. tabacum występowała chitynaza i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD). Także włoski lucereny odznaczały się wysoką zawartością białek obronnych, a inhibitory proteaz z rodziny PJN2 ulegały konstytutywnej ekspresji w gruczołach włosków psianki czarnej (Solanum americanum Mill.). Brak jest jednak informacji na temat udziału białek trychomów w interakcjach rośliny-mszyce. W przypadku niektórych roślin, atak roślinożercy indukuje wytwarzanie większej liczby włosków na młodych liściach, a mechanizm ten kontrolowany jest przez szlak sygnalizacyjny JA lub jego estru metylowego, co sugeruje powiązanie z systemicznymi mechanizmami ISR (PFEIFFER i współaut. 2009). Ponadto VOCs wydzielane przez włoski gruczołowe mogą wabić wrogów naturalnych roślinożerców. Z drugiej jednak strony występowanie włosków na powierzchni roślin może ograniczać efektywność drapieżców i parazytoidów. Wykazano bowiem, że samice bzyga prążkowanego (Episyrphus balteatus De Geer) częściej zasiedlały i lepiej się rozmnażały na osobnikach mszycy brzoskwinio-

50 Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela 581 wej, żerujących na grochu niż na pomidorze i ziemniaku. Według VERHEGGEN i współaut. (2009) różnice te związane były z wyższym zagęszczeniem włosków powierzchniowych na roślinach psiankowatych. Trychomy pomi- dora w znacznym stopniu ograniczały przemieszczanie się larw drapieżcy, które często opuszczały powierzchnię roślin przed zaatakowaniem mszyc. KUTIKULA I WOSKI KUTIKULARNE Kutikula głównych organów roślin wyższych składa się z kutyny (rzadziej z kutanu) i wosków kutikularnych. Kutyna pod względem chemicznym jest polimerem, zbudowanym z łańcucha w- i środkowego, z hydroksyi epoksy- pochodnych kwasów tłuszczowych C 16 i C 18 oraz niewielkich ilości glicerolu, natomiast woski są mieszaniną długołańcuchowych związków alifatycznych, niekiedy z rozgałęzionymi łańcuchami węglowymi (EIGEN- BRODE i JETTER 2002, REINA-PINTO i YEPHRE- MOV 2009). Rzadziej w ich strukturach występują triterpeny (C 30 ) z grupy oleananów i ursanów, poliprenoidy, flawonoidy oraz fitosterole. Przykładowo, woski kutikularne ziemniaka (Solanum tuberosum L.) zawierały długołańcuchowe n-alkany, 2- i 3-metyloalkany, pierwszorzędowe alkohole, kwasy tłuszczowe, ketony metylowe, sterole, -amirynę, estry kwasów tłuszczowych, 2-alkanole oraz metylowe, etylowe, izopropylowe i fenyloetylowe estry kwasów tłuszczowych (SZAFRA- NEK i SYNAK 2006). Część wosków może być zlokalizowana poza kutikulą stanowiąc tzw. woski epikutikularne (ang. epicuticular waxes, EW), podczas gdy pozostające w obrębie matrix kutikularnej, nazywane są woskami intrakutikularnymi. EW mogą tworzyć gęsty cienki film, lub grubsze warstwy urozmaicone przez mikroskopijne kryształy o zróżnicowanych kształtach i wielkości, a ich obecność nadaje powierzchni roślin białawy odcień (BARTHLOTT i współaut. 1998) (Ryc. 4). Według SHEPHERD i współaut. (1999) w składzie EW maliny właściwej (Rubus idaeus L.) dominowały długołańcuchowe estry kwasów tłuszczowych i alkoholi o liczbie atomów węgla wahającej się w granicach C 38 -C 52 oraz estry terpenylowe złożone z a- i b-amiriny i cykloartenolu oraz kwasów C 16, C 18 i C 20. Dotychczasowe badania wskazują, że udział wosków powierzchniowych w interakcjach rośliny-mszyce ma raczej specyficzny charakter. Według NI i współaut. (1998) woski powierzchniowe pszenicy, owsa i jęczmienia, różniące się ultrastrukturą i składem chemicznym, w zróżnicowany sposób wpływały na zachowanie się podczas żerowania D. noxia, nie oddziaływując jednak na płodność tego gatunku. Rośliny z rodzaju Brassica ze słabo rozwiniętą pokrywą woskową były podatniejsze na M. persicae i odporniejsze na B. brassicae. EW liści kapusty nie miały natomiast wpływu na płodność i przyrost masy ciała L. erysimi. Bemisia argentifolii (Bel. & Perr.) preferowała B. oleracea z dobrze rozwiniętą pokrywą woskową, natomiast B. tabaci składała na takich roślinach mniej jaj. Niebieskawe, wysokowoskowe odmiany pszenicy były podatniejsze na S. avenae niż ciemnozielone rośliny ze słabo rozwiniętą pokrywą woskową. W przypadku S. graminum, woski występujące na powierzchni roślin sorgo stanowiły źródło bodźców wzrokowych i dotykowych, które oddziaływały antyksenotycznie. Tak zróżnicowane, a czasami wręcz przeciwstawne dane sugerują funkcjonowanie różnych mechanizmów oddziaływania wosków kutikularnych na owady kłująco-ssące. Według EIGENBRODE (2004) preferencje niektórych gatunków mszyc w stosunku do roślin z lepiej rozwiniętą pokrywą woskową wynikać mogą z zapobiegania nadmiernym stratom wody. Redukcja pokrywy woskowej na powierzchni roślin kapusty i grochu zwiększała ich podatność na stres wodny i suszy, co wiązało się także ze wzrostem odporności na B. brassicae Ryc. 4. Struktura powierzchni liści pszenżyta o wysokiej (po lewej) i niskiej (po prawej) zawartości wosków epikutikularnych (fot. A. Wójcicka).

51 582 CEZARY SEMPRUCH Ryc. 5. Przykłady związków występujących w składzie wosków powierzchniowych. i A. pisum. Z drugiej jednak strony woski powierzchniowe mogą być źródłem allelozwiązków, negatywnie oddziaływujących na stawonogi. EW odpornych na mszycę lucernianą (Therioaphis maculata Buck.) odmian lucerny (Medicago sativa L.) odznaczały się o 50% wyższą zawartością estrów niż podatne (CASTILLO i współaut. 2010). Mieszanina czterech pospolitych kwasów tłuszczowych występujących w ekstraktach wosków powierzchniowych liści Clytostoma callistegioides (Cham.) wpływała odstraszająco na mszyce, przy czym aktywnymi składnikami były nienasycone kwasy linolowy i linolenowy (Ryc. 5). Testowane niezależnie składniki nasycone, tj. kwas palmitynowy i stearynowy, stymulowały zasiedlanie roślin przez M. persicae, nie wykazując jednocześnie wpływu na R. padi. Rośliny maliny zwyczajnej z niższą zawartością estrów cykloartenylowych i a-amirylowych (Ryc. 5) oraz z wyższym poziomem estrów długołańcuchowych kwasów tłuszczowych i krótkołańcuchowych alkoholi były chętniej akceptowane przez mszycę malinową (Amphorophora ideai Börn.) (SHEPHEARD i współaut. 1999). Zwiększona zawartość alkoholi, aldehydów i kwasów tłuszczowych w woskach powierzchniowych liści pszenicy wpływała negatywnie na mszyce (WANG i współaut. 2008). Silnie rozwinięte pokrywy woskowe na roślinach pszenżyta zakłócały żerowanie i rozwój mszyc zbożowych z gatunków S. avenae, R. padi i Metopolophium dirhodum (Walk.), a o chemicznym podłożu tych oddziaływań świadczyć mogą zmiany w liczebności oraz przebiegu żerowania i rozwoju mszyc, obserwowane po usunięciu EW z roślin wysokowoskowych rodów pszenżyta oraz po ich naniesieniu na rośliny ze słabo rozwiniętą pokrywą woskową (WÓJCICKA 2003, 2011; WÓJCIC- KA i współaut. 2009, 2010a, b). EW z wysokowoskowych rodów pszenżyta odznaczały się niższą zawartością węglowodorów oktakozanu i tiakontanu, natomiast takie składniki, jak: 14,16-hentriakontanedion i ester propylowy kwasu 2-(heksadocyloksy)-3-(oktadocyloksy) laurynowego występowały tylko w ekstraktach z dobrze rozwiniętych pokryw woskowych (WÓJCICKA i LESZCZYŃSKI 2004, WÓJCICKA i współaut. 2004). W składzie wosków powierzchniowych fasoli, będącej rośliną żywicielską dla A. fabae, występowały węglowodory C 23, octany i aldehydy, podczas gdy 1-heksakosanol i 1-heksakosanal obecne były tylko w ekstraktach woskowych z roślin owsa, nie będących roślinami żywicielskimi (POWELL i współaut. 1999). Usunięcie wosków powierzchniowych zwiększyło liczbę mszyc akceptujących rośliny owsa, przy czym allelozwiązkiem odpowiedzialnym za te oddziaływania był 1-heksakosanol (Ryc. 5). Według REINA-PINTO i YEPHREMOV (2009) istotną rolę w ochronie roślin przed stresem abiotycznym i biotycznym odgrywać mogły niskocząsteczkowe (7 9 kda), zasadowe (pi ok. 9) białka przenoszące lipidy (ang. lipid transfer proteins, LPTs), zdolne do wiązania i transferu kwasów tłuszczowych, estrów acylo-coa, fosfolipidów i ich pochodnych. Stanowią one jedną z grup obronnych białek PR (PR-14). Wiele LPTs zlokalizowanych jest w epidermie w powiązaniu z kutikulą, gdzie prawdopodobnie mogą transportować molekuły wosków i monomery kutyny z zewnętrznych błon plazmatycznych do miejsc formowania kutikuli. Inny mechanizm oddziaływania wosków powierzchniowych na owady związany jest

52 Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela 583 z utrudnianiem utrzymywania i poruszania się na powierzchni roślin. Oddziaływanie takie opisano dla roślin kapustnych, grochu i eukaliptusa oraz do różnych gatunków roślinożernych chrząszczy (EIGENBRODE i JET- TER 2002). Mechanizm ten wydaje się być także istotny w przypadku mszyc. Przykładowo, zróżnicowanie geometrii odnóży B. brassicae i L. erysimi może być wyrazem adaptacji tych gatunków do żerowania na roślinach z różną strukturą powierzchni, spowodowaną obecnością różnych pokryw woskowych (EIGENBRODE 2004). Ponadto w interakcjach rośliny-mszyce ważny jest wpływ EW na ześlizgiwanie się z powierzchni roślin naturalnych wrogów tych owadów, przy czym silniej oddziałują tu struktury mikrokrystaliczne niż gładki film. Na roślinach kapustnych ze zredukowanymi EW obserwowano więcej drapieżców i parazytoidów z rodzin Syrphidae, Anthocoridae, Staphylinidae i Dermaptera. Utrzymywanie się na powierzchni roślin przez drapieżną biedronkę azjatycką (Hippodamia convergens Guer. & Men.) i Chrysoperla plorabunda (Fitch) skorelowane było z efektywnością ograniczania liczebności fitofagów. Drapieżne biedronki i pasożytnicze błonkówki efektywniej ograniczały liczebność populacji A. pisum na roślinach grochu ze zredukowaną pokrywą woskową. Pasożytnicza Encarsia pergandiella (Howard) wydawała 2-4-krotnie więcej potomstwa oraz zwiększała śmiertelność B. tabbaci na roślinach niskowoskowych. Także pasożytnictwo A. ervi wzrastało na A. pisum na roślinach ze zredukowanymi woskami powierzchniowymi, a osobniki D. rapae skuteczniej ograniczały liczebność fitofa- gów po usunięciu pokrywy EW. Według EIGENBRODE (2004), kryształy EW silniej oddziałują na przytwierdzanie się owadów do powierzchni roślin niż gładki film, co może mieć cztery przyczyny: (i) krystaliczne agregaty EW ograniczają powierzchnię przytwierdzania się owada do powierzchni roślin, (ii) odczepiające się kryształy zanieczyszczają organy owadów odpowiadające za przytwierdzanie się do powierzchni roślin, (iii) EW zakłócają wilgotną adhezję poprzez adsorbowanie lipofilowych wydzielin tarsalnych owadów i (iv) wydzieliny tarsalne rozpuszczają kryształy EW, co w konsekwencji powoduje powstawanie na powierzchni roślin warstw cieczy lub koloidu. Ponadto pewną rolę mogą tu także odgrywać różnice w składzie chemicznym. Wykazano bowiem, że kwas C 22 n-alkanowy efektywniej ograniczał przytwierdzanie się H. convergens niż n-alkan-1-ol o analogicznej długości łańcucha węglowego, co może być związane z różnicami w oddziaływaniu tych związków na wilgotną adhezję owadów na powierzchni roślin (EIGENBRODE i JETTER 2002). Obok oddziaływania na wrogów naturalnych, woski powierzchniowe mają także wpływ na porażenie mszyc przez chorobotwórcze grzyby. Większa liczba mumii A. fabae z objawami porażenia przez Pandora neoaphidis (Rem. &. Hen.) występowała na grochu ze zredukowanymi woskami powierzchniowymi (DUETTING i współaut. 2003). Miało to związek z ułatwioną adhezją i kiełkowaniem konidiów grzyba na roślinach z gorzej rozwiniętymi pokrywami woskowymi, co z kolei zwiększało tempo i stopień infekcji. PODSUMOWANIE Dynamiczny rozwój warsztatu badawczego w ostatnich dekadach umożliwił uzyskanie wielu nowych informacji na temat znaczenia barwy roślin, roślinnych VOCs, włosków powierzchniowych oraz kutikululi i wosków epikutikularnych w interakcjach rośliny-mszyce, co zweryfikowało dotychczasowe poglądy na ten temat. Przedstawione w pracy dane świadczą, iż udział ww. czynników we wczesnych etapach wyboru żywiciela ma często charakter wielopłaszczyznowy, obejmujący różne poziomy troficzne. Zależności te rozpatruje się zarówno w sferze mechanizmów konstytucyjnych, jak i indukowanych żerowaniem mszyc, a ich dokładne poznanie jest obecnie przedmiotem intensywnych badań, prowadzonych często z wykorzystaniem najnowszych technik badawczych.

53 584 CEZARY SEMPRUCH INTERAKCJE MIĘDZY MSZYCAMI A ROŚLINAMI WE WSTĘPNYCH ETAPACH WYBORU ŻYWICIELA Streszczenie Praca stanowi przegląd informacji na temat biochemicznych i morfologicznych interakcji między mszycami i roślinami podczas wczesnych etapów selekcji żywiciela. Na lądowanie migrujących morf mszyc na żywicielu wpływają najpierw bodźce wzrokowe i węchowe. Żółte i zielone barwniki stymulują zasiedlanie roślin, natomiast niebieskie i czerwone hamują. Ponadto, lotne związki organiczne (VOCs) mogą wpływać na mszyc na początku kolonizacji jako atraktanty lub repelenty. Z drugiej strony mszyce, uszkadzając liście lub inne tkanki roślinne, stymulują emisję VOCs, które zapoczątkowują obronę pośrednią, wabiąc biedronki, pasożytnicze błonkówki i inne parazytoidy lub drapieżców. Związki lotne emitowane w odpowiedzi na żerowanie mszyc mogą partycypować w komunikacji między różnymi roślinami oraz w interakcjach trójtroficznych rośliny-wirusy-mszyce. Po wylądowaniu na powierzchni rośliny mszyce narażone są na oddziaływanie barie mechanicznych, wytwarzanych przez włoski powierzchniowe i kutikulę. W tym etapie interakcji ważną rolę mogą odgrywać toksyny i aresanty wydzielane przez włoski wydzielnicze oraz niektóre związki zlokalizowane na powierzchni rośliny. Jednak struktura i skład chemiczny powierzchni rośliny może także zakłócać behawior naturalnych wrogów mszyc. INTERACTIONS BETWEEN APHIDS AND PLANTS DURING EARLY STEPS OF THE HOST SELECTION Summary Data on biochemical and morphological interactions between aphids and plants during early steps of the host selection were reviewed. Landing of migratory aphid morphs on the hosts is affected by visual and aromatic stimuli at the first step of the colonization. Plant settling is stimulated by yellow and green pigments and depressed by blue and red ones. Moreover, volatile organic compounds (VOCs) may influence the aphids as attractants or repellents at the beginning of colonization. On the other hand, aphid damage to leaves and other plant tissues stimulates release of VOCs that initiate indirect defence through attracting of ladybugs, parasitic wasps and other parasitoids, and predators. In addition, volatile compounds emitted as a result of aphid feeding may participate in plant-plant communication and plantvirus-aphid interactions. After landing aphids are subjected to mechanical barriers formed by trichomes and/or cuticle. Toxins and arrestants secreted by glandular trichomes as well as some compounds localized on plant surface may play important role during this step of the interactions. However, structural and chemical properties of plant surface may also disturb aphids predation by their natural enemies. LITERATURA ARCHETTI M., The origin of autumn colours by coevolution. J. Theor. Biol. 205, ARCHETTI M., DÖRING T. F., HAGEN S. B., HUGHES N. M., LEATHER S. R., LEE D. W., LEV-YADUN S., MANE- TAS Y., OUGHAM H. J., SCHABERGAND P. G., THOMAS H., Unravelling the evolution of autumn colours: an interdisciplinary approach. Trends Ecol. Evol. 24, ARIMURA G., KOST C., BOLAND W., Herbivore- -induced, indirect plant defences. Bioch. Bioph. Acta 1734, BALDWIN I. T., KESSLER A., HALITSCHKE R., Volatile signalling in plant-plant-herbivore interactions: what is real? Cur. Opin. Plant Biol. 5, 1 4. BARTHBOTT W., NEINHUIS C., CUTLER D., DITSCH F., MEUSEL I., THEISEN I., WILHELMI H., Classification and terminology of epicuticular waxes. Bot. J. Linnean Soc. 126, BERNASCONI M. L., TURLINGS T. C. J., AMBROSETTI L., BASSETTI P., DORN S., Herbivore-induced emission of maize volatiles repel the corn leaf aphid Rhopalosiphum maidis. Ent. Exp. Appl. 87, CASTILLO L., DIAZ M., GONZÁLEZ-COLOMA A., GONZÁLEZ A., ALONSO-PAZ E., BASSAGODA M. J. ROSSINI C., Clytostoma callistegioides (Bignoniaceae) wax extract with activity on aphid settling. Phytochemistry 71, CHAMBERLEIN K., GUERRIERI E., PENNACCHIO F., PET- TERSSON J., PICKETT J.A., POPPY G. M., POWELL W., WADHAMS L. J., WOODCOCK C. M., Can aphid-induced plant signals be transmitted aerially and through the rhizosphere. Bioch. Syst. Ecol. 29, CIEPIELA A., SEMPRUCH C., NIRAZ S., The influence of steam distilled chemical compounds from winter wheat on the biology of the grain aphid, Sitobion avenae. Proc. Conf. Insect Chem. Ecol. Tabor 1990, COSTA-ARBULU C., GIANOLI E., GONZÁLES W. L., NIE- MEYER H. M., Feeding by the aphid Sipha flava produces a reddish spot on leaves of Sorghum halepense: an induced defense? J. Chem. Ecol. 27, DEGENHARDT D. C., REFI-HIND S., STRATMANN J. W., LIN- COLN D. E., Systemin and jasmonic acid regulate constitutive and herbivore-induced systemic volatile emission in tomato, Solanum lycopersicum. Phytochemistry 71, DE VOS M., JANDER G., Volatile communication in plant-aphid interactions. Cur. Opin. Plant Biol. 13, DÖRING T. F., CHITTKA L., Visual ecology of aphids a critical review on the role of colours in host finding. Arth. Plant Interact. 1, 3 16.

54 Interakcje między mszycami a roślinami we wstępnych etapach wyboru żywiciela 585 DU Y., POPPY G. M., POWELL W., PICKET J. A., WAD- HAMS L. J., WOODCOCK C. M., Identification of semiochemicals released during aphid feeding that attract parasitoid Aphidius ervi. J. Chem. Ecol. 24, DUETTING P. S., DING H., NEUFELD J., EIGENBRODE S. D., Plant waxy bloom on peas affects infection of pea aphids by Pandora neoaphidis. J. Invert. Path. 84, EIGENBRODE S. D., The effect of plant epicuticular waxy blooms on attachment and effectiveness of predatory insects. Arthrop. Struct. Develop. 33, EIGENBRODE S. D., JETTER R., Attachment of plant surface waxes by an insect predator. Integr. Comp. Biol. 42, FERNIE A. R., The future of metabolic phytochemistry: larger number of metabolites, higher resolution, greater understanding. Phytochemistry 68, GIRLING R. D., MADISON R., HASSALL M., POPPY G. M., TURNER J. G., Investigations into plant biochemical wound-response pathways involved in the production of aphid-induced plant volatiles. J. Exp. Bot. 59, GLINWOOD R. T., PETERSON J., Change in response of Rhopalosiphum padi spring migrants to the repellent winter host component methyl salicylate. Ent. Exp. Appl. 94, GONZÁLES W. L., RAMÍREZ C. C., OLEA N., NIEMEYER H. M., Host plant changes produced by the aphid Sipha flava: consequences for aphid feeding behaviour and growth. Ent. Exp. Appl. 103, HE J., CHEN F., CHEN S., LV G., DENG Y., FANG W., LIU Z., GUAN Z., HE C., Chrysanthemum leaf epidermal surface morphology and antioxidant and defense enzyme activity in response to aphid infestation. J. Plant Physiol. 168, KARAGEORGOU P., BUSCHMANN C., MANETAS Y., Red leaf colour as a warning signal against insect herbivory: honest or mimetic? Flora 203, KELLNER M., KOLODINSKA BRANTESTAM A., ÅHMAN I., NINKOVIC V., Plant-volatile induced aphid resistance in barley cultivars is related to cultivar age. Theor. Appl. Genet. 121, KIRCHNER S. M., DÖRING T. F., SAUCKE H., Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera: Aphididae). J. Insect Physiol. 51, KRZYŻANOWSKI R., LESZCZYŃSKI B., The impact of aphid Panaphis juglandis feeding on the emission of volatile compounds. Abstr. 6 th World Congr. Allelopathy, 136. LESZCZYŃSKI B., Mechanizmy odporności pszenicy ozimej na mszycę zbożową. WSRP, Siedlce. LEV-YADUN S., GOULD K. S., What do red and yellow autumn leaves signal? Bot. Rev. 73, MAFFEI M. E., MITCHÖFER A., BOLAND W., Insect feeding on plants: rapid signals and responses preceding the induction of phytochemical release. Phytochemistry 68, MUSETTI L., NEAL J. J., Resistance to the pink potato aphid, Macrosiphum euphorbiae, in two accessions of Lycopersicon hirsrutum f. glabratum. Ent. Exp. Appl. 84, NI X., QUISENBERRY S. S., SIEGFRIED B. D., LEE K. W., Influence of cereal leaf epicuticular wax on Diuraphis noxia probing behavior and nymphoposition. Ent. Exp. Appl. 89, NI X., QUISENBERRY S. S., HENG-MOSS T., MARKWELL J., HIGLEY L., BAXENDALE F., SARATH G., KLUCAS R., Dynamic change in photosynthetic pig- ments and chlorophyll degradation elicited by cereal aphid feeding. Ent. Exp. Appl. 105, NINKOWIC V., ÅHMAN I. M., Aphid acceptance of Hordeum genotypes is affected by plant volatile exposure and is correlated with aphid growth. Euphytia 169, PFEIFFER M., TOOKER J. F., LUTHE D. S., FELTON G. W., Plants on early alert: glandular trichomes as sensors for insect herbivores. New Phytol. 184, PICKETT J. A., WADHAMS L. J., WOODCOCK C. M., HAR- DIE J., The chemical ecology of aphids. Ann. Rev. Ent. 37, POPE T. W., KISSEN R., GRANT M., PICKETT J. A., ROSSI- TER J. T., POWELL G., Comparative innate responses of the aphid parasitoid Diaeretiella rapae to alkenyl glucosinolate derived isothiocyanates, nitriles, and aphithionitriles. J. Chem. Ecol. 34, POWELL G., MANIAR S. P., PICKETT J. A., HARDIE J., Aphid responses to non-host epicuticular lipids. Ent. Exp. Appl. 91, POWELL W., PENNACCHIO F., POPPY G. M., TREMBLAY E., Strategies involved in the location of hosts by the parasitoid Aphidius ervi Haliday (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiinae). Biol. Control 11, PROKOPY R. J., Response of apple maggot flies to rectangles of different colors and shades. Environ. Ent. 1, PROKOPY R. J., OWENS E.D., Visual detection of plants by herbivorous insects. Ann. Rev. Ent. 28, REINA-PINTO J. J., JEPHREMOV A., Surface lipids and plant defences. Plant Physiol. Bioch. 47, SCHAEFER H. M., WILKINSON D. M., Red leaves, insects and coevolution: a red herring? Trends Ecol. Evol. 19, SCHILMILLER A. L., LAST R. L., PICHERSKY E., Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compound. Plant J. 54, SHEPHARD R. W., WAGNER G. J., Phylloplane proteins: emerging defenses at the aerial frontline? Trends Plant Sci. 12, SHEPHARD T., ROBERTSON G. W., GRIFFITHS D. W., BIRCH A. N. E., Epicuticular wax ester and triacylglycerol composition in relation to aphid infestation and resistance in red raspberry (Rubus idaeus L.). Phytochemistry 52, SIMMONS A. T., MCGRATH D., GURR G. M., Trichome characteristics of F1 Lycopersicon esculentum L. cheesmanii f. minor and L. esculentum L. pennellii hybrids and effects on Myzus persicae. Euphytica 144, SZAFRANEK B. M., SYNAK E. E., Cuticular waxes from potato (Solanum tuberosum) leaves. Phytochemistry 67, UNSICKER S. B., KUNERT G., GERSHENZON J., Protective perfumes: the role of vegetative volatiles in plant defense against herbivores. Cur. Op. Plant Biol. 12, VANDERMOTEN S., MESCHER M. C., FRANCIS F., HAUBRU- GE E., VERHEGGEN F. J., Aphid alarm pheromone: An overview of current knowledge on biosynthesis and functions. Insect Bioch. Mol. Biol. 42, VERHEGGEN F. J., CAPELLA Q., SCHWARTZBERG E. G., VOIGT D., HAUMBRUGE E., Tomato-aphid- -hoverfly: a tritrophic interaction incompatibile for pest management. Artrop. Plant Inter. 3, WANG E., HALL J. T., WAGNER G. J., Transgenic Nicotiana tabacum L. with enhanced trichome

55 586 CEZARY SEMPRUCH exudate cembratieneols has reduced aphid infestation in the field. Mol. Breed. 13, WANG E., HALL J. T., WAGNER G. J., Transgenic Nicotiana Tabacum L. with enhanced trichome exudate cembratrieneols has reduced aphid infestation in the field. Mol. Breed. 13, WÓJCICKA A., Effect of tritcale surface compounds on growth and development of cereal aphids. Aphids Other Hemipter. Insects 13, WÓJCICKA A., Wpływ wosków powierzchniowych pszenżyta ozimego na elemnty biologii mszycy czeremchowo-zbożowej Rhopalosiphum padi. Post. Ochr. Rośl. 51, WÓJCICKA A., LESZCZYŃSKI B., Effect of triticale waxes on host selection by aphids. Harba Pol., 50, WÓJCICKA A., SALAK-WARZECHA K., LESZCZYNSKI B., Surface waxes possible triticale resistance factor to grain aphid. IOBC Bull. 27, WÓJCICKA A., LESZCZYŃSKI B., WARZECHA R., An influence of epicuticular waxes on feeding behaviour of grain aphid. Acta Bioch. Pol. 56 (Sup. 2), WÓJCICKA A., SEMPRUCH C., ŁUKASIK I., WARZECHA R., 2010a. Wpływ wosków powierzchniowych pszenżyta ozimego na zachowanie mszycy różano-trawowej Metopolophium dirhodum (Walker). Zesz. Prob. PNR 556, WÓJCICKA A., SEMPRUCH C., WARZECHA R., 2010b. Wpływ wosków powierzchniowych pszenżyta ozimego na wybór rośliny żywicielskiej przez mszyce zbożowe. Post. Ochr. Rośl. 50, XUE K., DENG S., WANG R. J., YAN F. M., XU C. R., Leaf surface factors of transgenic Bt cotton associated with the feeding behaviors of cotton aphids: aa case study on non-target effects. Sci. China Ser. C-Life Sci. 51,

56 Tom Numer 4 (297) Strony MAJA BOCZKOWSKA, JERZY PUCHALSKI Polska Akademia Nauk Ogród Botaniczny Centrum Zachowania Różnorodności Biologicznej w Powsinie Prawdziwka 2, Warszawa m.boczkowska@ihar.edu.pl TELOMERY I TELOMERAZA W KOMÓRKACH ROŚLINNYCH WSTĘP Historia badań nad telomerami i telomerazą sięga lat 30-tych ubiegłego wieku. Pierwsze doniesienia dotyczące funkcji końców chromosomów pochodzą z pracy Hermana Mullera nad mutantami Drosophila melanogaster. Na podstawie obserwacji aberracji chromosomowych sformułował on tezę, że końce chromosomu muszą pełnić w stosunku do niego funkcję ochronne. Jest on również autorem terminu telomer, który stworzył poprzez połączenie greckich słów: telos koniec i meros część (MULLER 1938). Barbara McClintock prowadząc badania nad cyklem pęknięcie-fuzja-mostek chromosomów Zea mays potwierdziła jednoznacznie funkcję telomerów (MCCLINTOCK 1941). Nie- stety przez kolejne trzy dekady właściwie nie prowadzono badań nad telomerami. Dopiero w latach 70-tych ubiegłego wiek wzrosło zainteresowanie tym tematem. Po raz pierwszy sekwencję telomerów opisali BLACKBURN i GALL w 1978 r. u orzęska Tetrahymena. Na odkrycie enzymu związanego z telomerami, telomerazy, przyszło poczekać jeszcze 7 lat. W 1985 roku GREIDER i BLACKBURN odkryły specyficzną dla telomerów terminalną transferazę. Odkrycie to, wraz z wcześniejszym wyjaśnieniem roli sekwencji telomerowego DNA w ochronie chromosomów przed degradacją (SZOSTAK i BLACKBURN 1982), zostało wyróżnione nagrodą Nobla w 2009r. TELOMERY Obecnie telomery definiuje się jako wyspecjalizowane struktury o nukleoproteinowym charakterze, zlokalizowane na końcach chromosomów organizmów eukariotycznych, w obrębie których nie występują sekwencje kodujące. U większości eukariontów telomerowe DNA jest dwuniciową cząsteczką o prostej sekwencji tandemowej, definiowanej przez matrycę RNA telomerazy (FAJKUS i współaut. 2005). Na końcu 3 występuje tzw. ogon G, czyli jednoniciowy fragment o różnej długości, charakteryzujący się wysoką zawartością guaniny (HENDERSON i BLACKBURN 1989, ZHAO i współaut. 2009). Ogon G poprzez zagięcie i wplecenie w dwuniciowy fragment telomerowego DNA tworzy trzeciorzędową strukturę nazywaną pętlą-t. Strukturę tę zaobserwowano u ssaków (GRIFFITH i współaut. 1999, PALM i DE LANGE 2008), a w świecie roślin u Pisum sativum (CESARE i współaut. 2003). W miejscu wplecenia ogona G dochodzi do odsunięcia jednej z nici dwuniciowego w tym miejscu telomerowego DNA i powstania struktury zwanej pętlą-d (GREIDER 1999). Uważa się, że utworzenie pętli chroni końcowy fragment telomeru przed rozpoznaniem go przez mechanizmy naprawcze komórki, jako miejsca pęknięcia dwuniciowej cząsteczki DNA oraz ogranicza dostęp telo-

57 588 MAJA BOCZKOWSKA, JERZY PUCHALSKI Ryc. 1. Schemat budowy telomeru oraz lokalizacji sześciu podstawowych białek telomerowych. merazy (GRIFFITH i współaut. 1999, PALM i DE LANGE 2008). Schematyczną budowę telomeru przedstawiono na Ryc. 1. Monomer telomerowy jest stosunkowo silnie zakonserwowany ewolucyjnie o ogólnym wzorze budowy 5 -T x (A)G y -3. Po raz pierwszy siedmionukleotydową sekwencję telomerową o wzorze TTTAGGG wykryto u Arabidopsis thaliana (RICHARDS i AUSBEL 1988). Późniejsze badania, bazujące głownie na technice FISH, potwierdziły występowanie tej sekwencji zarówno u jednokomórkowych glonów Chlorella vulgaris i Chlorella variabilis (HIGASHIYAMA i współaut. 1995, BLANK i współaut. 2010), u mszaków Pellia epiphylla (FUCHS i współaut. 1995), u nagonasiennych Pinus sylvestris (FUCHS i współaut. 1995), jak i gatunków okrytonasiennych np. u Lycopersicon esculentum (GNAL i współaut. 1991) czy u Secale cereale (SCHWARZACHER i HESLOP-HARRI- SON 1991). Jak się okazało, w świecie roślin istnieje jednak wiele odstępstw od powyżej przedstawionej budowy monomeru telomerowego. Jednym z nich jest gatunek jednokomórkowej zielenicy Chlamidomonas reinwardtii, u którego sekwencja telomerowa bazuje na powtórzeniach TTTTAGGG (PETRACEK i współaut. 1990). Istnieje również liczna grupa gatunków roślin jednoli- ściennych należących do rzędu Asparagales (około 6300 gatunków), u której występują charakterystyczne dla człowieka i innych kręgowców powtórzenia TTAGGG (ADAMS i współaut. 2001). Tajemnicą jednak pozostaje budowa telomerów u gatunków z rodzaju Allium; nie występuje tam żadna z dotychczas poznanych sekwencji telomerowych (FUCHS i współaut. 1995). Poza omówionymi powyżej różnymi typami budowy sekwencji telomerowej, powszechnie obserwuje się występowanie różnych odmian powtórzeń tandemowych w obrębie chromosomu (GANAL i współaut. 1991, RICHARDS i współaut. 1993). Zjawisko to powstaje na skutek nie całkowitej dokładności telomerazy w trakcie wydłużania telomerowego DNA, w efekcie czego powstają powtórzenia o zróżnicowanej liczbie nukleotydów T i G (TSUJIMOTO i współaut. 1997, 1999). Długość telomerów podlega precyzyjnej kontroli genetycznej i rozwojowej (GRE- IDER 1996) i waha się od 0,5 kb u Chlorella vulgaris, przez kb u Solanum esculentum, do 150 kb u Nicotiana tabacum (GNAL i współaut. 1991, HIGASHIYAMA i współaut. 1995, FAJKUS i współaut. 1995). Za skracanie telomerów w głównej mierze odpowiada proces niepełnej replikacji końców, który prowadzi do utraty końcowego fragmentu cząsteczki DNA podczas każdego podziału komórkowego. Jednak w przypadku roślin, aktywność telomerazy jest obserwowana głównie w tkankach merystematycznych, w których zachodzi większość podziałów komórkowych. Skracanie się telomerów w tym przypadku nie jest tak znaczące (OGUCHI i współaut. 1999). Nie zaobserwowano istotnych zmian w długości sekwencji telomerowej podczas ontogenezy Silene latifolia i Arabidopsis thaliana (RIHA i współaut. 1998, FIZGERALD i współaut. 1999). Natomiast w przypadku Hordeum vulgare dochodzi do utraty sekwencji telomerowej o długości 50 kb podczas rozwoju zarodka (KILIAN i współaut. 1995), co wskazuje na występowanie u tego gatunku mechanizmu szybkiego usuwania telomerów. Podobny mechanizm opisano u Sacharomyces cerevisie (LI i LUSTIG 1996). Do wydłużania telomerów dochodzi zaś w komórkach kallusa w kulturach in vitro. Zmiany tego typu zaobserwowano na przykład u Hordeum vulgare i Silene latifolia (KILIAN i współaut. 1995, RIHA i współaut. 1998).

58 Telomery i telomeraza w komórkach roślinnych 589 BIAŁKA TELOMEROWE Budowa i poprawne funkcjonowanie telomerów pozostaje w ścisłym związku z obecnością szeregu białek wchodzących w skład kompleksu telomerowego. Mimo iż sama sekwencja telomerowa jest stosunkowo silnie zakonserwowana ewolucyjnie, to grupa wiążących się z nią białek charakteryzuje się dużym zróżnicowaniem wśród dotychczas przebadanych organizmów. U człowieka i pozostałych ssaków telosom zbudowany jest z sześciu białek, a jedynie trzy z nich łączą się w bezpośredni sposób z sekwencją telomerową. TRF1 i TRF2 (ang. teomeric repeat biling factor 1 i 2) i wiążą się z dwuniciowym fragmentem telomeru (CHONG i współaut. 1995, BILAUD i współaut. 1997, LIU i współaut. 2004), natomiast POT1 (ang. protection of telomeres 1) z fragmentem jednoniciowym (BAUMANN i CECH 2001). Pozostałe trzy białka są do nich rekrutowane: TIN2 (ang. TRF1- intracting protein 2), TPP1 (ang. POT1/TIN2 organizig protein) i RAP1 (ang. Ras-related protein 1) (LIU i współaut. 2004, DE LANGE 2005). Jak wykazały ostatnie badania, białko RAP1 wiąże się również z sekwencją TTAGG występującą poza regionem telomerowym, w efekcie czego może przeciwdziałać niestabilności i rekombinacji w tych miejscach genomu (MARTINEZ i współaut. 2010). Świadczy to o potencjale białek telomerowych do pełnienia również innych, niezwiązanych z telomerami funkcji. U drożdży Saccharomyces cerevisiae jak dotąd wykryto tylko jedno białko telosomu wykazujące homologię do ludzkiego RAP1. Jednak w odmienny sposób wchodzi ono w interakcję z sekwencją telomerową wiąże się z nią bezpośrednio (BIANCHI i SHORE 2008). Obecny stan wiedzy z zakresu budowy i funkcji białek wchodzących w skład roślinnego kompleksu telomerowego jest nieporównywalnie mniejszy niż w przypadku drożdży czy człowieka. Dotychczas nie udało się zidentyfikować roślinnych białek, których funkcja byłaby w pełni homologiczna z trzema podstawowymi elementami ludzkiego telosomu. Zidentyfikowano na razie dwa białka wiążące się z jednoniciowymi powtórzeniami telomerowymi: GTBP1 (ang. G-strand specific single-stranded telomere-binding protein 1) u Nicotiana tabacum oraz STEP1 (singlestranded telomere-binding protein 1) u Arabidopsis thaliana (HIRATA i współaut. 2004, KWON i CHUNG 2004, LEE i KIM 2011). Wykryto również homologi białka POT1. Tworzy ono heterodimer z TPP1, który kontroluje aktywność telomerazy zarówno w pozytywny, jak i negatywny sposób (XIN i współaut. 2007, WANG i współaut. 2007). U Arabidopsis thaliana zidentyfikowano trzy homologi POT1: A, B i C, o zróżnicowanej funkcjonalności. POT1A łączy się z telomerazą i jest niezbędne do syntezy powtórzeń telomerowych, podczas gdy POT1B i C są zaangażowane w ochronę końców chromosomów (SHAKIROV i współaut. 2005, TANI I MURATA 2005, SURO- VTSEVA i współaut. 2007). Natomiast u mchu Physcomitrella patens zidentyfikowano tylko jedno białko POT1, którego funkcja wykazuje większe podobieństwo do tej pełnionej w komórkach kręgowców niż Arabidopsis thaliana (SHAKIROV i współaut. 2010). W 1999 r. wyizolowano również z Arabidopsis thaliana białko asocjujące do dwuniciowego fragmentu telomerowego DNA AtPur (TRE- MOUSAYGUE i współaut. 1999). Udało się także rozpoznać złożoną grupę białek zawierającą silnie zakonserwowaną domenę Myb. Jest ona charakterystyczna dla TRF1-2 i odpowiada za przyłączanie się tych białek do sekwencji telomerowej (BILAUD i współaut. 1996). W obrębie tej grupy udało się zidentyfikować rodzinę małych białek SMH (ang. single myb histone) zawierającą domenę Myb na końcu N (MARIAN i współaut. 2003). U kukurydzy wyizolowano pięć białek typu SMH (MARIAN i współaut. 2003), a u Arabidopsis trzy (HWANG i współaut. 2001; SCHRUMPFOVA i współaut. 2004, 2008). Odkryto również białka TRFL (TRF-like proteins), gdzie domena Myb jest zlokalizowana na końcu karboksylowym. Białka tego typu znaleziono u Arabidopsis thaliana, Oryza sativa i Nicotiana tabacum (YU i współaut. 2000, YANG i współaut. 2003, KARAMYSHEVA i współaut. 2004). W przypadku wszystkich opisanych powyżej białek nie udało się jednak dowieść bezsprzecznie ich funkcjonalnego powiązania z kompleksem telomerowym in vivo. Uzasadnione więc wydaję się być stwierdzenie, że nie poznano jeszcze najważniejszych białek asocjujących do dwuniciowej cząsteczki telomerowego DNA roślin. Telomerowe DNA, pomimo dużej ilości związanych z nim białek telomerowych, jest nawinięte na nukleosomy. Organizacja chromatyny w obrębie telomerów jest kolejną cechą, która nie wykazuje silnego zakonserwowania ewolucyjnego. U Arabidopsis thaliana region subtelomerowy jest silnie upakowaną

59 590 MAJA BOCZKOWSKA, JERZY PUCHALSKI heterochromatyną, natomiast sekwencja telomerowa wykazuje cechy euchromatyny (VA- RQUERO-SEDAS i współaut. 2010). U ssaków zaś obydwa te rejony tworzą skondensowaną heterochromatynę (BLASCO 2007). Telomero- we DNA nie zawiera jednak informacji pozycjonującej nukleosom, w związku z czym obserwuje się zaburzenia w regularności rozłożenia nukleosomów (MECHELLI i współaut. 2004; PISANO i współaut. 2006, 2007). ROLA TELOMERÓW Wyróżnia się pięć podstawowych funkcji telomerów. Główną rolą jest ochrona końców chromosomów przed rozpoznaniem jako pęknięć podwójnej nici DNA, w skutek czego dochodziłoby do niehomologicznego łączenia końców i powstawania chromosomów dicentrycznych oraz aktywacji enzymów nukleolitycznych (BLACKBURN 2005). Poza tym telomery pełnią jeszcze dodatkowo szereg innych funkcji w komórce, między innymi biorą udział w prawidłowym rozmieszczeniu chromosomów w interfazo- wym jądrze oraz odpowiadają za prawidłowy ich rozdział w czasie podziału komórkowego (MADDAR i współaut. 2001). Działają one jak zegar komórkowy, który mierzy historię replikacji i określa potencjał proliferacyjny komórki (BLACKBURN 2001, DUBRANA i współaut. 2001). Telomery tłumią również ekspresję genów położonych w ich sąsiedztwie (APARICIO i współaut. 1991), chociaż ich rola w wyciszaniu transkrypcyjnym nie jest do końca wyjaśniona. TELOMERAZA Pełna struktura holoenzymu telomerazy nie została jeszcze całkowicie opisana. Stan obecnej wiedzy wskazuje, że jest to kompleks rybonukleoproteinowy, w skład którego wchodzi szereg białek i cząsteczka RNA, wykazujący aktywność odwrotnej transkryptazy (LUNDBLAD 1998). Na centrum aktywności ludzkiej telomerazy składa się: telomerazowe RNA (TER lub TR), telomerazowa odwrotna transkryptaza (TERT) oraz dyskerina (DKC) (COHEN i współaut., 2007) (Ryc. 2). Telomerazowe RNA, TER, zawiera krótką sekwencję komplementarną do powtórzeń telomerowych, która wykorzystywana jest jako matryca dla odwrotnej transkrypcji (GREINER i BLACKBURN 1987, 1989; YU i współaut. 1990). Podjednostka ta różni się pomiędzy organizmami i sekwencją i rozmiarem (od 150 nt u Tetrahymena do ponad 1200 nt u Schizosaccharomyces pombe), jednak jej struktura drugorzędowa pozostaje silnie zakonserwowana (GRAEIDER i BLACK- BURN 1989, LINGNER i współaut. 1994, CHEN i współaut. 2000, LEONARDI i współaut. 2008, WEBB i ZAKIAN 2008). Jak dotąd udało się zidentyfikować telomerazowe RNA tylko u Arabidopsis thaliana (CIFUENTES-ROJAS i współaut. 2011). U tego gatunku występują dwie cząsteczki TER 1 i 2, kodowane w odrębnych loci i różniące się w znaczny sposób sekwencją nukleotydową. Ryc. 2. Schemat budowy holoenzymu telomerazy u człowieka (na górze) i u A. thaliana (na dole).

60 Telomery i telomeraza w komórkach roślinnych 591 Jednak tylko TER1 jest w istotny sposób zaangażowane w utrzymanie telomerów, oraz stanowi miejsce przyłączenia białka POT1 (CIFUENTES-ROJAS i współaut. 2011). Drugą podjednostkę stanowi telomerazowa odwrotna transkryptaza TERT, która katalizuje odwrotną transkrypcję telomerowych powtórzeń na matrycy telomerazowego RNA (LINGNER i współaut. 1997). Dotychczas udało się zidentyfikować geny kodujące tą podjednostkę u wielu różnych organizmów (SYKO- ROVA i FAJKUS 2009). Charakteryzuje się ona jednolitą budową u ewolucyjnie odległych organizmów. W budowie TERT wyróżnia się cztery domeny: na końcu aminowym i karboksylowym, odwrotnej transkryptazy oraz wiążącą RNA (KELLEHER i współaut. 2002). Wyizolowana z Arabidopsis podjednostka AtTERT ma wielkość 131 kda i zawiera wszystkie motywy aminokwasowe typowe dla odwrotnych transkryptaz oraz dodatkowo dwa motywy specyficzne tylko dla telomeraz (LINGNER i współaut. 1997, FITZGERALD i współaut. 1999, OGUCHI i współaut. 1999). Na podstawie analizy filogenetycznej określono również, że AtTERT wykazuje większe podobieństwo do podjednostki TERT człowieka niż drożdży i orzęsków (OGUCHI i współaut. 1999). AtTERT jest kodowana przez gen występujący w pojedynczej kopii, tak samo jak u człowieka (KILIAN i współaut. 1997, MEYER- SON i współaut. 1997, FITZGERALD i współaut. 1999, OGUCHI i współaut. 1999). U roślin ekspresja telomerazy jest tkankowo i rozwojowo specyficzna. Zachodzi w tkankach generatywnych, embrionalnych i merystematycznych oraz w komórkach kallusa. Natomiast aktywności telomerazy jest bardzo niska lub niewykrywalna w tkankach wegetatywnych (FIZGERALD i współaut. 1996, HELLER i współaut. 1996, KILIAN i współaut. 1998, RIHA i współaut. 1998, WATSON i RIHA 2010). Wzór ekspresji telomerazy wykazuje podobieństwo do opisanego dla zwierząt. Aktywność telomerazy jest związana z semikonserwatywną replikacją w fazie S cyklu komórkowego (CHAKH- PARONIAN i WELLINGER 2003). Na matrycy RNA zawartego w podjednostce TER, telomeraza syntetyzuje powtórzenia telomerowego DNA wykorzystując aktywność odwrotnej transkryptazy podjednostki TERT. W pierwszym etapie następuje rozpoznanie jednioniciowego fragmentu telomeru, ogona G, który jest wykorzystywany jako starter. Następnie zachodzi synteza telomerowych powtórzeń, przesunięcie na koniec nowo zsyntetyzowanego fragmentu i wznowienie cyklu syntezy. Etapy te są powtarzane aż do czasu oddysocjowania enzymu (GREIDER 1995). Aktywność telomerazy jest ściśle powiązana z trzeciorzędową strukturą telomerów. Proces syntezy może być rozpoczęty jedynie wtedy, gdy pętla-t zostanie rozwinięta i pojawi się wolny ogon G. Struktura pętli jest stabilizowana przez kompleks białek wchodzących w skład telosomu (CHAKHPARONIAN i WELLINGER 2003). ROLA TELOMERAZY Podstawowa rola telomerazy opiera się o opisany powyżej mechanizm. Kompensacja utraty sekwencji telomerów zabezpiecza je przed erozją, do której dochodzi w przypadku braku aktywności telomerazy (KILIAN i współaut. 1995, COLGIN i REDDEL 1999). Erozja telomerów skutkuje niestabilnością genomu i wprowadza komórkę na drogę apoptozy (BLACKBURN 2001). Aktywność telomerazy ma również związek z naprawianiem złamanych chromosomów. Sekwencja telomerowa jest wówczas syntetyzowana od nowa, dzięki czemu do komórki potomnej przekazywany jest nieuszkodzony chromosom. Zjawisko to opisano m.in. w komórkach pszenicy (TSUJI- MOTO i współaut. 1999). U ssaków zaobserwowano także, że w komórkach, w których przywrócona została aktywność telomerazy, dochodzi do podniesienia potencjału replikacyjnego, procesu nowotworzenia oraz wzrostu przeżywalności. Jednakże tym procesom nie towarzyszy wydłużanie sekwencji telomerowej (DE LANGE i współaut. 1990, FU i współaut. 2000, ZHU i współaut. 2000, BLA- SCO 2002). Liczne badania wskazują na niezależne od telomerów funkcje telomerazy. Podjednostka TERT wykazuje funkcje regulatora rozwoju związane z kontrola odpowiedzi transkrypcyjnych (CHOI i współaut. 2008). Wraz z RMRP (ang. RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease) może działać jako zależna od RNA polimeraza RNA (MAIDA i współaut. 2009). Potwierdzono również role telomerazy w regulacji apoptozy w sposób niezależny od telomerów (HAENDELER i współaut. 2004).

61 592 MAJA BOCZKOWSKA, JERZY PUCHALSKI KOMPLEKS TELOMEROWY A PROCESY STARZENIA U ROŚLIN Wiele przesłanek wskazuje na związek kompleksu telomerowego ze starzeniem się roślin. Liczne podobieństwa w budowie, funkcji i sposobie utrzymania telomerów w świecie roślin i zwierząt nasuwają przypuszczenie, że skracanie telomerów w czasie ontogenezy może w obydwu przypadkach działać jak mechanizm sygnalizujący starzenie. U części roślin (Hordeum vulgare, Nicotiana tabacum) telomery skracają się w rozwoju ontogenetycznym tak samo jak u człowieka (COUNTER i współaut. 1992, KILIAN i współaut. 1998), natomiast u innych (Melandrium album, Arabidopsis thaliana, Avena sativa) pozostają stabilne (RIHA i współaut. 1998, FITZGERALD i współaut. 1999, ZENTGRAF i współaut. 2000). W pracach przeglądowych dotyczących kompleksu telomerowego występuje tendencja do generalizowania wyników otrzymanych dla Arabidopsis thaliana, negującego udział skracania się telomerów w sygnalizowaniu starzenia u wszystkich roślin. Bez przeprowadzenia dokładniejszych badań obejmujących więcej gatunków i z uwzględnieniem innych zmian w obrębie kompleksu telomerowego, wysunięcie takiego wniosku wydaje się być przedwczesne. Prace badawcze z ostatniej dekady wskazują bowiem na udział kompleksu telomerowego w procesach starzenia się roślin. Wykazano występowanie pozytywnej korelacji między długością telomerów i aktywnością telomerazy a spodziewaną długością życia u pięciu gatunków z rodzaju Pinus (FLANARY i KLETETSCHKA 2005). Zarówno u Arabidopsis thaliana, jak i Melandrium album zaobserwowano skracanie się ogona G w raz z rozwojem od siewki do dojrzałego liścia. W komórkach ludzkich elementem sygnalizującym przejście do fazy starzenia jest właśnie stan ogona G (RIHA i współaut. 2000, STEWARD i współaut. 2003). W liściach Arabidopsis thaliana obserwuje się ekspresję specyficznego białka (ATB2) pośrednio wiążącego się z telomerami w czasie przejścia liścia z fazy poprzedzającej starzenie do fazy starzenia (ZENTGRAF i współaut. 2000). Wraz z rozwojem korzeni i hypokotyli u Vigna radiata wykryto zmienność kompleksów białkowych wiążących się z telomerami (LEE i współaut. 2000). U zwierząt charakterystyczna budowa pętli-t stanowi jeden z elementów sygnalizujących komórce przejście w kierunku starzenia, analogiczna struktura została opisana u Pisum sativum (CHAN i BLACKBURN 2002, CESARE i współaut. 2003). Zaobserwowano również zmiany w kompleksie telomerowym na skutek starzenia się ziarniaków pszenicy i żyta (BUCHOLC i BUCHOWICZ 1992, 1995; BO- URBIAK i współaut. 2007). W obydwu przypadkach autorzy obserwowali, iż na skutek utraty żywotności zarodków dochodzi do zaniku sekwencji telomerowych w wysokocząsteczkowym DNA, przy jednoczesnym pojawieniu się ich we frakcji niskocząsteczkowej. Powstawanie pozachromosomalnych elementów telomerowych było skorelowane z ogólną fragmentacją genomu, do której dochodzi w czasie przechowywania nasion w stanie wysuszonym. Obserwowano również, że telomery znikały z frakcji niskocząsteczkowej, gdy nasiona przechowywane poddawano 3 6 godzinnej immbibicji. Według autorów istnieją również oznaki całkowitej utraty telomerów w skutek długotrwałego przechowywania (BUCHOLC i BUCHOWICZ 1992, 1995; BOURBIAK i współaut. 2007). Tabela 1. Budowa i długość telomerów u różnych organizmów. Gatunek Sekwencja powtórzenia Długość telomeru Tetrahymena thermophila TTGGGG powtórzeń Homo sapiens TTAGGG 10 15kb Saccharomyces cerevisiae T(G) bp Arabidopsis thaliana TTTAGGG 2 9 kb Chlorella vulgaris TTTAGGG 0,5kb Chlamydomonas reinhardii TTTAGGGG 0,5 1 kb Allium cepa nieznana nieznana

62 Telomery i telomeraza w komórkach roślinnych 593 PODSUMOWANIE Kompleks telomerowo-telomerazowy jest od dłuższego czasu obiektem licznych badań z zakresu jego budowy i funkcji w komórkach zwierzęcych. Spowodowane jest to związkiem aktywności telomerazy z niektórymi procesami nowotworzenia oraz dążeniem człowieka do zdobycia wiedzy jak stać się nieśmiertelnym. Obecny stan wiedzy o budowie i funkcji telomerów, telomerazy i białek im towarzyszących w komórkach roślin- nych jest nieporównywalnie skromniejszy. Jednakże wypracowane metody badawcze coraz częściej są stosowane w analizie obiektów należących do królestwa roślin. Musimy również pamiętać, że dotychczas otrzymane wyniki wskazują na wysoki poziom analogii kompleksu telomer-telomeraza u tych dwóch grup organizmów, uzasadnione jest, więc oczekiwanie kolejnych odkryć związanych ze światem roślin. TELOMERY I TELOMERAZA W KOMÓRKACH ROŚLINNYCH Streszczenie W budowie i funkcji kompleksu telomerowego występującego w komórkach roślin i zwierząt, obserwuje się szereg podobieństw. W jego skład wchodzą telomerowe DNA, białka telomerowe oraz enzym telomeraza. Telomery to struktury zbudowane z kompleksu białek i tandemowo powtórzonych sekwencji DNA, zlokalizowane na końcach chromosomów eukariotycznych. Pełnią szereg istotnych funkcji w komórkach organizmów żywych. Najważniejszą ich rolą jest ochrona genomu przed potencjalną niestabilnością. O ile sekwencja telomerowego DNA jest stosunkowo silnie zakonserwowana nawet u organizmów odległych ewolucyjnie, o tyle kompleks białek telomerowych charakteryzuje się dużym zróżnicowaniem. Z telomerami współdziała telomeraza - enzym o aktywności odwrotnej transkryptazy, który na matrycy własnego RNA dobudowuje na końcach chromosomów sekwencje telomerowe. Istniej wiele przesłanek wskazujących na udział kompleksu telomerowego w starzeniu się komórek roślinnych. Jednak dotychczas nie udało się w pełni zweryfikować tej hipotezy. Wiedza z zakresu budowy i funkcji telomerów i telomerazy w komórkach roślinnych ciągle pozostaje daleko w tyle za tą uzyskaną dla komórek ssaków. TELOMERES AND TELOMERASE IN PLANT CELLS Summary Both in plants and animals cells several similarities in structure and function of telomere complex are observed. Telomere complex consists of DNA, proteins and telomerase. Telomeres are the special structures composed of proteins and tandem repeated DNA sequences, localized at the physical end of eukariotic chromosomes. They carry out many important functions in the cells. The most important of their role is to protect the genome from potential instability. While the telomeric DNA sequence is relatively highly conserved even among evolutionarily distant organisms, telomeric protein complex has a great diversity. Telomerase interacts with telomeres. This enzyme has a reverse transcriptase activity and based on its own RNA template adds telomeric sequences at the ends of chromosomes. There are lots of indications that telomere complex participates in the plant cells aging process. But so far this hypothesis has not been fully verified. Knowledge in the field of structure and function of telomeres and telomerase in plant cells still remains far behind that achieved in mammalian cells. LITERATURA ADAMS S. P., HARTMAN T. P., LIM K. Y., CHASE M. W., BENNETT M. D., LEITCH I. J., LEITCH A. R., Loss and recovery of Arabidopsis-type telomere repeat sequences 5 -(TTTAGGG)(n)-3 in the evolution of a major radiation of flowering plants. Proc. Biol. Sci. 268, APARICIO O. M., BILLINGTON B. L., GOTTSCHLING D. E., Modifiers of position effect are shared between telomeric and sileni miting type loci in S cerevisiae. Cell 66, BAUMANN P., CECH T. R., Pot1, the putative telomere end-binding protein in fission yeast and humans. Science 292, BIANCHI A., SHORE D., How telomerase reaches its end: mechanism of telomerase regulation by the telomeric complex. Mol. Cell 31, BILAUD T., KOERING C. E., BINET-BRASSELET E., ANCELIN K., POLLICE A., GASSER S. M., GILSON E., The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucl. Acids Res. 24,

63 594 MAJA BOCZKOWSKA, JERZY PUCHALSKI BILAUD T., BRUN C., ANCELIN K., KOERING C. E., LA- ROCHE T., GILSON E., Telomeric localization of TRF2, a novel human telobox protein. Nat. Genet. 17, BLACKBURN E. H., GALL J. G., A tandemly repeated sequence at the termini of the extrachromosomal ribosomal RNA genes in Tetrahymena. J. Mol. Biol. 120, BLACKBURN E. H., Switching and signaling at the telomere. Cell 106, BLACKBURN E. H., 2005.Telomeres and telomerase: their mechanisms of action and their effects of altering their functions. FEBS Lett. 579, BLANC G., DUNCAN G., AGARKOVA I., BORODOVSKY M., GURNON J., KUO A., LINDQUIST E., LUCAS S., PANG- ILINAN J., POLLE J., SALAMOV A., TERRY A., YAMADA T., DUNIGAN D. D., GRIGORIEV I. V., CLAVERIE J. M., VAN ETTEN J. L., The Chlorella variabilis NC64A genome reveals adaptation to photosymbiosis, coevolution with viruses, and cryptic sex. Plant Cell 22, BLASCO M. A., Telomerase beyond telomeres. Nat. Rev. Cancer 2, BLASCO M., The epigenetic regulation of mammalian telomeres. Nat. Rev. Genet. 8, BOUBRIAK I., POLISCHUK V., GRODZINSKY A., OSBORNE D. J., Telomeres and seed banks. Cytol. Genet. 41, BUCHOLC M., BUCHOWICZ J., Synthesis of extra chromosomal DNA and telomere-releted sequences in germinating wheat embryos. Seed Sci. Res. 2, BUCHOLC M., BUCHOWICZ J., An extrachromosomal fragment of telomeric DNA in wheat. Plant Mol. Biol. 27, CESARE A. J., QUINNEY N., WILLCOX S., SUBRAMANIAN D., GRIFFITH J. D., Telomere looping in P. sativum (common garden pea). Plant J. 36, CHAKHPARONIAN M., WELLINGER R. J., Telomere maintance and DNA replication: how closely are these two connected? Trends Genet. 19, CHAN S. W. L., BLACKBURN E. H., New ways not to make ends meet: telomerase, DNA damage proteins and heterohromatin. Oncogene 21, CHEN J. L., BLASCO M. A., GREIDER C. W., Secondary structure of vertebrate telomerase RNA. Cell 100, CHOI J., SOUTHWORTH L. K., SARIN K. Y., VENTEICHER A. S., MA W., CHANG W., CHEUNG P., JUN S., ARTANDI M. K., SHAH N., KIM S. K., ARTANDI S. E., TERT promotes epithelial proliferation through transcriptional control of a Myc- and Wnt related developmental program. PLoS Genet. 4, e10. CHONG L., VAN STEENSEL B., BROCCOLI D., ERDJUMENT- BROMAGE H., HANISH J., TEMPST P., DE LANGE T., A human telomeric protein. Science 270, COHEN S. B., GRAHAM M. E., LOVERECZ G. O., BACHE N., ROBINSON P. J., REDDEL R. R., Protein composition of catalytically active human telomerase from immortal cells. Science 315, CIFUENTES-ROJAS C., KANNAN K., TSENG L., SHIOOEN D. E., Two RNA subunits and POT1a are components of Arabidopsis telomerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, COLGIN L. M., REDDEL R. R., Telomere maintance mechanisms and cellular immortalization. Curr. Opin. Genet. Develop. 9, COUNTER C. M., AVILION A. A., LEFEUVREL C. E., STEW- ART N. G., GREIDER C. W., HARLEY C. B., BACCHET- TIL S., Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. EMBO J. 11, DE LANGE T., SHIUE L., MYERS R. M., COX D. R., NAYLOR S. L., KILLERY A. M., VARMUS H. E., Structure and variability of human chromosome ends. Mol. Cell. Biol. 10, DE LANGE T., Shelterin: The protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Develop. 19, DUBRANA K., PERROD S., GASSER S. M., Turning telomeres off and on. Curr. Opin. Cell Biol. 13, FAJKUS J., KOVARÍK A., KRÁLOVICS R., BEZDĚK M., Organization of telomeric and subtelomeric chromatin in the higher plant Nicotiana tabacum. Mol. Gen. Genet. 247, FAJKUS J., SÝKROVÁ E., LEITCH A. R., Telomeres in evolution and evolution of telomeres. Chromosome Res. 13, FIZGERALD M. S., MCKNIGHT T. D., SHIPPEN D. E Characterization and developmental patterns of telomerase expression in plants. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, FIZGERALD M. S., RIHA K., GAO F., REN S., MCKNIGHT T. D., SHIPPEN D. E., Disruption of the telomerase catalytic subunit gene from Arabidopsis inactivates telomerase anl leads to sa slow loss of telomeric DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, FLANARY B. E., KLETETSCHKA G., Analysis of telomere length and telomerase activity in tree species of various life-spans, and with age in the bristlecone pine Pinus longaeva. Biogerontology 6, FU W., KILLEN M. W., CULMSEE C., DHAR S., PANDITA T., MATTSON M. P., The catalytic subunit of telomerase is expressed in developing brain neurons and serves a cell survival-promoting function. J. Mol. Neurosci. 14, FUCHS I., BRANDES A., SCHUBERT I., Telomere sequence localization and karyotype evolution in higher plants. Plant Systemat. Evol. 196, GNAL M. W., LAPITAN N. L. V., TANKSLEY S. D., Macrostructure of the tomato telomeres. Plant Cell 3, GREIDER C. W., Telomerase Biochemistry and Regulation [W:] Telomeres. BLACKBURN E. H., GREIDER C. W. (red.). Cold Spring Harbor Labolatory Press, NY, GREIDER C. W., Telomere length regulation. Ann. Rev. Biochem. 65, GREIDER C. W., Telomeres Do D-Loop T-Loop. Cell 97, GREIDER C. W., BLACKBURN E. H., Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell 43, GREIDER C. W., BLACKBURN E. H., The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell 51, GREIDER C. W., BLACKBURN E. H., A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature 337, GRIFFITH J. D., COMEAU L., ROSENFIELD S., STANSEL R. M., BIANCHI A., MOSS H., DE LANGE T., Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell 97, HAENDELER J., HOFFMANN J., DIEHLJ. F., VASA M., SPYRI- DOPOULOS I., ZEIHER A.M., DIMMELERS., Antioxidants inhibit nuclear export of telomerase reverse transcriptase and delay replicative senescence of endothelial cells. Circulation Res. 94,

64 Telomery i telomeraza w komórkach roślinnych 595 HELLER K., KILIAN A., PIATYSZEK M. A., KLEINHOFS A., Telomerase activity in plant extracts. Mol. Gen. Genet. 252, HENDERSON E. R., BLACKBURN E. H., An overhanging 3 terminus is a conserved feature of telomeres. Mol. Cell. Biol. 9, HIGASHIYAMA T., MAKI S., YAMADA T., Molecular organisation of Chlorella vulgaris chromosome I: presence of telomeric repeats that are conserved in higher plants. Mol. Gen. Genet. 246, HIRATA Y., SUZUKI C., SAKAI S., Characterization and gene cloning of telomere-binding protein from tobacco BY-2 cells. Plant Physiol. Biochem. 42, HWANG M. G., CHUNG I. K., KANG B. G., CHO M. H., Sequence-specific binding property of Arabidopsis thaliana telomeric DNA binding protein 1 (AtTBP1). FEBS Lett. 503, KARAMYSHEVA Z. N., SUROVTSEVA Y. V., VESPA L., SHA- KIROV E. V., SHIPPEN D. E., A C-terminal Myb extension domain defines a novel family of double-strand telomeric DNA-binding proteins in Arabidopsis. J. Biol. Chem. 279, KELLEHER C., TEIXEIRA M. T., FORSTEMANN K., LINGNER J., Telomerase: biochemical considerations for enzyme and substrate. Trends Biochem. Sci. 27, KILIAN A., STIFF C., KLEINHOFS A., Barley telomeres shorten during differentioation but grow in callus culture. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, KILIAN A., BOWTELL D. D., ABUD H. E., HIME G.R., VEN- TER D. J., KEESE P.K., DUNCAN E. L., REDDEL R. R., JEFFERSON R. A., 1997.Isolation of a candidate human telomerase catalytic subunit gene which reveals complex splicing patterns in different cell types. Human Mol. Genet. 6, KILIAN A., HELLER K., KLEINHOFS A., Developmental patterns of telomerase activity in barley and maize. Plant Mol. Biol. 37, KWON C., CHUNG I. K., Interaction of an Arabidopsis RNA-binding Protein with Plant Singlestranded Telomeric DNA Modulates Telomerase Activity. J. Biol. Chem. 279, LEE J. H., KIM J. H., KIM W. T., KANGB. G., CHUNG I. K., Characterization and developmental expression of single-stranded telomeric DNAbinding proteins from mung bean (Vigna radiata). Plant Mol. Biol. 42, LEE Y. W., KIM W. T., Roles of NtGTBP1 in telomere stability. Plant Signal. Behav. 6, LEONARDI J., BOX J. A., BUNCH J. T., BAUMANN P., TER1, the RNA subunit of fission yeast telomerase. Nature Struct. Mol. Biol. 15, LI B. B., LUSTIG A. J., A novel mechanism for telomere size control in Saccharomyces cerevisiae. Genes Develop. 10, LINGNER J., HENDRICK L. L., CECH T. R, Telomerase RNAs of different cilitates have a common secondary structure and permuted template. Genes Develop. 8, LINGNER J., HUGHES T. R., SHEVCHENKO A., MANN M., LUNDBLAD V, CECH T. R., Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science 276, LIU D., O CONNOR M. S., QIN J., SONGYANG Z., Telosome a mammalian telomere-associated complex formed by multiple telomeric proteins. J. Biol. Chem. 279, LUNDBLAD V., Telomerase catalysis: a phylogenetically conserved reverse transcriptase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, MADDAR H., RATZKOVSKY N., KRAUSKOPF A., Role for Telomere Cap Structure in Meiosis. Mol. Biol. Cell 12, MAIDA Y., YASUKAWA M., FURUUCHI M., LASSMANN T., POSSEMATO R., OKAMOTO N., KASIM V., HAYASHIZA- KI Y., HAHNW. C., MASUTOMIK., An RNA-dependent RNA polymerase formed by TERT and the RMRP RNA. Nature 461, MARIAN C. O., BORDOLI S. J., GOLTZ M., SANTARELLA R. A., JACKSON L. P., DANILEVSKAYA O., BECKSTETTE M., MEELEY R., BASS H. W., The maize Single myb histone 1 gene, Smh1, belongs to a novel gene family and encodes a protein that binds telomere DNA repeats in vitro. Plant Physiol. 133, MARTINEZ P., THANASOULA M., CARLOSA. R., GÓMEZ- LÓPEZ G., TEJERA A. M., SCHOEFTNER S., DOMIN- GUEZ O., PISANOD. G., TARSOUNAS M., BLASCO M. A., Mammalian Rap1 controls telomere function and gene expression through binding to telomeric and extratelomeric sites. Nature Cell Biol. 12, MCCLINTOCK B., The stability of broken ends of chromosomes in Zea mays. Genetics 26, MECHELLI R., ANSELMI C., CACCHIONE S., DE SANTIS P., SAVIANO M., Organisation of telomeric nucleosomes: atomic force microscopy imaging and theoretical modelling. FEBS Lett. 566, MEYERSON M., COUNTER C. M., EATON E. N., ELLISEN L. W., STEINER P., CADDLE S. D., ZIAUGRA L., BEIJER- SBERGEN R. L., DAVIDOFF M. J., LIU Q., BACCHETTI S., HABER D. A., WEINBERG R. A., hest2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell 90, MULLER H. J., The remaking of chromosome. Collecting Net 8, OGUCHI K., LIU H., Tamura K., Takahasi H., Molecular cloning and characterization of AtTERT, a telomerase reverse transcriptase homolog in Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. 457, PALM W., DE LANGE T., How shelterin protects Mammalian telomeres. Ann. Rev. Genet. 42, PETRACEK M. E., LEFEBVRE P. A., SILFLOW C. D., BERMAN J., Chlamydomonas telomere sequences are A+T-rich but contain three consecutive G- Cbase pairs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, PISANO S., PASCUCCI E. C., CACCHIONE S., DE SANTIS P., SAVIANO M., AFM imaging and theoretical modelling studies of sequence-dependent nucleosome positioning. Biophys. Chem. 124, PISANO S., MARCHIONI E., GALATI A., MECHELLI R., SA- VIANO M., CACCHIONE S., Telomeric nucleosomes are intrnscally mobile. J. Mol. Biol. 369, RIHA K., FAJKUS J., SIROKY J., VYSKOT B., Developmental control of telomere lengths and telomerase activity in plants. Plant Cell 10, RIHA K., MCKNIGHT T. D., FAJKUS J., VYSKOT B., SHIP- PEND. E., Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. Plant J. 23, RICHARDS E. J., AUSBEL F. M., Isolation of a higher eucariotic telomere from Arabidopsis thaliana. Cell 53, RICHARDS E. J., VONGS A., WALSH M., YANG J., CHAO S., Substructure of telomere repeat arrays. [W:] The chromosome. HESLOP-HARRISON J. S., FLAVELL R. B. (red.). Bios Scientific Publisher, Oxford, SCHRUMPFOVA P., KUCHAR M., MIKOVA G., SKRISOVSKA L, KUBICAROVA T, FAJKUS J., Characterization of two Arabidopsis thaliana myb-like

65 596 MAJA BOCZKOWSKA, JERZY PUCHALSKI proteins showing affinity to telomeric DNA sequence. Genome 47, SCHRUMPFOVA P., KUCHAR M., PALECEK J., FAJKUS J., Mapping of interaction domains of putative telomere-binding proteins AtTRB1 and At- POT1b from Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. 582, SCHWARZACHER T., HESLOP-HARRISON J. S., In situ hybridization to plant telomeres using synthetic oligomers. Genome 34, SHAKIROV E. V., SUROVTSEVA Y. V., OSBUN N, SHIPPEN D. E., The Arabidopsis Pot1 and Pot2 proteins function in telomere length homeostasis and chromosome end protection. Mol. Cell. Biol. 25, SHAKIROV E. V., PERROUD P. F., NELSON A. D., CANNELL M. E., QUATRANO R. S., SHIPPEN D. E., Protection of Telomeres 1 is required for telomere integrity in the moss Physcomitrella patens. Plant Cell 22, STEWART S. A., BEN-PORATH I., CAREY V. J., O CONNOR B. F., HAHN W. C., WEINBERG R. A., Erosion of the telomeric single-strand overhang at replicative senescence. Nat. Genet. 33, SUROVTSEVA Y. V., SHAKIROV E. V., VESPA L., OSBUN N., SONG X., SHIPPEN D. E., Arabidopsis POT1 associates with the telomerase RNP and is required for telomere maintenance. EMBO J. 26, SYRKOWA E., FAJKUS J., Structure-function relationships in telomerase genes. Biol. Cell 101, SZOSTAK J. W., BLACKBURN E. H., Cloning yeast telomeres on linear plasmids. Cell 29, TANI A., MURATA M., Alternative splicing of Pot1 (Protection of telomere)-like genes in Arabidopsis thaliana. Genes Genet. Syst. 80, TREMOUSAYGUE D., MANEVSKI A., BARDET C., LESCURE N., LESCURE B.,1999. Plant interstitial telomere motifs participate in the control of gene expression in root meristems. Plant J. 20, TSUJIMOTO H., YAMADA T., SASAKUMA, T., Molecular structure of a wheat chromosome end healed after gametocidal gene-induced breakage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, TSUJIMOTO H., USAMI N., HASEGAWA K., YAMADA T., SA- SAKUMA T., De novo synthesis of telomere sequences at the healed breakpoints of wheat deletionchromosomes. Mol. Gen. Genet. 262, VAQUERO-SEDAS M., GAMEZ-ARJONA F. M., VEGA-PALAS M. A., Arabidopsis thaliana telomeres exhibit euchromatic features. Nucl. Acids Res. 39, WANG F., PODELL E. R., ZAUG A. J., YANG Y., BACIU P., CECH T. R., LEI M., POT1-TPP1 telomere complex is a telomerase processivity factor. Nature 445, WATSON J. M., RIHA K., Comperative biology of telomeres: where plants stand. FEBS Lett. 584, WEBB C. J., ZAKIAN V. A., Identification and characterisation of the Schizosaccharomyces pombe TER1 telomerase RNA. Nat. Struct. Mol. Biol. 15, XIN H., LIU D., WAN M., SAFARI A., KIM H., SUN W., O CONNOR M. S., SONGYANG Z., TPP1 is a homologue of ciliate TEBP-beta and interacts with POT1 to recruit telomerase. Nature 455, YANG S. W., KIM D. H., LEE J. J., CHUN Y. J., LEE J. H., KIM Y. J., CHUNG I. K., KIM W. T., Expression of the telomeric repeat binding factor gene NgTRF1 is closely coordinated with the cell division program in tobacco BY-2 suspension culture cells. J. Biol. Chem. 278, YU E. Y., KIM S. E., KIM J. H., KO J. H., CHO M. H., CHUNG I. K., Sequence-specific DNA recognition by the Myb-like domain of plant telomeric protein RTBP1. J. Biol. Chem. 275, YU G. L., BRADLEY J. D., ATTARDI L. D., BLACKBURN E. H., In vivo alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. Nature 344, ZENTGRAF U., HINDERHOFER K., KOLB D., Specific association of a small protein with the telomeric DNA-protein complex during the onset of leaf senescence in Arabidopsis thaliana. Plant Mol. Biol. 42, ZHAO Y., SFEIR A.J, ZOU Y., BUSEMAN C.M., CHOW T.T., SHAY J.W., WRIGHT W.E., Telomere extension occurs at most chromosome ends and is uncoupled from fill-in in human cancer cells. Cell 138, ZHU H., FU W., MATTSON M. P., The catalytic subunit of telomerase protects neurons against amyloid beta-peptide-induced apoptosis. J. Neurochem. 75,

66 Tom Numer 4 (297) Strony IZABELA SZUĆKO, MAGDALENA ACHREM, ANNA KALINKA Katedra Biologii Komórki Wydział Biologii Uniwersytet Szczeciński Wąska Szczecin izabela.szucko@univ.szczecin.pl CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE SSR ORAZ ISSR W BADANIACH GENOMÓW ROŚLINNYCH WPROWADZENIE Rośliny są doskonałym obiektem do badań zmienności z zastosowaniem technik biologii molekularnej. Biorąc pod uwagę fakt, że genomy jądrowe roślin wyróżniają się wśród genomów eukariotycznych dużą zmiennością wielkości i złożonością strukturalno-organizacyjną, metody oparte na analizie DNA dają możliwość poznania i wyjaśnienia ich skomplikowanej natury. Markery molekularne odgrywają znaczącą rolę we wszystkich aspektach hodowli roślin, obejmujących między innymi identyfikację genów odpowiedzialnych za pożądane cechy z punktu widzenia agronomicznego (SHUL- MAN i współaut. 2004). Odkrycie, że od 30 do 90% genomu wszystkich gatunków jest zbudowana z regionów powtarzalnego DNA o wysoce polimorficznej naturze, stało się niezwykle przydatne w opracowaniu nowych markerów molekularnych służących między innymi do identyfikacji osobników czy też gatunków. Sekwencje te mają różną wielkość, są wielokrotnie powtórzone w genomie, mogą również nabywać nowe funkcje poprzez addycję czy delecję sekwencji lub na skutek zmian w sekwencji par zasad. W regionach tych zawarte są sekwencje mikrosatelitarne, które są bardzo atrakcyjnym celem do tworzenia systemów markerowych z uwagi na dużą zdolność gromadzenia mutacji (LI i współaut. 2004, SHARMA i współaut. 2008). CZYM JEST MARKER MOLEKULARNY? Pod pojęciem markera molekularnego rozumiemy fragment DNA lub polipeptyd, który wykazuje polimorfizm dziedziczy się zgodnie z prawami Mendla i nie ulega wpływom środowiska zewnętrznego (MA- SOJĆ 2004, SHARMA i współaut. 2008). Według GOSTIMSKY EGO i współaut. (2005), molekularnymi markerami DNA są polimorficzne sekwencje nukleotydów rozproszone w całym genomie, których mutacje mogą być wykrywane z użyciem technik opartych na PCR (ang. polymerase chain reaction). Markery molekularne są bardziej użyteczne do badań nad zmiennością genetyczną niż analiza morfologiczna czy genealogiczna z tego względu, że nie oddziałują na nie środowisko i odzwierciedlają one podobieństwo genetyczne bez uprzedniej wiedzy o pochodzeniu. Molekularne markery DNA można podzielić na dwie klasy: oparte na hybrydyzacji i oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) (KULEUNG i współaut. 2004).

67 598 IZABELA SZUĆKO i współaut. FENOMEN MIKROSATELITÓW Mikrosatelity są dynamicznymi komponentami genomu, których liczba zmienia się w czasie. Termin mikrosatelity wprowadzili LITT i LUTY w 1989 roku. Należą one do rodziny repetetywnego DNA i występują zarówno u organizmów eukariotycznych, jak i prokariotycznych (GUR-ARIE i współaut. 2000). Wiadomym jest, że nie ma obecnie dwóch żyjących osobników, które miałyby identyczną kombinację alleli mikrosatelitarnych. Do niedawna sądzono, że mikrosatelity w roślinnym genomie występują z dziesięciokrotnie mniejszą frekwencją niż w genomie ludzkim, chociaż ostatnie badania wskazują, że ilość tych sekwencji jest porównywalna u roślin i zwierząt (SHULMAN i współaut. 2004). Mikrosatelity to sekwencje z motywami powtórzonymi tandemowo. Motywy te zawierają od 1-6 pz powtórzonych kilka razy (SHULMAN 2007). U roślin mikrosatelity zawierają wielokrotnie powielone sekwencje typu (AT) n oraz (TAT) n, znacznie rzadziej występują sekwencje (GA) n i sporadycznie (CA) n te ostatnie powszechne są w genomach zwierzęcych (MASOJĆ 2004, SZTUBA-SO- LIŃSKA 2005,WANG i współaut. 2005, SHULMAN 2007, SHARMA i współaut. 2008). Oprócz mikrosatelitów doskonałych (GC) n, poprzez substytucje, delecje czy insercje, powstają mikrosatelity niedoskonałe (GC) n (N)(GC) n, które są stabilniejsze od doskonałych i odgrywają znaczną rolę w regulacji aktywności genów (SURESH I NAGARAJARAM 2007). Przypuszcza się, że mikrosatelitarne sekwencje mają także wpływ na organizację chromatyny, rekombinacje, replikacje DNA, cykl komórkowy oraz system naprawy błędnie sparowanych nukleotydów (ang. mismatch repair, MMR) (LI i współaut. 2004). Mikrosatelity są równomiernie rozproszone w chromosomach lub wykazują preferencje do obszarów przycentromerowych. Występują zarówno poza genami, jak i w ich obrębie (u roślin sekwencje dwunukleotydowe występują powszechniej w intronach, zaś trójnukleotydowe głównie w egzonach) oba rodzaje sekwencji liczniejsze są w obszarach flankujących 5 niż 3 (ROGALSKA i współaut. 2005). Wykazano, że u roślin wyższych se- kwencje mikrosatelitarne występują rzadziej w regionach kodujących niż w niekodujących (WANG i współaut. 2005). W regionach kodujących większa ilość tych motywów zlokalizowana jest w transkrybowanych regionach genomu obejmujących geny kodujące białka (ang. expressed sequence tags). Zwiększenie/zmniejszenie liczby kopii mikrosatelitów w regionach kodujących prowadzi często do przesunięcia ramki odczytu, czego konsekwencją są zmiany w produkcie końcowym - białku, a w regionach niekodujących powoduje to zmiany w regulacji aktywności genów (SURESH i NAGARAJARAM 2007). KASHI i KING (2006) podają, że mikrosatelity są źródłem zmienności genetycznej stanowiącej podstawę ewolucji adaptacyjnej. Wśród wielu cech korzystnych, opisujących charakter mikrosatelitów, najistotniejsze jest to, że obficie występują w genomie, wykazując silny polimorfizm długości determinowany różną liczbą powtórzeń sekwencji podstawowej. Szacuje się, że polimorfizm charakteryzujący mikrosatelity sięga 90%. Może być on następstwem pomyłek polimerazy DNA, tzw. ślizgania się polimerazy (ang. polymerase slippage), które prowadzi do wydłużania dinukleotydowych sekwencji powtórzonych. Częściej poślizg ten prowadzi do wstawienia, rzadziej do delecji, przynajmniej jednej z powtórzonych jednostek. Zatem, co pewien czas poślizg polimerazy prowadzi do powstania nowego wariantu sekwencji mikrosatelitarnej o innej długości wzbogacając zestaw alleli znajdujących się w populacji. W genomie ludzkim na polimorfizm tych motywów mogą również wpływać mutacje dynamiczne, będące następstwem poślizgu polimerazy, których istotą jest zwielokrotnienie charakterystycznych, krótkich sekwencji mikrosatelitarnych w obrębie określonego genu. Polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych oraz to, że flankujące je sekwencje są specyficzne dla określonych miejsc w DNA sprawia, że są one wykorzystywane jako cecha diagnostyczna w mapowaniu genomu i analizie sprzężeń, w genetyce populacyjnej, w badaniach filogenetycznych i ewolucyjnych (SŁOMSKI i współaut. 2004a, b; BROWN 2009). SYSTEM MARKEROWY SSR I JEGO ZASTOSOWANIE Amplifikowane sekwencje mikrosatelitarne tworzą system markerów określany jako SSR (ang. simple sequence repeats; proste sekwencje powtarzalne) albo STR (ang. short

68 Charakterystyka i zastosowanie SSR oraz ISSR w badaniach genomów roślinnych 599 tandem repeats; krótkie tandemowe powtórzenia). Każdy odcinek mikrostatelitarny sąsiaduje z unikatowymi sekwencjami, które można wykorzystać do projektowania specyficznych starterów. Markery SSR mają wiele zastosowań w genetyce i hodowli roślin ze względu na ich multialleliczną naturę, kodominacyjny sposób dziedziczenia, powszechność w genomie oraz łatwość analizy (KU- LEUNG i współaut. 2004, VARSHNEY i współaut. 2005, DECLERCK i współaut. 2009). Mikrosatelity są obecnie szeroko stosowane do uzupełnienia genetycznych map sprzężeń kilku gatunków zbóż takich jak: kukurydza (CORDE- RIO 2000), jęczmień (THIEL i współaut. 2003), ryż (TEMNYKH i współaut. 1999, DECLERCK i współaut. 2009), pszenica (RÖDER i współaut. 1998) oraz pszenżyto (TAMS i współaut. 2004). Oprócz tworzenia map genetycznych można ich używać także do identyfikacji osobniczego DNA i oznaczania rodzicielstwa, jak również w genetyce populacyjnej takich gatunków roślinnych jak brzoskwinia (Prunuspersica L.) czy słodka wiśnia (P. avium L.) (DIRLEWANGER i współaut. 2002, NICOT i współaut. 2004). Oszacowano częstość występowania motywów mikrosatelitarnych w takich roślinach jak Arabidopsis thaliana, ryż, soja, kukurydza i pszenica, u których rozmiar genomu haploidalnego mieści się w zakresie 125Mpz do 5,660Mpz. U tych gatunków całkowita częstość sekwencji mikrosatelitarnych była odwrotnie proporcjonalna do rozmiaru genomu i ilości powtarzalnego DNA, ale pozostała niezmienna w częściach genomu, które podlegają transkrypcji. Częstość sekwencji mikrosatelitarnych była wyższa w obszarach transkrybowanych, zwłaszcza w regionach nie podlegających translacji (UTR). Motywy (CT) 10, (GAA) 5, (AAT) 6 wykorzystano do określenia różnorodności genetycznej w badaniach taksonomicznych, do analizy pochodzenia, a także do identyfikacji genotypów takich gatunków roślin jak ryż, pszenica, soja czy winorośl (MORGANTE i współaut. 2002, SURESH i NAGARAJARAM 2007). Dzięki wykorzystaniu markerów SSR zaprojektowanych dla pszenicy, przeanalizowano sekwencje zlokalizowane w chromosomach żyta (FU i współaut. 2010). Udowodniono także, że sekwencje SSR są obecne w obrębie EST (ang. expressed sequence tags; sekwencyjne znaczniki ekspresji) i wiele z nich zostało wykorzystanych do stworzenia markerów EST-SSR. Tego typu markery umożliwiają szybką identyfikację szukanych genów, a markery zaprojektowane dla sekwencji EST jednego gatunku mogą zostać wykorzystane do analiz gatunków z nim spokrewnionych. Znalazły one zastosowanie w konstruowaniu porównawczej mapy pszenicy i ryżu (KANTE- TY i współaut. 2002, YU i współaut. 2004). Markery SSR obrazowały także podobieństwo genetyczne pomiędzy różnymi odmianami pszenżyta, bez względu na ich pochodzenie genealogiczne, geograficzne czy wymagania wzrostowe. Wykazano, że markery SSR zaprojektowane dla pszenicy i żyta mogą stać się użyteczne do badań genetycznych nad pszenżytem (KULEUNG i współaut. 2004). SYSTEM MARKEROWY ISSR I JEGO ZASTOSOWANIE Polimorfizm sekwencji międzymikrosatelitarnych (ang. inter simple sequence repeats, ISSR) został wykorzystany po raz pierwszy jako system markerowy przez ZIĘTKIEWICZ i współaut. w 1994 roku. Analiza ISSR obejmuje amplifikację fragmentów DNA usytuowanych pomiędzy dwoma mikrosatelitarnymi, powtórzonymi regionami zorientowanymi w przeciwległych kierunkach. Oligonukleotydowe startery wykorzystywane do ISSR-PCR składają się z powtarzalnych, tzw. zakotwiczonych jednostek na końcu 5 lub 3, dzięki ich użyciu możliwa jest amplifikacja fragmentów DNA o zmiennej długości z obszarów pomiędzy motywami mikrosatelitarnymi. Polimorfizm ISSR wynika z mutacji, insercji lub delecji w obrębie sekwencji mikrosatelitarnej. Zmiany te powodują wystąpienie lub nie, produktu, który stanie się widoczny na żelu postaci prążka (REDDY i współaut. 2000, CARVALHO i współaut. 2005, VAILLANCOURT i współaut. 2008). Technika ta nie wymaga wstępnych informacji o analizowanej sekwencji DNA. ISSR zaliczają się do markerów dominujących, w niektórych przypadkach mogą cechować się segregacją kodominacyjną. Analiza ISSR, tak jak metoda RAPD, wykazuje wysoką rozdzielczość generowanych wzorów prążkowych, lecz zapewnia lepszą powtarzalność (startery są dłuższe i komplementarne do regionów mikrosatelitarnych) (REDDY i współaut. 2000, GOSTIMSKY i współaut. 2005, VAILLANCOURT i współaut. 2008). Markery te wykorzystuje się do określenia różnorodności genetycznej, badań filogenetycznych (CARVALHO i współaut. 2005,VA-

69 600 IZABELA SZUĆKO i współaut. ILLANCOURT i współaut. 2008), identyfikacji genów (ang. gene tagging) i poszerzania wiedzy o ewolucji wielu istotnych, z punktu widzenia rolniczego, gatunków roślin zbożowych (REDDY i współaut. 2000), tj. pszenica (NAGAOKA i OGIHARA 1997), żyto (MATOS i współaut. 2001), pszenżyto (SÖZEN 2011), kukurydza (PEJIC i współaut. 1998), ryż (QIAN i współaut. 2001, GIRMA i współaut. 2010) czy jęczmień (FERNÁNDEZ i współaut. 2002, GO- STIMSKY i współaut. 2005, KANABAR i KONDO 2011). System ten również wykorzystano do wyznaczenia markerów sprzężonych z genami odporności na choroby i wielkością ziarniaków heksaploidalnej pszenicy (AMMIRAJU i współaut. 2001), a także do analizy somatycznych hybryd Citrus (SCARANO i współaut. 2002). Zastosowano go również do genetycznej charakterystyki międzynarodowej kolekcji roślin kakaowca (CHARERS i WIL- KINSON. 2000). ISSR wykazują wystarczający polimorfizm do odróżnienia rozmaitych odmian chryzantem (WOLFF i współaut. 1995). NKONGOLO i współaut. (2005) oraz MEHES i współaut. (2005) odnaleźli u drzew iglastych gatunkowo-specyficzne markery ISSR. Zostały one wykorzystane do identyfikacji mieszańców międzygatunkowych Picea i rodzaju Pinus. Metoda ta w prosty sposób pozwala dostrzec różnice między osobnikami. Została użyta do identyfikacji powszechnie uprawianych gatunków roślin takich jak: trójlistkowa pomarańcza (FANG i ROESE 1997) i ziemniak (PREVOST I WILKINSON 1999). Powtarzalność na dobrym poziomie, prostota wykonania i wymóg małej ilości DNA czyni technikę ISSR-PCR odpowiednią do analizy odmiennych gatunków roślin. PODSUMOWANIE Pomimo że oba opisane systemy markerowe oparte są o polimorfizm sekwencji mikrosatelitarnych, wykazują pewne różnice. Ważnymi kryteriami wyboru techniki są jej koszty, pracochłonność i czasochłonność. Metoda SSR, pomimo licznych zalet posiada i wady. Do zalet zaliczyć należy wysoką częstotliwość wykrywanego polimorfizmu, wynikająca ze zmiennej liczby powtórzeń motywu nukleotydowego, możliwość oceny homo- lub heterozygotyczności analizowanego osobnika na podstawie profilu genetycznego, analiza pojedynczego locus, a także możliwości automatyzacji metody poprzez technikę elektroforezy kapilarnej w żelu poliakrylamidowym z zastosowaniem znaczników fluorescencyjnych. Wadą jest możliwość występowania homoplazji (ang. homoplasy, allele o tej samej liczbie par zasad różnią się sekwencją) i niewykrywalność niemych alleli (ang. null allels), a także wysokie koszty analizy obejmujące wieloetapowe przygotowanie specyficznych starterów i późniejszą reakcję PCR (NICOT i współaut. 2004, SZTUBA- -SOLIŃSKA 2005, NOWAKOWSKA 2006, BROWN 2009). W przeciwieństwie do markerów SSR, system markerowy ISSR-PCR jest stosunkowo niedrogą techniką obejmująca jednoczesną analizę wielu loci. Technika ta również nie jest czasochłonna. Punktem krytycznym w analizach ISSR-PCR jest wybór odpowiednich starterów. Już w latach 90. ubiegłego wieku zwrócono uwagę, że sekwencje mikrosatelitarne mogą zostać wykorzystane do opracowania markerów. Ich ogromne znaczenie wynika z ich wysokiego polimorfizmu. Dzięki temu znalazły zastosowanie w badaniach filogenetycznych i populacyjnych (DÁVILA i współaut. 1999). Udowodniono, że markery oparte o proste sekwencje powtórzone, pozwalają na zrozumienie organizacji genomu roślin. Dzięki ich wykorzystaniu można prześledzić dziedziczenie chromosomów (SŁOMSKI i współaut. 2004A). Dzięki wszechobecności i łatwym metodom wykrywania, sekwencje mikrosatelitarne stały się powszechnie używanym narzędziem służącym do identyfikacji osobników, gatunków i odmian. Znalazły one pełne zastosowanie w tak ważnej dziedzinie, jaką jest hodowla roślin (CUADRAODO i SCHWARZACHER 1998). CHARAKTERYSTYKA I ZASTOSOWANIE SSR ORAZ ISSR W BADANIACH GENOMÓW ROŚLINNYCH Streszczenie W badaniach roślin markery DNA stanowią odpowiednie narzędzie pozwalające na szczegółową genetyczną analizę, mapowanie genów oraz określenie genetycznego zróżnicowania. Sekwencje mikro-

70 Charakterystyka i zastosowanie SSR oraz ISSR w badaniach genomów roślinnych 601 satelitarne i obszary znajdujące się między nimi okazały się ważnym źródłem markerów DNA i były z powodzeniem stosowane przy badaniach genetycznego zróżnicowania, mapowaniu genomów, selekcji cech pożądanych w rolnictwie oraz przy rozróżnianiu genotypów. Markery SSR (ang simple sequence repeat) i ISSR (ang. inter simple sequence repeat) wykazują wiele zalet w porównaniu do innych markerów stosowanych w badaniach genetycznych. Charakteryzują się one wysokim polimorfizmem i dużą częstością występowania. Niniejszy przegląd przedstawia cechy i zastosowanie markerów SSR i ISSR w badaniach genomów roślinnych. CHARACTERISTIC AND APPLICATIONS OF SSR AND ISSR IN STUDY OF PLANT GENOMES Summary In plant investigations, DNA based markers are suitable tools for detailed genetic analysis, gene mapping and estimation of genetic diversity. Microsatellites and regions between them are important source of DNA markers and have been successfully applied for detection of genetic diversity, genome mapping, marker assisted selection of agronomically important traits and genotype differentiation. Simple sequence repeat (SSR) and inter simple sequence repeat (ISSR) markers have many advantages for genetic studies over other markers. They are highly polymorphic and abundant. This review aimed to characterize and present possible applications of SSR and ISSR in plant genome research. LITERATURA AMMIRAJU J. S. S., DHOLAKIA B. B., SANTRA D. K., SINGH H., LAGU M. D., TAMHANKAR S. A., DHALIWAL H. S., RAO V. S., GUPTA V. S., RANJEKAR P. K., Identification of inter simple sequence repeat (ISSR) markers associated with seed size in wheat. Theor. Appl. Genet. 102, BROWN T. A., Genomy. PWN, Warszawa. CARVALHO A., LIMA-BRITO J., GUEDES-PINTO H., MATOS M., BENITO C., DNA fingerprinting of F1 interspecific hybrids from the Triticeae tribe using ISSRs. Euphytica 143, CHARERS Y. M., WILKINSON M. J., The use of self-pollinated progenies as in-groups for the genetic characterization of cocoa germplasm. Theor. Appl. Genet. 100, CORDERIO G. M., Characterisation of microsatellite markers from sugarance (Saccharum spp.) ESTs cross transferable to erianthus and srorghum. Plant Sci. 160, CUADRAODO A., SCHWARZACHER T., The chromosomal organization of simple sequence repeats in wheat and rye genomes. Chromosoma 107, DÁVILA J. A., LOARCE Y., FERRER E., Molecular characterization and genetic mapping of random amplified microsatellite polymorphism in barley. Theor. Appl. Genet. 98, DECLERCK G., CARTINHOUR S., MCCOUCH S., TEMNYKH S., LUKASHOWA A., Computational and experimental analysis microsatellites in rice (Oryza sativa L.): frequency, lenght variation, transposon associations, and genetic marker potential. Cold Spring Harb Laboratory Press 11, DIRLEWANGER E., CROSSON A., TAVAUD P., ARANZANA M. J., POIZAT C., ZANETTO A., ARÚS P., LAIGRET L., Development of microstellite markers in peach and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet cherry. Theor. Appl. Genet. 105, FANG D. Q., ROESE M. L., Identification of cloesly related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers. Theor. Appl. Genet. 95, FERNÁNDEZ M. E., FIQUEIRAS A. M., BENITO C., The use of ISSR and RAPD markers for detecting DNA polymorphism, genotype identyfication and genetic diversity among barley cultivars with known origin. Theor. Appl. Genet. 104, FU S., TANG Z., REN Z., ZHANG H., YAN B., Isolation of rye-specific DNA fragment and genetic diversity analysis of rye genus Secale L. using wheat SSR markers. J. Genet. 89, GIRMA G., TESFAYE K., BEKELE E., Inter simple sequence repeat (ISSR) analysis of wild and cultivated rice species from Ethiopia. Afr. J. Biotech. 9, GOSTIMSKY S. A., KOKAEVA G., KONOVALOV F. A., Styding plan genome variation using molecular markers. Russ. J. Genet. 41, GUR-ARIE R., COHEN C. J., EITAN Y., SHELEF L., HALLER- MAN E. M., KASHI Y., Simple sequence repeats in Escherichia coli: abundance, distribution, composition, and polymorphism. Genome Res. 10, KANABAR A., KONDO K., Efficiency of ISSR and RAPD dominant markers in assessing genetic diversity among Japanese and Syrian cultivars of barley ( H. vulgare L.). Res. J. Agric. Biol. Sci. 7, KANTETY R. V., ROTA M. L., MATTHEWS D. E., SORRELS M. E., Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley, maize, rice, sorghum and wheat. Plant Mol. Biol. 48, KASHI Y., KING D., Simple sequence repeats as advantageous mutators in evolution. Trends Genet. 22, KULEUNG C., BAENZIGER P. S., DWEIKAT I., Transferability of SSR markers among wheat, rye, and triticale. Theor. Appl. Genet. 108, Li Y., Karol A.B., Fahima T., Nevo E., Microsatellites within genes: structure, function, and evolution. Mol. Biol. Evol. 21, LITT M., LUTY J. M., A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. Hum. Genet. 44, MASOJĆ P., 2004: Ustalenie tożsamości genetycznej. [W:] Biotechnologia roślin. MALEPSZY S. (red.). PWN, Warszawa. MATOS M., PINTO-CARNIDE O., BENITO C., Phylogenetic relationships among Portuguese rye

71 602 IZABELA SZUĆKO i współaut. based on isozyme, RAPD and ISSR markers. Hereditas 134, MEHES M., NKONGOLO K. K., MICHAEL P., Genetic analysis of Pinus strobus and P.monticola populations using ISSR and RAPD markers: Development of genome-specific SCAR markers. Plant Syst. Evol. 267, MORGANTE M., HANAFEY M., POWELL W., Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes. Nat. Genet. 30, NAGAOKA T., OGIHARA Y., Applicability of intersimple sequence repeat polymorphisms in wheat for use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 94, NICOT N., CHIQUET V., GANDON B., AMILHAT L., LEGAI F., LEROY P., BERNARD M., SOURDILLE P., Study of simple sequence repeat (SSR) markers from wheat expresserd sequence tags (ESTs). Theor. Appl. Genet. 109, NKONGLO K. K., MICHAEL P., DEMERS T., Application of ISSR, RAPD and cytological markers to the certification of Picea mariana, P.glanca and P. engelmannii trees, and their putative hybrids. Genome 48, NOWAKOWSKA J., Zastosowanie markerów DNA (RAPD, SSR, PCR-RFLP i STS) w genetyce drzew leśnych, entomologii, fitopatologii i łowiectwie. Leśne Prace Badawcze.1, PEJIC L., AJMONE-MARSAN P., MORGANTE M., KOZUM- PLICK V., CASTIGLIONI P., TARAMINO G., MOTTO M., Comparative analysis of genetic similarity among maize inbred lines detected by RFLPs, RAPDs, SSRs and AFLPs. Theor. Appl. Genet. 97, PREVOST A., WILKINSON M. J., A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theor. Appl. Genet. 98, QIAN W., GE S., HONG D. Y., Genetic variation within and among populations of a wild rice Oryza granulata from China detected by RAPD and ISSR markers. Theor. Appl. Genet. 102, REDDY R. P., SARLA N., SIDDIQ E. A., Inter simple sequence repeat (ISSR) polymorphism and its application in plant breeding. Euphytica 128, ROGALSKA S., MAŁUSZYŃSKA J., OLSZEWSKA M., Podstawy cytogenetyki roślin. PWN, Warszawa. RÖDER M., KORSU V., WENDEHAKE K., PLASCHKE J., TIXIER M., LEROY P., GANAL M., A microsatellite map of the wheat genome. Genetics 149, SCARANO M. T., ABBATE L., FERRANTE S., LACRETTI S., TASA N., ISSR-PCR technique: a useful method for characterizing new allotetraploid somatic hybrids of mandarin. Plant Cell Rep. 20, SHARMA A., NAMDEO A. G., MAHAGIK K. R., Molecular markers in plant genome analysis. Pharmacognosy Rev. 2, SHULMAN A., Molecular markers to assess genetic diversity. Euphytica 158, SHULMAN A., GUPTA P., VARSHNEY R., Organization of retrotransposons and microsatellites in cereal genomes. Cereal Genomics. Kluwer Academic Publishers, SŁOMSKI R., KOWALSKA K., KARCZMAREK M., WIELGUS K., JURA J., 2004a. Analiza powtórzeń trinukleotydowych w DNA. [W:] Przykłady analiz DNA. SŁOMSKI R. (red.). Wyd. AR im. A. Cieszkowskiego, Poznań. SŁOMSKI R., PŁAWSKI A., JUZWA W., SZALAŁA M., 2004b. Analiza powtórzeń dinukleotydów (CA) n. [W:] Przykłady analiz DNA. SŁOMSKI R. (red.). Wyd. AR im. A. Cieszkowskiego, Poznań. SÖZEN E., Evolution of ISSR markers to access genetic variability and relationship among winter triticale (X Triticosecale Wittmack) cultivarsm. Pak. J. Bot. 42, SURESH B., NAGARAJARAM M. A., IMEx: Imperfect microsatellite extraxtor. Bioinformatics 23, SZTUBA-SOLIŃSKA J., Systemy markerów molekularnych i ich zastosowanie w hodowli roślin. Kosmos 54, TAMS S. H., BAJER E., OETTLER G., MELCHINGER A. E., Genetic diversity in European winter triticale determined with SSR markers and coancestry coefficient. Theor. Appl. Genet. 108, TEMNYKH S., PARK W., AWERS N., CARTINHOUR S., HAUCK N., LIPOVICH L., CHO Y., ISHII T., MCCOUCH S., Mapping and genome organization of microsatellites in rice Oryza sativa. Theor. Appl. Genet. 100, THIEL T., MICHALEK W., VARSHNEY R. K., GRANER A., Exploiting EST databases for the development of cdna derived microsatellite markers in barley (Hordeum vulgare L.). Theor. Appl. Genet. 106, VAILLANCOURT A., NIKONGOLO K., MICHAEL P., MEHES M., Identification, characterisation, and chromosome locations of rye and wheat specific ISSR and SCAR markers useful for breeding puposes. Euphytica 159, VARSHNEY R. K., GRANER A., SORRELS M. E., Genic microsatellite markers in plants: features and applications. Trend Biotech. 1, WANG M. L., BARKLEY N. A., NEWMAN M. L., PEDERSON G. A., Tranfer of simpe sequence repeat (SSR) markers from major cereal crops to minor grass species for germplasm characterization and evaluation. Plant Genet. Res. 3, WOLFF K., ZIETKIEWICZ E., HOFSTRA H., Identification of chrysanthemum cultivars and stability of DNA fingerprinting patterns. Theor. Appl. Genet. 91, YU J. K., LA ROTA M., KANTETY R. V., SORRELS M. E., EST derived SSR markers for comparative mapping in wheat and rice. Mol. Genet. Genom. 271, ZIĘTKIEWICZ E., RAFALSKI A., LABUDA D., Genome fingerprinting by Simpe Sequence Repeat (SSR)-Anchored Polymerase Chain Reaction Amplification. Genomics 20,

72 Tom Numer 4 (297) Strony EMILIA WILMOWICZ, AGATA KUĆKO, MAGDALENA SIDŁOWSKA, KAMIL FRANKOWSKI, BEATA MACIEJEWSKA, PAULINA GLAZIŃSKA, JAN KOPCEWICZ Uniwersytet Mikołaja Kopernika Wydział Biologii i Nauk o Ziemi Katedra Fizjologii Roślin i Biotechnologii Gagarina 9, Toruń emwil@umk.pl kucko@poczta.pl sidlowska@wp.pl kfrank@o2.pl beata.maciejewska@bioscience.pl pnowa@umk.pl kopcew@biol.uni.torun.pl ROLA JASMONIANÓW W REGULACJI ROZWOJU GENERATYWNEGO* WPROWADZENIE Jasmoniany są grupą fitohormonów występujących powszechnie u roślin telomowych należących do różnych grup systematycznych. Początkowo hormony te postrzegane były głównie jako stymulatory procesu starzenia. Obecnie wiadomo, że uczestniczą one w regulacji wzrostu i rozwoju roślin na każdym ich etapie. Jasmoniany, obok etylenu (ang. ethylene, ET) i kwasu abscysynowego (ang. abscisic acid, ABA), uznawane są za hormony stresowe uczestniczące w adaptacji roślin do zmieniających się warunków środowiska (CHUNG i współaut. 2008, FLORS i współaut. 2008, REN i współaut. 2008, WA- STERNACK i KOMBRINK 2010). Ich obecność jest również konieczna dla pełnego sukcesu reprodukcyjnego roślin, gdyż regulują m. in.: czas kwitnienia, morfogenezę kwiatów, dyferencjację płci i produkcję ziaren pyłku (ACOSTA i współaut. 2009, CHENG i współaut. 2009, AVANCI i współaut. 2010, WILSON i współaut. 2011). Początki badań dotyczących udziału jasmonianów w rozwoju generatywnym roślin są związane z odkryciem kwasu jasmonowego (ang. jasmonic acid, JA) oraz jego metylowej pochodnej (ang. methyl jasmonic acid, MeJA) w pylnikach i ziarnach pyłku kamelii (Camellia), a także koniugatów JA z izoleucyną (ang. jasmonoyl-isoleucine, JA-Ile) w ziarnach pyłku kosodrzewiny (Pinus mugo) i petunii ogrodowej (Petunia hybrida) (AVANCI i współaut. 2010). Początkowo hormonom tym przypisywano jedynie udział w dojrzewaniu i kiełkowaniu ziaren pyłku. Jednakże, dzięki zastosowaniu mutantów rzodkiewnika pospolitego (Arabidopsis thaliana) charakteryzujących się zaburzeniami szlaku biosyntezy i/lub transdukcji sygnału tych hormonów okazało się, że jasmoniany ogrywają także istotną rolę w regulacji wielu innych procesów związanych z reprodukcją roślin. Prekursorem jasmonianów jest kwas -linolenowy (18:3) (ang. linolenic acid, -LA), uwalniany z błon chloroplastowych przez lipazy (ELLINGER i współaut. 2010). Biosynteza jasmonianów zachodzi w trzech kompartymentach komórkowych: chlo- *Praca finansowana z Programu Wieloletniego MRiRW nr 149/2011 i grantu MNiSW nr N

73 604 EMILIA WILMOWICZ i współaut. Ryc. 1. Schemat szlaku biosyntezy kwasu jasmonowego (wg AVANCI i współaut. 2010, zmodyfikowane, szczegóły w tekście). roplastach, peroksysomach i cytozolu. W pierwszym etapie syntetyzowany jest kwas 12-oksofitodienowy (ang. 12-oxo-phytodienoic acid, OPDA) i/lub dinor-oksofitodienowy (ang. dinor-oxo-phytodienoic acid, dnopda) przy udziale lipoksygenazy (ang. lipoxygenase, LOX), syntazy i cyklazy tlenku allenowego (ang. allene oxide synthase, AOS; allene oxide cyclase, AOC). JA powstaje w peroksysomach w reakcji katalizowanej przez reduktazę kwasu 12-oksofitodienowego (ang. oxophytodienoic acid reductase3, OPR3), a w cytozolu ulega dalszym przemianom metabolicznym (Ryc. 1) (FONSECA i współaut. 2009, SCHALLER i STINTZI 2009). Szczegółowo biosyntezę jasmonianów opisano zarówno w polskich, jak i zagranicznych pracach przeglądowych (ACOSTA i FARMER 2010, AVANCI i współaut. 2010, WILMOWICZ i współaut. 2012). DAD1 lipaza; LOX lipoksygenaza; AOS syntaza tlenku allenowego; AOC cyklaza tlenku allenowego; OPR3 reduktaza kwasu 12-oksofitodienowego; MeJA ester metylowy kwasu jasmonowego; JA-Ile koniugat kwasu jasmonowgo z aminokwasem izolaucyną. Odkrycie kolejnych elementów szlaku sygnałowego JA, a także receptora tego hormonu oraz miejsca jego wiązania, umożliwiło poznanie mechanizmu działania JA w regulacji rozwoju generatywnego roślin. Receptorem jasmonianów jest białko COI1 (ang. CORONATINE INSENSITIVE1) (YAN i współaut. 2009). Percepcja sygnału JA ma miejsce na terenie jądra komórkowego i prowadzi do aktywacji ligazy ubikwityny E3 typu SCF- COI1 (ang. skp1-cullin-f-box-ring box protein 1), a w konsekwencji do proteolitycznej degradacji represorów transkrypcji, białek JAZ (ang. jasmonate zim-domain) (KAZAN i MAN- NERS 2008, CHINI i współaut. 2009, CHUNG i współaut. 2008, FRANKOWSKI i współaut. 2009b, MARCINIAK i współaut. 2010). Obniżenie puli tych represorów umożliwia aktywację czynników transkrypcyjnych i ekspresję genów aktywowanych jasmonianami. INDUKCJA KWITNIENIA Po osiągnięciu przez roślinę stanu kompetencji czynniki zarówno wewnętrzne, jak i środowiskowe indukują w niej zmiany rozwojowe (indukcja), w efekcie których dochodzi do przekształcenia merystemów wegetatywnych w generatywne (ewokacja, inicjacja) i wytworzenia kwiatów (dyferencjacja, morfogeneza) (KOPCEWICZ 2009). U A. thaliana zidentyfikowano i scharakteryzowano geny powiązane z indukcją generatywną oraz wyodrębniono cztery główne szlaki indukcji kwitnienia: fotoperiodyczny, wernalizacyjny, autonomiczny i hormonalny. Modulują one ekspresję genów integratorowych

74 Rola jasmonianów w regulacji rozwoju generatywnego 605 (ang. LEAFY, LFY; FLOWERING LOCUS T, FT; SUPRESSOR OF OVEXPRESION OF CO1, SOC1), które regulując aktywność genów tożsamości merystemu prowadzą do zmiany wzorca rozwojowego wierzchołka wzrostu pędu, a następnie rozwoju kwiatu. Ten ostatni etap (formowanie poszczególnych części kwiatu) znajduje się pod ścisłą kontrolą genów tożsamości organów kwiatowych i u A. thaliana opisuje go model ABCE. Zakłada on, że rozwój działek kielicha, płatków korony, pręcików i słupków, ułożonych w poszczególnych okółkach kwiatu, jest kontrolowany przez cztery typy genów homeotycznych: A (ang. APETALA 1, 2; AP1, 2), B (ang. PISTIL- LATA, AP3 i PI), C (ang. AGAMOUS, AG) i E (ang. SEPALLATA, SEP). Każdy z okółków powstaje na skutek zróżnicowanej aktywności jednego lub dwóch z tych genów (GLAZIŃSKA i współaut. 2011). U A. thaliana gibereliny regulują ekspresję genów związanych z tworzeniem kwiatów, w sposób bezpośredni, poprzez aktywację genu LFY i FT lub pośredni, przez pozytywną regulację genu SOC1 (MUTASA-GÖTT- GEN i HEDDEN 2009). Mechanizmy te leżą u podstaw stymulującego wpływu giberelin na kwitnienie roślin dnia długiego (ang. long day plant, LDP) oraz niektórych gatunków roślin dnia krótkiego (ang. short day plant, SDP) (WILMOWICZ i współaut. 2011c). Chociaż u A. thaliana szlak hormonalny dotyczy głównie giberelin, to jednak obecnie liczne wyniki badań wskazują, że w procesie tym istotne znaczenie mają również inne fitohormony, m. in. auksyny, ABA, ET i jasmoniany (KĘSY i współaut. 2008, 2010; WILMOWICZ i współaut. 2008, 2011a, b; FRANKOWSKI i współaut. 2009a). U niektórych gatunków roślin jasmoniany hamują indukcję kwitnienia. Efekt taki obserwowano m.in. u spirodeli wielokorzeniowej (Spirodela polyrrhiza), wolfii bezkorzenio- wej (Wolffia arrhiza), tytoniu zwyczajnego (Nicotiana tabacum) i komosy czerwonej (Chenopodium rubrum). Ester metylowy kwasu jasmonowego aplikowany tuż przed indukcyjną ciemnością hamuje także kwitnienie wilca wielkokwiatowego (Pharbitis nil) (ang. short day plant, SDP) (KĘSY i współaut. 2011). Początkowo uważano, że MeJA działa pośrednio poprzez stymulację produkcji etylenu, silnego inhibitora kwitnienia P. nil. Jednakże dalsze badania pokazały, że indukowane do kwitnienia siewki P. nil potraktowane MeJA wytwarzają porównywalną ilość etylenu do roślin kontrolnych (KĘSY i współaut. 2011). Sugeruje to, że hamujące działanie jasmonianów na indukcję kwitnienia P. nil nie jest efektem stymulacji produkcji etylenu. Natomiast obniżenie endogennego poziomu jasmonianów przez podanie inhibitora ich biosyntezy (aspiryny), prowadzi do stymulacji indukcji kwitnienia. Wynika stąd, że wysoka zawartość jasmonianów w liścieniach P. nil podczas indukcyjnej nocy jest czynnikiem hamującym indukcję kwitnienia. Mimo że w szeregu procesach etylen wpływa na biosyntezę jasmonianów, to jednak brak jest danych dotyczących takiej zależności w fotoperiodycznej indukcji kwitnienia. KĘSY i współaut. (2011) wykazali, że podanie etylenu w czasie indukcyjnej nocy nie zmienia znacząco poziomu MeJA w liścieniach siewek P. nil, co sugeruje, że mechanizmy hamowania kwitnienia przez oba hormony są niezależne. Wpływ jasmonianów na kwitnienie różnych roślin jest niejednoznaczny. U wielu gatunków hamują one kwitnienie, jednak np. u rzepaku (Brassica napus) MeJA przyspiesza tworzenie pąków kwiatowych oraz zwiększa liczbę otwierających się kwiatów (PAK i współaut. 2009). Dokładny mechanizm działania jasmonianów w regulacji indukcji kwitnienia nie jest znany. MORFOGENEZA KWIATU Koordynacja procesów związanych z rozwojem pręcików oraz słupka jest podstawą do wytworzenia w pełni funkcjonalnego i zdolnego do zapylenia kwiatu. Prawidłowy rozwój tego organu zależy m. in. od zmian zawartości fitohormonów w różnicującym się merystemie wierzchołkowym. Zaburzenia szlaku biosyntezy i/lub transdukcji sygnału jasmonianów zakłócają prawidłowy rozwój kwiatów (Tabela 1) (AVANCI i współaut. 2010). Mutant A. thaliana dad1 (ang. defective in anther dehiscence1) z uszkodzonym genem kodującym fosfolipazę A1 charakteryzuje się zaburzeniami męskiej płodności (SCHOMMER i współaut. 2008, ELLINGER i współaut. 2010). Zawiera on o 80% mniej jasmonianów (JA, MeJA) niż rośliny typu dzikiego i charakteryzuje się opóźnionym dojrzewaniem ziaren pyłku oraz zaburzeniami w otwieraniu pylników i kwiatów. W procesach

75 606 EMILIA WILMOWICZ i współaut. Tabela 1. Wpływ mutacji genów kodujących enzymy zaangażowane w szlak biosyntezy oraz transdukcji sygnału jasmonianów na rozwój generatywny roślin. Mutant Fenotyp Efekt mutacji fad3-2fad7- -2fad8 dde1 dad1 dde2-2 jai1 opr3 męskosterylny męskosterylny męskosterylny męskosterylny żeńskosterylny męskosterylny zahamowane powstawanie -LeA zahamowana konwersja OPDA do JA zahamowane uwalnianie -LeA zahamowana biosynteza OPDA zaburzona kontrola dojrzewania nasion zahamowana konwersja OPDA tych kluczową rolę odgrywają ruchy wody. W początkowych etapach rozwoju kwiatu młode pylniki pobierają wodę przez wiązkę przewodzącą nitki pręcikowej, a następnie w momencie poprzedzającym otwarcie pylnika, wierzchołkowe komórki nitki pręcikowej wysychają, hamując przepływ wody i substancji odżywczych. Badania wzorca ekspresji DAD1 umożliwiły utworzenie modelu regulacji transportu wody do pręcików i płatków korony przez JA (Ryc. 2). Według niego, JA powstający w nitce pręcika synchronizuje dojrzewanie ziaren pyłku z otwieraniem pylników i kwiatów. U roślin typu dzikiego Zmutowany gen Literatura FAD MCCONN i BROWSE 1996 OPR3 SANDERS i współaut DAD1 ISHIGURO i współaut AOS VON MALEK i współaut COI1 LI i współaut OPR3 STINTZI i BROWSE 2000 uwolnienie ziaren pyłku z woreczków pyłkowych musi być poprzedzone utratą wody z komórek o nierównomiernie zgrubiałych ścianach warstwy włóknistej (endotecjum) w komorze pyłkowej. Listewki zgrubień są mocniejsze od strony zewnętrznej pylnika i delikatniejsze od wewnątrz. Przed otwarciem kwiatów następuje ekspresja genu DAD1 w górnej części nitki pręcika, prowadząca do akumulacji JA. Związek ten indukuje transport wody z komór pyłkowych przez łącznik i warstwę włóknistą do nitki pręcika. Odwodnione komórki warstwy włóknistej i łącznika zaczynają skręcać się na zewnątrz Ryc. 2. Model regulowanego przez kwas jasmonowy transportu wody podczas kolejnych stadiów rozwoju kwiatu. A dojrzewanie pyłku, B otwieranie pylników, C otwieranie kwiatów. Szarym kolorem zaznaczono elementy kwiatów, do których następuje transport wody. Przemieszczanie się JA w obrębie kwiatu, wzrost elongacyjny poszczególnych elementów kwiatu oraz ruch wody zaznaczono strzałkami (wg WILSONA i współaut. 2011, zmodyfikowane, szczegóły w tekście).

76 Rola jasmonianów w regulacji rozwoju generatywnego 607 Prawidłowo funkcjonujący szlak biosyntezy i przekazywania sygnału jasmonianów jest również istotny dla wydłużania nitki pręcika i transportu wody w płatkach korony. W stadium poprzedzającym otwarcie kwiatu ekspresja genu DAD1 zachodzi w całej nitce pręcika. Produkowany w niej JA promuje transport wody zarówno ze ścian pylnika, jak i szypułki kwiatu prowadząc do wydłużenia nitki pręcika. Woda może łatwo przepływać do płatków korony powodując ich wzrost i w konsekwencji otwarcie kwiatu (WILSON i współaut. 2011) (Ryc. 2). U ryżu (Oryza sativa) zidentyfikowano gen P0491E01 kodujący białko, wysoce podobne do występującego u A. thaliana, białka DAD1. Wyniki badań cytologicznych męskosterylnych mutantów wykazały, że defekt płodności związany jest z osłabieniem rozwoju mikrospor w dojrzałych ziarnach pyłku (AVANCI i współaut. 2010). Z kolei, badania prowadzone na potrójnym mutancie A. thaliana fad3-2fad7-2fad8 (ang. fatty acid desaturase) dowiodły, że przyczyną męskiej sterylności jest brak kwasu -linolenowego w tkance odżywczej woreczka pyłkowego (tapetum). Aplikacja jasmonianów na pąki kwiatowe przywracała płodność u tego mutanta (ZHANG i TURNER 2008). Uszkodzenie genu OPR3 u dde1 (ang. delayed dehiscence1), którego białkowy produkt jest zaangażowany w redukcję podwójnego wiązania w pierścieniu cyklopentenowym (9S,13S)-OPDA, powoduje opóźnienie otwierania pylników i prowadzi do nieefektywnego zapylenia. Za pomocą techniki in situ hybrydyzacji wykazano, że w początkowych etapach rozwoju kwiatu mrna DDE1 akumulowane jest we wszystkich częściach tego organu. W późniejszych etapach obecność transkryptu tego genu stwierdzono jedynie w słupkach, płatkach korony i nitkach pręcików, a nie obserwowano go w stomium oraz komórkach przegrody pylników, które są bezpośrednio zaangażowane w uwalnianie ziaren pyłku. Mutanty dde1, jak również dde2-2 (ang. delayed-dehiscence2-2), są męskosterylne, a ich płodność można przywrócić przez aplikację egzogennego JA (AVANCI i współaut. 2010). Kwiaty A. thaliana z defektem w genie OPR3 charakteryzują się opóźnionym wydłużaniem nitki pręcikowej i niepękającymi pylnikami, co ogranicza samozapylenie i prowadzi do męskiej bezpłodności. Fenotyp ten można odwrócić przez aplikację JA, natomiast podanie OPDA nie wywołuje takieprowadząc do wzrostu napięcia ściany pylnika i w konsekwencji jej rozerwania w stomium (miejsce zgrupowania wyspecjalizowanych komórek znajdujących się na styku dwu sąsiadujących woreczków pyłkowych). Odwodnienie komór umożliwia dojrzewanie ziaren pyłku. Procesu tego nie zaobserwowano u mutanta dad1, u którego komory pyłkowe pozostają napełnione wodą, a komórki warstwy włóknistej oraz łącznika są znacznie powiększone (WILSON i współaut. 2011). Na zachowanie odpowiedniego stanu uwodnienia pylników i w konsekwencji dojrzewanie ziaren pyłku wpływa również degeneracja tapetum oraz akumulacja białek PIP2 (ang. PLASMAMEMBRANE INTRINSIC PROTE- IN2) w łączniku i ścianie pylników. PIP2 są błonowymi akwaporynami, uczestniczącymi w ruchach wody wywołanych zmianami gradientu ciśnienia osmotycznego i hydrostatycznego w obrębie błon komórkowych (VAN WILDER i współaut. 2008). U mutanta A. thaliana srs7 (ang. shi-related sequence7) nie dochodzi do degeneracji tapetum i w konsekwencji otwarcia pylników (KIM i współaut. 2010). Wzorzec ekspresji genu SRS7 w nitce pręcika jest podobny do wzorca ekspresji genu DAD1, a rośliny z uszkodzonym genem SRS7 wykazują podobne zaburzenia płodności, jak mutanty z defektami biosyntezy lub szlaku sygnałowego JA (WILSON i współaut. 2011). Pękanie pylników związane jest również z degradacją pektynowych ścian komórkowych. Istotny w tym procesie wydaje się być udział poligalaktouronianów (ang. polygalacturonase, PG), -1,4-glukanazy oraz ekspansyn (GORGUET i współaut. 2009, WIL- SON i współaut. 2011). U A. thaliana zidentyfikowano i scharakteryzowano trzy białka PG (ang. Arabidopsis dehiscence zone polygalactouronase 1, 2, ADPG1, ADPG2; QRT2- -quartet 2, QRT2) zaangażowane w pękanie pylników, otwieranie strąków oraz aktywację komórek warstwy odcinającej kwiatów (OGAWA 2009). ADPG1 i ADPG2 uczestniczą w otwieraniu strąków, podczas gdy ADPG1, ADPG2 oraz QRT2 biorą udział w procesach związanych z pękaniem pylników. Aplikacja JA na pylniki powoduje dziesięciokrotny wzrost poziomu transkryptów genów kodujących wymienione białka (WILSON i współaut. 2011). Dodatkowo, ekspresję genu ADPG2 reguluje etylen, a QRT2 zarówno etylen, jak i ABA (OGAWA 2009). Zatem mechanizm pękania pylników z udziałem białek PG wydaje się być wypadkową interakcji między JA, ET i ABA.

77 608 EMILIA WILMOWICZ i współaut. go efektu (AVANCI i współaut. 2010). Mimo że OPDA często pełni funkcję bioaktywnej molekuły, to badania dotyczące koordynacji wydłużania nitki pręcikowej, otwierania pylników i produkcji żywotnych ziaren pyłku wskazują, że w regulacji tych procesów aktywną cząsteczką jest JA. Znaczny postęp, jaki dokonał się w ostatnim dziesięcioleciu w poznaniu szlaków biosyntezy i przekazywania sygnału jasmonianów i giberelin, doprowadził do ujawnienia licznych mechanizmów interakcji między tymi substancjami w regulacji rozwoju generatywnego roślin. Polegają one, m. in. na wpływie obu hormonów na aktywność czynników transkrypcyjnych MYB: MYB21, MYB24, regulujących ekspresję genów zaangażowanych w prawidłowy rozwój pręcików (CHENG i współaut. 2009). Kwiaty mutanta A. thaliana myb21-t1 myb24-t1 myb57-t1 charakteryzują się krótkimi pręcikami i męskosterylnością. Ekspresja MYB21 zachodzi w tkance waskularnej pylników oraz w komórkach łączących pylnik z nitką pręcika. Wysoki poziom transkryptu tego genu obserwowano również w komórkach gruczołowych wydzielających nektar i w zalążkach. Aktywność transkrypcyjną MYB24 stwierdzono w tkance przewodzącej działek kielicha, nitce pręcika oraz w komórkach górnej części słupka. Mechanizm działania giberelin polega na degradacji białek DELLA, transkrypcyjnych represorów odpowiedzi na gibereliny. Białka DELLA łączą się z czynnikami transkrypcyjnymi kontrolującymi ekspresję pierwotnych genów odpowiedzi na gibereliny, przez co hamują transkrypcję. Wzrost stężenia giberelin w komórkach aktywuje proteolityczą degradację białek DELLA w Ryc. 3. Współdziałanie kwasu jasmonowego z giberelinami w regulacji rozwoju pręcików (szczegóły w tekście). proteasomie 26 S, co prowadzi do uwolnienia czynników transkrypcyjnych i aktywacji genów (MURASE i współaut. 2008, SHIMADA i współaut. 2008). Spośród zidentyfikowanych u A. thaliana białek DELLA tylko RGA (ang. Represor of GA 1-3) i RGL2 (ang. RGA Like2) są zaangażowane w regulację rozwoju pręcika. Utrata funkcji obu białek umożliwia ekspresję MYB21, MYB24 i tym samym prawidłowy rozwój pręcika. Z kolei, deficyt giberelin prowadzi do akumulacji RGA i RGL2, zablokowania aktywności MYB21 oraz MYB24 i zahamowania wydłużania nitki pręcikowej (Ryc. 3). Dodatkowo, w młodych pąkach kwiatowych mutanta giberelinowego ga1-3 gai-t6 rga-t2 rgl/1-1 (ang. quadruple mutant, Q3) stwierdzono niższą zawartość jasmonianów, niż u roślin typu dzikiego. Gibereliny stymulują ekspresję genu DAD1, którego białkowy produkt jest zaangażowany w biosyntezę jasmonianów (CHENG i współaut. 2009). Jasmoniany kontrolują również powstawanie żeńskich organów rozrodczych. Mutanty jai1 (ang. jasmonic acid insensitive1) pomidora (Lycopersicon esculentum) z uszkodzonym szlakiem przekazywania sygnału JA są żeńskosterylne (LI i współaut. 2004). W kwiatach tych roślin znamię słupka znacząco wystaje ponad pylniki, co zmniejsza wydajność zapylenia. Tkanki kwiatów L. esculentum zawierają więcej JA, OPDA i JA-Ile niż liścienie. Proporcje tych endogennych jasmonianów są różne w poszczególnych częściach okwiatu, co może świadczyć o specyficznym zaangażowaniu każdego z nich w prawidłowy rozwój poszczególnych elementów kwiatu. Wyniki badań prowadzonych u B. napus pokazały, że zbyt duże stężenie MeJA prowadzi do anomalii w morfogenezie kwiatów, które u roślin dzikich zbudowane są z 4 działek kielicha, 4 płatków korony, 6 pręcików i słupka (PAK i współaut. 2009). Najczęściej obserwowaną nieprawidłowością jest przedwczesne otwieranie niedojrzałych męskosterylnych pąków kwiatowych (ang. early opened immature bud, EOIMB), charakteryzujących się powiększonymi pylnikami oraz niewykształconymi płatkami. Niemniej jednak mogą również występować inne morfologiczne nieprawidłowości w budowie kwiatów (ang. abnormal flowers, abf), jak na przykład: nierówna liczba płatków i działek kielicha (ang. abnormal flowers of type 1, abf-1), wyparte słupki i brak płatków korony (abf-2), zmniejszona liczba pręcików,

78 Rola jasmonianów w regulacji rozwoju generatywnego 609 płatków oraz działek kielicha (abf-3) (PAK i współaut. 2009). Większość roślin tworzy kwiaty zawierające zarówno żeńskie, jak i męskie elementy rozrodcze. Niektóre jednak, np. kukurydza, tworzą osobno kwiaty męskie i żeńskie. U tej jednopiennej rośliny kwiatostany żeńskie, wykształcone na pędach bocznych przekształconych w osadki tworzące kolby stojące pojedynczo w pachwinach liści, są fizycznie oddzielone od kwiatostanów męskich, które w postaci złożonych wiech osadzone są na wierzchołkach źdźbeł. Kwiaty męskie zawierają trzy pręciki, natomiast kolby są dwukwiatowe. Jeden z kwiatów ma normalnie rozwinięty słupek z bardzo długim znamieniem, natomiast drugi jest szczątkowy, niezdolny do zapłodnienia. Każdy merystem inicjuje powstawanie organów kwiatowych poprzez wytworzenie trzech primordiów pręcików i primordium słupka (ACOSTA i współaut. 2009). Ten początkowo obupłciowy merystem zostaje następnie zdeterminowany jako męski poprzez usunięcie primordiów słupka, a w proces determinacji płci są zaangażowane jasmoniany (BROWSE i współaut. 2009). Zanik primordiów słupkowych w kwiatach męskich jest skutkiem apoptozy komórek, w której uczestniczą białka TS1 i TS2 (ang. Tasselseed1, 2) (ACOSTA i współaut. 2009). TS1 jest podobne do roślinnych lipoksygenaz i zawiera dwie charakterystyczne dla tej grupy enzymów konserwatywne domeny oraz sekwencję sygnalną skierowującą je do chloroplastów. Mutacja genu TS1 powoduje utratę aktywności lipoksygenazowej, co powoduje zmniejszenie poziomu JA w rozwijających się kwiatostanach, i w konsekwencji powstawanie kwiatów żeńskich na wiechach kwiatów męskich. Podobne zaburzenia wykazują mutanty ts2. Gen TS2 koduje białko posiadające aktywność dehydrogenaz/reduktaz. Prawdopodobnie TS2 jest jednym z enzymów katalizujących -oksydację w szlaku syntezy JA. Ze względu na szerokie spektrum działania tego białka nie poznano dotąd jego naturalnego substratu, jak również nie określono jego dokładnej roli w apoptozie komórek słupka. Sugeruje się, że TS2 może wytwarzać proapoptotyczny sygnał lub rozkładać substraty niezbędne dla utrzymania komórek przy życiu. Męskie kwiaty mutantów ts1/ts2 traktowane JA produkują żywotne ziarna pyłku, co sugeruje, że oba produkty tych genów działają w jednym szlaku metabolicznym (ACOSTA i współaut. 2009). SEKRECJA NEKTARU Sekrecja nektaru jest regulowana przez jasmoniany i, obok koloru, zapachu oraz kształtu kwiatów, jest istotnym czynnikiem podnoszącym atrakcyjność rośliny. U B. napus wydzielanie nektaru poprzedzone jest wzrostem biosyntezy JA (PAK i współaut. 2009). Egzogenne JA, JA-Ile i koronatyna (substancja strukturalnie podobna do JA-Ile) również wzmagają sekrecję nektaru, chociaż w przypadku dwóch ostatnich związków efekt jest słabszy. U fasoli półksiężycowatej (Phaseolus lunatus) jasmoniany regulują wydzielanie nektaru przez kwiaty, jednakże efekt końcowy dodatkowo zależy od warunków fotoperiodycznych (RADHIKA i współaut. 2010). JA hamuje sekrecję nektaru u roślin rosnących w ciemności, podczas gdy u roślin rosnących na świetle stymuluje ten proces. Wzrost natężenia światła (o 25%) podnosi ilość wydzielanego nektaru pod wpływem JA w porównaniu do roślin nietraktowanych hormonem. Jednakże wzrost natężenia światła odpowiednio o 50 i 100% nie koreluje ze wzrostem sekrecji nektaru. Intensywność tego procesu zależy bowiem od współczynnika R:FR, czyli proporcji światła czerwonego (ang. red, R) do dalekiej czerwieni (ang. far red, FR). JA i JA-Ile hamują sekrecję nektaru u roślin wystawionych na działanie FR. Natomiast, w miarę wzrostu współczynnika R:FR wzrasta wrażliwość roślin na JA i JA-Ile. Co ciekawe, JA-Ile wzmaga sekrecję nektaru u roślin rosnących na świetle i nie powoduje jej obniżenia u roślin rosnących w ciemności. Zahamowanie biosyntezy JA-Ile na świetle zmniejsza szybkość wydzielania nektaru, a efekt ten można odwrócić przez aplikację JA-Ile. Do koniugacji JA z Ile jest również konieczne światło, które nie stymuluje syntezy JA (RADHIKA i współaut. 2010). Wynika stąd, że światło reguluje sekrecję nektaru pośrednio poprzez modulację tworzenia JA-Ile, która u P. lunatus jest biologicznie aktywną cząsteczką bezpośrednio zaangażowaną w ten proces.

79 610 EMILIA WILMOWICZ i współaut. PODSUMOWANIE Jasmoniany kontrolują przebieg poszczególnych faz rozwoju ontogenetycznego roślin. Biorą także udział w regulacji rozwoju generatywnego i to zarówno na etapie indukcji w liściach, jak i morfogenezy kwiatu w wierzchołkach wzrostu pędu. Wpływ jasmonianów na indukcję kwitnienia jest niejednoznaczny, ponieważ u jednych roślin hamuje, zaś u innych stymuluje ten proces. Wysoka zawartość jasmonianów w okresie indukcyjnej nocy wydaje się być czynnikiem hamującym kwitnienie. Obecność jasmonianów jest także konieczna dla prawidłowej morfogenezy, dyferencjacji płci kwiatów oraz wytworzenia ziaren pyłku. Koniugat kwasu jasmonowego z aminokwasem izoleucyną (JA-Ile) pełni jednocześnie rolę pośrednika w regulowanej światłem sekrecji nektaru przez kwiaty. ROLA JASMONIANÓW W REGULACJI ROZWOJU GENERATYWNEGO ROŚLIN Streszczenie Jasmoniany są fitohormonami warunkującymi prawidłowy przebieg poszczególnych faz rozwojowych rośliny. Prekursorem jasmonianów jest kwas -linolenowy, a ich biosynteza zachodzi w trzech strukturach subkomórkowych: chloroplastach, peroksysomach i cytozolu. Niniejsza praca podsumowuje najnowsze osiągnięcia dotyczące udziału jasmonianów w reprodukcji roślin. U większości gatunków roślin jasmoniany hamują kwitnienie. Jednakże, badania prowadzone na rzepaku wskazują, że rola tych związków w indukcji generatywnej nie jest jednoznaczna, gdyż, w pewnych warunkach, mogą one także przyspieszać tworzenie kwiatów. Jasmoniany pełnią również istotną rolę w prawidłowym formowaniu płonnych i płodnych części kwiatu, a także w otwieraniu pąków kwiatowych. Ponadto, kwas jasmonowy (JA) powstający w nitce pręcika synchronizuje dojrzewanie ziaren pyłku z otwieraniem pylników i kwiatów. Na podstawie analizy wzorca ekspresji genu DAD1, kodującego enzym zaangażowany w powstawanie jasmonianów, utworzono model regulacji transportu wody do pręcików i płatków korony przez JA. Dodatkowo, zaobserwowano, że jedna z bioaktywnych form kwasu jasmonowego, koniugat z aminokwasem izoleucyną (JA-Ile), pełni rolę cząsteczki pośredniczącej w regulowanej przez światło sekrecji nektaru. JA-Ile wzmaga wydzielanie nektaru u roślin uprawianych na świetle i nie powoduje jej obniżenia u roślin uprawianych w ciemności. Zahamowanie biosyntezy JA-Ile na świetle zmniejsza sekrecję nektaru, a efekt ten można odwrócić przez aplikację JA-Ile. THE ROLE OF JASMONATES IN THE REGULATION OF GENERATIVE DEVELOPMENT IN PLANTS Summary Jasmonates are phytohormones conditioning proper functioning of separate plant development stages. Jasmonates precursor is -linolenic acid. Their biosynthesis occurs in three subcellular structures: chloroplasts, peroxisomes and cytosol. This paper summarizes the most recent achievements on participation of jasmonates in the field of reproduction of plants. Jasmonates hinder florescence among the most species of plants. However, researches carried out over rape indicate that the role of these compounds in generative induction is not explicit, i.e. they may speed up the growth of flowers in certain circumstances. Jasmonates are also very important in a process of proper formation of sterile and fertile parts of flower, as well as in opening flower buds. Furthermore, jasmonic acid (JA) nascent in a thread rod synchronizes maturation of pollen grains with the process of opening anthers and flowers. On the basis of gene expression pattern DAD1 analysis (the one that encodes an enzyme involved in the first stage of jasmonates formation), there was created a model of water transport regulation by JA to the stamens and petals of the crown. In addition, it was observed that one of the bioactive forms of jasmonic acid (JA-Ile) acts as an intermediary molecule in the secretion of nectar, regulated by the light. JA-Ile increases in the secretion of nectar in plants cultivated in the light and does not cause its decrease in plants cultivated in the dark. Inhibition of the JA-Ile biosynthesis in the light reduces the secretion of nectar. This result can be inverted by the application of JA-Ile. LITERATURA ACOSTA I. F., FARMER E. E., Jasmonates. The Arabidopsis book. Am. Soc. Plant Biol. doi/ / tab ACOSTA I. F., LAPARRA H., ROMERO S. P., SCHMELZ E., HAMBERG M., MOTTINGER J. P., MORENO M. A., DEL- LAPORTA S. L., tasselseed1 is a lipoxygenase affecting jasmonic acid signaling in sex determination of maize. Science 323, AVANCI N. C., LUCHE D. D., GOLDMAN G. H., GOLDMAN N. H., Jasmonates are phytohormones

80 Rola jasmonianów w regulacji rozwoju generatywnego 611 with multiple functions, including plant defense and reproduction. Genet. Mol. Res. 9, BROWSE J., Jasmonate: preventing the maize tassel from getting in touch with his feminine side. Sci. Signal. 2, e9. CHENG H., SONG S., XIAO L., SOO H. M., CHENG Z., XIE D., PENG J., Gibberellin acts through jasmonate to control the expression of MYB21, MYB24, and MYB57 to promote stamen filament growth in Arabidopsis. PLoS Genet. 5, e CHINI A., BOTER M., SOLANO R., Plant oxylipins: COI1/JAZs/MYC2 as the core jasmonic acid-signalling module. FEBS J. 276, CHUNG H. S., KOO A. J., GAO X., JAYANTY S., THINES B., JONES A. D., HOWE G. A., Regulation and function of Arabidopsis JASMONATE ZIM-domain genes in response to wounding and herbivory. Plant Physiol. 146, ELLINGER D., STINGL N., KUBIGSTELTIG I. I., BALS T., JU- ENGER M., POLLMANN S., BERGER S., SCHUENEMANN D., MUELLER M. J., DONGLE and DEFEC- TIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 lipases are not essential for wound- and pathogen-induced jasmonate biosynthesis: redundant lipases contribute to jasmonate formation. Plant Physiol. 153, FLORS V., TON J., VAN DOORN R., JAKAB G., GARCÍA- AUGUSTÍN P., MAUCH-MANI B., Interplay between JA, SA and ABA signaling during basal and induced resistance against Pseudomonas syringe and Alternaria brassicicola. Plant J. 54, FONSECA S., CHINI A., HAMBERG M., ADIE B., PORZEL A., KRAMELL R., MIERSCH O., WASTERNACK O., SOLANO R., (+)-7-iso-Jasmonoyl-L-isoleucine is the endogenous bioactive jasmonate. Nat. Chem. Biol. 5, FRANKOWSKI K., KĘSY J., WOJCIECHOWSKI W., KO- PCEWICZ J., 2009a. Light- and IAA regulated ACC synthase gene (PnACS) from Pharbitis nil and its possible role in IAA-mediated flower inhibition. J. Plant Physiol. 166, FRANKOWSKI K., ŚWIEŻAWSKA B., WILMOWICZ E., KĘSY J., KOPCEWICZ J., 2009b. Szlak sygnałowy kwasu jasmonowego nowe informacje. Post. Bioch. 55, GLAZIŃSKA P., BRACHA J., WILMOWICZ E., KOPCEWICZ J., Udział mikro RNA w rozwoju generatywnym roślin. Kosmos 60, GORGUET B., SCHIPPER D., VAN LAMMEREN A., VISSER R. G., VAN HEUSDEN A. W., PS-2, the gene responsible for functional sterility in tomato, due to non-dehiscent anthers, is the result of a mutation in a novel polygalacturonase gene. Theor. App. Genet. 118, ISHIGURO S., KWAI-ODA A., UEDA J., NISHIDA I., OKADA K., The DEFECTIVE IN ANTHER DEHIS- CENCE1 gene encodes a novel phospholipase A1 catalyzing the initial step of jasmonic acid biosynthesis, which synchronizes pollen maturation. Plant Cell 13, KAZAN K., MANNERS J. M., Jasmonate signaling: toward an integrated view. Plant Physiol. 146, KĘSY J., MACIEJEWSKA B., SOWA M., SZUMILAK M., KA- WAŁOWSKI K., BORZUCHOWSKA M., KOPCEWICZ J., Ethylene and IAA interactions in the inhibition of photoperiodic flower induction of Pharbitis nil. Plant Growth Regul. 55, KĘSY J., FRANKOWSKI K., WILMOWICZ E., GLAZIŃSKA P., WOJCIECHOWSKI W., KOPCEWICZ J., The possible role of PnACS2 in IAA-mediated flower inhibition in Pharbitis nil. Plant Growth. Regul. 61, KĘSY J., WILMOWICZ E., MACIEJEWSKA B., FRANKOWSKI K., GLAZIŃSKA P., KOPCEWICZ J., Independent effects of jasmonates and ethylene on inhibition of Pharbitis nil flowering. Acta. Physiol. Plant 33, Kim S. G., Lee S., Kim Y. S., Yun D. J., Woo J. C., Park C. M., Activation tagging of an Arabidopsis SHI-RELATED SEQUENCE gene produces abnormal anther dehiscence and floral development. Plant Mol. Biol. 74, KOPCEWICZ J., Generatywny okres rozwoju. [W:] Fizjologia roślin. LEWAK S., KOPCEWICZ J. (red.). Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, LI L., ZHAO Y., MCCAIG B. C., WINGERD B. A., WANG J., WHALON M. E., PICHERSKY E., HOWE G. A., The tomato homolog of CORONATINE-INSENSI- TIVE1 is required for the maternal control of seed maturation, jasmonate-signaled defense responses, and glandular trichome development. Plant Cell. 16, MARCINIAK K., TUROWSKI T., WILMOWICZ E., FRANKOW- SKI K., KĘSY J., KOPCEWICZ J., Ligazy ubikwitynowo-białkowe w szlakach sygnałowych auksyn, jasmonianów i giberelin. Post. Biol. Kom. 37, MCCONN M., BROWSE J., The critical requirement for linolenic acid is pollen development, not photosynthesis, in an Arabidopsis mutant. Plant Cell 8, MURASE K., HIRANO Y., SUN T. P., HAKOSHIMA T., Gibberellin induced DELLA recognition by the gibberellin receptor GID1. Nature 456, MUTASA-GÖTTGENS E., HEDDEN P., Gibberellin as a factor in floral regulatory networks. J. Exp. Bot. 60, OGAWA M., KAY P., WILSON S., SWAIN S.M., ARA- BIDOPSIS DEHISCENCE ZONE POLYGALACTU- RONASE1 (ADPG1), ADPG2, and QUARTET2 are polygalacturonases required for cell separation during reproductive development in Arabidopsis. Plant Cell 21, PAK H., GUO Y., CHEN M., CHEN K., LI Y., HUA S., SHAMSI I., MENG H., SHI C., JIANG L., The effect of exogenous methyl jasmonate on the flowering time, floral organ morphology, and transcript levels of a group of genes implicated in the development of oilseed rape flowers (Brassica napus L.). Planta 231, RADHIKA V., KOST C., BOLAND W., HEIL M., The Role of jasmonates in floral nectar secretion. PLoS ONE 5: doi: /journal. pone REN D., LIU Y., YANG K.-Y., HAN I., MAO G., GLAZE- BROOK J., ZHANG S., A fungal-responsive MAPK cascade regulates phytoalexin biosynthesis in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, SANDERS P. M., LEE P. Y., BIESGEN C., BOONE J. D., BEALS T. P., WEILER E. W., GOLDBERG R. B., The Arabidopsis DELAYED DEHISCENCE1 gene encodes an enzyme in the jasmonic acid synthesis pathway. Plant Cell 12, SCHALLER A., STINTZI A., Enzymes in jasmonate biosynthesis structure, function, regulation. Phytochem. 70, SCHOMMER C., PALATNIK J. F., AGGARWAL P., CHETELAT A., CUBAS P., FARMER E. E., NATH U., WEIGEL D., Control of jasmonate biosynthesis and senescence by mir319 targets. PLoS Biol. 6, e230. SHIMADA A., UEGUCHI-TANAKA M., NAKATSU T., NAKAJI- MA M., NAOE Y., OHMIYA H., KATO H., MATSUOKA M., Structural basis for gibberellin recognition by its receptor GID1. Nature 456,

81 612 EMILIA WILMOWICZ i współaut. STINTZI A., BROWSE J., The Arabidopsis malesterile mutant, opr3, lacks the 12-oxophytodienoic acid reductase required for jasmonate synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, VAN WILDER V., MIECIELICA U., DEGAND H., DERUA R., WAELKENS E., CHAUMONT F., Maize plasma membrane aquaporins belonging to the PIP1 and PIP2 subgroups are in vivo phosphorylated. Plant Cell Physiol. 49, VON MALEK B., VAN DER GRAAFF E., SCHNEITZ K., KELLER B., The Arabidopsis male-sterile mutant dde1-2 is defective in the ALLENE OX- IDE SYNTHASE gene encoding one of the key enzymes of the jasmonic acid biosynthesis pathway. Planta 216, WASTERNACK C., KOMBRINK E., Jasmonates: structural requirements for lipid-derived signals active in plant stress responses and development. ACS Chem. Biol. 5, WILMOWICZ E., KĘSY J., KOPCEWICZ J., Ethylene and ABA interactions in the regulation of flower induction in Pharbitis nil. J. Plant Physiol. 165, WILMOWICZ E., FRANKOWSKI K., GLAZIŃSKA P., KĘSY J., KOPCEWICZ J., 2011a. Involvement of ABA in flower induction of Pharbitis nil. Acta Soc. Bot. Pol. 80, WILMOWICZ E., FRANKOWSKI K., GLAZIŃSKA P., KĘSY J., WOJCIECHOWSKI W., KOPCEWICZ J., 2011b. Cross talk between phytohormones in the regulation of flower induction in Pharbitis nil. Biol. Plant. 55, WILMOWICZ E., FRANKOWSKI K., GLAZIŃSKA P., SIDŁOW- SKA M., MARCINIAK K., KOPCEWICZ J., 2011c. Rola giberelin w regulacji kwitnienia roślin. Kosmos 60, WILMOWICZ E., FRANKOWSKI K., SIDŁOWSKA M., KUĆKO A., KĘSY J., GĄSIOROWSKI A., GLAZIŃSKA P., KOPCE- WICZ J., Biosynteza jasmonianów u roślin najnowsze odkrycia. Post. Bioch., 58, WILSON Z.A., SONG J., TAYLOR B., YANG C., The final split: the regulation of anther dehiscence. J. Exp. Botan. 62, YAN J., ZHANG C., GU M., BAI Z., ZHANG W., QI T., CHENG Z., PENG W., LUO H., NAN F., WANG Z., XIE D., The Arabidopsis CORONATINE INSEN- SITIVE1 protein is a jasmonate receptor. Plant Cell 21, ZHANG Y.I., TURNER J.G., Wound-induced endogenous jasmonates stunt plant growth by inhibiting mitosis. PLoS ONE 3:e3699. doi: /journal.pone

82 Tom Numer 4 (297) Strony SYLWIA ZIELIŃSKA Katedra Biotechnologii Roślin, Wydział Biologii Uniwersytet Szczeciński Wąska 13, Szczecin sziel@univ.szczecin.pl METABOLIZM WĘGLOWODANÓW JAKO JEDEN ZE SKŁADNIKÓW MECHANIZMÓW TOLERANCJI NA STRESY ABIOTYCZNE U ROŚLIN Stresy środowiskowe, takie jak ekstremalne temperatury, susza czy zasolenie, na które narażone są rośliny wyższe, są głównymi przyczynami zmian w metabolizmie węglowodanów. W warunkach działania stresów abiotycznych następuje regulacja metabolizmu roślin dzięki współdziałaniu szlaków sygnalnych wywołanych przez cukry ze szlakami odpowiedzi na zmieniające się warunki środowiska zewnętrznego. Duża liczba genów wrażliwych na stres jest indukowana przez glukozę, co wskazuje na rolę cukrów w odpowiedziach roślin na stresy środowiskowe. Rola węglowodanów jest związana z regulacją genów kodujących białka enzymów metabolizmu węglowodanów (SEKI i współaut. 2002), a także ze zróżnicowaną regulacją zawartości cukrów i aktywności enzymów metabolizmu węglowodanów oraz z funkcją cukrów jako cząsteczek sygnalnych w ekspresji genów podczas stresów abiotycznych (HO i współaut. 2001, GUPTA i KAUR 2005). Węglowodany jako cząsteczki sygnalne wpływają na rośliny we wszystkich stadiach wzrostu. WSTĘP Cukry regulują wzrost roślin poprzez modulację ekspresji genów i aktywności enzymów w tkankach donorowych, które produkują i eksportują węglowodany oraz w tkankach akceptorowych. Ta regulacja zapewnia optymalną syntezę i wykorzystanie zasobów węgla i energii. Ogólnie niski poziom cukrów zwiększa wydajność fotosyntezy, mobilizację materiałów zapasowych i ich eksport, podczas gdy duża ilość cukrów promuje wzrost roślin oraz magazynowanie w nich węglowodanów. Akumulacja cukrów w tkankach donorowych obniża wydajność fotosyntezy. Mechanizm homeostazy pozwala na adaptacje metabolizmu węglowodanów na zmieniające się warunki środowiska. Spośród czynników środowiskowych, które wpływają na rośliny: susza, zasolenie i ekstremalne temperatury są najważniejszymi, natomiast inne, takie jak promieniowanie nadfioletowe UVB, metale ciężkie, powodzie i zanieczyszczenia atmosferyczne zyskały na znaczeniu w ostatnich latach. STRES NISKIEJ TEMPERATURY A METABOLIZM WĘGLOWODANÓW Stres chłodu powoduje w roślinach różne dysfunkcje na poziomie komórkowym, tzn. uszkodzenia błon komórkowych, powstawanie reaktywnych form tlenu (ang. reactive oxygen species, ROS), denaturację białek, akumulację toksycznych metabolitów (BOWERS 1994, SHAO i współaut. 2008). W warunkach naturalnych rośliny mogą uzyskiwać tolerancję na niską temperaturę dzięki aklimatyzacji do chłodu, czyli stopniowej ekspozycji na niskie temperatury nie powodujące zamarzania (THOMASHOW 1999). Proces ten jest związany ze złożonymi mechanizmami, które obejmują zmiany w ekspresji genów, w zawartości składników budulcowych membran, w podwyższaniu zawartości kwasu abscysynowego,

83 614 SYLWIA ZIELIŃSKA antyoksydantów, w akumulacji znacznych ilości substancji rozpuszczalnych takich jak cukry rozpuszczalne, aminokwasy i betaina glicynowa odgrywające rolę w ochronie komórek przed uszkodzeniami w wyniku zamarzania (MA i współaut. 2009). Udowodniono, że wiele rodzajów cukrów rozpuszczalnych jest włączanych w proces aklimatyzacji do chłodu. Takimi cukrami są przede wszystkim dwucukry: sacharoza, trehaloza, a oprócz nich heksozy (fruktoza, glukoza) oraz skrobia i niektóre oligosacharydy, szczególnie rodziny rafinozy (RFO), czyli rafinoza i stachioza. RFO są akumulowane u wielu roślin w odpowiedzi na ekspozycję w niskich temperaturach (CHAT- TERTON i współaut. 1990, BACHMANN i współaut. 1994). Utrzymanie lub wzrost zawartości sacharozy (PALONEN i współaut. 2000) oraz wzrost zawartości rafinozy i stachiozy (IMANI- SHI i współaut. 1998, MORSY i współaut. 2007) zapewniało wysoką tolerancję roślin na stres chłodu. Ponadto stwierdzono 2-krotnie pod- wyższony poziom monosacharydu pentozy, arabinozy, podczas traktowania chłodem roślin Coffea canephora (PARTELLI i współaut. 2010). Arabinoza zaś, podobnie jak hydroksyprolina, jest ważnym składnikiem glikoprotein i odgrywa ważną rolę strukturalną w budowie ściany komórkowej, szczególnie w warunkach działania zimna, gdyż utrzymuje rozciągliwość ściany komórkowej. W związku z akumulacją poszczególnych cukrów rozpuszczalnych, a szczególnie sacharozy i fruktanów, w metabolizmie cukrów podczas stresu niskiej temperatury obserwowano zdolność do zwiększania aktywności następujących enzymów: syntazy fosfosacharozowej (SPS, EC ), syntazy sacharozowej (SS, SuSy, EC ) oraz fruktozylotransferazy sacharoza: sacharoza (SST, EC ) (GUY i współaut. 1992). Kontrolę metabolizmu sacharozy u roślin w odpowiedzi na zmienne warunki środowiska opisano w pracy przeglądowej CIERESZKO (2006). METABOLIZM CUKROWCÓW W WARUNKACH WYSOKIEJ TEMPERATURY Poziom całkowitej ilości cukrów rozpuszczalnych w roślinach jest podwyższony również podczas stresu wysokiej temperatury. Zawartość tych cukrów wiąże się z uzyskiwaniem termotolerancji, czyli odporności na stres cieplny. Efektem szoku cieplnego na metabolizm węglowodanów było istotne zwiększenie ich zawartości w siewkach m. in. Brassica spp. oraz zwiększenie aktywności enzymatycznej inwertazy (INV, EC ) (KAUR i współaut. 2009). Taki stan jest wynikiem mechanizmu adaptacyjnego do warunków stresu i skutkuje ochronnym wpływem cukrów i ich działaniem jako cząsteczki sygnalne. Do węglowodanów, które są akumulowane podczas działania stresu cieplnego należą przede wszystkim: fruktoza, sacharoza, galaktinol i rafinoza (PANIKULANGA- RA i współaut. 2004). W odpowiedzi na stres wysokiej temperatury w roślinach Arabidopsis typu dzikiego oraz w roślinach transgenicznych ze zwiększoną ekspresją głównego czynnika transkrypcyjnego szoku cieplnego HSF3 stwierdzono indukcję ekspresji genu syntazy galaktinolu (GolS1, EC ) kluczowego enzymu odpowiedzialnego za biosyntezę oligosacharydów rodziny rafinozy (RFO): rafinozy, stachiozy i werbaskozy (PA- NIKULANGARA i współaut. 2004). WPŁYW STRESU DEFICYTU WODY NA METABOLIZM CUKROWCÓW I CUKROLI W warunkach niedoboru wody rośliny reagują bardzo szybko w różnorodny sposób. Jedną z reakcji jest regulacja potencjału osmotycznego w komórkach dzięki akumulacji różnych substancji, które powodują utrzymanie odpowiedniego turgoru, przewodnictwa szparkowego, intensywności fotosyntezy, transpiracji i obniżenie wrażliwości liści (THOMAS 1997). Ponadto, stres deficytu wodnego może powstawać przy wielu warunkach środowiskowych, włączając w to oprócz suszy, zasolenie, a także ekstremalne temperatury. Wiele cząsteczek związanych z regulacją osmotyczności, a w szczególności poliole (cukrole alkohole cukrowe, polihydroksylowe np. mannitol, ononitol, pinitol) mają także zdolność niszczenia toksycznych reaktywnych form tlenu (ROS) (SHEN i współaut. 1997). W roślinach Cercis canadensis znacznie zwiększała się pod wpływem suszy zawartość D-pinitolu (GRIFFIN i współaut. 2004). Rola pinitolu i jego prekursorów, myo-inozytolu i ononitolu jako osmoprotektantów, została dobrze poznana u Mesembryathemum crystallinum L. (VERNON i BOHNERT 1992). Akumulacja tych osmoprotektantów

84 Metabolizm węglowodanów a tolerancja na stresy abiotyczne u roślin 615 i antyoksydantów reprezentuje fizjologiczną odpowiedź na suszę i mechanizm obrony przed fotoinhibicją (GRIFFIN i współaut. 2004). Zawartość sacharozy oraz skrobi była natomiast zmniejszana przez suszę (MOHAM- MEDKHANI i HEIDARI 2008), a całkowitą ilość cukrów rozpuszczalnych tworzyły glukoza i fruktoza, a poza tym zwiększała się ilość cukroli: myo-inozytolu, ononitolu i z przewagą pinitolu (GRIFFIN i współaut. 2004). Udowodniono, że lepszym markerem tolerancji na suszę u Triticum durum Desf. jest zawartość cukrów rozpuszczalnych niż proliny (AL HA- KIMI i współaut. 1995). Akumulacja węglowodanów rozpuszczalnych jest silnie skorelowana z uzyskiwaniem przez rośliny odporności na suszę (HOEKSTRA i BUITINK 2001). Podczas działania stresu deficytu wody obniżała się także zawartość oligosacharydów: galaktinolu, rafinozy i stachiozy, podobnie jak węglowodanów niestrukturalnych (heksoz, sacharozy i skrobi). Było to związane z hamowaniem aktywności enzymu GolS1 oraz indukcją aktywności transferazy metyloinozytolu (IMT, EC ) (PATTANAGUL i MADORE 1999). Enzym IMT katalizuje metylację myo- -inozytolu w szlaku biosyntezy ononitolu i jego aktywność jest kluczowa dla tolerancji deficytu wodnego, a także stresu solnego. Stwierdzono indukcję transkryptów GmIMT (cdna IMT z Glycine max) w liściach siewek transgenicznej soi oraz rzodkiewnika podczas działania stresu suszy i zasolenia, a ponadto potwierdzono obecność produktu białkowego GmIMT i jego substratu przy użyciu systemu rekombinacyjnego w Escherichia coli (AHN i współaut. 2011). METABOLIZM CUKROWCÓW I CUKROLI W WARUNKACH ZASOLENIA Ilość węglowodanów rozpuszczalnych ma ważne znaczenie podczas działania stresu solnego, ponieważ wtedy są one syntetyzowane i akumulowane w cytozolu. Wzrost zawartości cukrów poprawia regulację osmotyczną i utrzymanie turgoru podczas wzrostu w warunkach zasolenia, które wpływają na rośliny poprzez obniżenie potencjału osmotycznego i pobierania wody oraz toksyczność specyficznych jonów (Na +, K +, Cl - ) (NEMA- TI i współaut. 2011). Jednak rola cukrów w efektach jonowych jest ciągle niewyjaśniona (SIRINGAM i współaut. 2011). Rośliny, które posiadają zdolność do tolerancji zasolenia akumulują cukry proste oraz oligosacharydy (rafinozę i stachiozę). Stres solny indukował syntezę cukrów u takich gatunków roślin jak: słonecznik, jęczmień, sorgo, pomidor, ryż, rzodkiewnik, topola, kukurydza (PARVAIZ i SATYAWATI 2008, PATTANAGUL i THITISAKSAKUL 2008). Ponadto, akumulacja cukrów rozpuszczalnych była związana z wzrostem zawartości jonów Na +. Wiedza na temat metabolizmu węglowodanów podczas działania zasolenia jest ciągle bardzo ograniczona. Całkowita zawartość sacharozy oraz pozostałych cukrów rozpuszczalnych podwyższała się podczas stresu solnego u ryżu (Oryza sativa L.) odmiany wrażliwej na zasolenie, natomiast nie było takiego efektu u odmiany umiarkowanie wrażliwej i odpornej (PATTANAGUL i THI- TISAKSAKUL 2008). Stres solny powodował przy tym wzrost aktywności enzymu SPS, jednak aktywność ta nie była skorelowana z akumulacją sacharozy. Interesującym było, że odmiany ryżu umiarkowanie wrażliwe na zasolenie i odporne nie wykazywały akumulacji sacharozy. Podobnie reagowały wrażliwe i odporne na zasolenie odmiany pomidora (BALIBREA i współaut. 2000). Reakcja roślin wrażliwych mogła być rezultatem redukcji węglowodanów zapasowych, natomiast reakcja roślin odpornych była odwrotna, gdyż następowała w nich akumulacja skrobi. Jednakże skrobia może nie odgrywać znaczącej roli w mechanizmie tolerancji na zasolenie. Sugeruje się, że zdolność roślin do magazynowania cukrów w postaci skrobi pomaga uniknąć zmian metabolicznych z powodu nadmiaru sacharozy w cytoplazmie komórek (PATTANAGUL i THITISAKSAKUL 2008). Uważa się, że względna tolerancja zasolenia związana jest z akumulacją mannitolu i trehalozy, które odgrywają rolę w osmoregulacji podczas działania tego stresu abiotycznego (MORSY i współaut. 2007, PARVAIZ i SATYAWA- TI 2008). Proporcja mannitolu w całkowitym spektrum węglowodanów osiągała więcej niż 40% i zwiększała się dwukrotnie w porównaniu do jego zawartości w roślinach kontrolnych Olea europaea L. (REJŠKOVÁ i współaut. 2007). Oligosacharydy z rodziny rafinozy (RFO) nie odgrywają szczególnej roli podczas stresu zasolenia, gdyż w żadnym przypadku nie były obszernie badane i ich rola jest niewyjaśniona. Ponadto stwierdzono, że w roślinach słonolubnych, tzw. halofitach, oraz innych, np. Glycine max, Aster

85 616 SYLWIA ZIELIŃSKA tripolium, Arenaria peploides, Medicago sativa, Pinus pinaster, Spergularia marginata, magazynowane są bardzo duże ilości cyklicznych polioli, takich jak myo-inozytol, i jego metylowanych pochodnych, takich jak D-ononitol i D-pinitol (SENGUPTA i współaut. 2008). Ich biosynteza wymaga zaangażowania czterech ścieżek enzymatycznych począwszy od prekursora glukozo-6-fosforanu. Myo-inozytol jest syntetyzowany z glukozo-6-fosforanu w dwóch reakcjach katalizowanych przez syntazę 1-fosforanu myo-inozytolu (MIPS, INO, EC ). Następnie produkt MIPS jest specyficznie defosforylowany przez Mg 2+- -zależną monofosfatazę 1-fosforanu L-myo- -inozytolu (IMP, EC ) i tworzy wolny inozytol. Podczas działania stresu solnego w roślinach inozytol może być metylowany do D-ononitolu przez IMT w reakcji zależnej od S-adenozylometioniny (SAM). D-ononitol jest następnie epimeryzowany przez epimerazę D-ononitolu (OEP) i w ten sposób powstaje D-pinitol, który może być demetylowany do D-chiro-inozytolu (SENGUPTA i współaut. 2008, PATRA i współaut. 2010, AHN i współ- aut. 2011). Gen kodujący enzym MIPS (INO) został sklonowany z różnych gatunków roślin: Arabidopsis thaliana, ryż, soja, sezam, halofitów Mesembryanthemum crystallinum i Porteresia coarctata (PcINO1), przy czym transkrypcja tego genu u halofitów była indukowana przez stres solny (AHN i współaut. 2011) i biosynteza pinitolu z inozytolu była regulowana i wzmagana przez działanie tego stresu abiotycznego (SENGUPTA i współaut. 2008). Gen kodujący enzym IMP nie został jeszcze sklonowany z żadnego organizmu (AHN i współaut. 2011). Z wyżej wymienionych halofitów sklonowano również gen kodujący enzym IMT. Indukcję transkrypcji tego genu przez stres solny stwierdzono u tychże halofitów oraz w roślinach transgenicznych Nicotiana tabacum wykazujących koekspresję genów PcINO1 i McIMT1 (PATRA i współaut. 2010), a także w A. thaliana z nadekspresją genu GmIMT (AHN i współaut. 2011). W wyniku tej indukcji rośliny transgeniczne charakteryzowały się zwiększoną tolerancją na stres solny. STRES NADMIARU WODY A METABOLIZM WĘGLOWODANÓW Nadmiar wody w glebie spowodowany częstymi deszczami, okresowym zalewaniem czy powodziami jest też częstym problemem dotykającym głównie rośliny uprawne. Bardzo ważną biologiczną konsekwencją zalania wodą jest niedobór (hipoksja) lub całkowity brak tlenu (anoksja) w glebie, który ogranicza wzrost, rozwój i produkcję roślin. Gatunki roślin tolerujące ten rodzaj stresu mogą adaptować się do jego warunków dzięki mechanizmom morfologicznym i metabolicznym. Mechanizmy morfologiczne to przede wszystkim rozwój korzeni bocznych z dobrze uformowaną aerenchymą zawierającą barierę dla dyfuzji tlenu z pędów do korzeni, aby mogło w nich zachodzić oddychanie beztlenowe podczas hipoksji lub anoksji. Główne efekty metaboliczne odporności roślin na stres nadmiaru wody to: zwiększona aktywność enzymów glikolitycznych i fermentacyjnych, zwiększona dostępność cukrów rozpuszczalnych i zaangażowanie mechanizmów obrony antyoksydacyjnej przeciw postresowym uszkodzeniom oksydacyjnym (HOSSAIN i UDDIN 2011). Ponadto, rośliny wytworzyły dwie strategie zachowania podczas działania stresu nadmiaru wody: (i) strategia ucieczki z wody związana z szybszym wydłużaniem pędów np. u ryżu, kukurydzy, Paspalum dilatatum, Rumex palustris oraz (ii) strategia spoczynku związana z zużywaniem węglowodanów zapasowych, np. u niektórych odmian ryżu, jednego zimującego ekotypu Ranunculus repens i Rumex crispus (MANZUR i współaut. 2009). Poza tym stwierdzono, że u Lotus tenuis strategia zachowania mogła zmieniać się w zależności od głębokości zanurzenia w wodzie. Całkowite zanurzenie tych roślin w wodzie powodowało spoczynek, podczas którego następowała jedynie utylizacja cukrów rozpuszczalnych i skrobi w procesie oddychania beztlenowego, podczas gdy w warunkach częściowego zanurzenia rośliny szybko rosły, ale nie zużywały węglowodanów zapasowych (MANZUR i współaut. 2009). Odpowiednia zawartość cukrów, które mogą być szybko metabolizowane poprzez fermentację w warunkach hipoksji lub anoksji w korzeniach jest jednym ze składników mechanizmu adaptacyjnego w odpowiedzi na stres nadmiaru wody i niedoboru tlenu (SAIRAM i współaut. 2009, HOSSAIN i UDDIN 2011). Zawartość cukrów zapasowych w korzeniach i aktywność enzymów hydrolizujących sacharozę są ważnymi determinantami tolerancji stresu nadmiaru wody u roślin uprawnych

86 Metabolizm węglowodanów a tolerancja na stresy abiotyczne u roślin 617 (SAIRAM i współaut. 2009). W hydrolizę sacharozy zaangażowane są enzymy z grupy inwertaz (INV), których aktywność jest hamowana oraz SuSy, której aktywność jest wzmagana w czasie hipoksji. Korzenie roślin genotypów odpornych zawierały więcej cukrów, w tym redukujących i nieredukujących niż korzenie roślin genotypów wrażliwych. Ponadto nadmiar wody indukował wzrost zawartości cukrów redukujących dzięki zwiększonej aktywności SuSy w genotypach odpornych, potwierdzonej jednocześnie wyższą ekspresją mrna dla SuSy (SAIRAM i współaut. 2008, 2009). Z drugiej strony stwierdzono, że degradacja sacharozy wymaga obniżenia zużycia tlenu i pozwala uniknąć anoksji, kiedy stężenie tlenu w tkankach jest bardzo niskie (HORCHANI i współaut. 2011). Skrobia magazynowana w korzeniach Medicago sativa oraz kukurydzy była mobilizowana i hydrolizowana dzięki podwyższonej aktywności -amylazy do cukrów rozpuszczalnych już na wczesnym etapie zalewania, co prowadziło do istotnego zwiększenia zawartości sa- charozy i heksoz, która następnie stopniowo zmniejszała się podczas działania stresu (CA- STONGUAY i współaut. 1993, LIAO i LIN 2001, POURABDAL i współaut. 2008). Odporne na zalewanie genotypy ryżu charakteryzowały się zwiększoną ekspresją genu RAmy3D oraz wysoką aktywnością amylazy, która była odpowiedzialna za rozpad skrobi i wysokie stężenie cukrów rozpuszczalnych podczas kiełkowania nasion i dostarczała niezbędnych substratów do produkcji energii wymaganej do wzrostu i utrzymania metabolizmu (ISMAIL i współaut. 2009). Do akumulacji skrobi oraz cukrów rozpuszczalnych podczas działania stresu nadmiaru wody dochodziło natomiast w liściach różnych gatunków roślin np. Helianthus annuus, Citrus sinensis, Pinus serotina, Momordica charantia i było spowodowane zmniejszeniem tempa fotosyntezy oraz stopnia translokacji węglowodanów z liści do korzeni, zahamowaniem wzrostu i niskim poziomem metabolizmu w korzeniach (LIAO i LIN 2001, IRFAN i współaut. 2010, KANG i współaut. 2010). ROLA FRUKTANÓW I TREHALOZY W ODPORNOŚCI ROŚLIN NA STRES ABIOTYCZNY Fruktany są polimerami fruktozy pochodzącej z rozpadu sacharozy i występują w ok. 15% roślin kwiatowych oraz u wielu bakterii i grzybów (MARTINEZ-FLEITES i współaut. 2005). U roślin dwuliściennych fruktany typu inuliny są akumulowane jako długoterminowe węglowodany zapasowe w organach podziemnych, korzeniach i bulwach (VALLURU i VAN DEN ENDE 2008). U traw, graminan, lewan i fruktany powstające z neokestozy działają jako krótkotrwałe składniki zapasowe w wierzchołkach wzrostu, blaszkach liściowych, wydłużających się podstawach liści, a ponadto są też akumulowane na dłuższy czas, aby przetrwać okres zimowy. Podstawową rolą fruktanów jest zapewnienie dodatkowej energii, regulacja osmozy oraz ochrona roślin przed stresem chłodu i suszy poprzez stabilizację membran (HINCHA i współaut. 2003). Zawartość fruktanów i ich metabolizm są ściśle związane z tolerancją chłodu i suszy (DE ROOVER i współaut. 2000, LIVINGSTON i współaut. 2009). Mechanizmy molekularne działania fruktanów w czasie ochrony przeciw stresom abiotycznym nie są jeszcze poznane. Fruktany jako jedyna klasa polisacharydów jest zdolna do interakcji z fosfolipidami w błonie komórkowej w podobny sposób jak disacharydy i RFO. Podczas działania stresów chłodu i suszy fruktany silnie oddziaływują na błony komórkowe poprzez bezpośrednie wiązanie wodoru do grup fosforowych i cholinowych lipidów, co ogranicza odpływ wody z membran (HINCHA i współaut. 2000, 2003). Ponadto te węglowodany, szczególnie typu inuliny, zagłębiają się w dwuwarstwy lipidowe zmieniając konformację i także w ten sposób ochraniają je przed zmianą fazy (VEREYKEN i współaut. 2001). Przejście fazowe lipidów jest odpowiedzialne za większość uszkodzeń spowodowanych zwiększeniem przepuszczalności błon. Fruktany mogą zagłębiać się bardziej w membrany (bardziej niż sacharoza) powodując ich stabilizację oraz mogą reagować z wolnymi rodnikami i reaktywnymi formami tlenu (ROS), dlatego też stwierdzono, że pełnią również rolę w obronie przed stresem oksydacyjnym (VALLURU i VAN DEN ENDE 2008). Sugeruje się, że fruktany bezpośrednio wymiatają ROS lub działają pośrednio poprzez stymulację innych specyficznych antyoksydacyjnych mechanizmów obrony np. reakcji utleniania zredukowanego glutationu (GSH) do disulfidu glutationu (GSSG), kwasu askorbinowego do dehydroaskorbinowego lub usuwania jonów ponadtlenkowych

87 618 SYLWIA ZIELIŃSKA przez dysmutazę ponadtlenkową (VAN DEN ENDE i VALLURU 2009). Trehaloza, nieredukujący disacharyd glukozy, składający się z dwóch reszt glukozowych połączonych w pozycji (1,1) i trehalozo- -6-fosforan (T6P), które są zaangażowane w odpowiedź na stres u wielu organizmów, zostały uznane za nowe regulatory metabolizmu węgla i rozwoju roślin (RAMON i współaut. 2008). Ten rodzaj węglowodanów jest syntetyzowany z UDP-glukozy i glukozo-6-fosforanu poprzez prekursor trehalozo-6-fosforan i występuje u wielu organizmów: bakterii, grzybów, bezkręgowców i roślin, a także bardzo często jest akumulowany u organizmów odpornych na stres. U bakterii, grzybów, drożdży i glonów funkcjonuje pięć różnych szlaków biosyntezy trehalozy. U roślin wyższych trehaloza jest syntetyzowana tylko w jeden sposób: przez syntazę fosforanu trehalozy (TPS) i fosfatazę fosforanu trehalozy (TPP). Biosynteza i degradacja trehalozy wraz z kompletnym opisem ekspresji genów za nie odpowiedzialnych została poznana przede wszystkim dzięki roślinie modelowej A. thaliana, a także ryżu, soi, tytoniu, ziemniaka, pomidora i kukurydzy (PAUL i współaut. 2008, SCHLU- EPMANN i PAUL 2009, JIANG i współaut. 2010, PONNU i współaut. 2011). Rola trehalozy w tolerancji stresu abiotycznego została po raz pierwszy zademonstrowana przy rehydratacji roślin Myrothamnus flabellifolius, Selaginella tamarascina i Selaginella lepidophylla. Te rośliny są odporne na desykację i mogą wytrzymywać całkowitą dehydratację, a po ponownej rehydratacji odzyskują całkowicie żywotność. Zawartość trehalozy w ich tkankach sięgała od 3 do 12 mg g -1 świeżej masy i działała ochronnie na białka i membrany. Oprócz stresu suszy akumulacja trehalozy miała miejsce również podczas działania stresu niskiej i wysokiej temperatury oraz zasolenia. Ponadto analiza mikromacierzy wykazała, że najwięcej genów związanych z metabolizmem trehalozy u A. thaliana reagowało na stresy abiotyczne takie jak chłód, zasolenie i promieniowanie UV (IORDACHESCU i IMAI 2008). Obecnie różne grupy badaczy próbują stworzyć rośliny odporne na stres poprzez wprowadzanie genów biosyntezy trehalozy do roślin uprawnych. Tolerancja suszy jest jedną z pierwszych otrzymanych dzięki konstytutywnej nadekspresji genu syntazy trehalozy z drożdży (ScTPS1) w tytoniu i genu AtTPS1 w A. thaliana. Otrzymane linie transgeniczne akumulowały więcej trehalozy, a A. thaliana wykazywał też wyższą zawartość trehalozo-6-fosforanu. Transgenicz- ne pomidory z nadekspresją genu ScTPS1 były również bardziej odporne na zasolenie, suszę i stres oksydacyjny. Ryż z nadekspresją genów syntazy trehalozy z Escherichia coli (OtsA i OtsB) był odporny na stres zasolenia i stres niskiej temperatury. Ponadto te rośliny charakteryzowały się zwiększoną od 3- do 10-krotnie zawartością trehalozy w porównaniu do roślin kontrolnych nietransgenicznych, wyższą aktywnością fotosyntetyczną i ogólną zawartością węglowodanów (FERNANDEZ i współaut. 2010). Akumulacja trehalozy może redukować przekazywanie sygnałów wywołanych przez ROS i tym samym może wpływać na późniejszą odpowiedź obronną rośliny. Rola trehalozy w przekazywaniu sygnałów pozostaje kontrowersyjna z powodu przeciwstawnych ról trehalozy i trehalozo-6-fosforanu. Trehaloza współdziałała z lipidami i białkami, które są częścią kaskady przekazywania sygnałów. Z drugiej strony, trehalozo-6-fosforan hamował heksokinazę (sensor glukozy) u drożdży (PAUL i współaut. 2008). Ostatnie badania wykazały, że T6P wywierał hamujący wpływ na kinazę SnRK1, kluczowy regulator transkrypcji u Arabidopsis, w transgenicznych komórkach zawiesinowych trzciny cukrowej, w ekstraktach z ziaren pszenicy, bulwach ziemniaka (PONNU i współaut. 2011). Hamowanie kinazy SnRK1 przez T6P powodowało następnie aktywację czynnika transkrypcyjnego bzip11, który wpływa na ekspresję genów związanych z metabolizmem węglowodanów i jest częścią mechanizmu regulującego wzrost roślin. Wykazano także, że T6P reguluje metabolizm skrobi w roślinach. U Arabidopsis egzogennie podana trehaloza indukowała akumulację skrobi poprzez podwyższenie aktywności pirofosforylazy ADP-glukozy (AGP-azy), głównego enzymu kontrolującego biosyntezę skrobi. Podobnie T6P ułatwiał aktywację AGP-azy w chloroplastach za pomocą reakcji redoks z tioredoksyną (Trx) jako pośrednikiem (PON- NU i współaut. 2011). Akumulacja sacharozy w liściach powodowała również zwiększenie zawartości T6P w cytozolu, co prowadziło do aktywacji AGP-azy w chloroplastach bez widocznej zmiany tempa fotosyntezy. W ten sposób trehalozo-6-fosforan może działać jako sygnał pomiędzy cytozolem a chloroplastem, ale mechanizm transportu T6P do chloroplastu jest nieznany (PONNU i współaut. 2011) (Ryc. 1). Podsumowując funkcje T6P można stwierdzić, że jest on nową cząsteczką sygnalną i kluczowym regulatorem centralnego metabolizmu węgla i wzrostu roślin w odpowiedzi na bodźce środowiskowe.

88 Metabolizm węglowodanów a tolerancja na stresy abiotyczne u roślin 619 ODBIÓR, PRZEKAZYWANIE SYGNAŁÓW I REGULACJA GENÓW JAKO EFEKT DZIAŁANIA WĘGLOWODANÓW PODCZAS STRESU ABIOTYCZNEGO Cukry rozpuszczalne są bardzo szybko przekształcane podczas wzrostu i rozwoju roślin. Sacharoza rozkładana jest na glukozę i fruktozę, a nadmiar tych heksoz jest ponownie wykorzystywany do syntezy sacharozy. Ta interkonwersja jest bardzo narażona na stresy zewnętrzne. Cukry, podobnie jak hormony, mogą działać jako pierwotne przekaźniki i regulować sygnały, które kontrolują ekspresję różnych genów biorących udział w metabolizmie i wzroście roślin. Ponadto węglowodany bezpośrednio regulują wzrost i metabolizm poprzez modulację ekspresji genów i aktywności enzymów w tkankach donorowych i akceptorowych (ROSA i współaut. 2009). Stwierdzono, że poziom węglowodanów w roślinach jest odpowiedzialny nie tylko za ekspresję genów, ale również za represję. Regulacja genów przez cukry może odbywać się na poziomie transkrypcyjnym, potranskrypcyjnym oraz translacyjnym. Akumulacja cukrów rozpuszczalnych w tkankach donorowych obniża intensywność fotosyntezy i wywołuje represję genów kodujących białka uczestniczące w procesie fotosyntezy, natomiast niesprzyjające warunki środowiska powodują zróżnicowaną ekspresję poszczególnych białek związanych z metabolizmem węglowodanów np. enzymów związanych z biosyntezą skrobi (AGP-aza) oraz z biosyntezą sacharozy (SuSy, SPS i INV). Geny, których produkty są wykorzystywane w innych szlakach metabolicznych i te posiadające funkcje komórkowe, także są pozytywnie regulowane przez cukry rozpuszczalne np. geny kodujące białka zapasowe takie jak: patatyna, sporamina oraz geny kodujące białka obronne np. inhibitor II proteinazy. Wiele genów może też ulegać represji przez cukry np. geny kodujące: -amylazę, endopeptydazę, SuSy, syntazę asparaginy, syntazę jabłczanu, liazę izocytrynianu (ROSA i współaut. 2009). Jednak mechanizmy związane z odbiorem, przekazywaniem sygnałów cukrowych i regulacją genów przez cukry w roślinach wyższych nie zostały do końca wyjaśnione. Wiele badań dotyczących mechanizmów aktywacji i represji wykazało ich regulację przez cukry na poziomie transkrypcyjnym. Ta regulacja odgrywa szczególną rolę podczas odpowiedzi roślin na stresy środowiskowe (PRICE i współaut. 2004). W badaniach mających na celu określenie szlaków percepcji i przekazywania sygnału cukrowego wykorzystano wie- le mutantów A. thaliana ze zmniejszoną (np. mutant rsr, ang. reduced sugar response) lub zwiększoną wrażliwością na cukier (np. gss, ang. glucose super sensitive; hss, ang. high sugar response) lub nie reagujących na stężenie cukru (np. gin, ang. glucose insensitive; sis, ang. sucrose insensitive). Sygnały cukrowe są odbierane przez receptory zewnątrz- i wewnątrzkomórkowe oraz przekazywane dalej wewnątrz komórki przy pomocy kaskad specyficznych kinaz i fosfataz białkowych. W momencie, gdy dotrą do jądra komórkowego wywołują aktywację czynników transkrypcyjnych oraz ekspresję bądź represję genów (Ryc. 1). Odbiór i przekazywanie sygnałów cukrowych prawdopodobnie następuje przy udziale inwertaz zlokalizowanych w ścianie komórkowej, transporterów cukrowych w plazmolemmie (białko SUT2) oraz enzymu heksokinazy (HXK1, EC ) bądź niezależnie od heksokinazy lub przy udziale innych sensorów np. glukokinazy czy fruktokinazy. Za kluczowy i konserwatywny sensor glukozy uznano heksokinazę (HXK1) (Ryc. 1). Heksokinaza jest wielofunkcyjnym białkiem, które jest jednocześnie enzymem katalizującym pierwszy etap glikolizy oraz receptorem glukozy. Oprócz heksokinazy za sensor glukozy uważa się receptor sprzężony z białkiem G (HANSON i SMEEKENS 2009) (Ryc. 1). Mechanizmy odbioru i przekazywania sygnałów cukrowych szczegółowo opisano w pracach przeglądowych GUPTA i KAUR (2005), ROLLAND i współaut. (2006), CIERESZ- KO (2007), RAMON i współaut. (2008), TUTEJA i SOPORY (2008), HANSON i SMEEKENS (2009). Wszystkie badania wykonano przy użyciu A. thaliana jako głównego roślinnego systemu modelowego. Za pośrednictwem heksokinazy jest regulowana ekspresja genów kodujących białka metabolizmu fotosyntezy, które ulegają represji pod wpływem nadmiaru glukozy, a także ekspresja genu SuSy (Sus1), która była z kolei stymulowana. Bez pośrednictwa heksokinazy jest stymulowana ekspresja genu kodującego pirofosforylazę ADP-glukozy (CIERESZKO 2007). W przekazywanie sygnałów cukrowych zaangażowane są również kaskady specyficznych kinaz białkowych: SnRK (kinazy serynowo-treoninowe), CDPK (kinazy serynowo-treoninowe zależne od jonów Ca 2+ ), MAP (kinazy aktywujące mitogen) i wiele innych, a także fosfatazy białkowe (serynowo-treoninowe i tyrozynowe),

89 620 SYLWIA ZIELIŃSKA fitohormony, np. kwas abscysynowy, etylen, oraz jony wapnia. Kinazy białkowe KIN10 i KIN11 (Ryc. 1) są centralnym punktem, który łączy szlaki sygnalne stresu, cukrów i rozwoju w regulacji metabolizmu, równowagi energetycznej, wzrostu i przeżywalności podczas stresów abiotycznych (BAENA-GONZALEZ i współaut. 2007). Te kinazy są katalitycznymi podjednostkami kompleksu heterotrimerycznej kinazy SnRK1 i są głównymi regulatorami transkrypcji oraz aktywują katabolizm i hamują anabolizm podczas braku energii zwią- zanego z warunkami stresu (BAENA-GONZALEZ i SHEEN 2008). Fosforany cukrów, a szczególnie glukozo-6-fosforan i trehalozo-6-fosforan, powodują inhibicję aktywności kinaz SnRK1, w tym KIN10 i 11. Białka KIN10/11 regulują ekspresję genów dzięki aktywności specyficznych czynników transkrypcyjnych z grupy bzip klasy S1 lub czynników przyłączających białko G (GBF) (BAENA-GONZALEZ i współaut. 2007, HANSON i SMEEKENS 2009). Poza regulacją transkrypcji kinazy SnRK1 modulują enzymy ważne dla metabolizmu węgla i azotu Ryc. 1. Schemat mechanizmów działania cukrów w roślinach podczas stresów abiotycznych (wg ROLLAND i współaut. 2006, RAMON i współaut. 2008, HANSON i SMEEKENS 2009): a) odbiór sygnału glukozowego przez receptor sprzężony z białkiem G (RGS1/GPA1); b) odbiór sygnału sacharozowego i transport sacharozy przez błony dzięki białku SUT2; c), d) działanie heksokinazy (HXK1) jako sensora glukozy w połączeniu z organellami chloroplastem i mitochondrium; e) działanie heksokinazy (HXK1) jako sensora glukozy w cytozolu oraz f) w jądrze komórkowym; g) bezpośrednie działanie kinazy KIN10/11 (SnRK1) w warunkach stresów abiotycznych poprzez inaktywację enzymów oraz hamowanie KIN10/11 przez cukry, głównie T6P, który aktywuje również AGP-azę w chloroplastach. Glc: glukoza, Suc: sacharoza, Fru: fruktoza, Tre: trehaloza, T6P: trehalozo-6-fosforan, G6P: glukozo-6-fosforan, SuSy: syntaza sacharozowa, INV: inwertaza, TPS: syntaza fosforanu trehalozy, TPP: fosfataza fosforanu trehalozy, NR: reduktaza azotanowa, SPS: syntaza fosfosacharozowa, HMG-CoAR: reduktaza 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A.

90 Metabolizm węglowodanów a tolerancja na stresy abiotyczne u roślin 621 poprzez bezpośrednią fosforylację np. inaktywują reduktazę azotanową (NR) i SPS (RA- MON i współaut. 2008), reduktazę 3-hydroksy- -3-metyloglutarylo-koenzymu A (HMG-CoAR), syntazę 5 trehalozo-6-fosforanu (TPS5), AGP- -azę (BAENA-GONZALEZ i SHEEN 2008) (Ryc. 1). Mimo, że w ostatnich latach opisano niektó- re mechanizmy działania cukrów, jednak potrzebne są dodatkowe badania, aby otrzymać pełny obraz oddziaływania cukrów w roślinach i poszerzyć wiedzę o mechanizmach tolerancji i adaptacji w czasie stresu abiotycznego. PODSUMOWANIE Cukry odgrywają dwojaką rolę w roślinach: po pierwsze są one zaangażowane w różne szlaki metaboliczne, a po drugie działają jako cząsteczki sygnalne regulujące ekspresję różnych genów, zwłaszcza tych, biorących udział w fotosyntezie, metabolizmie sacharozy i syntezie osmoprotektantów. Węglowodany rozpuszczalne integrują procesy regulujące i kontrolujące funkcje komórki roślinnej. Disacharydy np. trehaloza oraz oligosacharydy rodziny rafinozy, a także poliole i cyklitole działają jako protektanty przed stresami abiotycznymi. Metabolizm trehalozy został uznany za nowy, ważny regulator wzrostu roślin, metabolizmu i odporności na stres. Obecnie kładzie się nacisk na wydajną produkcję roślin transgenicznych z wysoką tolerancją różnych stresów abiotycznych dzięki nadekspresji genów odpowiedzialnych za biosyntezę powyższych cukrów. METABOLIZM WĘGLOWODANÓW JAKO JEDEN ZE SKŁADNIKÓW MECHANIZMÓW TOLERANCJI NA STRESY ABIOTYCZNE U ROŚLIN Streszczenie Zmiany w zawartości węglowodanów w tkankach roślinnych są często zaangażowane w odpowiedzi roślin na wiele stresów abiotycznych takich jak chłód, susza, zasolenie czy zalewanie. Stresy środowiskowe są głównymi przyczynami zmian w metabolizmie węglowodanów. Szlaki sygnalne wywołane przez cukry współdziałają ze szlakami odpowiedzi na stres i modyfikują metabolizm. W pracy opisano zmiany w zawartości cukrów i ich rolę podczas wzrostu i rozwoju roślin w warunkach stresów abiotycznych. Ponadto przedstawiono najnowsze dane na temat sposobu, w jaki rośliny odbierają i odpowiadają na czynniki środowiskowe poprzez mechanizmy odbioru sygnałów cukrowych. Dyskutowano także o złożoności ścieżek sygnalnych i znaczeniu poszczególnych cukrów rozpuszczalnych dla odporności roślin na stresy abiotyczne. CARBOHYDRATE METABOLISM AS A COMPOUND OF TOLERANCE MECHANISMS AGAINST ABIOTIC STRESSES IN PLANTS Summary Changes of carbohydrate concentration in plant tissues have been frequently shown to be involved in plant responses to many abiotic stresses like cold, drought, salinity and waterlogging. Environmental stresses lead to major alterations in carbohydrate metabolism. The sugar signaling pathways interact with stress pathways to modulate metabolism. This review describes the changes in sugar content and their role during plant growth and development under abiotic stresses. Moreover, recent evidences on the way how plants sense and respond to environmental factors through sugar-sensing mechanisms are presented. The complexity of signaling pathways and importance of several soluble sugars for resistance to abiotic stresses in plants are discussed. LITERATURA AHN C., PARK U., PARK P. B., Increased salt and drought tolerance by D-ononitol production in Arabidopsis thaliana. Biochem. Biophys. Res. Commun. 415, AL HAKIMI A., MONNEVEUX P., GALIBA G., Soluble sugars, proline and relative water content (RWC) as traits for improving drought tolerance and divergent selection for RWC from T. polonicum into T. durum. J. Genet. Breed. 49, BACHMANN M., MATILE P., KELLER F., Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptans L. Cold acclimation, translocation and sink to source transition: dis-

91 622 SYLWIA ZIELIŃSKA covery of the chain elongation enzyme. Plant Physiol. 105, BAENA-GONZALEZ E., ROLLAND F., THEVELEIN J. M., SHEEN J., A central integrator of transcription network in plant stress and energy signaling. Nature 448, BAENA-GONZALEZ E., SHEEN J., Convergent energy and stress signaling. Trends Plant Sci. 13, BALIBREA M. E., DELL AMICO J., BOLARIN M. C., PEREZ- -ALFOCEA F., Carbon partitioning and sucrose metabolism in tomato plants growing under salinity. Physiol. Plant. 110, BOWERS M. C., Environmental effects of cold in plants. [W:] Plant-environment interactions. Wilkinson R.E. (red.). Marcel Dekker, New York, CASTONGUAY Y., NADEAU P., SIMARD R. R., Effects of flooding on carbohydrate and ABA levels in roots and shoots of alfalfa. Plant Cell Environ. 16, CHATTERTON N. J., HARISSON P. A., THORNLEY W. R., BENNETT J. H., Sucrosyl-oligosaccharides and cool temperature growth in 14 forb species. Plant Physiol. Biochem. 28, CIERESZKO I., Kontrola metabolizmu sacharozy u roślin w odpowiedzi na zmienne warunki środowiska. Kosmos 55, CIERESZKO I., Odbiór i przekazywanie sygnału wywołanego zmianami poziomu cukrów w komórkach roślin. Post. Biol. Kom. 34, DE ROOVER L., VANDENBRANDEN K., VAN LAERE A., VAN DEN ENDE W., Drought induces fructan synthesis and 1-SST (sucrose:sucrose fructosyltransferase) in roots and leaves of Cichorium seedlings (Cichorium intybus L.). Planta 210, FERNANDEZ O., BETHENCOURT L., QUERO A., SANGWAN R. S., CLEMENT C., Trehalose and plant stress responses: friend or foe? Trends Plant Sci. 15, GRIFFIN J. J., RANNEY T. G., PHARR D. M., Heat and drought influence photosynthesis, water relations, and soluble carbohydrates of two ecotypes of redbud (Cercis canadensis). J. Amer. Soc. Hort. Sci. 129, GUPTA A. K., KAUR N., Sugar signalling and gene expression in relation to carbohydrate metabolism under abiotic stresses in plants. J. Biosci. 30, GUY C. L., HUBER J. L. A., HUBER S. C., Sucrose phosphate synthase and sucrose accumulation at low temperature. Plant Physiol. 100, HANSON J., SMEEKENS S., Sugar perception and signaling an update. Curr. Opin. Plant Biol. 12, HINCHA D. K., HELLWEGE E. M., HEYER A. G., CROWE J. H., Plant fructans stabilize phosphatidylcholine liposomes during freeze-drying. Eur. J. Biochem. 267, HINCHA D. K., ZUTHER E., HEYER A. G., The preservation of liposomes by raffinose family oligosaccharides during drying is mediated by effects on fusion and lipid phase transitions. Biochim. Biophys. Acta 1612, HO S.-L., CHAO Y.-C., TONG W.-F., YU S.-M., Sugar coordinately and differentially regulates growth- and stres-regualted gene expression via a complex signal transduction network nad multiple control mechanisms. Plant Physiol. 125, HOEKSTRA F. A., BUITINK J., Mechanisms of plant desiccation tolerance. Trends Plant Sci. 8, HORCHANI F., R BIA O., ASCHI-SMITI S., Oxygen sensing and plant acclimation to soil flooding. Int. J. Agric. Res. 6, HOSSAIN M. A., UDDIN S. N., Mechanisms of waterlogging tolerance in wheat: morphological and metabolic adaptations under hypoxia or anoxia. Aust. J. Crop Sci. 5, IMANISHI H. T., SUZUKI T., MARUDA K., HARADA T., Accumulation of raffinose and stachyose in shoot apices of Lonicera caerulea L. during cold acclimation. Sci. Hortic. 72, IORDACHESCU M., IMAI R., Trehalose biosynthesis in response to abiotic stresses. J. Integr. Plant Biol. 50, IRFAN M., HAYAT S., HAYAT Q., AFROZ S., AHMAD A., Physiological and biochemical changes in plants under waterlogging. Protoplasma 241, ISMAIL A. M., ELLA E. S., VERGARA G. V., MACKILL D. J., Mechanisms associated with tolerance to flooding during germination and early seedling growth in rice (Oryza sativa). Ann. Bot. 103, JIANG W., FU F.-L., ZHANG S.-Z., WU L., LI W.-C., Cloning and characterization of functional trehalose-6-phosphate synthase gene in maize. J. Plant Biol. 53, KANG S.-Y., LEE K. J., LEE G.-J., KIM J.-B., CHUNG S.-J., SONG J. Y., LEE B.-M., KIM D. S., Development of AFLP and STS markers linked to a waterlogging tolerance in Korean soybean landraces. Biol. Plant. 54, KAUR P., GHAI N., SANGHA M. K., Induction of thermotolerance through heat acclimation and salicylic acid in Brassica species. Afr. J. Biotechnol. 8, LIAO C.-T., LIN C.-H., Physiological adaptation of crop plants to flooding stress. Proc. Natl. Sci. Counc. 25, LIVINGSTON D. P. III, HINCHA D. K., HEYER A. G., Fructan and its relationship to abiotic stress tolerance in plants. Cell. Mol. Life Sci. 66, MA Y., ZHANG Y., LU J., SHAO H., Roles of plant soluble sugars and their responses to plant cold stress. Afr. J. Biotechnol. 8, MANZUR M. E., GRIMDDI A. A., INSAUSTI P., STRIKER G. G., Escape from water or remain quiescent? Lotus tenuis changes its strategy depending on depth of submergence. Ann. Bot. 104, MARTINEZ-FLEITES C., ORTIZ-LOMBARDIA M., PONS T., TARBOURIECH N., TAYLOR E. J., ARRIETA J. G., HER- NANDEZ L., DAVIES G. J., Crystal structure of levan-sucrase from the Gram-negative bacterium Gluconacetobacter diazotrophicus. Biochem. J. 390, MOHAMMADKHANI N., HEIDARI R., Drought-induced accumulation of soluble sugars and proline in two maize varieties. World App. Sci. J. 3, MORSY M. R., JOUVE L., HAUSMAN J.-F., HOFFMANN L., MCD STEWART J., Alteration of oxidative and carbohydrate metabolism under abiotic stress in two rice (Oryza sativa L.) genotypes contrasting in chilling tolerance. J. Plant Physiol. 164, NEMATI I., MORADI F., GHOLIZADEH S., ESMAEILI M. A., BIHAMTA M. R., The effect of salinity stress on ions and soluble sugars distribution in leaves, leaf sheets and roots of rice (Oryza sativa L.) seedlings. Plant Soil Environ. 57, PALONEN P., BUSZARD D., DONNELLY D., Changes in carbohydrates and freezing tolerance during cold acclimation of raspberry cultivars grown

92 Metabolizm węglowodanów a tolerancja na stresy abiotyczne u roślin 623 in vitro and in vivo. Physiol. Plant. 110, PANIKULANGARA T. J., EGGERS-SCHUMACHER G., WUN- DERLICH M., STRANSKY H., SCHÖFFL F., Galactinol synthase 1. A novel heat shock factor target gene responsible for heat-induced synthesis of raffinose family oligosaccharides in Arabidopsis. Plant Physiol. 136, PARTELLI F. L., VIEIRA H. D., RODRIGUES A. P. D., PAIS J., CAMPOSTRINI E., CHAVES M. M. C.C., RAMALHO J. C., Cold induced changes on sugar contents and respiratory enzyme activities in coffee genotypes. Ciência Rural 40, PARVAIZ A., SATYAWATI S., Salt stress and phyto-biochemical responses of plants a review. Plant Soil Environ. 54, PATRA B., RAY S., RICHTER A., MAJUMDER A. L., Enhanced salt tolerance of transgenic tobacco plants by co-expression of PcINO1 and McIMT1 is accompanied by increased level of myo-inositol and methylated inositol. Protoplasma 245, PATTANAGUL W., MADORE M. A., Water deficit effects on raffinose family oligosaccharide metabolism in coleus. Plant Physiol. 121, PATTANAGUL W., THITISAKSAKUL M., Effect of salinity stress on growth and carbohydrate metabolism in three rice (Oryza sativa L.) cultivars differing in salinity tolerance. Indian J. Exp. Biol. 46, PAUL M. J., PRIMAVESI L. F., JHURREEA D., ZHANG Y., Trehalose metabolism and signaling. Annu. Rev. Plant Biol. 59, PONNU J., WAHL V., SCHMID M., Trehalose- 6-phosphate: connecting plant metabolism and development. Front. Plant Sci. 2, 70. doi: /fpls POURABDAL L., HEIDARY R., FARBOODNIA T., Effects of three different flooding periods on some anatomical, morphological and biochemical changings in maize (Zea mays L.) seedlings. Asian J. Plant Sci. 7, PRICE J., LAXMI A., MARTIN S. K. S., JANG J. C., Global transcription profiling reveals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. Plant Cell 16, RAMON M., ROLLAND F., SHEEN J., Sugar sensing and signaling. The Arabidopsis Book, Number 6, tab REJŠKOVÁ A., PATKOVÁ L., STODŮLKOVÁ E., LIPAVSKÁ H., The effect of abiotic stresses on carbohydrate status of olive shoots (Olea europaea L.) under in vitro conditions. J. Plant Physiol. 164, ROLLAND F., BAENA-GONZALEZ E., SHEEN J., Sugar sensing and signaling in plants: conserved and novel mechanisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57, ROSA M., PRADO C., PODAZZA G., INTERDONATO R., GONZALEZ J. A., HILAL M., PRADO F. E., Soluble sugars metabolism, sensing and abiotic stress. A complex network in the life of plants. Plant Signal. Behav. 4(5), SAIRAM R. K., KUMUTHA D., CHINNUSAMY V., MEENA R. C., Waterlogging-induced increase in sug- ar mobilization, fermentation, and related gene expression in the roots of mung been (Vigna radiata). J. Plant Physiol. 166, SAIRAM R. K., KUMUTHA D., EZHILMATHI K., DESHMUKH P. S., SRIVASTAVA G. C., Physiology and biochemistry of waterlogging tolerance in plants. Biol. Plant. 52, SCHLUEPMANN H., PAUL M., Trehalose metabolites in Arabidopsis elusive, active and central. The Arabidopsis Book, Number 7, SEKI M., NARUSAKA M., ISHIDA J., NANJO T., FUJITA M., OONO Y., KAMIYA A., NAKAJIMA M., ENJU A., SAKU- RAI T., SATOU M., AKIYAMA K., TAJI T., YAMAGUCHI- SHINOZAKI K., CARNINCI P., KAWAI J., HAYASHIZAKI Y., SHINOZAKI K., Monitoring the expression profiles of 7000 Arabidopsis genes under drought, cold and high-salinity stresses using a full-length cdna microarray. Plant J. 31, SENGUPTA S., PATRA B., RAY S., MAJUMDER A. L., Inositol methyl transferase from a halophytic wild rice, Porteresia coarctata Roxb. (Tateoka): regulation of pinitol synthesis under abiotic stress. Plant Cell Environ. 31, SHAO H. B., CHU L. Y., LU Z. H., KANG C. M., Primary antioxidant free radical scavengeging and redox signalling pathways in higher plant cells. Int. J. Biol. Sci. 4, SHEN B., JENSEN R. G., BOHNERT H. J., Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants by targeting mannitol biosynthesis to chloroplasts. Plant Physiol. 113, SIRINGAM K., JUNTAWONG N., CHA-UM S., KIRDMANEE C., Salt stress induced ion accumulation, ion homeostasis, membrane injury and sugar contents in salt-sensitive rice (Oryza sativa L. spp. indica) roots under iso-osmotic conditions. Afr. J. Biotechnol. 10, THOMAS H., Drought resistance in plants. [W:] Mechanisms of environmental stress resistance in plants. Basra A. S., Basra R. K. (red.). Harwood Academic Publ., Netherlands, THOMASHOW M. F., Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, TUTEJA N., SOPORY S. K., Chemical signaling under abiotic stress environment in plants. Plant Signal. Behav. 3(8), VALLURU R., VAN DEN ENDE W., Plant fructans in stress environments: emerging concepts and future prospects. J. Exp. Bot. 59, VAN DEN ENDE W., VALLURU R., Sucrose, sucrosyl oligosaccharides, and oxidative stress: scavenging and salvaging? J. Exp. Bot. 60, VEREYKEN I. J., CHUPIN V., DEMEL R. A., SMEEKENS S. C., DE KRUIJFF B., Fructans insert between the headgroups of phospholipids. Biochim. Biophys. Acta. 1510, VERNON D. M., BOHNERT H. J., A novel methyl transferase induced by osmotic stress in the facultative halophyte Mesembryanthemum crystallinum. EMBO J. 11,

93

94 Tom Numer 4 (297) Strony KAROL STAWSKI, ANNA GOC Zakład Genetyki Wydział Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytet Mikołaja Kopernika Lwowska 1, Toruń stawski@umk.pl goc@umk.pl ROŚLINNE CZYNNIKI SZOKU CIEPLNEGO WPROWADZENIE Odpowiedź na szok cieplny (ang. heat shock response, HSR) jest wysoce konserwowanym mechanizmem w całym świecie ożywionym, która umożliwia przeżycie organizmom w niekorzystnych warunkach środowiska. Indukcja genów w szoku jest zależna od obecności w ich promotorach regulatorowej sekwencji DNA określanej jako element Hse (ang. heat shock element), który jest ciągiem co najmniej trzech powtórzeń sekwencji 5 ngaan3, występujących w przeciwnych orientacjach (PELHAM 1982, JEDLICKA i współaut. 1997). Pierwszych dowodów na to, że są to miejsca przyłączania czynników transkrypcyjnych szoku cieplnego Hsf (ang. heat shock factor) dostarczyły badania prowadzone na izolatach jąder komórkowych Drosophila melanogaster (PARKER i TOPOL 1984). U Drosophila, Saccharomyces i Caenorhab- ditits elegans za utrzymanie homeostazy komórkowej odpowiadają pojedyncze Hsf (FU- JIMOTO i NAKAI 2010). U muszki owocowej Hsf jest również niezbędny do prawidłowego rozwoju embrionalnego (JEDLICKA i współaut. 1997). Dla ssaków opisano cztery czynniki Hsf, z których tylko Hsf1 odgrywa kluczową rolę w kształtowaniu HSR (FUJIMOTO i NAKAI 2010), ale najbardziej liczna grupa Hsf występuje w świecie roślin. Do najlepiej scharakteryzowanych należą czynniki Hsf rzodkiewnika (Arabidopsis thaliana), pomidora (Lycopersicon esculentum) oraz ryżu (Oryza sativa), reprezentowane odpowiednio przez 21, 25 i 18 białek (MORIMOTO 1998, NOVER i współaut. 2001, BANIWAL i współaut. 2004). Budowa poszczególnych białek Hsf decyduje o ich funkcji. BUDOWA HSF Wszystkie Hsf posiadają zachowawczą strukturę modułową (Ryc. 1). Blisko końca aminowego znajduje się domena DBD (ang. DNA binding domain) z motywem helisa- -skręt-helisa, który zapewnia precyzyjne pozycjonowanie DBD względem rozpoznawanej palindromowej sekwencji Hse (SCHULTHEISS i współaut. 1996, CICERO i współaut. 2001). Do niej przylega region oligomeryzacji odpowiadający za oddziaływania z innymi cząsteczkami Hsf. Składa się on dwóch części HR-A i HR-B, w których występują motywy składające sie z siedmiu reszt aminokwasowych, z pierwszą i czwartą resztą o charakterze hydrofobowym. Mogą one tworzyć połączenia zarówno wewnątrz-, jak i międzycząsteczkowe. Konwersja nieaktywnych monomerów Hsf do funkcjonalnych czynników transkrypcyjnych wymaga ich trimeryzacji (PETERANDERL i współaut. 1999). W centralnej części białka Hsf znajduje się sekwencja sygnałowa NLS (ang. nuclear localization si-

95 626 KAROL STAWSKI, ANNA GOC Ryc. 1. Budowa HsfA2 Arabidopsis thaliana (wg KOSKULL-DÖRING i współaut. 2007). gnal) kierująca Hsf do jądra komórkowego, zaś koniec karboksylowy cząsteczki zajmuje domena aktywacyjna CTAD (ang. C-terminal activation domain) (NOVER i współaut. 2001, KOSKULL-DÖRING i współaut. 2007). Roślinne Hsf są najbardziej zróżnicowane pod względem budowy rejonu HR-A/B, co stało się podstawą ich podziału na 3 klasy: A, B i C. W klasie A i C obszary HR-A i HR-B są na skutek insercji bardziej od siebie oddalone (odpowiednio 27 i 13 reszt aminokwasowych) niż w klasie B (6 reszt aminokwasowych), która zawiera Hsf podobne do zwierzęcych (NOVER i współaut. 2001). U modelowej rośliny jaką jest rzodkiewnik, klasyfikacja Hsf obejmuje 14 różnych grup (A1-9, B1-4, C1). Liczba poszczególnych członków w grupie zmienia się pomiędzy gatunkami. U ryżu w grupie A1 zidentyfikowano tylko pojedynczy gen, podczas gdy dla rzodkiewnika są to odpowiednio: A1a, A1b, A1d, A1e, a dla pomidora A1a, A1b, A1c. Z kolei grupa A2 jest reprezentowana przez je- den gen w genomie Arabidopsis thaliana i pięć genów w Oryza sativa (A2a-e) (NOVER i współaut. 2001; KOSKULL-DÖRING i współaut. 2007). Klasa A posiada kwaśną domenę CTAD z charakterystycznym, krótkim motywem motywem AHA, uczestniczącym w aktywacji transkrypcji (DÖRING i współaut. 2000; KOTAK i współaut. 2004). Z kolei funkcja klas B i C jest trudna do przewidywania. Jądrowa dystrybucja roślinnych Hsf nie jest stała i może ulec zmianie dzięki sekwencji NES (ang. nuclear export signal) kierującej eksportem z jądra komórkowego do cytoplazmy, a zlokalizowanej na końcu karboksylowym ponad połowy roślinnych Hsf (NOVER i współaut. 2001). Lokalizacja Hsf wynika z równowagi pomiędzy jądrowym importem i eksportem. Przykładowo, mutacja wewnątrz sekwencji sygnałowej NES HsfA2 L. esculentum zakłóca dystrybucję białka tak, że przyjmuje ono wyłącznie lokalizację jądrową (HE- ERKLOTZ i współaut. 2001). FUNKCJONALNE INTERAKCJE POMIĘDZY HSF Wielopoziomowy proces aktywacji Hsf wymaga, jak już wspomniano, trimeryzacji monomerycznych białek. Duża różnorodność roślinnych Hsf, jak i wysokie podobieństwo pomiędzy rejonami oligomeryzacji, sprzyja powstawaniu heterooligomerów (MILLER i MITTLER 2006, CHAN-SCHAMINET i współaut. 2009). U pomidora zidentyfikowano konstytutywnie eksprymowany HsfA1, który jest uważany za główny czynnik szoku cieplnego (MI- SHRA i współaut. 2002), u rzodkiewnika nie udało się wyznaczyć takiego pojedynczego czynnika. Nokaut nawet dwóch izogenów HsfA1 (HsfA1a i A1b) ma tylko niewielki wpływ na termotolerancję rzodkiewnika (LOHMANN i współaut. 2004). U pomidora HsfA1 kontroluje transkrypcję HsfA2 i HsfB1 (MISHRA i współaut. 2002), których białka wspólnie z HsfA1 biorą udział w utrzymaniu termotolerancji rośliny (SCHARF i współaut. 1998). Aktywacja genów pomidora, kodujących białka biorące udział w stresie cieplnym, zachodzi przy udziale superaktywatora, który jest formowany na skutek heterooligomeryzacji HsfA1 i HsfA2. Zdolności aktywatorowe homooligomerów HsfA1 bądź HsfA2 są kilka razy mniejsze niż heterooligomerów. Różnice te są następstwem komplementacji dwóch różnych domen CTAD i motywów AHA o odmiennych zdolnościach do interakcji z czynnikami maszynerii transkrypcyjnej.

96 Roślinne czynniki szoku cieplnego 627 W pierwszej kolejności w obrębie domeny oligomeryzacji HsfA dochodzi do szybkiej homotrimeryzacji pomiędzy regionami HR-A, a następnie do heterooligomeryzacji pomiędzy homotrimerami HsfA1 i HsfA2, co pociąga za sobą formowania heksamerycznych kompleksów. Proces ich powstawania jest uprzywilejowany w stosunku do homoligomerycznych heksamerów. O specyfice oddziaływań HsfA1/A2 decyduje rejon HR-B, a o stabilności pozostałe elementy rejonu oligomeryzacji. Dynamiczna równowaga, która się ustala pomiędzy kompleksami homo- lub heterooligomerów HsfA1/A2 jest kluczowa dla właściwej ekspresji genów indukowanych w szoku cieplnym (CHAN-SCHAMINET i współaut. 2009). Tendencję do heterooligomeryzacji mają również członkowie Hsf klasy A rzodkiewnika. Heterooligomery powstają między innymi z HsfA1a i HsfA1b i funkcjonują one jako aktywatory transkrypcji (LI i współaut. 2010). Łączenie się HsfA5 i HsfA4 zmienia znacząco ich właściwości. Stosując zarówno technikę immunostrącania, jak i dwuhybrydowy system drożdżowy potwierdzono preferencyjne powstawanie kompleksów HsfA4/ A5 w stosunku do homooligomerówów A4 lub A5. Homotrimery HsfA4 funkcjonują jako aktywatory transkrypcyjne, ale w wyniku oddziaływania z HsfA5 tracą swą aktywność. Sądzono, że fizyczna interakcja obu czynników transkrypcyjnych jest wynikiem wysokiego podobieństwa domen HR-A/B, jednakże porównując ich sekwencję do analogicznych obszarów HsfA1 lub HsfA2 nie stwierdzono istnienia znaczących różnic w ich budowie. Istota tych oddziaływań pozostaje ciągle nieznana, niemniej jednak HsfA1 po podstawieniu domeny HR-A/B na pochodzącą z HsfA4b łączy się z HsfA5 (BANIWAL i współaut. 2007). Regulacja aktywności HsfA4 na drodze interakcji z oligomerami HsfA5 została potwierdzona zarówno dla pomidora, jak i rzodkiewnika. Ustalenie dynamicznej równowagi pomiędzy ich aktywnymi homooligomerami a nieaktywnymi heterooligomerami jest częścią złożonego mechanizmu regulacji genów w odpowiedzi na stres u roślin. Potwierdza to również fakt, że geny Arabidopsis HsfA4a, HsfA4c i HsfA5 ulegają specyficznej tkankowo i rozwojowo ekspresji. Poziom ich mrna zmienia się także w warunkach stresu, ale zazwyczaj w taki sposób, że równowaga pomiędzy nimi jest przesunięta na korzyść aktywatorowego homotrimeru HsfA4 (BANIWAL i współaut. 2007). SPOSOBY REGULACJI TRANSKRYPCJI GENÓW HSF Analiza in silico potencjalnych sekwencji promotorowych położonych 1000 pz powyżej miejsca startu transkrypcji wykazała, że u Oryza sativa regulacja 12 spośród 26 genów Hsf mogłaby odbywać się na zasadzie pętli sprzężenia zwrotnego przez ich własne sekwencje regulatorowe Hse (MITTAL i współaut. 2009). Taką formę regulacji zaproponowano dla genów rzodkiewnika już wcześniej (NOVER i współaut. 2001). Jednak należy pamiętać, że jest to tylko jeden z wielu możliwych sposobów ich kontroli, gdyż brak Hse (np. w promotorze OsHsfA2c) nie wyklucza indukcji genu w warunkach szoku cieplnego, podobnie brak elementu LTR (ang. low temperature response) w promotorach Hsf klasy C ryżu ich aktywacji w warunkach chłodu (MITTAL i współaut. 2009). Zjawisko tolerancji krzyżowej roślin na stres jest między innymi zasługą regulacji ekspresji genów Hsf przy udziale loci kodujących w genomie A. thaliana aktywatory transkrypcyjne takie jak: ABI3, ABI4, ABI5 (ang. abscisic acid-insensitive). Spośród nich ABI3 reguluje transkrypcję specyficznego rozwojowo genu HsfA9 (KOTAK i współaut. 2007). Białko HsfA9 powstaje wyłącznie w późnych etapach rozwoju nasion i wpływa na indukcję kilku niskocząsteczkowych genów Hsp (ang. small heat shock proteins, shsp) oraz Hsp70 i Hsp101. Ma to ogromne znaczenie dla rozwoju nasion, gdyż brak shsp uwrażliwia je na przesuszanie. Co ciekawe, homologiczne transkrypty HsfA9 były wykrywane także w dojrzałych ziarnach kawy i nasionach pomidorów, ale nigdy w tkankach wegetatywnych i tylko ekotopowa ekspresja genu ABI3 w obecności kwasu abscysynowego prowadzi do akumulacji HsfA9. Również mutanty ABI3 A. thaliana (abi3-6 i S138922) nie wykazywały obecności transkryptów HsfA9 ani jego białka. Specyficzna budowa promotora HsfA9 i obecność w nim swoistych elementów RY/Sph, charakterystycznych dla genów eksprymowanych w nasionach, rodzi przypuszczenia, że mogą to być miejsca wiązania dla ABI3 lub innych specyficznych rozwojowo czynników transkrypcyjnych. Selektywna zdolność HsfA9

97 628 KAROL STAWSKI, ANNA GOC do indukcji wybranych shsp (Hsp17.4-CI, Hsp17.7-CII) i Hsp101, podczas gdy inne Hsp (Hsp17.6A-CI, Hsp 17.6-CII) nie są eksprymowane w nasionach wskazuje, że ten rodzaj regulacji może zależeć od struktury chromatyny (KOTAK i współaut. 2007). Inny czynnik transkrypcyjny, Dreb2a (ang. dehydration-responsive element binding protein), kontroluje ekspresję genu HsfA3 rzodkiewnika. Dreb2A uczestniczy zarówno w stresie cieplnym, jak i w powstawaniu odpowiedzi na suszę (YOSHIDA i współaut. 2008). Oprócz HsfA3 aktywuje on również wybrane shsp (Hsp18.1-CI, Hsp26.5 MII) i Hsp70 (SAKUMA i współaut. 2006). Nadekspresja Dreb2a zwiększa zakres termotolerancji uruchamiając całą kaskadę sygnałową genów powiązanych ze stresem abiotycznym. W warunkach szoku cieplnego szybka indukcja genu Dreb2a poprzedza późniejszą aktywację HsfA3, która narasta stopniowo do około 10 godziny działania podwyższonej temperatury. Nokaut genu Dreb2a prowadzi w trakcie szoku cieplnego do gwałtownego spadku HsfA3 oraz zmniejszenia zakresu termotolerancji rzodkiewnika (YOSHIDA i współaut. 2008). Istnieje jeszcze jeden poziom regulacji Hsf, który także wiąże się ze strukturą ich promotorów. Często geny regulowane poprzez Hsf posiadają co najmniej kilka sekwencji Hse rozdzielonych przez miejsca wiązania dla innych czynników transkrypcyjnych. BHARTI i współaut. (2004) zaobserwowali zależnie od budowy promotora efekt, który wykraczał poza możliwości działania samego czynnika HsfA1. Nowopoznanym, synergistycznym kooperatorem aktywności HsfA1 pomidora okazał się być HsfB1. Oba czynniki, po przyłączeniu się w osobnych miejscach w obrębie promotora, współdziałają w aktywacji transkrypcji. Ponieważ białko HsfB1 samo nie posiada motywu aktywacyjnego AHA, przypuszcza się, że rekrutuje ono inne czynniki transkrypcyjne (BHARTI i współaut. 2004). Funkcja HsfB1 pomidora wydaje się być uniwersalna, gdyż może wzmacniać transkrypcję również w obecności innych przedstawicielami klasy A zarówno pomidora, jak i rzodkiewnika, a nawet Gal4 drożdży i wirusowego białka VP16. Jak się okazało, zdolność ta wiąże się z specyficzną budową domeny CTAD HsfB1, a dokładniej obecnością w niej sekwencji GRGKMMK, którą oprócz Lycopersicum esculentum posiadają również HsfB1 Glycine max i Nicotiana tabacum. Sekwencja ta pozwala na interakcję z białkiem CBP (ang. CREB binding protein) będącym ortologiem histonowej acetylotransferazy HAC1 (ang. histone acetyl transferase-like protein 1), która poprzez modyfikacje histonów wpływa na stopień kondensacji chromatyny. Zarówno ssacze białka CBP/p300, jak i roślinne CBP (HAC1) wywierają silny stymulujący wpływ na transkrypcję genów. HAC1/CBP jest pierwszym opisanym czynnikiem wchodzącym w interakcje jednocześnie z dwoma typami Hsf. Prawdopodobnie białko to służy jako platforma do formowanie kompleksu aktywacyjnego CBP/HsfA1/HsfB1 (BHAR- TI i współaut. 2004). HsfB1 rzodkiewnika ma na końcu karboksylowym sekwencję GRSRMTETK, w której zamiast centralnie zlokalizowanej reszty lizyny (K) występuje reszta metioninowa (M), przez co traci on powinowactwo do CBP (BHARTI i współaut, 2004) i jest represorem aktywności Hsf klasy A (CZARNECKA-VERNER i współaut. 2004). Domena HsfB1 rzodkiewnika odpowiedzialna za represję transkrypcji ma wysoce konserwowaną sekwencję (LFGV), która poprzedza sygnał lokalizacji jądrowej. Sekwencja ta została zidentyfikowana również w innych roślinnych czynnikach transkrypcyjnych (IKEDA i OHME-TAKAGI 2009). Dla rzodkiewnika podwójna mutacja hsfb1/b2b nie ma wpływu na ekspresję genów szoku cieplnego takich jak Hsp17.6, Hsp23.6, Hsp70, Hsp83.1 i Hsp101 i prowadzi do silnej indukcji genu Pdf1.2a- /b (KUMAR i współaut. 2009). Kodowane przez ten ostatni gen białko uczestniczy w wytworzeniu odporności roślin na stres biotyczny. Sposób w jaki dochodzi do aktywacji Pdf1.2a/b jest nieznany. Wiadomo jednak, że represja omawianego genu przez HsfB nie zachodzi poprzez wiązanie się z DNA w obrębie promotora Pdf1.2a/b. Dowodzi to, że klasa B Hsf rzodkiewnika musi działać pośrednio poprzez oddziaływanie z innymi białkami. Zatem może dochodzić do interakcji pomiędzy szlakami czynników Hsf w takich reakcjach jak stres cieplny i atak patogenów, czego dowodem jest na przykład, że w wysokiej temperaturze środowiska patogenny grzyb Alternaria brassiciola nie infekuje rzodkiewnika (KUMAR i współaut. 2009).

98 Roślinne czynniki szoku cieplnego 629 INTERAKCJA BIAŁEK TYPU HSF Z BIAŁKAMI SZOKU CIEPLNEGO Interakcje jakie zachodzą pomiędzy Hsp i Hsf mogą być konserwowane dla większości systemów biologicznych. Pierwsze doniesienia o istnieniu tego typu oddziaływań opierały się głównie na badaniach Hsf1 kręgowców. Białka chaperonowe (czapeczkujące) Hsp70/90 wiążą zwierzęce Hsf tworząc z nimi kompleksy, uniemożliwiając indukcję genów im podległych (MORIMOTO 1998). Silne zróżnicowanie roślinnych Hsf ma swoje odzwierciedlenie w ich zdolności do wiązania się z określonymi białkami czaperonowymi (Hsp90, Hsp70, shsp). Formowanie pomiędzy nimi zależnych układów biologicznych jest podstawą budowania odpowiedzi komórkowej w szoku cieplnym, jak również w późniejszym wyciszeniu uczestniczących genów. W takich układach zależności występują opisane białka pomidora: HsfA1 regu- lowane przez Hsp70, HsfA2 przez Hsp CII i HsfB1 przez Hsp90 (HAHN i współaut. 2011). W trakcie procesu wyciszania HSR u L. esculentum zanika zdolność do tworzenia heterooligomerycznych kompleksów HsfA1/ HsfA2. HsfA1 jest wycofywany z jądra komórkowego do cytoplazmy (SCHARF i współaut. 1998), zaś HsfA2 pozostaje na jego terenie związany przez niskocząsteczkowe shsp klasy CI i CII. Białka tych dwóch klas wykazują przeciwstawne funkcje, podczas gdy Hsp17.4-CII działa jako specyficzny korepresor HsfA2, zatrzymując go w warunkach stresu cieplnego w białkowych agregatach cytoplazmatycznych, czynnik Hsp17-CI uczestniczy w ich rozbijaniu (PORT i współaut. 2004). Nieaktywne cząsteczki HsfA2 po uwolnieniu z kompleksów, w warunkach stresu cieplnego, mogą ponownie być rekrutowane przez Ryc. 2 Interakcje HSP i HSF u Lycopersicon esculentum (wg HAHN i współaut. 2011, zmodyfikowana). W trakcie procesu wyciszania HSR dochodzi do związania HsfA1, A2, B1 (A1, A2, B1) przez Hsp70 i Hsp90, co prowadzi do ich degradacji w proteosomie. HsfB1 (B1) w kompleksie z Hsp90 może funkcjonować jako represor genów szoku cieplnego (Geny HS) lub po związaniu Hsp70 również podlegać degradacji. Równolegle HsfB1 jest wymagany do podtrzymania transkrypcji genów metabolizmu podstawowego (Geny HK) poprzez oddziaływania z czynnikami transkrypcyjnymi (X). Po ustaniu warunków szoku cielpnego HsfA2 tworzą głównie cytoplazmatyczne granule HSG, które po powtórnym zadziałaniu stresu rozpadają się uwalniając HsfA2, który wraz z HsfA1 formuje kompleksy aktywatorowe (A1/A2). Indukcja poprzez HsfA1 i HsfB1 prowadzi do włączenia innych genów szoku cieplnego mających dla nich dwa niezależne miejsca wiązania Hse.

99 630 KAROL STAWSKI, ANNA GOC HsfA1 (SCHARF i współaut. 1998). Zarówno HsfA2, jak i HsA1 oddziałują ponadto z Hsp70 i Hsp90. Do tego typu interakcji białko Hsp90 wykorzystuje swój koniec karboksylowy, lecz nie jest to motyw MEEVD, odpowiedzialny za interakcje z ko-chaperonami posiadającymi domenę konserwowanych 34-aminokwasowych powtórzeń TPR (ang. tetratricopeptide repeat) (TRAVERS i FARES 2007). Wykorzystując dwuhybrydowy system drożdżowy wykryto również rejony biorące udział w interakcji z Hsp70. Dla HsfA2 jest to koniec karboksylowy, a dla HsfA1 koniec aminowy białka (HAHN i współaut. 2011). Interakcja HsfA1 z Hsp70 uniemożliwia jego wiązane się z elementem Hse blokując przez to jego zdolności aktywatorowe. Hsp70 może uczestniczyć w modulowaniu aktywności HsfA1 zarówno w normalnych warunkach fizjologicznych, jak również w trakcie atenuacji HSR. Kluczowa wydaje się tylko dostępność płaszczyzny odziaływań Hsf- -Hsp. Jeśli HsfA1 tworzy heterooligomeryczne kompleksy superaktywatorowe HsfA1/A2, to czynnik wydaje się być niedostępny dla Hsp70 (CHAN-SCHAMINET i współaut. 2009). HAHN i współaut. (2011) przedstawili model oddziaływania pomiędzy poziomem białek czaperonowych Hsp70/Hsp90 a Hsf, podczas HSR (Ryc. 2). Szczególną funkcję w modulowaniu tej odpowiedzi zajmuje HsfB1. Jego asocjacja z Hsp90 nie tylko ułatwia czynnikowi odnalezienie sekwencji Hse w genach metabolizmu podstawowego pomidora, lecz również hamuje ekspresje genów Hsp aktywowanych wcześniej przez HsfA1 i HsfB1. Jak już wcześniej opisano, HsfB może oddziaływać również z czynnikami transkrypcyjnymi, po przyłączeniu HAC1 indukować geny Hsp (BHARTI i współaut. 2004) lub współdziałając z innymi białkami hamować ich ekspresję (KUMAR i współaut. 2009). Niezależnie od funkcji HsfB1 jego stabilność jest zależna nie tylko od interakcji z Hsp90, lecz również z Hsp70. Po uzupełnieniu kompleksu HsfB1/Hsp90 o Hsp 70, HsfB1 jest kierowany na drogę proteosomalnej degradacji. W wyniku podobnych interakcji w trakcie wyciszania HSR usuwany jest HsfA1. Ponadto w C-końcu HsfB1 odkryto rejon, który nie uczestniczy w wyżej wymienionych oddziaływaniach, lecz decyduje o szybkości degradacji HsfB1. Element ten zawiera dwie reszty lizynowe i kilka serynowych, co rodzi przypuszczenia, że może ulegać potranslacyjnym modyfikacjom lub rekrutuje nieznane dotąd czynniki (HAHN i współaut. 2011). Farmakologiczna inhibicja Hsp90 prowadzi do wydłużonej akumulacji i stabilizacji oprócz HsfB1 również HsfA2. Fizyczna asocjacja Hsf z chaperonami Hsp70 i Hsp90 wskazuje na współistnienie różnych kompleksów lub bliską współpracę Hsp70 i Hsp90, tak jak ma to miejsce u kręgowców w przypadku modulowania aktywności receptorów glikokortykoidowych (PRATT i współaut. 2008). UDZIAŁ ROŚLINNYCH HSF W STRESIE I ICH SPECYFIKA ROZWOJOWA Dla rzodkiewnika HsfA2 należy do kluczowych białek indukowanych przez różne rodzaje stresu. Spośród czynników klasy A wykazuje on najwyższą ekspresję w stresie oksydacyjnym wywołanym zarówno przez silne światło, szok cieplny lub poprzez traktowanie roślin H 2 O 2 lub O 3 (MILLER i MITTLER 2006, NISHIZAWA i współaut. 2006). Oprócz tego równie silnie jest indukowany w warunkach stresu solnego i osmotycznego, jak i anoksji (OGAWA i współaut. 2007, BANTI i współaut. 2010). Pod kontrolą HsfA2 pozostaje duża grupa ok. 720 genów rzodkiewnika, które są związane z kształtowaniem się odporności na stres, a wśród nich są geny niemal wszystkich shsp i poszczególnych izoform Hsp70 i Hsp100, jak również gen peroksydazy askorbinianowej APX2 i syntetazy galaktinolu GolS (SCHRAMM i współaut. 2006, NISHIZAWA-YOKOI i współaut. 2009). Nadekspresja HsfA2 u A. thaliana uodparnia roślinę na warunki stresu, zaś nokaut tego genu redukuje poziom tolerancji na ciepło, jak również reaktywne formy tlenu (RFT) (NISHIZAWA i współaut. 2006, OGAWA i współaut. 2007). Indukcja jego genu przebiega przy udziale HsfA1d i HsfA1e, lecz bez HsfA1a i HsfA1b (NISHIZAWA-YOKOI i współaut. 2011). RFT są wspólnym czynnikiem dla heterogenicznych rodzajów stresu, takich jak: światło UV, zranienia, atak patogena czy hipoksja korzenia. Różne czynniki wywołujące stres mają swój charakterystyczny profil produkcji poszczególnych form RFT: O 2, 1 O 2 i H 2 O 2. Generalnie większość genów powiązanych z odpowiedzią roślin na RFT zostaje aktywowana w odpowiedzi na podwyższony poziom tlenu singletowego ( 1 O 2 ), a nadtlenek wodoru (H 2 O 2 ) i anionorodnik ponadtlenkowy

100 Roślinne czynniki szoku cieplnego 631 Ryc. 3. Drogi oddziaływania czynników Hsf u Arabidopsis thaliana (wg LIU i współaut. 2011, NISHIZAWA-YOKO i współaut. 2011, zmodyfikowana). (O 2 ) indukują tylko nieliczne z nich (GADJEV i współaut. 2006). Wybrane Hsf mogą pełnić funkcje sensorów RFT w komórce. Spośród wszystkich Hsf ryżu najlepiej predysponuje do tej funkcji OsHsfA2a. Koduje go gen wczesnej odpowiedzi na RFT, a inne Hsf (OsHsfA2f i OsHsfA7) mogą być także włączane później (MITTAL i współaut. 2009). U rzodkiewnika za sensory RFT są uważane AtHsfA4a i AtHsfA8 (DAVLETOVA i współaut. 2005). Ich ekspresja w warunkach stresu oksydacyjnego rośnie gwałtownie, podczas gdy innych Hsf zmienia się tylko nieznacznie. Podobną funkcję przypisuje się również HsfA1b. Jego nadekspresja podnosi poziom antyoksydacyjnego enzymu peroksydazy askorbinianowej 1 (Apx1), a w stresie cieplnym i świetlnym również Apx2 (PANCHUK i współaut. 2002). Warto również zauważyć, że niektóre z omawianych czynników transkrypcyjnych, tak jak wcześniej wspominane OsHsfA2a i OsHsfA2f biorą udział w odpowiedzi na dwa rodzaje stresu (cieplny i oksydacyjny). Z kolei OsHsfA5, OsHsfC2a mają jeszcze szerszy zakres odpowiedzi, co potwierdza udział Hsf w kształtowaniu się tolerancji krzyżowej roślin (MIT- TAL i współaut. 2009). LIU i współaut. (2011) zaproponowali model powstawania odpowiedzi HSR u rzodkiewnika. Kluczowe miejsce zajął w nim HsfA2, które moduluje siłę odpowiedzi na stres. RFT i jony wapnia są głównymi cząsteczkami sygnałowymi w stresie. U rzodkiewnika prowadzą do indukcji genów z grupy HsfA1 poprzez kaskadę sygnałów zależnych od Ca 2+, która może przebiegać od kalmoduliny (CaM) do białek wiążących CaM (CBK3) (LIU i współaut. 2011) (Ryc. 3). Aktywacja genów HsfA1 rzodkiewnika prowadzi do wzrostu transkrypcji ponad 200 różnych genów. Pośród nich można wyróżnić HsfA2, HsfA7a/7b i Dreb2a. Wymienione czynniki transkrypcyjne działają jako wtórne aktywatory kolejnych genów zaangażowanych w szoku cieplnym, co zostało potwierdzone w przypadku HsfA3, który pozostaje pod kontrolą Dreb2a (SCHRAMM i współaut. 2006, YOSHIDA i współaut. 2008, NISHIZAWA-YOKOI i współaut. 2011). HsfA2 i HsfA3 mogą specyficznie regulować geny, które nie są pod bezpośrednią kontrolą HsfA1 (LIU i współaut. 2011). Ponadto pomiędzy HsfA1e, A2 i A3 istnieje dodatnie sprzężenie zwrotne. HsfA3 może indukować transkrypcję HsfA1e (YOSHIDA i współaut. 2008), który wpływa na ekspresję HsfA2, a ten na HsfA3 (OGAWA i współaut. 2007). Niektóre spośród Hsf rzodkiewnika i ryżu wykazują wysoki stopień stresowej specjalizacji. U ryżu w szoku cieplnym nie uczestniczą geny: OsHsfA5, OsHsfB4c, LOC_Os06g22610, a poziom OsHsfC1a obniża się (MITTAL i współaut. 2009). Podobnie niewielki poziom ekspresji w warunkach szoku cieplnego, jak i w stresie solnym, osmotycznym, oksydacyjnym i UVB, wykazują niektóre Hsf rzodkiewnika (6 z klasy A i 1 z B) (SWINDELL i współaut. 2007). W reakcji na chłód u O. sativa dochodzi do spadku transkrypcji wszystkich członków klasy B za wyjątkiem OsHsfB4a i OsHsfB4b. Ostatni podlega indukcji po około 5 godzinach w warunkach 5 C, dużo później niż trzej członkowie klasy A: OsHsfA3, OsHsfA4d, OsHsfA9 i pojedynczy przedstawiciel C - OsHsfC1b (MITTAL i współaut. 2009). Wszystkie Hsf, oprócz wybiórczej wrażliwości w stresie, wykazują własną specyfikę tkankową. Do indukcji transkrypcji HsfA9 rzodkiewnika dochodzi w nasionach w późnym stadium ich rozwoju (KOTAK i współaut. 2007). Jego ortolog u ryżu nie wykazuje już takiej zależności (MITTAL i współaut. 2009). Wysoki poziom OsHsfB1 obserwowano w nasionach i korzeniach ryżu, OsHsfA4d w liściach, OsHsfA2e w kwiatostanie, OsHsfA1a w kwiatach, a OsHsfB4b w słupkach (MITTAL i współaut. 2009). Podobnie w przypadku rzod-

101 632 KAROL STAWSKI, ANNA GOC kiewnika transkrypty HsfA5 wraz z HsfA4c są wykrywane w pyłku, natomiast w korzeniach występują transkrypty HsfB1 i HsfC1 (SWINDELL i współaut. 2007). PODSUMOWANIE Roślinne Hsf jako czynniki transkrypcyjne stanowią przedmiot zainteresowań badaczy zajmujących się odpowiedzią roślin na szeroko rozumiany stres nie tylko abiotyczny. Udział wybranych Hsf w powstaniu odpowiedzi na kilka stresów jednocześnie stawia je na kluczowym miejscu w szlakach transdukcji sygnałów. Wysokie podobieństwo pomiędzy poszczególnymi członkami Hsf w obrębie klasy lub grupy nie ma jednak odzwierciedlenia w przewidywaniu funkcji poszczególnych jej członków. O ich aktywności nie decyduje wyłącznie budowa domenowa, lecz zdolność do oligomeryzacji lub/i heterooligomeryzacji. Dobrym przykładem jest HsfA1 pomidora lub HsfA4 rzodkiewnika (BANIWAL i współaut. 2007, LI i współaut. 2010). Mogą również wchodzić w interakcje z białkami czaperonowymi shsp, Hsp70 i Hsp90, które decydują głównie o ich stabilności (HAHN i współaut. 2011). Ponadto aktywność Hsf może być zależna do oddziaływania z innymi czynnikami transkrypcyjnymi, w sposób bezpośredni lub pośredni budując kombinację Hsf i/lub czynników transkrypcyjnych przyłączonych w obrębie tego samego promotora. O ile dobrze poznana jest rola Hsf klasy A w kształtowaniu HSR, to dużo mniej wiadomo na temat funkcji pozostałych Hsf członków klasy B i C. Ogromna różnorodność Hsf pozwala przypuszczać, że są one również konieczne w procesach różnicowania się komórek roślinnych. ROŚLINNE CZYNNIKI SZOKU CIEPLNEGO Streszczenie Transkrypcyjne czynniki szoku cieplnego (Hsf) są niezbędne dla wszystkich organizmów eukariotycznych do przetrwania w warunkach silnego stresu. Są odpowiedzialne za transkrypcyjną regulację genów kodujących białka chaperonowe oraz inne białka powiązane ze stresem. W porównaniu do czterech Hsf kręgowców, roślinne Hsf są bardzo liczne i mogą mieć nawet 25 członków. Wykazują one wysoki stopień specjalizacji w stosunku do rodzaju stresu jak również różnych programów rozwojowych. Pomimo pewnych wysoce zachowywanych cech, różnice w strukturze roślinnych Hsf pozwoliły na wyróżnieni trzech podstawowych klas (klasa A, B i C). W przeciwieństwie do aktywatorowej klasy A, klasy C i B o porównywalnej liczbie członków nie posiadają oczywistej funkcji. U roślin transkrypcyjna regulacja genów zależnych od Hsf jest kontrolowana przez pośrednią lub bezpośrednią kooperację pomiędzy różnymi czynnikami Hsf, jak również w wyniku interakcji z białkami czperonowymi. Wciąż jednak sieć wzajemnych zależności pomiędzy poszczególnymi Hsf jest mało zrozumiała. Z całą pewność Hsf funkcjonują jako część składowa szlaków transdukcji sygnałów aktywowanych w stresie środowiskowym jak i w trakcie rozwoju. PLANT HEAT STRESS FACTORS Summary Heat shock factors (Hsf) are essential for all eukaryotic organisms to survive under exposures to acute stress. They are transcriptional regulators of genes encoding molecular chaperones and other stress proteins. Compared with other eukaryotes, e.g. vertebrates with 4 members of the Hsf family, the plant Hsf family shows a large multiplicity, with more than 20 members. The plant Hsf family shows a strong diversification of expression pattern not only in response to stress, but also during various developmental programs. Despite many conserved features plant Hsf are allocated based on structural characteristics into three major classes (class A, B and C). In contrast to class A, a considerable number of Hsf assigned to classes B and C heave no evident function as transcription activators. Transcriptional regulation of Hsf dependent genes in plants is controlled by direct and indirect cooperation between distinct Hsf members and by interaction with chaperones. However our understanding of the function of plant Hsf network is far from complete. Certainly, they can functions as part of different signal transduction pathways operating in response to environmental stress and during development.

102 Roślinne czynniki szoku cieplnego 633 LITERATURA BANIWAL S. K., BHARTI K., CHAN K. Y., FAUTH M., GAN- GULI A., KOTAK S., MISHRA S. K., NOVER L., PORT M., SCHARF K. D., TRIPP J., WEBER C., ZIELINSKI D., VON KOSKULL-DÖRING P., Heat stress response in plants: a complex game with chaperones and more than twenty heat stress transcription factors. J. Biosci. 4, BANIWAL S. K., CHAN K. Y., SCHARF K.-D., NOVER L., Role of heat stress transcription factor HsfA5 as specific repressor of HsfA4. J. Biol. Chem. 282, BANTI V., MAFESSONI F., LORETI E., ALPI A., PERATA P., The heat-inducible transcription factor HsfA2 enhances anoxia tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 152, BHARTI K., VON KOSKULL-DORING P., BHARTI S., KUMAR P., TINTSCHL-KORBITZER A., TREUTER E., NOVER L., Tomato heat stress transcription factor HsfB1 represents a novel type of general transcription coactivator with a histone-like motif interacting with the plant CREB binding protein ortholog HAC1. Plant Cell 16, CHAN-SCHAMINET K. Y., BANIWAL S. K., BUBLAK D., NOVER L., SCHARF K. D., Specific interaction between tomato HsfA1 and HsfA2 creates hetero-oligomeric superactivator complexes for synergistic activation of heat stress gene expression. J. Biol. Chem. 284, CICERO M. P., HUBL S. T., HARRISON C. J., LITTLEFIELD O., HARDY J. A., NELSON H. C. M., The wing in yeast heat shock transcription factor (HSF) DNA-binding domain is required for full activity. Nucleic Acids Res. 29, CZARNECKA-VERNER E., PAN S., SALEM T., GURLEY W. B., 2004 Plant class B HSFs inhibit transcription and exhibit affinity for TFIIB and TBP. Plant Mol. Biol. 56, DAVLETOVA S., RIZHSKY L., LIANG H., SHENGQIANG Z., OLIVER D.J., COUTU J., SHULAEV V., SCHLAUCH K., MITTLER R., Cytosolic ascorbate peroxidase 1 is a central component of the reactive oxygen gene network of Arabidopsis. Plant Cell 17, DÖRING P.,TREUTER E., KISTNER C., LYCK R., CHEN A., NOVER L., The role of AHA motifs in the activator function of tomato heat stress transcription factors HsfA1 and HsfA2. Plant Cell 12, FUJIMOTO M., NAKAI A., The heat shock factor family and adaptation to proteotoxic stress FEBS J. 277, GADJEV I., VANDERAUWERA S., GECHEV T. S., LALOI C., MINKOV I. N., SHULAEY V., APEL K., INZE D., MIT- TLER R., VAN BREUSEGEM F., Transcriptomic footprints disclose specificity of reactive oxygen species signaling in Arabidopsis. Plant Physiol. 141, HAHN A., BUBLAK D., SCHLEIFF E., SCHARF K. D., Crosstalk between Hsp90 and Hsp70 chaperones and heat stress transcription factors in tomato. Plant Cell 23, HEERKLOTZ D., DÖRING P., BONZELIUS F., WINKELHAUS S., NOVER L., 2001 The balance of nuclear import and export determines the intracellular distribution of tomato heat stress transcription factor HsfA2. Mol. Cell Biol. 21, IKEDA M., OHME-TAKAGI M., A novel group of transcriptional repressors in Arabidopsis. Plant Cell Physiol. 50, JEDLICKA P., MORTIN M. A., WU C., Multiple functions of Drosophila heat shock transcription factor in vivo. EMBO J. 16, KOSKULL-DÖRING P., SCHARF K.-D., NOVER L., The diversity of plant heat stress transcription factors. Trends Plant Sci. 12, KOTAK S., PORT M., GANGULI A., BICKER F., VON KOSKULL-DÖRING P., Characterization of C-terminal domains of Arabidopsis heat stress transcription factors (Hsfs) and identification of a new signature combination of plant class A Hsfs with AHA and NES motifs essential for activator function and intracellular localization. Plant J. 39, KOTAK S., VIERLING E., BÄUMLEIN H., VON KOSKULL- DÖRING P., A novel transcriptional cascade regulating expression of heat stress proteins during seed development of Arabidopsis. Plant Cell 19, KUMAR M., BUSCH W., BIRKE H., KEMMERLING B., NURN- BERGER T., SCHÖFFL F., Heat shock factors HsfB1 and HsfB2b are involved in the regulation of Pdf1.2 expression and pathogen resistance in Arabidopsis. Mol. Plant 2, LI M., DOLL J., WECKERMANN K., OECKING C., BEREN- DZEN K.-W., SCHÖFFL F., Detection of in vivo interactions between Arabidopsis class A- HSFs, using a novel BiFC fragment, and identification of novel class B-HSF interacting proteins. Eur. J. Cell Biol. 89, LIU H. C., LIAO H. T., CHARNG Y. Y., The role of class A1 heat shock factors (HSFA1s) in response to heat and other stresses in Arabidopsis. Plant Cell Environ. 34, LOHMANN C., EGGERS-SCHUMACHER G., WUNDERLICH M., SCHÖFFL F., Two different heat shock transcription factors regulate immediate early expression of stress genes in Arabidopsis. Mol. Genet. Genomics. 271, MILLER G., MITTLER R., Could heat shock transcription factors function as hydrogen peroxide sensors in plants? Ann. Bot. 98, MISHRA S. K., TRIPP J., WINKELHAUS S., TSCHIERSCH B., THERES K., NOVER L., SCHARF K. D., In the complex family of heat stress transcription factors, HsfA1 has a unique role as master regulator of thermotolerance in tomato. Genes Dev. 16, MITTAL D., CHAKRABARTI S., SARKAR A., SINGH A., GRO- VER A., Heat shock factor gene family in rice: genomic organization and transcript expression profiling in response to high temperature, low temperature and oxidative stresses. Plant Physiol. Biochem. 47, MORIMOTO R. I., Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Genes Dev. 12, NISHIZAWA A., YABUTA Y., YOSHIDA E., MARUTA T., YOSHIMURA K., SHIGEOKA S., Arabidopsis heat shock transcription factor A2 as a key regulator in response to several types of environmental stress. Plant J. 48, NISHIZAWA-YOKOI A., YOSHIDA E., YABUTA Y., SHIGEO- KA S., Analysis of the regulation of target genes by an Arabidopsis heat shock transcription factor, HsfA2. Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, NISHIZAWA-YOKOI A., NOSAKA R., HAYASHI H., TAINAKA H., MARUTA T., TAMOI M., IKEDA M., OHME-TAKAGI M., YOSHIMURA K., YABUTA Y., SHIGEOKA S., HsfA1d and HsfA1e involved in the transcriptional regulation of HsfA2 function as key regulators for the Hsf signaling network in response

103 634 KAROL STAWSKI, ANNA GOC to environmental stress. Plant Cell Physiol. 52, NOVER L., BHARTI K., DÖRING P., MISHRA S. K., GAN- GULI A., SCHARF K. D., 2001 Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: how many heat stress transcription factors do we need? Cell Stress Chaperon. 6, OGAWA D., YAMAGUCHI K., NISHIUCHI T., Highlevel overexpression of the Arabidopsis HsfA2 gene confers not only increased themotolerance but also salt/osmotic stress tolerance and enhanced callus growth. J. Exp. Bot. 58, PANCHUK I. I., VOLKOV R. A., SCHÖFFL F., Heat stress- and heat shock transcription factor-dependent expression and activity of ascorbate peroxidase in Arabidopsis. Plant Physiol. 129, PARKER C. S., TOPOL J. A., Drosophila RNA polymerase II transcription factor binds to the regulatory site of an hsp70 gene. Cell 37, PELHAM H. R., A regulatory upstream promoter element in the Drosophila hsp70 heat-shock gene. Cell 30, PETERANDERL R., RABENSTEIN M., SHIN Y. K., LIU C. W., WEMMER D. E., KING D. S., NELSON H. C., Biochemical and biophysical characterization of the trimerization domain from the heat shock transcription factor. Biochemistry 38, PORT M., TRIPP J., ZIELINSKI D., WEBER C., HEERKLOTZ D., WINKELHAUS S., BUBLAK D., SCHARF K. D., Role of Hsp17.4-CII as coregulator and cytoplasmic retention factor of tomato heat stress transcription factor HsfA2. Plant Physiol. 135, PRATT W. B., MORISHIMA Y., OSAWA Y., The Hsp90 chaperone machinery regulates signaling by modulating ligand binding clefts. J. Biol. Chem. 283, SAKUMA Y., MARUYAMA K., QIN F., OSAKABE Y., SHI- NOZAKI K., YAMAGUCHI-SHINOZAKI K., Dual function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heatstress-responsive gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, SCHARF K. D., HEIDER H., HOHFELD I., LYCK R., SCHMIDT E., NOVER L., The tomato Hsf system: HsfA2 needs interaction with HsfA1 for efficient nuclear import and may be localized in cytoplasmic heat stress granules. Mol. Cell. Biol. 18, SCHRAMM F., GANGULI A., KIEHLMANN E., ENGLICH G.,WALCH D., VON KOSKULL-DÖRING P., The heat stress transcription factor HsfA2 serves as a regulatory amplifier of a subset of genes in the heat stress response in Arabidopsis. Plant Mol. Biol. 60, SCHULTHEISS J., KUNERT O., GASE U., SCHARF K.-D., NOVER L., RÜTERJANS H., Solution structure of the DNA-binding domain of the tomato heat stress transcription factor HSF24. Eur. J. Biochem. 236, SWINDELL W. R., HUEBNER M., WEBER A. P., Transcriptional profiling of Arabidopsis heat shock proteins and transcription factors reveals extensive overlap between heat and non-heat stress response pathways. BMC Genomics 8, 125. TRAVERS S. A., FARES M. A., Functional coevolutionary networks of the Hsp70-Hop-Hsp90 system revealed through computational analyses. Mol. Biol. Evol. 24, YOSHIDA T., SAKUMA Y., TODAKA D., MARUYAMA K., QIN F., MIZOI J., KIDOKORO S., FUJITA Y., SHINOZA- KI K., YAMAGUCHI-SHINOZAKI K., Functional analysis of an Arabidopsis heat-shock transcription factor HsfA3 in the transcriptional cascade downstream of the DREB2A stress-regulatory system. Biochem. Biophys. Res. Commun. 368,

104 Tom Numer 4 (297) Strony URSZULA KRASUSKA, ANNA GLINKA, AGNIESZKA GNIAZDOWSKA Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Wydział Rolnictwa i Biologii Katedra Fizjologii Roślin Nowoursynowska 159, Warszawa agnieszka_gniazdowska@sggw.pl urszula_krasuska@ sggw.pl MENU ROŚLIN MIĘSOŻERNYCH WSTĘP JAKIE ROŚLINY NAZYWAMY MIĘSOŻERNYMI? Spośród wszystkich roślin, które oddziałują na wyobraźnię człowieka szczególnie wyróżniają się rośliny mięsożerne (łac. plantae carnivorae). Organizmy te, w wyniku szeregu zmian adaptacyjnych, mogły opanować siedliska niesprzyjające innym gatunkom roślin. Mięsożerność w świecie roślin to fenomen przyrodniczy. Powszechnie uważa się, że ten sposób pozyskiwania pokarmu jest zarezerwowany głównie dla organizmów zwierzęcych. Stąd też wynika fascynacja roślinami mięsożernymi sięgająca czasów Karola Darwina, który w dziele poświęconym tym organizmom nazywał je jednymi z najbardziej cudownych roślin na świecie (DARWIN 1875, ELLISON i GOTELLI 2009). Należy zaznaczyć, że wszystkie poznane do tej pory rośliny mięsożerne są autotrofami (przeprowadzają proces fotosyntezy). Naturalnie występują w środowiskach ubogich w łatwo przyswajalne składniki mineralne, zatem zapotrzebowanie roślin na makro- i mikroelementy jest zaspokajane poprzez pobieranie ich z ciał zdobytych ofiar. Taki sposób przetrwania tych organizmów, jako swoistych heterotrofów, stał się możliwy dzięki przekształceniu liści asymilacyjnych w pułapki wabiące zdobycz (kolorem, kształtem czy zapachem), przeprowadzaniu procesu trawienia oraz wchłaniania uwolnionych składników pokarmowych (AD- LASSNIG i współaut. 2009, JURGENS i współaut. 2009). Dokładny opis budowy i funkcjonowania pułapek roślin mięsożernych zaintere- sowany czytelnik znajdzie w pracach przeglądowych: PODBIELKOWSKI i SUDNIK-WÓJCI- KOWSKA 2003, MITHÖFER 2011, KRÓL i współaut Warto pamiętać, że zdolność do wydzielania enzymów trawiennych (takich jak proteinazy czy fosfatazy) mają też rośliny nie zaliczane do mięsożernych (PŁACHNO i współaut. 2009). Ponadto, jak ma to miejsce w przypadku bodziszka lepkiego (Geranium viscosissimum), produkty powstające w wyniku aktywności egzogennych proteinaz są absorbowane przez roślinę (PŁACHNO i współaut. 2009). Rośliny mięsożerne niewątpliwie dostarczają nam szczególnych wrażeń estetycznych. Ponadto były, są i mogą być wykorzystywane przez człowieka w życiu codziennym, chociażby jako ekologiczne środki owadobójcze (PODBIELKOWSKI i SUDNIK-WÓJCIKOWSKA 2003). Coraz częściej też zwraca się uwagę na substancje wytwarzane przez rośliny mięsożerne, takie jak np. związki grzybobójcze należące do naftochinonów (MITHÖFER 2011). Ponadto liście pułapkowe typu dzbanek zawierają specyficzne mikroorganizmy, których enzymy, np. lipazy odporne na niskie ph płynu trawiennego, mogłyby być z powodzeniem wykorzystywane przez człowieka (MOROHOSHI i współaut. 2011). Dziś szacuje się, że wśród wszystkich roślin naczyniowych występuje około 700 gatunków zaliczanych do grupy mięsożernych (KRÓL i współaut. 2012). Rośliny mięsożerne to głównie byliny z przewagą hemikryptofi-

105 636 URSZULA KRASUSKA i współaut. tów (ich pąki odnawiające mogą przetrwać niekorzystną porę roku na powierzchni podłoża). Można je odnaleźć zarówno pośród roślin jedno-, jak i dwuliściennych (ELLISON i GOTELLI 2009). Nieliczne gatunki należą do epifitów, np. pływacz lotosolistny (Utricularia nelumbifolia), czy tłustosz morański (Pinguicula moranensis), lian (niektóre dzbaneczniki Nepenthes), lub są roślinami jednorocznymi, tak jak żenlisea afrykańska (Genlisea africana) (PODBIELKOWSKI i SUD- NIK-WÓJCIKOWSKA 2003, ADLASSNIG i współaut. 2005). Rośliny mięsożerne nie posiadają jednego wspólnego przodka i nie należą do jednej grupy systematycznej. Mięsożerność jako adaptacja rozwijała się w różnych regionach geograficznych, niezależnie i pięciokrotnie w toku ewolucji (ELLISON i GOTELLI 2009, ADLASSNIG i współaut. 2011). Wyniki badań prowadzonych nad mięsożernością roślin zaowocowały sformułowaniem koncepcji tzw. syndromu mięsożerności (PŁACHNO i współaut. 2009, KRÓL i współaut. 2012), wiążącego się ze zwabieniem ofiary do pułapki, utrzymaniem ofiary w pułapce, zabiciem jej, strawieniem i przyswojeniem uzyskanych składników pokarmowych. Jednakże wiele roślin, które uważano do tej pory za mięsożerne nie spełnia wszystkich kryteriów syndromu mięsożerności. Część roślin nie wabi ofiar, a niektóre nie są w stanie samodzielnie strawić schwytanej zdobyczy (PŁACHNO i współaut. 2009). Takie organizmy często są uważane za pseudomięsożerne. Summa summarum, jako główny warunek zaliczenia danej rośliny do grupy mięsożernych uważa się zdolność do pobierania i wykorzystywania składników mineralnych z ciał innych organizmów (bądź ich fragmentów) (PŁACHNO i współaut. 2009). Przykład stanowią rośliny z rodzaju roridula (Roridula), kapturnica (Sarracenia), bądź dojrzałe osobniki dzbanecznika Lowiego (Nepenthes lowii) (CLARKE i współaut. 2009, PŁACHNO i współaut. 2009, KOOPMAN i współaut. 2010). Roridula chwyta ofiarę za pomocą lepkiej, hydrofobowej wydzieliny pochodzącej z włosków gruczołowych umieszczonych na liściach. Ofiary nie są trawione przez roślinę, lecz zjadane przez owady symbiotyczne, których odchody służą jako donor składników mineralnych absorbowanych przez roridulę (PŁACHNO i współaut. 2009). Kapturnice żyją w symbiozie z mikroorganizmami, które rozkładają schwytaną w pułapkę zdobycz na swoistego rodzaju pożywny bulion. Uwolnione składniki mineralne są absorbowane przez roślinę (KOOPMAN i współaut. 2010, KRÓL i współaut. 2012). Dzbanecznik występuje w tropikalnych lasach w górach na Borneo. Osobniki niedojrzałe należą do klasycznych roślin mięsożernych, które produkują dzbanki naziemne zdolne do wabienia i łapania głównie mrówek. Z chwilą kiedy roślina uzyskuje dojrzałość (wytwarza zmodyfikowane dzbanki powietrzne) zmienia sposób pozyskiwania azotu. Wchodzi w mutualistyczne interakcje z wiewiórecznikiem górskim (Tupaia montana), wabionym słodką wydzieliną, którego odchody pozostawione w dzbanku dostarczają około % azotu absorbowanego przez liść (CLARKE i współaut. 2009). Ponadto, niedawno odkryty gatunek dzbanecznika (N. baramensis), wcześniej znany jako N. rafflesiana var. elongata, korzysta z azotu pochodzącego z odchodów nietoperza z gatunku Kerivoula hardwickii (CLARKE i współaut. 2011). Jak wykazano, nietoperze dostarczają w ten sposób około 34% całkowitego azotu pobieranego przez liście (CLARKE i współaut. 2011). Ze względu na wzrost, stopień odzyskiwania składników pokarmowych z obumierających organów oraz interakcje pomiędzy pobieraniem korzeniowym a absorpcją przez liście pułapkowe, lądowe rośliny mięsożerne zostały podzielone na trzy grupy ekofizjologiczne (ADAMEC 1997). Do pierwszej należą gatunki, u których wchłanianie przez pułapki stymuluje zdolność pobierania substancji odżywczych przez korzenie. Stopień odzyskiwania azotu i fosforu ze starszych części rośliny jest w tym przypadku niewielki. Druga grupa charakteryzuje się współzawodnictwem pomiędzy pobieraniem korzeniowym i liściowym jeden sposób odżywiania hamuje drugi. Trzecia grupa to rośliny ze słabo wykształconymi korzeniami, które są zdecydowanie zależne od odżywiania mineralnego poprzez trawienie ofiar. Pozyskiwanie przez rośliny niezbędnych do przeżycia substancji z ciał ofiar jest związane ze specyficznym środowiskiem naturalnym (JURGENS i współaut. 2009). Większość gatunków roślin mięsożernych występuje w siedliskach oligotroficznych bądź dystroficznych, bezwapiennych i kwaśnych: na torfowiskach wysokich i przejściowych, piaskach, w szczelinach skał granitowych oraz piaskowców (ADLASSNIG i współaut. 2005, KRÓL i współaut. 2012). Charakterystyczną cechą roślin mięsożernych jest słabo wykształcony system korzeniowy (rosiczki Drosera, muchołówki Dionea, kapturnice, dzbaneczniki)

106 Menu roślin mięsożernych 637 lub nawet całkowity jego brak (aldrowanda Aldrovanda, część pływaczy Utricularia, żenlisea Genlisea) (ADLASSNIG i współaut. 2005, BREWER i współaut. 2011). Jedynie rosolistniki Drosophyllum i byblis Byblis występują na glebach okresowo suchych i są silniej przytwierdzone do podłoża (ADLASSNIG i współaut. 2005). Brak rozwiniętego systemu korzeniowego stanowi kolejną adaptację roślin mięsożernych do trudnych warunków środowiska (BREWER i współaut. 2011). Typowe rośliny mięsożerne są zdolne do trawienia ciał drobnych zwierząt takich jak owady i ich larwy, pająki, roztocza, oczliki, rozwielitki, ślimaki, żaby, a nawet małe ryby i drobne ssaki (PEROUTKA i współaut. 2008, PAVLOVIČ i współaut. 2011). Niektóre gatunki korzystają z katabolicznych zdolności mikroorganizmów zamieszkujących wnętrze pułapki i w ten sposób absorbują przygotowany im pożywny bulion (KRÓL i współaut. 2012). Należy jednak wziąć pod uwagę fakt, że w ogromnej większości rośliny zaliczane do mięsożernych wabią ofiarę do pułapki, w której następuje śmierć zwierzęcia, to promuje wzrost, rozwój i kwitnienie (ELLISON i FARNSWORTH 2005). MINERALNE ODŻYWIANIE ROŚLIN Skład pierwiastków wchodzących w skład każdego żywego organizmu decyduje o jego funkcjonowaniu, ze względu na specyficzną budowę poszczególnych pierwiastków oraz ich zdolność do tworzenia charakterystycznych wiązań chemicznych. Makro- i mikroelementy niezbędne do życia decydują o zachowaniu równowagi elektro-chemicznej komórek, uczestniczą jako kofaktory w reakcjach biochemicznych, a przede wszystkim, stanowią podstawowy budulec tkanek roślinnych (BAXTER 2009). Nauka zajmująca się badaniem znaczenia, regulacji i wzajemnych oddziaływań pierwiastków biogennych to jonomika (BAXTER 2009). W przyrodzie naturalnie występują 92 różne pierwiastki, ale jedynie kilkanaście spośród nich jest niezbędnych dla organizmów roślinnych do realizacji cyklu życiowego (MAATHUIS 2009). Termin mineralne odżywianie roślin dotyczy pobierania makro- i mikroelementów, transportu i dystrybucji oraz przemian w organizmie. Węgiel (C) (pierwiastek biogenny) absorbowany jest głównie w postaci CO 2 przez liście. Rośliny mięsożerne są zdolne do pobierania węgla również w postaci organicznej (z ciała schwytanej ofiary). To źródło węgla w niektórych przypadkach pokrywa nawet do kilkudziesięciu procent zapotrzebowania na ten pierwiastek (ADAMEC 1997). Typowe rośliny lądowe rozwinęły różne metody pozyskiwania składników mineralnych. Głównym organem odpowiedzialnym za pobieranie związków mineralnych takich jak np. azot (N) jest korzeń. U większości gatunków roślin pula zgromadzonego azotu, fosforu (P) i siarki (S) jest zbyt niska, by umożliwić normalny wzrost i rozwój dłużej niż przez kilka dni (GOJON i współaut. 2009). Stąd istnieje konieczność regularnego pobierania tych pierwiastków dla zapewnienia ich homeostazy w organizmie i prawidłowego przebiegu wszystkich procesów fizjologicznych. Azot jest pobierany przez rośliny głównie w formie jonów azotanowych (NO 3- ) i amonowych (NH 4+ ), a także w pewnym stopniu jako związki organiczne, np. aminokwasy (również amidy) czy mocznik. Jednakże stężenie najbardziej korzystnych energetycznie, zredukowanych form azotu (NH 4+, mocznik, aminokwasy czy peptydy) w standardowych warunkach w glebie jest niskie (RENTSCH i współaut. 2007, GOJON i współaut. 2009, KROUK i współaut. 2010). Pierwiastek ten jest niezbędny, ponieważ stanowi element budulcowy kwasów nukleinowych, białek (w tym enzymów), chlorofilu, regulatorów wzrostu i rozwoju, lipidów i nośników energii w postaci ATP (MAATHUIS 2009, ADAMCZYK i GO- DLEWSKI 2010). Dużą rolę w fizjologii roślin odgrywają NO 3-, pełniące funkcję cząsteczki sygnałowej, regulującej ekspresję genów, architekturę korzeni, wzrost liści, kiełkowanie nasion czy kwitnienie (KROUK i współaut. 2010). Bezpośrednie pobieranie aminokwasów (amidów) i peptydów z gleby możliwe jest dzięki występowaniu selektywnych transporterów zlokalizowanych w błonach komórkowych korzeni (RENTSCH i współaut. 2007). Jednakże rośliny przeważnie korzystają z pomocy symbiotycznych, mikorozowych grzybów glebowych rozkładających wysokocząsteczkowe peptydy na prostsze związki, które tylko w części są przyswajane przez grzyby, a reszta pozostaje do dyspozycji dla organizmów roślinnych. W warunkach bez-

107 638 URSZULA KRASUSKA i współaut. całkowitej biomasie rośliny u mięsożernych wynosi (w zależności od gatunku) od 3,4 do 23% (ADAMEC 1997). Płyn trawienny liści pułapkowych posiada odczyn kwaśny (w przypadku dzbaneczników od ph 5,5 do nawet poniżej 3,0), co sprzyja aktywności enzymów trawiennych. Aktywne zakwaszanie płynu jest związane z wydzielaniem protonów (H + ) przez komórki epidermy (ADLASSNIG i współaut. 2011). Wykazano, że dzbanecznik beczułkowaty (Nepenthes ampullaria) nie tylko wydziela H + ale również absorbuje protony w zależności od zmian ph płynu trawiennego (MO- RAN i współaut. 2010). Ilość pierwiastków pobieranych z ciał złapanych ofiar zależy od gatunku rośliny mięsożernej oraz środowiska, w którym występuje. Nie można zatem jednoznacznie stwierdzić, że substancje organicznego pochodzenia są najistotniejszym źródłem niezbędnych pierwiastków. Ważny wpływ na odżywianie mineralne roślin mięsożernych mają takie czynniki jak budowa organizmu (w tym rodzaj pułapki) i dostępność nieorganicznych związków w podłożu. Niektóre gatunki roślin mięsożernych traktują trawienie zwierząt jako dodatkową formę pozyskiwania składników mineralnych (kapturnice), inne są od tego bardziej zależne (tłustosze lub dzbaneczniki) (ADAMEC 1997). Lądowe rośliny mięsożerne zazwyczaj pobierają około 50% azotu i fosforu z ciał złapanych ofiar. W zależności od gatunku większość potasu, wapnia (Ca) oraz magnezu (Mg) jest pobierana z gleby. Z drugiej strony, wyniki badań prowadzonych na cefalotusie bukłakowatym (Cephalotus follicularis), heliamforze zwisłej (Heliamphora nutans) i kapturnicy purpurowej (Sarracenia purpurea) dotyczące pobierania składników mineralnych wykazały, że potas, żelazo (Fe) i mangan (Mn) są absorbowane przez pułapki (AD- LASSNIG i współaut. 2009). Wykazano, że powyżej 50% potasu rośliny pobierały właśnie z pułapki. Wyniki te tłumaczy fakt, że jest to pierwiastek trudno dostępny w środowisku bytowania roślin mięsożernych, ale bardzo ważny w przemianach metabolicznych (AD- LASSNIG i współaut. 2009). Gatunki wodne zaadoptowały się do niższych stężeń składników mineralnych, wyższych stężeń kwasów humusowych oraz tanin w środowisku. Odżywianie mineralne w tym przypadku dotyczy również absorpcji organicznego węgla, a co więcej, ofiary są jego bardzo ważnym źródłem (ADAMEC 1997). Generalnie stężenie azotu, fosforu i potasu w liściach roślin miętlenowych azot jest pobierany głównie w postaci NH 4 + (MAATHUIS 2009). Fosfor, który jest dosyć trudno dostępny dla roślin, jest pobierany przez korzenie w postaci jonów fosforanowych (PO 4 3 ) lub wodorofosforanowych (HPO 4 2 ) (GOJON i współaut. 2009). Podobnie jak azot, wchodzi on w skład ważnych biologicznie cząsteczek, takich jak kwasy nukleinowe, fosfolipidy, bierze udział w procesach przemiany energii (MAATHUIS 2009). Siarka jest pobierana z podłoża w postaci utlenionej (SO 4 2- ) oraz w niewielkich ilościach w postaci gazowej jako dwutlenek siarki (SO 2 ). W roślinach pierwiastek ten występuje głównie w formie zredukowanej w grupach sulfhydrylowych aminokwasów cysteiny (Cys) i metioniny (Met). W małych ilościach siarka w postaci utlenionej jest obecna w sulfolipidach, które wchodzą w skład błon komórkowych. Pierwiastek ten wpływa na kształtowanie struktury drugo- i trzeciorzędowej białek (MAATHUIS 2009). Potas występuje w tkankach wyłącznie w formie K +. Wpływa on na gospodarkę wodną komórek, jest aktywatorem wielu enzymów, zwiększa odporność roślin na szkodniki i choroby. Ponadto, bierze udział w syntezie białek i ich fosforylacji, w syntezie polisacharydów oraz transporcie cukrów (MAATHUIS 2009). MINERALNE ODŻYWIANIE ROŚLIN MIĘSOŻERNYCH U roślin mięsożernych, nastąpiła zdecydowana modyfikacja sposobu pozyskiwania pierwiastków. Duży udział w absorpcji makro- i mikroelementów mają wyspecjalizowane liście pułapkowe (ADAMEC 1997). Korzenie roślin mięsożernych mogą stanowić stały element organizmu bądź są wytwarzane tylko przez pewien okres w roku, jak ma to miejsce w przypadku rosiczek czy tłustoszy (ADLASSNIG i współaut. 2005). Powszechnie uważa się, że rośliny mięsożerne nie tworzą mikoryzy, z wyjątkiem roriduli, której mięsożerność nadal jest kwestionowana. Redukcja systemu korzeniowego szczególnie posunięta u pływaczy zaowocowała inwestycją w liście pułapkowe (ADLASSNIG i współaut. 2005, ADA- MEC 2010, SIROVÁ i współaut. 2010). Pływacze posiadają zmodyfikowane pędy pozbawione barwników, które mogą wrastać w podłoże i w ten sposób zastępować korzenie. Ponadto takie bezbarwne pędy uczestniczą w pobieraniu składników mineralnych (ADLASSNIG i współaut. 2005). Udział masy korzenia w

108 Menu roślin mięsożernych 639 sożernych jest niższe w porównaniu do liści roślin nie mięsożernych (ELLISON 2006), co prawdopodobnie wynika z warunków środowiskowych w jakich występują. WPŁYW WIELKOŚCI I RODZAJU POKARMU ROŚLINY MIĘSOŻERNEJ NA ABSORPCJĘ PIERWIASTKÓW MINERALNYCH Rozmiar ofiary wpływa na zdolność do absorpcji pierwiastków. Im jest ona mniejsza i ma delikatniejszy chitynowy pancerzyk, tym łatwiej roślinie wydobyć z niej potrzebne substancje odżywcze; np. rosiczka trawiąc muchę przyswaja z niej mniej substancji odżywczych niż z komara (ADAMEC 2002). Skuteczność przyswajania pierwiastków przez rośliny posiadające nieosłonięte pułapki lub ich części związane z absorpcją, może być osłabiona przez warunki atmosferyczne. Dla przykładu obfity deszcz może spłukać z pułapki złapane owady przed ich całkowitym wykorzystaniem (ADLASSNIG i współaut. 2011). W celu ustalenia zdolności do absorbowania pierwiastków takich jak azot, fosfor, potas i magnez z ciał owadów przez liście pułapkowe rosiczki przylądkowej (Drosera capensis) i rosiczki włosowatej (D. capillaris), dostarczano im określone ofiary: muszki owocowe (Drosophila melanogaster) oraz komary brzęczące (Culex pipiens). Badania prowadzone były w warunkach optymalnych dla wzrostu roślin mięsożernych. Dodatkowo zabezpieczano rośliny przed niekontrolowanym połowem owadów. Umieszczone na liściach pułapkowych muszki badano po 15 dniach trawienia, natomiast komary po 22 dniach, w celu oznaczenia pierwiastków pobranych przez roślinę. Jako wzorzec wykorzystano nienaruszone owady (ADAMEC 2002). Wyniki tych doświadczeń wykazały, że poszczególne pierwiastki były pobierane przez rośliny z różną intensywnością: azot w granicach 43 62%, fosfor 61 97%, potas 60-96% oraz magnez 57 92%. Wapń przyswajany był przez rosiczki jedynie wówczas, gdy pokarm stanowiły komary (ADAMEC 2002). Przy użyciu tych samych metod analitycznych zbadano zdolność do pobierania składników mineralnych z ciał owadów przez rośliny, które nie do końca spełniają wszystkie kryteria typowej mięsożerności, roridulę (Roridula gorgonias) oraz rosolistnika portugalskiego (Drosophyllum lusitanicum). Oba gatunki wydzielają lepką ciecz przez gruczoły znajdujące się na zmodyfikowanych anatomicznie liściach i łodygach. Absorpcja pierwiastków z muszek owocowych wynosiła: dla azotu 33 47%, dla fosforu 62 75%, dla magnezu 33 39%. Wyniki tych badań wykazały, że owady stanowią istotne źródło związków nieorganicznych (PŁACHNO i współaut. 2009). WPŁYW WIEKU PUŁAPKI NA POBIERANIE ZWIĄZKÓW MINERALNYCH Z CIAŁA OFIARY Pobieranie pierwiastków przez rośliny mięsożerne zależy również od wieku i miejsca usytuowania pułapki na samej roślinie. W przypadku dzbanecznika przedziwnego (Nepenthes mirabilis), który jest pnączem o nieco dłuższych dzbankach górnych w stosunku do dolnych, zawartość azotu (oznaczanego w postaci izotopu 15 N) pochodzącego z ciał owadów wzrastała w tkankach wraz ze wzrostem pozycji liścia pułapkowego na pędach odroślowych. Ponadto w tym przypadku obserwuje się zależność wieku pułapki od pozycji na roślinie: młodsze liście pułapkowe znajdują się wyżej na danym pędzie odroślowym rośliny. Stwierdzono, że młodsze pułapki pobierają azot pochodzący wyłącznie z owadów złapanych przez dowolny dzbanek rośliny. Starsze dzbanki (usytuowane niżej) pobierają ten pierwiastek z gleby lub korzystają z azotu atmosferycznego, asymilowanego przez mikroorganizmy zasiedlające pułapkę (SCHULZE i współaut. 1997). Na przykładzie cefalotusa bukłakowatego zbadano zależność pomiędzy wiekiem i wielkością osobnika a sposobem pobierania azotu. Uzyskane wyniki sugerują, że rośliny tego gatunku przed osiągnięciem dużych rozmiarów i wytworzeniem pułapek pobierają azot wyłącznie z gleby (SCHULZE i współaut. 1997). Ponadto wykazano, że na późniejszych etapach rozwoju azot pozyskiwany z ciał owadów stanowił jedynie dodatkowe źródło tego pierwiastka wspomagające szybszy wzrost i osiągnięcie fazy generatywnej oraz stymulujące produkcję nasion. Cefalotusy muszą zatem korzystać z azotu nieorganicznego, aby osiągnąć odpowiednią wielkość i możliwość łapania ofiary. Zdolność do pobierania różnych form azotu zależy również od gatunku rośliny. U darlingtonii kalifornijskiej (Darlingtonia californica) wiek liści pułapkowych nie wpływa na pobieranie azotu z ciał owadów (SCHULZE i współaut. 1997). ZASOBNOŚĆ ŚRODOWISKA W SKŁADNIKI MINERALNE A MIĘSOŻERNOŚĆ ROŚLIN Uważa się, że rośliny mięsożerne powinny być zupełnie zależne od łapania ofiar w

109 640 URSZULA KRASUSKA i współaut. przypadku, kiedy ich korzenie mają bardzo ograniczony dostęp do składników mineralnych (ZAMORA i współaut. 1997). Przeprowadzono eksperyment na tłustoszu wallisneriolistnym (Pinguicula vallisneriifolia), który występuje w górach na kamienistym podłożu, co w znaczący sposób ogranicza możliwość pobierania związków mineralnych za pomocą korzeni. Okazało się, że osobniki, które skutecznie łapały owady, bądź były im one dostarczane, rosły, rozmnażały się wegetatywnie i generatywnie szybciej niż te, które uprawiano na pożywce zawierającej komplet składników mineralnych (ELLISON 2006). Oznacza to, że mięsożerność u tego gatunku jest głównym sposobem pozyskiwania pierwiastków, niezależnie od ich obecności w podłożu. Ponadto wyniki podobnych badań prowadzonych na rosiczce Whittakera (Drosera whittakeri) oraz rosiczce dwudzielnej (D. binata) dowiodły, że w przypadku tych gatunków dodanie nieorganicznego azotu do podłoża wręcz hamuje ich wzrost (ELLISON 2006). Tego typu różnice wynikają z odmiennych rozwiązań adaptacyjnych do środowiska życia. Z drugiej strony, nie wszystkie gatunki roślin mięsożernych negatywnie reagują na dodatkowe wprowadzanie składników mineralnych do podłoża. W przypadku żenlisei fioletowej (Genlisea violacea) wzbogacenie gleby w azot, fosfor, magnez, wapń i żelazo powodowało w czasie trwania eksperymentu dwukrotnie większy przyrost biomasy w stosunku do obserwowanego u nienawożonych roślin kontrolnych (ADAMEC 2008b). Ponadto rośliny z gleb nawożonych posiadały większą ilość pułapek i liści niezmodyfikowanych (ADAMEC 2008b). Badania te potwierdzają gatunkowe różnice w przypadku całkowitego uzależnienia roślin mięsożernych od pobierania składników mineralnych z ciał złapanych ofiar. Na przykładzie czterech lądowych gatunków roślin mięsożernych: tłustosza alpejskiego (Pinguicula alpina), tłustosza kosmatego (P. villosa), tłustosza pospolitego (P. vulgaris) i rosiczki okrągłolistnej (Drosera rotundifolia) wykazano zmiany w asymilacji azotu w zależności od warunków otoczenia oraz jego dystrybucję do pąków spoczynkowych (łac. hibernacula) i organów reprodukcyjnych (HANSLIN i KARLSSON 1996). W trakcie eksperymentu część roślin rosła w warunkach dla nich naturalnych, a część w szklarni. Wszystkim roślinom podawano ofiary znakowane izotopem 15 N. Osobniki uprawia- ne w szklarni pobierały większe ilości azotu (40 50%) w stosunku do roślin znajdujących się w warunkach naturalnych (30 40%). W przypadku tłustosza pospolitego rosnącego w warunkach naturalnych ilość przyswajanego azotu sięgała około 41%, podczas gdy pozostałe gatunki roślin absorbowały ten pierwiastek tylko w około 30%. Takie różnice w pobieraniu azotu w zależności od warunków zewnętrznych najprawdopodobniej mają związek z tym, że w szklarni rośliny są osłonięte przed opadami atmosferycznymi oraz mają zapewnioną wyższą temperaturę (HANSLIN i KARLSSON 1996). Ponadto wykazano, że u osobników nie kwitnących azot pobierany z ciała ofiary kierowany był do pąków spoczynkowych (58 97%), natomiast u osobników kwitnących zarówno do pąków spoczynkowych (34 71%), jak i do organów reprodukcyjnych (17 43%) (HANSLIN i KARLS- SON 1996). Wodne gatunki roślin mięsożernych występują przeważnie w środowisku ubogim w łatwo przyswajalne składniki mineralne, które pobierają przez pęd z otoczenia lub z ciał złapanych ofiar. Ważną ekofizjologiczną adaptacją szybko rosnących gatunków pływaczy jest łatwa reutylizacja pierwiastków ze starzejących się organów (ADAMEC 2008a). Na przykładzie pływacza zachodniego (Urticularia australis) zbadano wpływ żyzności zbiornika wodnego (oligotroficzny, eutroficzny, mezotroficzny oraz dystroficzny) na zawartość azotu, fosforu, potasu, sodu oraz wapnia w pędzie tej rośliny (ADAMEC 2008a). Wykazano, że nawet w zbiornikach silnie oligotroficznych, przy małej ilości złapanych ofiar, zawartość azotu i fosforu w pędzie rośliny była powyżej wartości limitującej wzrost. Ponadto, ze starzejących się organów rośliny reutylizowały azot w około 57% i fosfor w 81%, ale traciły cały potas, sód, wapń i magnez. Stężenie potasu i fosforu w pułapkach było wyższe niż w liściach. Kluczowym endogennym czynnikiem regulującym wytwarzanie pułapek okazało się stężenie azotu w pędzie rośliny (ADAMEC 2008a). Regulacja ta ma charakter pętli sprzężenia zwrotnego spadek zawartości azotu w pędzie stymuluje wytwarzanie pułapek, co pozwala na złapanie większej ilości ofiar. Korelacja pomiędzy zawartością składników mineralnych w tkance a środowiskiem wodnym oraz liczbą pęcherzyków łownych zawierających ofiarę świadczy, że azot i fosfor zawarte w pędzie nie zależą od stężenia tych pierwiastków w wodzie, a jedynie od udanego polowania na

110 Menu roślin mięsożernych 641 ofiarę (ADAMEC 2008a). Węgiel jest absorbowany przez pływacza głównie z wolnego CO 2. Wyniki badań wykazały, że jego stężenie jest ponadto czynnikiem limitującym wzrost rośliny. Węgiel w postaci organicznej może być pobierany, ale jedynie w niewielkim stopniu (ADAMEC 2008a). Co ciekawe, to właśnie pływacze wydzielają zasymilowany węgiel do pułapki, w której znajduje się specyficzne środowisko mikroorganizmów symbiotycznych. Wydzielanie to jest analogiczne do aktywności wydzielniczej korzeni roślin nie będących mięsożernymi (SIROVÁ i współaut. 2010). MIĘSOŻERNI WEGETARIANIE Większość badań związanych z roślinami mięsożernymi skupia się na ich zdolności do pobierania składników mineralnych pochodzenia zwierzęcego. Jednakże w literaturze można spotkać pewne doniesienia związane z pozyskiwaniem makro- i mikroelementów z glonów eukariotycznych oraz roślin bądź ich fragmentów. W przypadku wodnych gatunków pływaczy, takich jak pływacz zwyczajny, pływacz zachodni, pływacz drobny (Utricularia minor) czy pływacz Brema (U. bremii), zanalizowano zawartość pułapek i okazało się, że nawet do ponad 80% schwytanych ofiar stanowią glony eukariotyczne, głównie protisty (z przewagą euglenin), które ulegają strawieniu i stanowią źródło pokarmu pływaczy (PEROUTKA i współaut. 2008). Autorzy przedstawili również zależność pomiędzy procentową zawartością glonów w pułapkach pływaczy a przewodnictwem elektrolitycznym wody w zbiorniku. Jeżeli woda jest uboga w jony wzrasta liczba chwytanych glonów. Jednakże podawanie okazom z gatunku pływacz zawilgocony (U. uliginosa) pokarmu tylko w postaci klejnotek (Euglena sp.) hamowało wzrost. Z drugiej strony, karmienie tych roślin pokarmem mieszanym (eugleniny i zwierzęta) skutkowało znacznym przyrostem biomasy (JOBSON i współaut. 2000). W przypadku dzbanecznika beczułkowatego wyniki badań z wykorzystaniem izotopów N dowiodły, że roślina ta korzysta z martwych części roślin, które wpadły do dzbanka. Ponadto wykazano, że nawet około 35% zaabsorbowanego azotu jest pochodzenia roślinnego (MORAN i współaut. 2003). Ten specyficzny dla roślin mięsożernych sposób pozyskiwania składników mineralnych stymuluje fotosyntezę i wzrost (PAVLOVIČ i współaut. 2011). ENZYMY SOKU TRAWIENNEGO ROŚLIN MIĘSOŻERNYCH Już za czasów Darwina udowodniono obecność enzymów proteolitycznych w soku trawiennym roślin mięsożernych (MITHÖFER 2011). Obecnie wiadomo, że do enzymów ułatwiających absorpcję składników mineralnych z ciał złapanych ofiar poza proteazami należą również: nukleazy, rybonukleazy, fosfatazy kwaśne i alkaliczne, fosfoamidazy, esterazy, amylazy, chitynazy i lipazy (MITHÖFER 2011, MOROHOSHI i współaut. 2011, ROTTLOFF i współaut. 2011). Jednakże trzeba zaznaczyć, że wiele gatunków roślin mięsożernych, które wykształcają pułapki pasywne w kształcie dzbanka, współżyje ze specyficznymi organizmami symbiotycznymi, których zadaniem jest trawienie martwych ciał ofiar (MITHÖFER 2011, MOROHOSHI i współaut. 2011, KRÓL i współaut. 2012). Do organizmów tych należą bakterie, grzyby, glony, nicienie i larwy owadów (KOOPMAN i współaut. 2010, KRÓL i współaut. 2012). Warto też dodać, że w pułapkach dzbaneczników czy kapturnic rozwijają się unikatowe mikroorganizmy, które posiadają specyficzne geny kodujące białka umożliwiające trawienie zdobyczy (KOOPMAN i współaut. 2010, MOROHOSHI i współaut. 2011). U dzbaneczników i cefalotusów niedojrzałe, zamknięte jeszcze pułapki wypełnia płyn trawienny. W przypadku dojrzałych dzbaneczników ilość płynu może przekraczać nawet 1 litr (ADLASSNIG i współaut. 2011). LIPAZY Lipazy (EC ) to enzymy katalizujące reakcję hydrolizy nierozpuszczalnych w wodzie triacylogliceroli (TÖKÉS i współaut. 1974, MOROHOSHI i współaut. 2011). Badania aktywności katalitycznej lipaz przeprowadzono z wykorzystaniem wydzieliny pobranej z nieotwartego dzbanka dzbanecznika Macfer-

111 642 URSZULA KRASUSKA i współaut. lana (Nepenthes macferlanei), którą inkubowano z trzema substratami: glicerolem trioleinowym, tripalmitynowym oraz lecytyną. W wyniku trawienia trioleinianu w ph 6,0 oraz ph 2,6 powstały produkty rozkładu: kwas oleinowy i dioleinian. Lecytyna również uległa hydrolizie do diglicerydów, co stanowi dowód na aktywność fosfatazy D. Jednak na podstawie uzyskanych wyników nie można jednoznacznie stwierdzić, że lipazy występujące w wydzielinie trawiennej są specyficzne względem nienasyconych kwasów tłuszczowych. Prawdopodobnie pełnią one dużą rolę w niszczeniu błon komórkowych, co z kolei sprzyja uwalnianiu białek z komórek ofiar (TÖKÉS i współaut. 1974). AMYLAZY Amylazy (EC 3.2.1) to enzymy hydrolityczne, które katalizują reakcje rozkładu wielocukrów. Zbadanie ich aktywności w wydzielinie trawiennej roślin mięsożernych przeprowadzono poprzez oznaczenie cukrów redukujących metodą Samogyi. Jako substratu użyto glikogenu wyizolowanego z ostryg, który inkubowano z wydzieliną dzbanecznika Macferlana. Nie wykryto znaczącej aktywności amylolitycznej w kwaśnym ph, charakterystycznym dla wnętrza pułapki. Jedynie znikomą aktywność zarejestrowano dla środowiska obojętnego (TÖKÉS i współaut. 1974). Wyniki tych badań mogą wskazywać albo na niewielką zawartość amylazy w wydzielinie trawiennej lub na małe znaczenie tego enzymu dla odżywiania mineralnego roślin mięsożernych. GLUKOZYDAZY Aktywność -glukozydazy (EC ) i -glukozydazy (EC ), (enzymów rozcinających wiązania pomiędzy cząsteczkami glukozy) oraz -heksozaminidazy (EC ), która rozkłada łańcuchy oligosacharydów badano u czterech gatunków wodnych roślin mięsożernych: pływacza złotego (Utricularia aurea), pływacza skąponasiennego (U. foliosa), pływacza zachodniego oraz pływacza zwyczajnego (SIROVÁ i współaut. 2003). Stosunkowo wysoką aktywność w pustych pułapkach stwierdzono tylko dla -glukozydazy (1,35 2,95 μmol produktu l 1 h 1 ), dla pozostałych enzymów aktywność okazała się o jeden lub nawet dwa rzędy niższa, a zatem właściwie bez znaczenia dla rośliny. Znikoma aktywność enzymów hydrolizujących cukry złożone świadczy o niewielkim wykorzystaniu tych związków pokarmowych z ciał ofiar. Jest to oczywiste, ponieważ rośliny mięsożerne są w stanie syntetyzować cukry w procesie fotosyntezy (SIROVÁ i współaut. 2003). CHITYNAZY Chitynazy (EC ) katalizują hydrolizę wiązań -1,4-glikozydowych w chitynie, która jest polimerem N-acetylo-D-glukozoaminy występującym w ciele ofiar roślin mięsożernych. Chitynazy dzieli się na dwie grupy. Endochitynazy przecinają polimer w środku łańcucha polisacharydowego, natomiast egzochitynazy na jego końcach (LIBANTOVA i współaut. 2009). Chitynazy występują w tkankach roślin i mogą być wydzielane przez komórki do apoplastu, jak i gromadzone w wakuoli (BYCZKOWSKI i współaut. 2009). Prawdopodobnie enzymy te biorą udział w reakcjach obronnych roślin na infekcje patogenne. Chityna jest również głównym związkiem, z którego zbudowane są szkielety zewnętrzne stawonogów (SUN i współaut. 2010). Wyniki badań przeprowadzonych na rosiczce okrągłolistnej wykazały, że aktywność chitynazy w poszczególnych częściach rośliny nie jest taka sama największa w korzeniach i kwiatach, natomiast najmniejsza w łodydze i liściach (LIBANTOVA i współaut. 2009). Większe znaczenie hydrolityczne chitynaza może mieć w przypadku dzbaneczników, podczas trawienia owadów. Aktywność endochitynazy w dzbankach zależy od gatunku rośliny, w niektórych przypadkach jest ona wysoka jak np. u dzbanecznika Thorela (Nepenthes thorelli) (ROTTLOFF i współaut. 2011). PROTEAZY I FOSFATAZY Trawienie białek umożliwiają enzymy proteolityczne (EC 3.4), które rozcinają wiązania peptydowe, łączące poszczególne aminokwasy. Analiza aktywności proteaz nie jest prosta, ponieważ enzymy te są wydzielane przez gruczoły trawienne w niewielkich ilościach. Ponadto w cieczy trawiennej pułapki mogą znajdować się enzymy proteolityczne obcego pochodzenia. Badania nad enzymami proteolitycznymi roślin mięsożernych związane były z pobieraniem wydzieliny trawiennej z nieotwartych jeszcze dzbanków dwudziestu gatunków dzbaneczników. Z analizowanej cieczy otrzymano frakcję wykazującą aktywność proteolityczną. Z frakcji tej wyizolowano enzym nazwany nepentensyną

112 Menu roślin mięsożernych 643 (JENTSCH 1972). Jednakże badania aktywności proteolitycznej cieczy trawiennej dzbanków zamkniętych są obarczone pewnym błędem, ponieważ odczyn ph płynu zamkniętego dzbanka wynosi 3,0 4,5 i jest nieco wyższy niż w dorosłych (otwartych), przygotowanych do łapania ofiar (ph 2,1 2,8). Spostrzeżenia te potwierdzono w przypadku dzbanecznika Macferlana. Po izolacji enzymów wykazano specyficzność działania enzymu proteolitycznego w stosunku do wiązania peptydowego. Okazało się, że jest ona analogiczna do tej, jaką wykazuje pepsyna ssaków (TÖKÉS i współaut. 1974). Podobnie inkubacja utlenionego łańcucha bydlęcej insuliny z płynem trawiennym pobranym z liścia pułapkowego dzbanecznika oskrzydlonego (Nepenthes alata) spowodowała uzyskanie zhydrolizowanych peptydów (AN i współaut. 2002b). Wyniki kolejnych badań prowadzonych na tym samym gatunku dzbanecznika wykazały, że pojawienie się ofiary w młodej, nowo otwartej pułapce powoduje spadek odczynu płynu trawiennego do ph 2,8 w ciągu 5 dni (AN i współaut. 2002b). Oznacza to, że musi istnieć mechanizm przystosowujący stężenie jonów wodorowych do pojawienia się obcego białka w wydzielinie. Ponadto, dodając do cieczy trawiennej pepstatynę A (silny inhibitor proteinazy asparaginowej) potwierdzono obecność tego enzymu w płynie trawiennym dzbanka. Uzyskane wyniki świadczą o utylizowaniu zwierzęcych białek w celu wykorzystania ich jako źródła azotu. Dodatkowo analiza ekspresji genów kodujących proteinazę asparaginową wykazała synchronizację pro- dukcji enzymu z obecnością ofiary w pułapce (AN i współaut. 2002a). Z drugiej strony, aktywność aminopeptydaz w przypadku pływaczy była znikoma. Minimalna obecność tego enzymu w pułapkach może być tłumaczona zanieczyszczeniem enzymami obecnymi w wodzie. Wykryto jednak wysoką aktywność kwaśnej fosfatazy (EC ), która bierze udział w procesach defosforylacji estrów fosforanowych (SIROVÁ i współaut. 2003). Dodatkowo, aktywność tego enzymu okazała się powszechna dla roślin mięsożernych, które w ten sposób są zdolne do przyswajania fosforu z ciał ofiar (PŁACHNO i współaut. 2006). RYBONUKLEAZY Wyniki badań przeprowadzonych na wydzielinie trawiennej rosiczki Adeli (Drosera adelae) wykazały obecność specyficznej rybonukleazy, czyli białka katalizującego reakcję rozkładu cząsteczki kwasu rybonukleinowego (RNA) na krótsze łańcuchy lub pojedyncze nukleotydy poprzez hydrolizę wiązań fosfodiestrowych (OKABE i współaut. 2005). Enzym sklasyfikowano jako RNazę DA-1 (EC 3.1). Homopolirybonukleotydy poddane jej działaniu ulegały strawieniu, za wyjątkiem sekwencji poli(c). Aktywność wykrytego enzymu była wysoka w kwaśnym ph, natomiast bliska zeru w zasadowym, przy czym odczyn ph płynu wydzielanego przez roślinę wynosi od 4,3 do 4,4. Mięsożerne rośliny produkują ten enzym prawdopodobnie w celu pozyskania fosforu z kwasów rybonukleinowych złapanych zwierząt (OKABE i współaut. 2005). PODSUMOWANIE Od czasów Karola Darwina, który zapoczątkował badania roślin zjadających zwierzęta, nasza wiedza na temat pokarmu mięsożernych autotrofów znacznie się poszerzyła. Dokładniej poznano menu tych organizmów. Na liście przysmaków znalazły się nie tylko owady, drobne mięczaki, małe ssaki, lecz także szczątki innych roślin i odchody zwierząt. Niektóre rośliny mięsożerne nie trawią samodzielnie zdobytego pokarmu, ale absorbują składniki mineralne z pożywnego bulionu przygotowanego przez mikroorganizmy symbiotyczne. Pozwoliło to, na wprowadzenie podziału tej grupy roślin na typowo mięsożerne i pseudomięsożerne (w tym detrytusożerne/koprofagi). Pozornie odwrócony porządek natury wymagał wykształcenia przez rośliny nie tylko mechanizmów łapania ofiary, ale także biochemicznej maszynerii pozwalającej na strawienie pokarmu i pozyskanie z ciał ofiar niezbędnych do życia składników mineralnych. Zewnętrzne żołądki roślin mięsożernych, pod pewnymi względami, niewiele różnią się od układu pokarmowego zwierząt. W wypełniającej je cieczy trawiennej występują podstawowe enzymy odpowiadające za rozkład białek, wielocukrów, kwasów nukleinowych, a nawet tłuszczów. Jednak, mimo intensywnie prowadzonych badań, wiedza związana z izola-

113 644 URSZULA KRASUSKA i współaut. cją i identyfikacją poszczególnych związków ułatwiających absorpcję składników mineralnych jest nadal fragmentaryczna. Niewiele wiadomo też, na temat molekularnych mechanizmów kontroli syntezy tych związków w samych roślinach, jak i u symbiotycznych mikroorganizmów zasiedlających pułapki. Zastosowanie w badaniach roślin mięsożernych coraz bardziej wyrafinowanych metod analitycznych pozwoliło na odsłonięcie licznych podobieństw pomiędzy roślinami i zwierzętami przy jednoczesnym podkreśleniu różnic jakie dzielą te dwa współzależne i współistniejące światy. Biorąc pod uwagę, postępujące zmiany klimatyczne, prowadzące do zmniejszania się areału zajmowanego przez naturalne środowiska roślin mięsożernych, istnieje potrzeba poznania upodobań dietetycznych tych organizmów w celu zapewnienia im szansy przetrwania np. na obszarach chronionych lub w ogrodach botanicznych. Chociaż uprawa roślin mięsożernych nie jest łatwa, dostarcza jednak satysfakcji estetycznych. Może ponadto, przynosić wymierne korzyści w postaci żywych lepów na muchy. Obiecujące, mogłoby być także wykorzystanie przez człowieka substancji trawiennych wytwarzanych przez rośliny mięsożerne i/lub mikroorganizmy symbiotyczne występujące w pułapkach. MENU ROŚLIN MIĘSOŻERNYCH Streszczenie Rośliny mięsożerne to organizmy autotroficzne wabiące i chwytające zwierzęta za pomocą specyficznych liści pułapkowych, można więc powiedzieć, że to rośliny odżywiające się pokarmem zwierzęcym. Mięsożerność w świecie roślin stanowi ciekawy przykład zdolności adaptacyjnych. Brak łatwo dostępnych składników mineralnych w środowisku naturalnym spowodował, że w toku ewolucji rośliny te wykształciły szereg mechanizmów umożliwiających im zdobywanie pierwiastków biogennych w sposób alternatywny do pobierania ich z roztworu glebowego. Wyniki badań prowadzonych od ponad 100 lat wskazują, że rośliny mięsożerne absorbują z ciał złapanych ofiar nie tylko azot, ale również m.in. fosfor i węgiel. Przyswajanie składników mineralnych jest możliwe dzięki obecności w pułapkach cieczy trawiennej, zawierającej enzymy odpowiadające za degradację białek, kwasów nukleinowych, cukrów, a nawet lipidów. Z uwagi na różny rodzaj pokarmu, sposób jego pozyskiwania i dalszej obróbki, można wśród roślin mięsożernych wyróżnić rośliny mięsożerne sensu stricto, pseudomięsożerne i rośliny detrytusożerne/koprofagi. W niniejszej pracy omówiono zagadnienia mineralnego odżywiania roślin mięsożernych, ze szczególnym uwzględnieniem preferowanej przez nie diety. MENU OF CARNIVOROUS PLANTS Summary Carnivory is a interesting example of plant adaptation to the environment deprived in mineral nutrients, especially nitrogen. Carnivorous plants derive some or most of their nutrients from trapping and consuming animals (mainly insects), instead of taking them from the soil. The results of experiments started in the past (even more than 100 years ago) on menu of carnivorous plants demonstrated that not only nitrogen but also phosphorous or carbon may be absorbed from trapped victims. Carnivorous plants are subdivided into those with passive traps and those with active traps. For some of these traps the actual method of insect decomposition involves digestive enzymes produced by the plant and bacterial decay within the trap. The composition of digestive fluid is still controversial, although activities of typical enzymes that can hydrolyze carbohydrates, nucleic acids, proteins and even lipids were found in the solution. Depending on the manner of nutrition e.g. a variety of victims, the group of carnivorous plants may be divided into carnivorous sensu stricto, pseudocarnivores and detritivores/coprophages. The aim of this review was to clarify current knowledge on mineral nutrition of carnivorous plants in relation to their favor diet. LITERATURA ADAMCZYK B., GODLEWSKI M., Różnorodność strategii pozyskiwania azotu przez rośliny. Kosmos 59, ADAMEC L., Mineral nutrition of carnivorous plants a review. Bot. Rev. 63, ADAMEC L., Leaf absorption of mineral nutrients in carnivorous plants stimulates root nutrient uptake. New Phytol. 155, ADAMEC L., 2008a. Mineral nutrient relations in the aquatic carnivorous plant Utricularia australis and its investment in carnivory. Arch. Hydrobiol. 3,

114 Menu roślin mięsożernych 645 ADAMEC L., 2008b. Soil fertilization enhances growth of the carnivorous plant Genlisea violacea. Biologia 2, ADAMEC L., Mineral cost of carnivory in aquatic carnivorous plants. Flora 205, ADLASSNIG W., PEROUTKA M., LAMBERS H., LICHTSCHEIDL I. K., The roots of carnivorous plants. Plant Soil 274, ADLASSNIG W., STEINHAUSER G., PEROUTKA M., MUSILEK A., STERBA J. H., LICHTSCHEIDL I. K., BICHLER M., Expanding the menu for carnivorous plants: Uptake of potassium, iron and manganese by carnivorous pitcher plants. Appl. Radiat. Isotop. 67, ADLASSNIG W., PEROUTKA M., LENDL T., Traps of carnivorous pitcher plants as a habitat: composition of the fluid, biodiversity and mutualistic activities. Ann. Bot. 107, AN C.-I., FUKUSAKI E., KOBAYASHI A., 2002a. Aspartic proteinases are expressed in pitchers of the carnivorous plant Nepenthes alata Blanco. Planta 214, AN C.-I., TAKEKAWA S., OKAZAWA A., FUKUSAKI E., KO- BAYASHI A., 2002b. Degradation of a peptide in pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes alata Blanco. Planta 215, BAXTER I., Ionomics: studying the social network of mineral nutrients. Curr. Opin. Plant Biol. 12, BREWER J. S., BAKER D. J., NERO A. S., PATTERSON A. L., ROBERTS R. S, TURNER L. M., Carnivory in plants as a beneficial trait in wetlands. Aquat. Bot. 94, BYCZKOWSKI B., MACIOSZEK V. K., KONONOWICZ A. K., Roślinne białka PR w odpowiedzi obronnej na atak grzybów neurotroficznych. Post. Biol. Kom. 36, CLARKE C. M., BAUER U., LEE C. C., TUEN A., REMBOLD K., MORAN J. A., Tree shrew lavatories: a novel nitrogen sequestration strategy in a tropical pitcher plant. Biol. Lett 5, CLARKE C., MORAN J. A., LEE C. C., Nepenthes baramensis (Nepenthaceae) a new species from north-western Borneo. Blumea 56, DARWIN C., Insectivorous plants. John Murray, London. ELLISON A. M., Nutrient limitation and stoichiometry of carnivorous plants. Plant Biol. 8, ELLISON A. M., FARNSWORTH E. J., The cost of carnivory for Darlingtonia californica (Sarraceniaceae): evidence from relationships among leaf traits. Am. J. Bot. 92, ELLISON A. M., GOTELLI N. J., Energetics and the evolution of carnivorous plants Darwin s most wonderful plants in the world. J. Exp. Bot. 60, GOJON A., NACRY P., DAVIDIAN J.-C., Root uptake regulation: a central process for NPS homeostasis in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 12, HANSLIN H. M., KARLSSON P. S., Nitrogen uptake from prey and substrate as affected by prey capture level and plant reproductive status in four carnivorous plant species. Oecologia 106, JENTSCH J., Enzymes from carnivorous plants (Nepenthes). FEBS Lett. 3, JOBSON R.W., MORRIS E.C., BURGIN S., Carnivory and nitrogen supply affect the growth of the bladderwort Utricularia uliginosa. Aust. J. Bot. 48, JURGENS A., EL-SAYED A. M., SUCKLING D. M., Do carnivorous plants use volatiles for attracting prey insects? Functional Ecol. 23, KOOPMAN M. M., FUSELIER D. M., HIRD S., CARSTENS B. C., The carnivorous pale pitcher plant harbors diverse, distinct and time-dependent bacterial communities. Appl. Environ. Microbiol. 76, KROUK G., CRAWFORD N. M., CORUZZI G. M, TSAY Y.- F., Nitrate signaling: adaptation to fluctuating environments. Curr. Opin. Plant Biol. 13, KRÓL E., PŁACHNO B. J., ADAMEC L., STOLARZ M., DZIUBIŃSKA M., TRĘBACZ K., Quite a few reasons for calling carnivores the most wonderful plants in the world. Ann. Bot. 109, LIBANTOVA J., KAMARAINEN T., MORAVCIKOVA J., MATU- SIKOVA I., SALAJ J., Detection of chitinolytic enzymes with different substrate specificity in tissues of intact sundew (Drosera rotundifolia L.). Mol. Biol. Rep. 36, MAATHUIS F. J. M., Physiological functions of mineral macronutrients. Curr. Opin. Plant Biol. 12, MITHÖFER A., Carnivorous pitcher plants: insights in an old topic. Phytochemistry 72, MORAN J. A., CLARKE C. M., HAWKINS B. J., From carnivore to detritivore? Isotopic evidence for leaf litter utilization by the tropical pitcher plant Nepenthes ampullaria. Int. J. Plant Sci. 164, MORAN J. A., HAWKINS B. J., GOWEN B. E., ROBBINS S. L., Ion fluxes across the pitcher walls of three Bornean Nepenthes pitcher plant species: flux rates and gland distribution patterns reflect nitrogen sequestration strategies. J. Exp. Bot. 61, MOROHOSHI T., OIKAWA M., SATO S., KIKUCHI N., KATO N., IKEDA T., Isolation and characterization of novel lipases from a metagenomic library of the microbial community in the pitcher fluid of the carnivorous plant Nepenthes hybrida. J. Biosci. Bioeng. 112, OKABE T., IWAKIRI Y., MORI H., OGAWA T., OHYAMA T., An S-like ribonuclease gene is used to generate a trap-leaf enzyme in the carnivorous plant Drosera adelae. FEBS Lett. 579, PAVLOVIČ A., SLOVÁKOVÁ L., ŠANTRŮČEK J., Nutritional benefit from leaf litter utilization in the pitcher plant Nepenthes ampullaria. Plant Cell Environ. 34, PEROUTKA M., ADLASSNIG W., VOLGGER M., LENDL T., URL W. G., LICHTSCHEIDL I. K., Utricularia: a vegetarian carnivorous plant? Algae as prey of bladderwort in oligotrophic bogs. Plant Ecol. 199, PŁACHNO B. J., ADAMEC L., LICHTSCHEIDL I. K., PER- OUTKA M., ADLASSNIG W., VRBA J., Fluorescence labelling of phosphatase activity in digestive glands of carnivorous plants. Plant Biol. 8, PŁACHNO B. J., ADAMEC L., HUET H., Mineral nutrientnt uptake from prey and glandular phosphatase activity as a dual test of carnivory in semi-desert plants with glandular leaves suspected of carnivory. Ann. Bot. 104, PODBIELKOWSKI Z., SUDNIK-WÓJCIKOWSKA B., Rośliny mięsożerne zwane też owadożernymi. Multico Oficyna Wydawnicza, Warszawa. RENTSCH D., SCHMIDT S., TEGEDER M., Transporters for uptake and allocation of organic nitrogen compounds in plants. FEBS Lett. 581, ROTTLOFF S., STIEBER R., MAISCHAK H., TURINI F. G., HEUBL G., MITHÖFER A., Functional characterization of a class III acid endochitinase from

115 646 URSZULA KRASUSKA i współaut. the traps of the carnivorous pitcher plant genus, Nepenthes. J. Exp. Bot. 62, SCHULZE W., SCHULZE E. D., PATE J. S., GILLISON A. N., The nitrogen supply from soils and insects during growth of the pitcher plants Nepenthes mirabilis, Cephalotus follicularis and Darlingtonia californica. Oecologia 112, SIROVÁ D., ADAMEC L., VRBA J., Enzymatic activities in traps of four aquatic species of the carnivorous genus Utricularia. New Phytol. 159, SIROVÁ D., BOROVEC J., ŠANTRŮČKOVÁ H., ŠANTRŮČEK J., VRBA J., ADAMEC L., Utricularia carnivory revisited: plants supply photosynthetic carbon to traps. J. Exp. Bot. 61, SUN J., TONG J., CHEN D., LIN J., LIU X., WANG Y., Micro-tensile testing of the lightweight laminated structures of beetle elytra cuticle. Adv. Nat. Sci. 3, TÖKÉS Z. A., WOON W. C., CHAMBERS S. M., Digestive enzymes secreted by the carnivorous plant Nepenthes macferlanei L. Planta 119, ZAMORA R., GOMEZ J. M., HODAR J. A., Responses of a carnivorous plant to prey and inorganic nutrients in a Mediterranean environment. Oecologia 111,

116 Tom Numer 4 (297) Strony KRZYSZTOF SOBIERALSKI, MAREK SIWULSKI, JOLANTA LISIECKA, IWONA SAS-GOLAK, AGNIESZKA JASIŃSKA, MAŁGORZATA NOWAK-SOWIŃSKA Katedra Warzywnictwa Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu ul. Dąbrowskiego 159, Poznań sobieralski@up.poznan.pl PLEUROTUS ERYNGII MAŁO ZNANY, WARTOŚCIOWY GATUNEK BOCZNIAKA WSTĘP W ostatnich kilkunastu latach obserwuje się dynamiczny rozwój produkcji grzybów jadalnych, tak w Polsce, jak i wielu rejonach Azji, Ameryki oraz Europy. Grzyby uprawne cenione są za stosunkowo wysoką zawartość witamin, mikroskładników, a także związków bioaktywnych. Szereg gatunków grzybów można zaliczyć do tzw. żywności funkcjonalnej, której znaczenie we współczesnych czasach szybko wzrasta. Gatunki boczniaka w stanie naturalnym występują w różnych siedliskach, można je spotkać w wielu strefach klimatycznych. Znaczne rozprzestrzenienie tych grzybów na kuli ziemskiej sprawiło, że powstały różne ekotypy, które często uznawane są przez badaczy jako odrębne gatunki. Największe znaczenie produkcyjne mają następujące gatunki: Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm., P. pulmonarius (Fr.) Quel., P. columbinus (Fr.) Quel., P. cornucopiae (Pers.) Rolland, P. eryngi (Fr.) Quel. oraz P. sajor-caju. W naszym kraju obserwuje się dość duże zainteresowanie nowymi gatunkami grzybów. Jest to tendencja uniwersalna, występująca w wielu krajach Europy (OEI 2003). Następuje stopniowe urozmaicenie asortymentu grzybów oferowanych konsumentom poprzez wprowadzenie do uprawy nowych, atrakcyjnych gatunków. Gatunki te oprócz walorów smakowych charakteryzują się także często wysoką zawartością substancji bio- logicznie czynnych, które mają wyjątkowo korzystny wpływ na zdrowie człowieka. Stosunkowo mało znanym gatunkiem jest boczniak mikołajkowy Pleurotus eryngii, którego owocniki zawierają szereg cennych związków stymulujących system immunologiczny człowieka (QUIMIO 2004, JEONG i współaut. 2010), a także charakteryzują się zawartością antyoksydantów (DUBOST i współaut. 2006, ALAM i współaut. 2011a) oraz polisacharydów o działaniu przeciwnowotworowym (JUNG i współaut. 2011). BAE i współaut. (2009) wykazali antynowotworowe działanie ubichinonu-9 pozyskanego z P. eryngii przeciwko komórkom leukemii. AKYUZ i KIRBAG (2009a) wykazali aktywność antybiotyczną wyciągu z P. eryngii w stosunku do wielu bakterii i grzybów, m.in. Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Candida albicans. Badania ALAMA i współaut. (2011b) potwierdziły pozytywny wpływ dodatku do diety ekstraktu z boczniaka mikołajkowego na obniżenie stężenia cholesterolu we krwi. HAN i współaut. (2011) wykazali przeciwalergiczne i przeciwzapalne działanie ekstraktu z P. eryngii. Owocniki boczniaka mikołajkowego zawierają -glukany, które mogą pełnić w diecie funkcję prebiotyków, stymulujących rozwój pożytecznych mikroorganizmów (SY- NYTSYA i współaut. 2009).

117 648 KRZYSZTOF SOBIERALSKI i współaut. CHARAKTERYSTYKA GATUNKU Rodzaj boczniak zaliczany jest do królestwa grzyby (Fungi), gromady grzyby podstawkowe (Basidiomycota), klasy podstawczaki (Basidiomycetes), rzędu pieczarkowce (Agaricales), rodziny boczniakowatych (Pleurotaceae) (MÜLLER i LOEFFLER 1992). HILBER (1989) zalicza wymieniony rodzaj do rodziny gąskowatych (Tricholomataceae). Boczniaki są typowymi gatunkami saprofitycznymi, które w warunkach naturalnych rosną najczęściej na martwych pniach, karpach drzew liściastych oraz kłodach. Niekiedy gatunki mogą rozwijać się na żywych drzewach, przeważnie w miejscu skaleczeń. W tym wypadku można określić ich rozwój jako pasożytniczy. Różne gatunki boczniaka spotkać można na wszystkich kontynentach kuli ziemskiej za wyjątkiem Antarktydy (LELLEY 1972, NESPIAK 1974, ZIOMBRA 1988). W środowisku naturalnym boczniak występuje w lasach, ale także w ogrodach (EDWARDS 2000). Często spotykany jest w alejach oraz parkach (NILLSON i PERSSON 1978). Różne gatunki boczniaka rozkładają substancję zawierającą celulozę, a także ligninę oraz hemicelulozę (KALBARCZYK i współaut. 1992, KEREM i współaut. 1992, SANJEEV i RAI 1992, VETTER 1992, MARTINEZ i współaut. 1994). Boczniak mikołajkowy występować może na różnych roślinach. Nazwę swą zawdzięcza mikołajkowi polnemu Eryngium campestre, na którym występuje jako pasożyt fakultatywny (STAMETS 2000). Odmiana botaniczna tego gatunku, Pleurotus eryngii var. elaeoselini, występuje na Elaeoselinum asclepium subsp. asclepium (ZERVAKIS i współaut. 2000). W ostatnich latach opisano także gatunek P. eryngii var. ferulae, którego rośliną żywicielską jest Ferula communis. Jeszcze inną odmianę boczniaka mikołajkowego opisano w Izraelu. Występuje ona tylko na gatunku Ferula tingitana. Szczegółowe badania genetyczne wykazały, że P. eryngii var. tingitanus jest spokrewniony z P. eryngii var. ferulae. Między wymienionymi wyżej populacjami wykazano istotne zróżnicowanie, między innymi dotyczące wielkości zarodników, a także cech grzybni (LEWINSOHN i współaut. 2002). Badania prowadzone przez RO i współaut. (2007) wykazały, że sekwencje DNA są w 99% identyczne u gatunków P. eryngii, P. ostreatus oraz P. ferulae. W świetle najnowszych badań, gatunek P. eryngii tworzy kompleks, w obrębie którego wyróżnia się: var. eryngii (DC.: Fr) Quel, var. ferulae Lanzi (syn = Pleurotus fuscus var. ferulae), var. elaeoselini Venturella et al., var. tingitanus Lewinsohn et al., var. nebrodensis (Inzenga) Sacc, var. tuoliensis C.J. Mou, Pleurotus hadamardii Costantin oraz Pleurotus fossulatus (Cooke) Sacc. (KAWAI i współaut. 2008, ALAM i współaut. 2009, RAVASH i współaut. 2010, RODRIGUEZ-ESTRADA i współaut. 2010, SZARVAS i współaut. 2011). Kompleks P. eryngii występuje od wybrzeża atlantyckiego Francji i Maroka poprzez Europę Środkową (Niemcy, Węgry, Słowacja) i Południową (Włochy, Grecja) aż do afrykańskich wybrzeży Morza Śródziemnego (URBANELLI i współaut. 2003). Strefa występowania boczniaka mikołajkowego rozciąga się na wschód aż do Kazachstanu i Indii (ZE- RVAKIS i współaut. 2001b). W dostępnej literaturze nie ma doniesień naukowych o występowaniu tego gatunku w stanie dzikim na terenie Polski. P. eryngii jest grzybem prawie nieznanym w naszym kraju. Na znaczną skalę uprawiany jest w niektórych krajach europejskich, takich jak Włochy i Hiszpania, a także w Stanach Zjednoczonych (BALZAS i współaut. 1973; LELLEY 1974, 1991; ZADRAŽIL 1974a; HILBER 1982; GINTEROVA 1985; ROYSE i SAN- CHEZ-VAZQUEZ 1999), natomiast największym producentem są Chiny i inne kraje azjatyckie (ROYSE i SANCHEZ-VAZQUEZ 1999, CHANG i MI- LES 2004, WANG i współaut. 2010). Owocniki boczniaka mikołajkowego są jasnobeżowe, posiadają jadalny trzon, który jest umieszczony centralnie względem kape- Ryc. 1. W pełni rozwinięte owocniki Pleurotus eryngii.

118 Pleurotus eryngii mało znany, wartościowy gatunek boczniaka 649 lusza (ZIOMBRA 1998a) (Ryc. 1). Należy podkreślić, że trzony innych gatunków boczniaka są niejadalne ze względu na łykowatą konsystencję (GAPIŃSKI i współaut. 1992). Cechy morfologiczne owocników, jak też ich barwa, zmieniają się pod wpływem warunków środowiska, pozostają jednak stałe i charakterystyczne dla odmiany (JANDAIK i KAPOOR 1974, CHANG i HAYES 1978, IMBERNON 1981, ZIOMBRA 1994). Według STAMETSA (2000) owocniki uzyskane w warunkach uprawy to- warowej są przeważnie większe niż owocniki zebrane w stanowiskach naturalnych. Kapelusze Pleurotus eryngii osiągają średnicę od 3 do 12 cm. Są wypukłe, a w miarę ich rozwoju obserwuje się wklęśnięcie w środku kapelusza. Zarodniki boczniaka powodują niekiedy alergie układu oddechowego (ZA- DRAŽIL 1973, OLSON 1987, IMBERNON i współaut. 1991, LANG i współaut. 1993). Boczniak tworzy zarodniki elipsoidalne o wymiarach m. SYSTEM ENZYMATYCZNY BOCZNIAKA MIKOŁAJKOWEGO Jak podaje wielu autorów, boczniak mikołajkowy może być uprawiany na podłożach złożonych z lokalnych, łatwo dostępnych materiałów lignino-celulozowych (HAS- SAN i współaut. 2010, MOONMOON i współaut. 2010). Gatunek ten może biodegradować te materiały dzięki wytwarzanemu kompleksowi enzymów. W skład systemu enzymatycznego wchodzą m.in. oksydaza arylalkoholowa AO oraz uniwersalna peroksydaza VP, która ma zdolność przeprowadzania reakcji utleniania, podobnie jak peroksydaza ligninowa i peroksydaza manganowa (HEINFLING i współaut. 1998, MESTER i FIELD 1998). Szczegółowy mechanizm degradacji lignin przez peroksydazę podaje RUIZ-DUEÑAS i współaut. (1999), a także HEINFLING i współaut. (1998) oraz WARIISHI i współaut. (1988). Boczniak mikołajkowy wytwarza także lakkazę, różniącą się od lakkaz wytwarzanych przez inne grzyby sekwencją aminokwasów. Wytwarzane są dwie izoformy lakkazy, które utleniają związki fenolowe, a także aminy aromatyczne oraz hydroksyfenole i metoksyfenole (MU- NOZ i współaut. 1997). Badania prowadzone w ostatnich latach wykazały, że obecność jonów miedzi Cu i manganu Mn w podłożu wywiera wpływ na produkcję lakkazy i peroksydazy u P. eryngii (STAJIC i współaut. 2006). UPRAWA BOCZNIAKA MIKOŁAJKOWEGO Wszystkie gatunki rodzaju Pleurotus można uprawiać ekstensywnie wykorzystując różne rodzaje drewna lub też intensywnie używając podłoża przygotowanego z materiałów pochodzenia roślinnego wzbogaconych dodatkami wysokobiałkowymi (ZIOMBRA 1993). Do uprawy ekstensywnej boczniaka nadaje się drewno większości gatunków drzew liściastych. Uprawa ekstensywna jest ściśle uzależniona od warunków atmosferycznych. Prowadzenie uprawy w klimatyzowanych pomieszczeniach umożliwia produkcję boczniaka przez cały rok i całkowicie uniezależnia ją od warunków zewnętrznych (ZIOMBRA 1988, ZAFAR 1989). Podłoża stosowane do uprawy boczniaka to najczęściej substraty przygotowane w oparciu o różne odpady powstające w produkcji rolnej, a także w przemyśle przetwórczym. W literaturze spotkać można receptury ponad 90 różnych rodzajów substratów używanych w tej produkcji (POPPE 2004). PODŁOŻA UPRAWOWE Boczniak mikołajkowy, podobnie jak inne gatunki boczniaka, może być uprawiany na bardzo różnych podłożach. W krajach europejskich, w tym także w Polsce najczęściej stosowanymi substratami do uprawy boczniaka są słomy zbóż (LELLEY 1991, ZIOMBRA 1993). Słoma zbóż jest w naszym kraju materiałem łatwo dostępnym i stosunkowo tanim (GAPIŃSKI i ZIOMBRA 1988). ZIOMBRA (1999) podkreśla, że słoma użyta jako podłoże w uprawie powinna być zdrowa, bez oznak czernienia i spleśnienia. Według ZIOMBRY (1998a) słoma pszenna stanowi dla boczniaka mikołajkowego lepsze podłoże do uprawy niż słoma żytnia. Autorka ta wykazała także, że słoma pszenna sprzyja szybszemu rozpoczęciu plonowania Pleurotus sp. niż słoma żytnia (ZIOMBRA 2002). Szereg autorów poleca do uprawy boczniaka mikołajkowego także inne podłoża, jak np. trociny bukowe, brzozowe, olszowe, to-

119 650 KRZYSZTOF SOBIERALSKI i współaut. Słoma przeznaczona do uprawy powinna być pocięta na sieczkę o długości 1,5 2 cm według HELTAYA (1991) i EDERA (1990) lub też na sieczkę o długości 3 5 cm według HO- UDEAU i współaut. (1991). Pociętą słomę należy odpowiednio nawilżyć poprzez moczenie w wodzie przez godzin (HOUDEAU i współaut. 1991), a następnie tak nawilżoną poddać pasteryzacji. Celem procesu pasteryzacji jest uzyskanie podłoża selektywnego, które stwarza optymalne warunki do wzrostu grzybni boczniaka (CAILLEUX i DIOP 1978) oraz wpływa na uzyskanie wysokiego plonu (ZIOMBRA 1986, GAPIŃSKI 1995). W trakcie procesu pasteryzacji w podłożu zachodzi szereg zmian, m. in. rozwijają się intensywnie promieniowce termofilne, które mają zdolność wytwarzania antybiotyków, hamujących rozwój drobnoustrojów szkodliwych dla boczniaka. Długość okresu pasteryzacji jest zróżnicowana, zależy od temperatury, w któpolowe, a także korę bukową (ZIOMBRA i GA- PIŃSKI 1986) oraz wszelkie włókna roślinne zawierające duże ilości celulozy (JU 1994). MARTINEZ-CARRERA (1989) oraz PANI i PANDA (1997) zalecają do uprawy boczniaka mikołajkowego podłoże przygotowane na bazie słomy jęczmiennej lub owsianej. EDER (1990) wykazał przydatność do uprawy tego gatunku słomy gryki. W Japonii uprawę boczniaka mikołajkowego prowadzi się na słomie ryżowej (BEETZ i KUSTUDIA 2004). Wielu autorów zaleca także różne mieszanki materiałów jako podłoże do uprawy boczniaka mikołajkowego, jak np. trociny drzew wymieszane z sieczką ze słomy oraz z drobnymi gałązkami (GAPIŃSKI i ZIOMBRA 1987), a także słomę kukurydzianą zmieszaną z otrębami ryżowymi (TERASHITA i współaut. 1997). KIRBAG i AKY- UZ (2008) wykazali przydatność do uprawy boczniaka mikołajkowego podłoża złożonego z bardzo różnych materiałów powstających w produkcji rolniczej, jak słoma pszenna, odpady bawełny oraz otręby ryżowe. AKYUZ i YIL- DIZ (2008) stwierdzili przydatność do uprawy boczniaka mikołajkowego podłoża złożonego ze słomy pszennej i sojowej oraz otrąb ryżowych. Badania AKYUZ i KIRBAG (2009b) potwierdziły wpływ podłoża na wartość odżywczą owocników, m.in. zawartość białka i tłuszczu. Badania ZIOMBRY (2002) wykazały, że dobre plonowanie omawianego gatunku można uzyskać na podłożu ze słomy pszennej z trocinami sosnowymi, których udział nie przekracza 20%. W uprawie wykorzystać można także materiały odpadowe powstające w trakcie przerobu bawełny, a także prowadzić uprawę na łuskach nasiennych różnych roślin oraz odpadach przemysłu cukrowego (SUN i YU 1989). Plonowanie boczniaka można zwiększyć poprzez wzbogacenie podłoża ze słomy lub trocin dodatkami wysokobiałkowymi (ROY- SE 1997). Przeważnie stosuje się dodatki organiczne, które stanowią źródło azotu wykorzystywanego przez boczniaka w trakcie uprawy (UPADHYAY i współaut. 2003). W towarowej produkcji boczniaka mikołajkowego dobre efekty uzyskano wzbogacając podłoże brzeczką lub peptonem. Dodatki te przyspieszały wzrost grzybni tego gatunku (ZHIYUAN 2002). W literaturze światowej można znaleźć wiele receptur podłoży, które wzbogacone zostały różnymi dodatkami zwiększającymi plonowanie boczniaka mikołajkowego (AZI- ZOLLAH i współaut. 2005, CHOI i współaut. 2009, RODRIGUEZ-ESTRADA i współaut. 2009). Badania prowadzone w ostatnich latach wykazały, że ziarno sojowe wprowadzone jako dodatek do podłoża zwiększało plonowanie boczniaka mikołajkowego (RODRIGUEZ-ESTRA- DA i ROYSE 2006). Dodatkiem wpływającym korzystnie na plonowanie mogą być także kultury bakteryjne. Dodatek szczepu Pseudomonas sp. P7014 do podłoża, w którym rozwijała się grzybnia boczniaka mikołajkowego, przyspieszał wzrost grzybni oraz skracał czas prowadzenia uprawy o około 5 dni (KIM i współaut. 2008). Dodatek do podłoża uprawowego miedzi w ilości 150 mg na 1 gram podłoża sprzyjał rozwojowi w podłożu Pseudomonas tolaasii (RODRIGUEZ-ESTRADA i ROY- SE 2006). PRZYGOTOWANIE PODŁOŻA DO UPRAWY Ryc. 2. Uprawa Pleurotus eryngii w butelkach na podłożu z trocin.

120 Pleurotus eryngii mało znany, wartościowy gatunek boczniaka 651 rej jest prowadzona oraz od rodzaju podłoża. ZIOMBRA (1998a) zaleca temperaturę pasteryzacji 60 C dla słomy żytniej, a dla kory i trocin powyżej 96 C (ZIOMBRA i GAPIŃSKI 1994). Po zakończeniu pasteryzacji podłoże powinno być schłodzone do temperatury około 25 C, a następnie dokładnie wymieszane z grzybnią (JU 1994). Takim podłożem napełnia się worki foliowe (Gapiński 1995) lub butelki polipropylenowe (KWON i KIM 2004) (Ryc. 2). Worki użyte do uprawy Pleurotus eryngii powinny mieć średnicę od 30 do 40 cm, gdyż wtedy zostaje zachowany optymalny stosunek pomiędzy objętością podłoża a powierzchnią zbioru owocników (GAPIŃSKI 1995). INKUBACJA GRZYBNI I PLONOWANIE Długość okresu inkubacji zależy od odmiany, rodzaju podłoża, temperatury oraz ilości grzybni użytej do inokulacji i trwa od 14 do 21 dni (KALBERER 1992). Pierwsze owocniki pojawiają się po dniach od zaszczepienia podłoża grzybnią (Gapiński 1995). Okres od zaszczepienia podłoża grzybnią do wytworzenia owocników zależy od rodzaju podłoża, a także długości okresu pasteryzacji i waha się w szerokich granicach od 28 do 45 dni (ZIOMBRA 1998a). Po przerośnięciu podłoża przez grzybnię, co następuje według STAMETSA (2000) po dniach, podłoże należy przenieść do pomieszczenia uprawowego. Boczniak mikołajkowy daje przeważnie dwa rzuty owocników co 14 dni. Plonowanie trwa około 45 dni (STAMETS 2000). W uprawie intensywnej 90% plonu zbiera się w pierwszym i drugim rzucie (ROYSE i ZAKI 1991). Zbiór owocników przeprowadza się tak, aby linia cięcia była możliwie blisko podłoża. Wycina się całe skupiska owocników, aby stworzyć młodym owocnikom możliwość dalszego rozwoju. ZIOMBRA (1998a) zaleca dokonywać zbioru owocników, gdy brzegi kapeluszy uprzednio podwinięte, przechodzą do pozycji poziomej. CZYNNIKI WPŁYWAJĄCE NA PRZEBIEG UPRAWY I PLONOWANIE BOCZNIAKA MIKOŁAJKOWEGO Do czynników wpływających na przebieg uprawy boczniaka mikołajkowego należą: temperatura, wilgotność powietrza, wilgotność i odczyn podłoża oraz intensywność oświetlenia, a także skład gazowy atmosfery. Zapewnienie odpowiednich parametrów podczas uprawy warunkuje prawidłowy jej przebieg oraz uzyskanie wysokiego plonu owocników dobrej jakości (STAMETS 2000). TEMPERATURA W literaturze znaleźć można różne dane odnośnie temperatury zapewniającej dobry wzrost grzybni boczniaka mikołajkowego. ZERVAKIS i współaut. (2001a) podają optymalną temperaturę jako 25 C. CHANG i HAYES (1978) i KALBERER (1992) określają tę temperaturę w zależności od odmiany boczniaka w przedziale C. Badania prowadzone w kraju (ZIOMBRA 1996) wykazały, że optymalna temperatura wzrostu grzybni boczniaka mikołajkowego wynosiła 24 C. GAPIŃSKI (1995) stwierdził, że optymalna temperatura powietrza w okresie rozrastania się grzybni powinna wynosić C. Zbyt niska, tj. poniżej 22 C, jak też zbyt wysoka, tj. powyżej 28 C, temperatura wpływa hamująco na wzrost grzybni (ZIOMBRA 1996). Obumieranie grzybni boczniaka mikołajkowego powoduje dłużej utrzymująca się temperatura w granicach C. CZAKAJ i współaut. (2006) wykazali, że taka temperatura obniża wydajność biosyntezy enzymów i aktywizuje konkurencyjne grzyby pleśniowe, których formy przetrwalne nie zostały zniszczone w trakcie pasteryzacji. Plonowanie boczniaka mikołajkowego zachodzi w szerokim zakresie temperatur wynoszącym od 15 do 21 C (ZIOMBRA 1998b). Część odmian boczniaka plonuje w niskich temperaturach poniżej 15 C, natomiast wiele z nich plonuje w wyższych temperaturach (GYURKÖ 1972). W wyższych temperaturach owocniki niektórych odmian boczniaka mogą być gorszej jakości (GINTEROVA 1985, ZIOMBRA 1991). Ze względu na stosunkowo duże wymagania cieplne w okresie plonowania, uprawę boczniaka mikołajkowego można z powodzeniem prowadzić latem (ZIOMBRA 1998a), bowiem optymalna temperatura dla plonowania wynosi od 18 do 20 C (CAILLEUX i DIOP 1978, ZIOMBRA 1999). WILGOTNOŚĆ PODŁOŻA Wilgotność podłoża ma istotne znaczenie dla wzrostu grzybni oraz plonowania wszystkich gatunków boczniaka. Wzrost grzybni gatunków rodzaju Pleurotus przebiega optymalnie w podłożu o wilgotności od 68 do 72%. Zarówno zbyt wysoka wilgotność podłoża, powyżej 75%, jak też zbyt niska, poniżej 70%, powoduje obniżenie tempa wzrostu grzybni (GEISSLER 1976, LELLEY i SCHMAUS 1976, HADAR i współaut. 1993). Wilgotność

121 652 KRZYSZTOF SOBIERALSKI i współaut. Gatunki oraz odmiany boczniaka wymagają do wytworzenia prawidłowo wykształconych owocników oświetlenia o ściśle określonej intensywności (KALBERER 1974; KALBERER i VOGEL 1974a, b; ZADRAŽIL 1974a, b; VOLLAND-NAIL 1981; IMBERNON i współaut. 1983; ROYSE i ZAKI 1991). W okresie wzrostu grzybni światło nie jest niezbędne. Jednak w okresie inicjacji oraz wzrostu owocników jest ono podstawowym czynnikiem decydującym o uzyskaniu wysokiego plonu dobrej jakości (KALBERER 1974, LELLEY i SCHMAUS 1976, GINTEROVA 1985, LABORDE 1989, LELLEY 1991, GAPIŃSKI i współaut. 1992, GAPIŃSKI 1995). Badania ZIOMBRY (1998b) wykazały, że najwyższe plony uzyskać można oświetlapodłoża zalecana przez różnych badaczy uzależniona jest od jego rodzaju. HADAR i współaut. (1993) zaleca optymalną początkową wilgotność podłoża z bawełny na poziomie 70%. FAN i współaut. (2006) stwierdzili, że najszybszy wzrost grzybni boczniaka mikołajkowego oraz najwyższy stopień rozkładu związków lignino-celulozowych następował przy wilgotności początkowej odpadów powstałych w procesie produkcji kawy wynoszącej 60 65%. Wyższa wilgotność podłoża powodowała zahamowanie wzrostu grzybni oraz zmniejszała aktywność wytworzonych przez nią enzymów. Nadmierna wilgotność podłoża powodowała także obniżenie jego porowatości, co hamowało proces transportu tlenu w podłożu. Zbyt niska wilgotność podłoża ograniczała dostępność składników odżywczych, co skutkowało zahamowaniem wzrostu grzybni. Zalecenia odnośnie nawilżania podłoża są znacznie zróżnicowane. Nawilżanie podłoża aż do 75% wilgotności zaleca TSANG i współaut. (1987). GAPIŃSKI i współaut. (2001) podają za właściwy zakres wilgotności podłoża od 68 do 72%. Zdaniem tych autorów utrzymywanie wilgotności w podanym wyżej zakresie powoduje najintensywniejszy przyrost biomasy oraz szybkie przerośnięcie podłoża przez grzybnię. WILGOTNOŚĆ POWIETRZA Istotnym czynnikiem decydującym o wielkości oraz jakości plonu jest wilgotność powietrza, która może wahać się w szerokich granicach w zależności od fazy rozwojowej boczniaka mikołajkowego (STAMETS 2000). W okresie wzrostu grzybni oraz tworzenia owocników wilgotność powietrza powinna być wysoka i zawierać się w przedziale od 85 do 95%, natomiast przed zbiorami należy ją obniżyć i utrzymywać na poziomie 70-80%. W okresie między rzutami plonowania, wilgotność powinna być znów podniesiona i wahać się od 85 do 95% (ZADRAŽIL 1978, IMBERNON i współaut. 1983, BISKO i DUDKA 1987, STAMETS 2000). ODCZYN PODŁOŻA Wartość ph podłoża w uprawie grzybów Pleurotus sp. jest dość zróżnicowana w zależności od gatunku i odmiany, a także od fazy rozwojowej grzybów (DUDKA 1978). Badania prowadzone w kraju przez ZIOMBRĘ (1998a) pozwoliły określić optymalne ph podłoża w uprawie Pleurotus ostreatus oraz Pleurotus precoce od 6,0 do 7,2. W tym przedziale ph uzyskiwano najszybszy wzrost grzybni oma- wianych gatunków na pożywce agarowej. Największy plon uzyskano natomiast przy ph wynoszącym od 6,8 do 7,6. Zdaniem LELLEYA (1991) optymalne ph podłoża dla rozwoju grzybów Pleurotus sp., w tym także P. eryngii, waha się w szerokich granicach i wynosi 5,2 7,0. ZAWARTOŚĆ CO 2 W POWIETRZU Skład gazowy atmosfery jest jednym z najbardziej istotnych czynników w uprawie boczniaka. Zalecana koncentracja dwutlenku węgla uzależniona jest od fazy rozwojowej owocników. Inicjacja zawiązywania owocników oraz ich prawidłowe wykształcenie wymaga obniżenia stężenia dwutlenku węgla w powietrzu do wartości poniżej 0,1%. Przekroczenie tej wartości powoduje deformację owocników. Zwiększenie koncentracji dwutlenku węgla do poziomu 0,2% całkowicie hamuje ich tworzenie (CAILLEUX i DIOP 1978, ZADRAŽIL 1978, LABORDE 1987, EDER 1988, OLIVIER 1990, ROYSE i ZAKI 1991, ZIOMBRA 1998b). Pomieszczenia uprawowe należy wietrzyć 3 4 razy na dobę (ZIOMBRA 1993). Stężenie dwutlenku węgla w pomieszczeniu uprawowym nie powinno przekraczać 0,08% ( ZIOMBRA 1999). W trakcie prowadzenia uprawy maksymalne stężenie dwutlenku węgla powinno wynosić od 0,06 do 0,07% (EDER 1988, OVERSTIJNS 1990). Wysoka koncentracja CO 2 w okresie inkubacji jest w pewnym stopniu korzystna dla rozwoju boczniaka, ponieważ chroni go przed patogenami oraz mikroorganizmami konkurencyjnymi, które przy wysokim stężeniu dwutlenku węgla słabo rosną lub też giną (ZADRAŽIL 1974b, GA- PIŃSKI i ZIOMBRA 1988). ŚWIATŁO

122 Pleurotus eryngii mało znany, wartościowy gatunek boczniaka 653 jąc uprawę światłem fluorescencyjnym o natężeniu powyżej 500 l przez 12 godzin na dobę. Plonowanie boczniaka mikołajkowego zachodzi optymalnie przy zapewnieniu natężenia oświetlenia w granicach lx (ZIOMBRA 1999). Wzrost owocników uzależniony jest nie tylko od intensywności oświetlenia, ale także długości okresu świetlnego w rytmie dobowym. Potrzebną ilość światła niezbędną do wykształcenia owocników można regulować, skracając czas oświetlenia przy jednoczesnym zwiększeniu jego natężenia. Możliwy jest także zabieg wydłużenia czasu oświetlenia przy zmniejszeniu jego intensywności (GYURKÖ 1972). Boczniak mikołajkowy wymaga oświetlenia od 10 do 12 godzin na dobę. Natężenie oświetlenia wywiera wpływ na cechy morfologiczne boczniaka, między innymi wielkość kapelusza i długość trzonu (TRUKHONOVETS 1991). PLEUROTUS ERYNGII MAŁO ZNANY, WARTOŚCIOWY GATUNEK BOCZNIAKA Streszczenie Boczniak mikołajkowy jest gatunkiem dotychczas mało znanym w Polsce. Jego owocniki charakteryzują się wysoką wartością odżywczą oraz dużymi walorami smakowymi. Na podkreślenie zasługuje również obecność wielu substancji biologicznie aktywnych decydujących o właściwościach prozdrowotnych tego grzyba. Z wymienionych powodów, boczniak mikołajkowy zasługuje na popularyzację w naszym kraju, zarówno wśród producentów grzybów, jak i konsumentów. Aktualnie prowadzone są badania nad opracowaniem optymalnego składu podłoży oraz określeniem warunków uprawy, zapewniających uzyskanie wysokiego plonu owocników dobrej jakości. Prowadzone są także doświadczenia, których celem jest dobór odmian boczniaka mikołajkowego najbardziej przydatnych do uprawy w naszym kraju. PLEUROTUS ERYNGII LITTLE KNOWN, VALUABLE SPECIES OF OYSTER MUSHROOM Summary Pleurotus eryngii named king oyster mushroom is a species little known in Poland. Carpophores of this species are characterized by high nutritional value and good flavor. They also contain many active substances which determine their medicinal properties. For these reasons P. eryngii is worth popularization in our country both among mushroom growers and consumers. King oyster mushroom can be cultivated on a variety of lignocellulosic substrates. Currently many studies are being conducted to establish an optimal composition of substrates and growing conditions to obtain a high yield of good quality. The purpose of these experiments is also to determine the suitability of P. eryngii strains to cultivation in our country. LITERATURA AKYUZ M., YILDIZ A., Evaluation of cellulosic wastes for the cultivation of Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.) Quel. Afr. J. Biotechnol. 7, AKYUZ M., KIRBAG S., 2009a. Antimicrobial activity of Pleurotus eryngii var. ferulae grown on various agro-wastes. EurAsian J. BioSci. 3, AKYUZ M., KIRBAG S., 2009b. Nutritive value of Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.)Quel. var. eryngii grown on various agro-wastes. Philipp. Agric. Scientist 92, ALAM N., SHIM M. J., LEE M. W., SHIN P. G., YOO Y. B., LEE T. S., Vegetative growth and phylogenetic relationship of commercially cultivated strains of Pleurotus eryngii based on ITS sequence and RAPD. Mycobiology 37, ALAM N., YOON K. N., LEE K. R., LEE J. S., LEE T. S., 2011a. Phenolic compounds concentration and appraisal of antioxidant and antityrosinase activities from the fruiting bodies of Pleurotus eryngii. Adv. Environ. Biol. 5, ALAM N., YOON K. N., LEE J. S., CHO H. J., SHIM M. J., LEE T. S., 2011b. Dietary effect of Pleurotus eryngii on biochemical function and histology in hypercholesterolemic rats. Saudi journal of biological sciences. 18, AZIZOLLAH A., GOLTAPEH E. M., KASHI A., ARZANI K., Effect of media and supplementation on yield of wild Pleurotus eryngii isolates Chaharmahal & Bkhtiary province (Iran). The 5 th International Conference on Mushroom Biology and Mushroom Products, April 8 12, Shanghai, China. BAE J. -S., PARK J. W., PARK S. H., PARK J. B., RHO Y.-H., RYU Y. B., LEE K.-S., PARK K.-H., BAE Y.-S., Apoptotic cell death of human leukaemia U937 cells by ubiquinone-9 purified from Pleurotus eryngii. Nat. Product Res. 23, BALZÁS S. GYURKÖ P., KORONCZY I., Gombatermesztés. Mezögazdasági Kiadó, Budapest. BEETZ A., KUSTUDIA M., Mushroom cultivation and marketing. com/resources/background/attramushroom.pdf BISKO N. A., DUDKA I. A., Biologija i kul tivirovanije s edobnykh gribov roda veshenka. Nauk. Dumka, Kiev. CAILLEUX R., DIOP A., La fructification du Pleurotus eryngii en conditions de culture non ster-

123 654 KRZYSZTOF SOBIERALSKI i współaut. iles et ses indicences pratiques. Rev. Mycol. 42, CHANG S. T., HAYES W. A., The biology and cultivation of edible mushrooms. Academic Press, New York. CHANG S. T., MILES P. G., Mushrooms. Cultivation, nutritional value, medicinal effect and environmental impact. CRC Press, Boca Ratton, London, New York, Washington D.C. CHOI U.-K., BAJPAI V. K., LEE N. -H., Influence of calcinated starfish powder on growth, yield, spawn run and primordial germination of king oyster mushroom (Pleurotus eryngii). Food Chem. Toxicol. 47, CZAKAJ J., RYSZKA L., SOKÓŁ J. L., KRAKOWIAK A., Uzdatnianie słomy i odpadowych surowców ligninocelulozowych przy użyciu grzybów z rodzaju Pleurotus. Postępy Nauk Rolniczych 4, DUBOST N. J., BEELMAN R., PETERSON D., Identification and quantification of ergothioneine in cultivated mushrooms by liquid chromatography mass spectrometry. Int. J. Med. Mushrooms 8, DUDKA I. A., Promyshlennoe kul ivirovanie s egobnykh gribov. Naukova dumka, Kiev. EDER J., Kulturführung im Pleurotus - Anbau. Champignon 319, EDER J., Untersuchungen zur Produktionstechnik für den Anbau von Austernpilz (Pleurotus ssp.) Mitt. Versuchsanst. Pilzanbau, Sonderh, 9. EDWARDS R., The missing link? Mushroom in permaculture. Permacult. Mag. 25, FAN L., SOCCOL A. T., PANDEY A., PORTO DE SOUZA VANDENBERGHE L., SOCCOL C. R., Effect of coffeine and tannins on cultivation and fructification of Pleurotus on coffee husks. Braz. J. Microbiol. 37, GAPIŃSKI M., Boczniak. PWRiL, Poznań. GAPIŃSKI M., ZIOMBRA M., Wpływ różnych podłoży i dodatków wapnia na wzrost grzybni Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. Probl. Hig. 1, GAPIŃSKI M., ZIOMBRA M., Wpływ pasteryzacji i dodatku mocznika lub pomiotu kurzego do podłoża na plon boczniaka ostrygowatego (Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm). Rocz. AR Poznań 180, GAPIŃSKI M., WOŹNIAK W., ZIOMBRA M., Boczniak. PWRiL, Poznań. GAPIŃSKI M., WOŹNIAK W., ZIOMBRA M., Boczniak. Technologia uprawy i przetwarzania. PWRiL, Poznań. GEISSLER T., Gemüseproduktion unter Glas und Plasten. Deutscher Landwirtschaftsverlag, Berlin. GINTEROVÁ A., Pestovanie húb. Priroda, Bratislava, GYURKÖ P., Die Rolle der Belichtung bei dem Anbau des Austernseitlings (Pleurotus ostreatus). Mushroom Sci. 8, HADAR Y., KEREM Z., GRODECKI B., Biodegradation of lignocellulosic agricultural wastes by Pleurotus ostreatus. J. Biotechnol. 30, HAN E. H., HWANG Y. P., KIM H. G., CHOI J. H., IM J. H., YANG J. H., LEE H. -U., CHUN S. -S., CHUNG Y. C., JEONG H. G., Inhibitory effect of Pleurotus eryngii extracts on the activities of allergic mediators in antigen-stimulated mast cells. Food Chem. Technol. 49, HASSAN F. R. H., MEDANY G. M., HUSSEIN A., Cultivation of the king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) in Egypt. Austr. J. Basic Applied Sci. 4, HEINFLING A., RUIZ-DUEÑAS F. J., MARTÍNEZ M. J., BERG- BAUER M., SZEWZYK U., MARTÍNEZ A. T., NMR study of manganese (II) binding by a new versatile peroxidase from the white rot fungus Pleurotus eryngii. FEBS Lett. 428, HELTAY I., Substratvorbereitungs Methoden für Pilzanbau, insbesondere das Xerothern Verfahren. Champignon 358, HILBER O., Die Gattung Pleurotus. Cramer. Vaduz. HILBER O., Valid, invalid and confusing taxa of the genus Pleurotus. Mushroom Sci. 12, HOUDEAU G., OLIVIER I. M., LIBMOND S., BAWADIKJI H., Improvement of Pleurotus cultivation. [W:] Science and cultivation of edible fungi. MA- HER M. J. (red.). Balkema, Rotterdam, IMBERNON M., Caracteristiques des meilleurs souches de Pleurotus ostreatus obtenues par hybridation. Mushroom Sci. 11, IMBERNON M., BRIAN C., GRANIT S., Neue Pleurotus (Austernpilz) Stämme, die wichtigsten Kultureigenschaften. Champignon 258, IMBERNON M., HOUDEAU G., MILLER L., Pleurotus pulmonarius 3300 INRA Somycel, a new poorly sporulating strain. [W:] Science and cultivation of edible fungi. MAHER M. J. (red.). Balkema, Rotterdam, JANDAIK C. L., KAPOOR J. N., Studies on the cultivation of Pleurotus sajor-caju. Mushroom Sci. 9, JEONG Y.-T., JEONG S.-C., GU Y.-A., ISLAM R., SONG C.- H., Antitumor and immunomodulataing activities of endo-biopolymers obtained from a submerged culture of Pleurotus eryngii. Food Sci. Biotechnol. 19, JU H.-Y., Oyster mushroom cultivation. Department of Plant Science, Nova Scotia Agricultural College, Truro, Canada. JUNG H. J., BAE I. Y., LEE S., LEE H. G., Effect of the degree of sulfation on the physicochemical and biological properties of Pleurotus eryngii polysaccharides. Food Hydrocolloids 25, KALBARCZYK J., JAMROZ J., KASPEREK K., Wpływ aktywności enzymatycznej grzybni na wydajność biomasy grzybni i owocników Pleurotus ostreatus. Biul. Inf. Przem. Pasz. 31, KALBERER P., The cultivation of Pleurotus ostreatus. Mushroom Sci. 9, KALBERER P., Moderne Methoden des Pleurotus - Anbaus. Champignon 369, KALBERER P., VOGEL E., 1974a. Untersuchungen zur Kultur von Pleurotus. Verschiedene Substrat - Fermentationen, Kulturtemperaturen und Brutsorten. Gemusebau 37, KALBERER P., VOGEL E., 1974b. Untersuchungen zur Kultur von Pleurotus. Einfluss des Grassmehl Anteils im Substrat, sowie der Brutmenge auf den Ertrag bei Pleurotus ostreatus Typ florida. Schweiz. Z. Speisepilz Anbau 1, KAWAI G., BABASAKI K., NEDA H., Taxonomic position of a Chinese Pleurotus Bai-Ling-Gu, it belongs to Pleurotus eryngii (DC., Fr.) Quel. and evolved independently in China. Mycoscience 49, KEREM Z., FRIESEM D., HADAR Y., Lignocellulose degradation during solid state fermentation, Pleurotus ostreatus versus Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ. Microbiol. 58, KIM M. K., MATH R. K., CHO K. M., SHIN K. J, KIM J. O., RYU J. S., LEE Y. H., YUN H. D., Effect of Pseudomonas sp. P7014 on the growth of edible mushroom Pleurotus eryngii in bottle culture for commercial production. Bioresour. Technol. 99,

124 Pleurotus eryngii mało znany, wartościowy gatunek boczniaka 655 KIRBAG S., AKYUZ M., Evaluation of agricultural waste for the cultivation of Pleurotus eryngii (DC. ex Fr.) Quel. var. ferulae Lanzi. Afr. J. Biotechnol. 7, KWON H., KIM B. S., Mushroom Grower s Handbook 1 Oyster Mushroom Cultivation. MushWorld, Korea, 7, LABORDE J., Propositions pour une amelioration de la culture des Pleurotus. Bull. Fed. Nat. Syndicate. Agricol. Cult. Champignons 33, LABORDE J., Technologie moderne de production des Pleurotus. Mushroom Sci. 12, LANG W. F., LI D. D., ZHOU J. H., CHEN W., LI. F., Relation of IL-2, IL-3 and IL-4 with allergic asthma induced by spores of mushroom (Pleurotus sp.). Biomed. Environ. Sci. 6, LELLEY J., Neuer Speisepilz für Anbauer und Verbraucher der Austernseitling. Champignon 125, LELLEY J., Erfahrungen über den Austernpilz Pleurotus ostreatus (Jacq.ex Fr.) Kummer. Diemorphologischen Merkmall und Werteigenschaften des Austernpilzes. Der Champignon 152, LELLEY J., Pilzanbau. Biotechnologie der Kulturspeisepilze. Ulmer, Stuttgart. LELLEY J., SCHMAUS F., Pilzanbau. Eugen Ulmer Verlag, Stuttgart. LEWINSOHN D., WASSER S.P., RESHETNIKOV S.V., HADAR Y., NEVO E., The Pleurotus eryngii speciescomplex in Israel, distribution and morphological description of a new taxon. Mycotaxon 81, MARTÍNEZ A. T., CAMARERO S., GUILLÉN F., GUTIERREZ A., MUNOZ C., VARELA E., MARTÍNEZ M. J, BARRASA J. M., RUEL K., PELAYO J. M., Progress in biopulping of non-woody materials, chemical, enzymatic and ultrastructural aspects of wheat straw delignification with ligninolytic fungi from the genus Pleurotus. FEMS Microbiol. Rev. 13, MARTÍNEZ-CARRERA D., Past and future of edible mushroom cultivation in tropical America. Mushroom Sci. 12, MESTER T., FIELD J.A., Characterization of a novel manganese peroxidase lignin peroxidase hybrid isozyme produced by Bjerkandera species strain BOS 55 in the absence of manganese. J. Biol. Chem. 273, MOONMOON M., UDDIN M. N., AHMED S., SHELLY N. J., KHAN M. A., Cultivation of different strains of king oyster mushroom (Pleurotus eryngii) on sawdust and rice straw in Bangladesh. Saudi J. Biol. Sci. 17, MÜLLER E., LOEFFLER W., Zarys mikologii. PWRiL, Warszawa. MUÑOZ C., GUILLÉN F., MARTÍNEZ A. T., MARTÍNEZ M. J., Laccase isoenzymes of Pleurotus eryngii, characterization, catalytic properties, and participation in activation of molecular oxygen and Mn 2+ oxidation. Appl. Environ. Microbiol. 63, NESPIAK A., Atlas grzybów leśnych. PWRiL, Warszawa. NILSSON S., PERSSON O., Fungi of Northern Europe. Gris Impressores. Portugal. OEI P., Mushroom cultivation. Backhuys Publishers Leiden, Netherlands. OLIVIER J. M., Les besoins des Pleurotus cultives. Bull. Fed. Nat. Syndicate Agricol. Cult. Champignons 45, OLSON J. A., Pleurotus spores as allergens. Mushroom J. 172, OVERSTIJNS A., Muss Pleurotus Substrat konditioniert werden oder nicht? Der Champignon 348, PANI B., PANDA S., Utilization of some byproducts and other wastes for sporophore production of oyster mushroom. Orissa J. Horticult. 25, POPPE J., Mushroom Grower s Handbook 1 Oyster Mushroom Cultivation. MushWorld 2004, Korea, 5, QUIMIO T. H., Mushroom Grower s Handbook 1 Oyster Mushroom Cultivation. MushWorld 2004, Korea, 1, RAVASH R., SHIRAN B., ALAVI A.-A., BAYAT F., RAJAEE S., ZERVAKIS G. I., Genetic variability and molecular phylogeny of Pleurotus eryngii species- -complex isolates from Iran, and notes on the systematic of Asiatic populations. Mycol. Progress 9, RO H. S., KIM S. S., RYU J. S., JEON C. O., LEE T. S., LEE H. S., Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eryngii, ITS sequence analysis, RAPD fingerprinting, and physiological characteristic. Mycol. Res. 111, RODRIGUEZ-ESTRADA A. E., ROYSE D. J., Yield, size and bacterial blotch resistance of Pleurotus eryngii grown on cottonseed hulls/oak sawdust supplemented with manganese, copper and whole ground soybean. Bioresour Technol. 98, RODRIGUEZ-ESTRADA A. E., JIMENEZ-GASCO M. M, ROYSE D. J., Improvement of yield of Pleurotus eryngii var. eryngii by substrate supplementation and use of a casing overlay. Bioresource Technol. 100, RODRIGUEZ-ESTRADA A. E., JIMENEZ-GASCO M. M, ROYSE D. J., Pleurotus eryngii species complex, Sequence analysis and phylogeny based on partial EF1 and RPB2 genes. Fungal Biol. 114, ROYSE D. J., Specialty mushrooms and their cultivation. Horticultural Rev. 19, ROYSE D. J., ZAKI S. A., Yield stimulation of Pleurotus flabellatus by dual nutrient supplementation of pasteurized wheat straw. [W:] Science and cultivation of edible fungi. MAHER M. J. (red.) Balkema, Rotterdam, ROYSE D. J., SANCHEZ-VAZQUEZ J. E., Effect of Brewer s grain and delayed release nutrient supplementation on yield and size of Pleurotus eryngii. (King oyster mushroom). [W:] Mushroom Biology and Mushroom Products. BRODER- ICK A., NAIR T. (red.). Proceedings of the 3 rd Int. Conf. Sydney, Australia, RUIZ-DUEÑAS F. J., MARTÍNEZ M. J., MARTÍNEZ A. T., Molecular characterization of a novel peroxidase isolated from the ligninolytic fungus Pleurotus eryngii. Mol. Microbiol. 31, SANJEEV S., RAI R. D., Effect of pretreatments of wheat straw on biodegradation by Pleurotus sajor-caju (Fr.) Sign. Mushroom Res. 1, STAJIC M., PERSKY L., FRIESEM D., HADAR Y., WASSER S.P., NEVO E., VUKOJEVIC J., Effect of different carbon and nitrogen sources on laccase and peroxidases production by selected Pleurotus species. Enzyme Microb. Technol. 38, STAMETS P., Growing gourmet and medicinal mushrooms Wyd. 3. Ten Speed Press, Berkeley, CA, SUN P.-J., YU J.-J., The cultivation of Pleurotus mushrooms on sterilized substrate in the field. Mushroom Sci. 12, SYNYTSYA A., MICKOVA K., SYNYTSYA A., JABLONSKY I., SPEVACEK J., ERBAN V., KOVARIKOVA E., COPIKOVA J., Glucans from fruit bodies of cultivated

125 656 KRZYSZTOF SOBIERALSKI i współaut. mushroom Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii, structure and potential prebiotic activity. Carbohyd. Polym. 76, SZARVAS J., GEOSEL A., PAL K., NAAR Z., GYORFI J., Comparative studies of the cutivabe king oyster mushrooms [Pleurotus eryngii (DC.,Fr.) Quel.] isolated by RAPD-PCR method. Acta Alimentaria 40 (Suppl.), TERASHITA T., UMEDA M., SAKAMOTO R., ARAI N., Effect of corn fiber on the fruit body prod. of edible mushrooms. Nippon Kigakukai Japan 8, TRUKHONOVETS V., Effect of illumination intensity on the formation of fruiting bodies in Pleurotus ostreatus (Jacq. Fr.) Kumm. Ukr. Bot. Zh. 48, TSANG J. L., REID D. I., COXWORTH E. C., Delignification of wheat straw by Pleurotus spp. under mushroom growing conditions. Appl. Environm. Microbiol. 53, UPADHYAY R. C., VERMA R. N., SINGH S. K., YADAV M. C., Effect of organic nitrogen supplementation in Pleurotus species. National Research Centre for Mushroom, Chambaghat, Splan, India, Mushworld, 92. URBANELLI S., DELLA ROSA V., FANELLI C., FABBRI A. A., REVERBERI M., Genetic diversity and population structure of the Italian fungi belonging to the taxa Pleurotus eryngii (DC.: Fr.) Quel and P. ferulae (DC.: Fr.) Quel. Heredity 90, VETTER I., Der Anbau verschiedener Lignozellulosen durch Anbau des Austernpilzes (Pleurotus ostreatus). Mikologie 58, VOLLAND-NAIL P., Action de la lumiere sur la fructification du Pleurotus du Québec. Mushroom Sci. 11, WANG Y., WAN C., YANG J., CHEN J., YUAN T., ZHAO J., Collection of group characteristics of Pleurotus eryngii using machine vision. Int. Fed. Inform. Processing AICT 317, WARIISHI H., AKILESWARAN L., GOLD M. H., Manganese peroxidase from the basidiomycete Phanerochaete chrysosporium, spectral characterization of the oxidized states and the catalytic cycle. Biochemistry 27, ZADRAŽIL F., Pleurotus Sporen Allergie. Champignon 140, ZADRAŽIL F., 1974a. The ecology and industrial production of Pleurotus ostreatus, Pleurotus florida, Pleurotus cornucopiae and Pleurotus eryngii. Mushroom Sci. 9, ZADRAŽIL F., 1974b. Aktivmyzel eine Ersparnis für die Pleurotus Herstelung. Champignon 151, 5 6. ZADRAŽIL F., Cultivation of Pleurotus. [W:] The biology and cultivation of edible mushrooms. CHANG S. T., STAYES W. A. (red.). Academic Press, New York, ZAFAR S. I., Contribution of basidiomycete fungi in the natural process self biodegradation of wood in forest stands. Pak. J. For. 39, ZERVAKIS G., LA ROCCA S., VENTURELLA G., Pleurotus eryngii var. elaeoselini var. nov. from Sicily. Mycotaxon 76, ZERVAKIS G., PHILIPPOUSSIS A., IOANNIDOU S., IAMAN- TOPOULOU P., 2001a. Mycelium growth kinetics and optimal temperature conditions for the cultivation of edible mushroom species on lignocellulosic substrates. Folia Microbiol. (Praha), 46, ZERVAKIS G., VENTURELLA G., PAPADOPOULOU K., 2001b. Genetic polymorphism and taxonomic infrastructure of the Pleurotus eryngii speciescomplex as determined by RAPD analysis, isozyme profiles and ecomorphological characters. Microbiology 147, ZHIYUAN G., Effects of nutrion and environment on the mycelia growth of Pleurotus eryngii. Acta Edulis Fungi 9, ZIOMBRA M., Wpływ podłoży i pasteryzacji na plonowanie boczniaka Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. Roczniki AR, Poznań 165, ZIOMBRA M., Wpływ różnych dodatków do podłoży na wzrost grzybni boczniaka ostrygowatego Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumm. Roczniki AR, Poznań 180, ZIOMBRA M., Porównanie cech morfologicznych owocników grzybów z rodzaju Pleurotus sp. Roczniki AR, Poznań 225, ZIOMBRA M., Plonowanie różnych odmian boczniaka w zależności od pasteryzacji podłoża. [W:] Materiały Ogólnopolskiego Sympozjum Nowe rośliny i technologie w ogrodnictwie AR, Poznań, ZIOMBRA M., Charakterystyka odmian boczniaka. [W:] Hodowla i nasiennictwo roślin ogrodniczych. DUCZMAL K. W., TUCHOLSKA H. (red.). Wydawnictwo Akademii Rolniczej w Poznaniu, Poznań, ZIOMBRA M., Wzrost grzybni i plonowanie kilku taksonów boczniaka na wybranych podłożach. Materiały VI Zjazdu Hodowców Roślin Ogrodniczych Hodowla roślin o podwyższonej jakości AR, Kraków, ZIOMBRA M., 1998a. Wpływ podłoża i pasteryzacji na plonowanie boczniaka Pleurotus eryngii (FR.) Quel. Roczniki AR, Poznań 304, ZIOMBRA M., 1998b. Wpływ niektórych czynników na wzrost grzybni i plonowanie boczniaka. Roczniki AR, Poznań 278, 1 75 (rozprawa habilitacyjna). ZIOMBRA M., Influence of substrate pasteurization methods on yielding of some Pleurotus cultivars. Research Institute of Vegetable Crops Skierniewice Poland, Vegetable Crops Res. Bull. 51. ZIOMBRA M., Wpływ różnych podłoży na wzrost grzybni i plonowanie odmian bocznika (Pleurotus sp.). Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych, PAN 485, ZIOMBRA M., GAPIŃSKI M., Wpływ podłoży i pasteryzacji na wzrost grzybni boczniaka Pleurotus ostereatus (Fr.). Roczniki AR, Poznań 165, ZIOMBRA M., GAPIŃSKI M., Wzrost grzybni i plonowanie boczniaka w zależności od odmiany i przygotowania podłoża. Materiały z Sympozjum z okazji 30-lecia Instytutu Warzywnictwa Integrowane metody produkcji warzyw. Inst. Warzywn., Skierniewice.

126 Tom Numer 4 (297) Strony SZYMON ZUBEK Instytut Botaniki, Uniwersytet Jagielloński Lubicz 46, Kraków szymon.zubek@uj.edu.pl CZY SYMBIOTYCZNE GRZYBY ARBUSKULARNE MOGĄ SPRZYJAĆ INWAZJI ROŚLIN?* PROBLEM INWAZYJNOŚCI OBCYCH GATUNKÓW ROŚLIN Wraz z rozwojem transportu, handlu i turystyki, czynniki antropogeniczne zaczęły odgrywać coraz większą rolę w kształtowaniu składu gatunkowego organizmów większo- ści regionów świata. Źródłem ekspansji gatunków poza ich naturalny zasięg może być zarówno celowe sprowadzanie niektórych taksonów jako roślin ozdobnych (np. nawłoć późna, Solidago gigantea) bądź użytkowych (np. barszcz Sosnowskiego, Heracleum sosnovskyi), a także przypadkowe ich zawleczenie (np. starzec wąskolistny, Senecio inaequidens). Dodatkowo, intensywna gospodarka zasobami naturalnymi oraz rozwój przemysłu i rolnictwa, spowodowały zubożenie składu gatunkowego, fragmentację siedlisk oraz wzrost zanieczyszczenia środowiska. Takie zaburzenia w równowadze ekosystemów sprzyjają ekspansji obcych gatunków roślin (SOLARZ 2007, OKARMA i SOLARZ 2009, MIREK 2010, TOKARSKA-GUZIK i współaut. 2011). Na obszarze naszego kontynentu występuje około obcych gatunków roślin. Przeciętnie we florze każdego z państw Europy jest ich kilkaset, a w Polsce ich liczba wynosi około trzysta (DAJDOK i PAWLACZYK 2009). Spośród tej grupy roślin za inwazyjne obce gatunki (ang. invasive alien species, IAS) Ryc. 1. Inwazyjne gatunki roślin we florze Polski. A niecierpek gruczołowaty (Impatiens glandulifera); B nawłoć kanadyjska (Solidago canadensis); C ambrozja bylicolistna (Ambrosia artemisiifolia); D rdestowiec ostrokończysty (Reynoutria japonica); fot. S. Zubek (A), M. Nobis (B, C), W. Bąba (D). *Praca powstała dzięki wsparciu finansowemu Narodowego Centrum Nauki, ze środków projektu badawczego przyznanego na podstawie decyzji numer DEC-2011/03/B/NZ8/00008.

127 658 SZYMON ZUBEK Tabela 1. Przykładowe inwazyjne gatunki roślin we florze Polski i ich status mikoryzowy. Status Gatunek rośliny Pochodzenie a Obszar inwazji b mikoryzowy c Ambrozja bylicolistna (Ambrosia artemisiifolia) Ameryka Północna Europa M Barszcz Sosnowskiego (Heracleum sosnovskyi) Azja Europa BD Czeremcha amerykańska (Padus serotina) Ameryka Północna Europa BD Klon jesionolistny (Acer negundo) Ameryka Północna Europa M Kolczurka klapowana (Echinocystis lobata) Ameryka Północna Europa M Nawłoć kanadyjska (Solidago canadensis) Ameryka Północna Azja, Europa M Nawłoć późna (Solidago gigantea) Ameryka Północna Azja, Europa M Niecierpek gruczołowaty (Impatiens glandulifera) Azja Europa M Niecierpek drobnokwiatowy (Impatiens parviflora) Azja Europa M Rdestowiec ostrokończysty (Reynoutria japonica) Azja Ameryka Północna, Europa NM Rudbekia naga (Rudbeckia laciniata) Ameryka Północna Europa M Uczep amerykański (Bidens frondosa) Ameryka Północna Europa M a,b Pochodzenie gatunku i obszar inwazji wg TOKARSKIEJ-GUZIK (2005), DAJDOKA i PAWLACZYKA (2009) oraz internetowej bazy danych Instytutu Ochrony Przyrody PAN w Krakowie. c Status mikoryzowy gatunku wg WAN- GA i QIU (2006), SHAH i współaut. (2009), ŠTAJEROVÁ i współaut. (2009) oraz niepublikowanych własnych danych; M gatunek, u którego stwierdzono mikoryzę arbuskularną, NM gatunek niemikoryzowy, BD brak danych o statusie mikoryzowym gatunku. wej, lub ekspansję amerykańskiej, wodnej paproci, azolli paprotkowej (Azolla filiculoides), utrudniającej żeglugę na kanałach Anglii (DAJDOK i PAWLACZYK 2009). Z kolei ziarna pyłku ambrozji bylicolistnej (Ambrosia artemisiifolia), inwazyjnego w Europie gatunku pochodzenia północnoamerykańskiego, są przyczyną alergii (LAAIDI i współaut. 2003). Nierzadkie są także przypadki uczulenia na promieniowanie słoneczne, powodujące poważne poparzenia, wywołane przez zetknięcie skóry z liśćmi barszczu Sosnowskiego (Heracleum sosnovskyi). Ten kaukaski gatunek sprowadzono do Polski i wielu innych krajów europejskich jako roślinę ozdobną lub pastewną. Stał się on jednak niebezpiecznym chwastem opanowującym zwłaszcza tereny dolin rzecznych. W związku z zagrożeniami dla przyrody, gospodarki oraz zdrowia ludzi problem inwazyjnych gatunków znalazł odzwierciedlenie w unijnych aktach prawnych i w konwencjach międzynarodowych (np. Dyrektywa Siedliskowa 92/43/EWG; Konwencja Berneńska 1979; Konwencja o Różnorodności Biologicznej, Rio de Janeiro 1992). Powstały także liczne bazy danych na poziomie lokalnym, państwowym [Baza Instytutu Ochrony Przyrody PAN w Krakowie ( krakow.pl/ias)] i międzynarodowym [np. Delivering Alien Invasive Species Inventouznajemy jedynie takie, których pojawienie się i rozprzestrzenienie skutkuje obniżeniem różnorodności biologicznej (DAJDOK i PAWLA- CZYK 2009). Przykładowe inwazyjne gatunki we florze Polski zestawiono w Tabeli 1 oraz przedstawiono na Ryc. 1. Negatywny wpływ tych gatunków na rodzimą florę przejawia się ograniczeniem różnorodności gatunków autochtonicznych, bezpośrednio przez wypieranie lub pośrednio poprzez konkurencję o zasoby, tj. np. owady zapylające czy wodę. Niekorzystny wpływ mają także pasożyty zawleczone z obcymi gatunkami, które atakują rośliny rodzime. Niektóre obce gatunki mogą się także krzyżować ze spokrewnionymi gatunkami autochtonicznymi doprowadzając do rozmycia ich puli genowej. Wymienione zagrożenia prowadzić mogą do spadku liczebności, a nawet całkowitego wyginięcia gatunków rodzimych (SOLARZ 2007, DAJDOK i PAWLACZYK 2009). Inwazje roślin stały się już nie tylko zmartwieniem przyrodników, ale także istotnym problemem ekonomicznym, ze względu na ich wpływ na naturalne zasoby przyrodnicze wykorzystywane przez człowieka, a często także problemem zdrowotnym (PIMENTEL 2002). Jako przykład przytoczyć można choćby masowy rozwój czeremchy amerykańskiej (Padus serotina), który ogranicza odnowienia lasów w Europie Środko-

128 Czy symbiotyczne grzyby arbuskularne mogą sprzyjać inwazji roślin? 659 ries for Europe, DAISE ( -aliens.org); Global Invasive Species Information Network, GISIN ( org)] mające na celu monitoring gatunków obcych oraz poszerzanie wiedzy na temat inwazji biologicznych. Jako że ekspansje roślin są wypadkową oddziaływania wielu czynników, prowadzone są interdyscyplinarne badania mechanizmów inwazji (SHAH i współaut. 2009, TOKARSKA- -GUZIK i współaut. 2011). W ramach tych prac zwrócono m.in. uwagę na interakcje roślin inwazyjnych z mikroorganizmami glebowymi, a szczególnie z symbiotycznymi grzybami arbuskularnymi, które kolonizują korzenie większości gatunków roślin lądowych, zarówno rodzimych dla danego obszaru, jak i tych obcego pochodzenia (WANG i QIU 2006, SMITH i READ 2008). Badania te prowadzone są pod kątem określenia wpływu grzybów arbuskularnych na gatunki inwazyjne, a co za tym idzie sprzyjaniu lub ograniczaniu ich ekspansji, a także oceny zmian różnorodności gatunkowej i liczebności tych mikroorganizmów glebowych pod wpływem inwazji. Istotnym aspektem są także zagadnienia praktyczne, czyli ewentualna rewitalizacja siedlisk po usunięciu gatunków obcych z zastosowaniem grzybów arbuskularnych. Celem niniejszego artykułu jest przybliżenie zagadnienia interakcji roślin inwazyjnych z grzybami arbuskularnymi. GRZYBY ARBUSKULARNE Grzyby arbuskularne (Glomeromycota) to jedna z gromad w obrębie królestwa grzybów (Mycota), której przedstawiciele tworzą związki symbiotyczne. Partnerami tych mikroorganizmów glebowych w strefie klimatu umiarkowanego są głównie rośliny zielne, ale także pewne gatunki drzew, na przykład z rodzajów takich jak klon (Acer), jesion (Fraxinus), kasztanowiec (Aesculus), oraz niektóre drzewa i krzewy ozdobne i owocowe. W rejonach tropikalnych mikoryzę arbuskularną tworzy większość gatunków drzewiastych. Do Glomeromycota należy około 230 opisanych do tej pory gatunków grzybów grupowanych obecnie w trzech klasach, pięciu rzędach, czternastu rodzinach i dwudziestu dziewięciu rodzajach (OEHL i współaut. 2011). Pozycję systematyczną przykładowych gatunków grzybów arbuskularnych przedstawiono w Tabeli 2. Zdecydowana większość tych grzybów to obligatoryjne symbionty roślin tworzące mikoryzę arbuskularną, będącą rodzajem endomikoryzy. Wyjątkiem jest Geosiphon pyriformis, jedyny przedstawiciel rodziny Geosiphonaceae, który nie tworzy mikoryzy arbuskularnej. Jest symbiontem sinic z rodzaju Nostoc, klasyfikowanym w obrębie Glomeromycota ze względu na bliskie pokrewieństwo filogenetyczne z grzybami tworzącymi mikoryzę arbuskularną (SMITH i READ 2008). Tabela 2. Pozycja systematyczna przykładowych gatunków grzybów arbuskularnych (Glomeromycota). Klasa Rząd Rodzina Gatunek Glomeromycetes Diversisporales Diversisporaceae Diversispora spurca Otospora bareae Gigasporales Gigasporaceae Gigaspora gigantea Scutellosporaceae Orbispora pernambucana Scutellospora calospora Glomerales Entrophosporaceae Albahypha drummondii Entrophospora infrequens Glomeraceae Funneliformis mosseae Glomus macrocarpum Archaeosporomycetes Archaeosporales Ambisporaceae Ambispora granatensis Archaeosporaceae Archaeospora trappei Geosiphonaceae Geosiphon pyriformis Paraglomeromycetes Paraglomerales Paraglomeraceae Paraglomus occultum

129 660 SZYMON ZUBEK Ryc. 2. Zarodniki oraz strzępki grzyba arbuskularnego (skala 25 μm; zarodniki izolowane z hodowli laboratoryjnych; fot. S. Zubek). Grzyby arbuskularne rozmnażają się poprzez tworzenie na zakończeniach strzępek zarodników o charakterze przetrwalnikowym (Ryc. 2). Powstają one najczęściej bezpośrednio w glebie, ale czasem również we wnętrzu korzenia. Zarodniki kiełkują i w przypadku obecności rośliny wchodzącej w symbiozę mikoryzową tworzą grzybnię kolonizującą korzenie (Ryc. 3) oraz grzybnię zewnątrzkorzeniową, pełniącą funkcje absorpcyjne. Strzępki kolonizujące wnętrze korzenia mogą rozrastać się na kilka sposobów w obrębie Ryc. 3. Fragment korzenia uczepu amerykańskiego (Bidens frondosa), gatunku inwazyjnego we florze Polski, intensywnie skolonizowany przez grzyby arbuskularne; grzybnia wybarwiona została błękitem aniliny; preparat wykonano przez rozgniecenie korzenia między szkiełkami mikroskopowymi; arbuskule (ar), komórki korzenia (kr), strzępki (st), wiązka przewodząca (wp) (skala 100 μm; roślina zebrana ze stanu naturalnego; fot. S. Zubek). kory pierwotnej, tworząc osiem morfotypów mikoryzy arbuskularnej (DICKSON 2004). Zawsze jednak w komórkach kory pierwotnej powstają drzewkowate rozgałęzienia strzępek zwane arbuskulami, które pozostają w ścisłym kontakcie z otaczającą je plazmalemmą komórek roślin. Struktury te, od których pochodzi nazwa omawianego typu mikoryzy, są miejscem wymiany związków chemicznych pomiędzy partnerami symbiozy. Roślina otrzymuje od swojego partnera wodę i związki mineralne, natomiast w zamian przekazuje związki węgla wytworzone w procesie fotosyntezy. Grzyby arbuskularne uzyskują związki węgla prawie wyłącznie od rośliny i praktycznie nie posiadają one zdolności do funkcjonowania jako organizmy saprobiontyczne. Oprócz arbuskul, które są miejscem opisanej wymiany między partnerami symbiozy, w korzeniu obecne mogą być także pęcherzyki rozdęcia zakończeń strzępek, tworzone przez niektóre gatunki grzybów z gromady Glomeromycota. Pęcherzyki są miejscem gromadzenia związków zapasowych, ale mogą także stanowić propagule, czyli struktury dające początek nowej grzybni (SMITH i READ 2008). Jedną z podstawowych korzyści dla roślin, wynikającą z tworzenia mikoryzy arbuskularnej, jest dostarczanie fosforu, którego niedobór w znacznym stopniu limituje wzrost roślin. Jony fosforanowe są mało mobilne w glebie. Tworzą one liczne, nierozpuszczalne związki kompleksowe, przez co ich dyfuzja jest powolna. W konsekwencji roślina pobierając fosfor wykształca wokół korzeni strefę pozbawioną tego pierwiastka. Strzępki zewnątrzkorzeniowe grzybów arbuskularnych penetrują glebę w znacznie większym stopniu niż korzenie, co zapewnia roślinie lepszą dostępność fosforu. Wśród innych pierwiastków, w których transporcie do rośliny biorą udział grzyby arbuskularne, wymieniane są m.in. azot, potas, cynk, wapń, magnez oraz miedź. Istotna jest także rola grzybów arbuskularnych w ochronie roślin przed patogenami korzeniowymi. Grzyby mikoryzowe zajmują niszę ekologiczną jaką jest wnętrze korzenia, a także korzystają ze związków węgla dostarczanych przez roślinę, stając się potencjalnymi konkurentami patogenów. Dodatkowo, zarówno związki chemiczne produkowane przez grzyby, jak i modyfikacja składu wydzielin korzeniowych, będąca konsekwencją wytworzenia mikoryzy arbuskularnej, mają wpływ na wzrost mikroorganizmów glebowych, w tym na hamowanie rozwoju patogenów. Wykazano pozytyw-

130 Czy symbiotyczne grzyby arbuskularne mogą sprzyjać inwazji roślin? 661 ną rolę grzybów arbuskularnych w ochronie roślin przed atakiem pasożytniczych grzybów oraz nicieni. Strzępki grzybni zewnątrzkorzeniowej oraz ich wydzieliny przyczyniają się również do formowania właściwej struktury gleby. Grzybnia jest zaangażowana w tworzenie agregatów glebowych, głównie dzięki produkcji związków takich jak glikoproteiny. Znane są także przykłady pozytywnego działania grzybów na witalność i wzrost roślin w warunkach stresu związanego z wysokimi stężeniami metali ciężkich czy też chlorku sodu w glebie. Wymieniając korzyści roślin ze związków symbiotycznych z grzybami arbuskularnymi należy jednak zaznaczyć, że odpowiedź rośliny na kolonizację grzyba nie zawsze jest pozytywna. Zdarza się bowiem, że koszty utrzymania partnera grzybowego, a konkretnie ilość związków węgla przekazywanych do grzybni, są wysokie. Jak wykazały eksperymenty laboratoryjne inokulacja niektórych gatunków roślin przez pewne szczepy grzybów arbuskularnych skutkowała mniejszymi przyrostami masy w porównaniu z roślinami nie inokulowanymi (SMITH i READ 2008). WPŁYW GRZYBÓW ARBUSKULARNYCH NA ROŚLINY INWAZYJNE Ze względu na omówione w poprzednim rozdziale korzyści dla roślin wynikające z tworzenia symbiozy mikoryzowej, rośliny inwazyjne mogą korzystać z obecności grzybów arbuskularnych poprzez (i) mniejsze nakłady na tworzenie rozbudowanego systemu korzeniowego, (ii) większą dostępność fosforu, (iii) lepszy wzrost siewek, które zostają włączone w sieć mikoryzową w danym zbiorowisku, a także (iv) przez wzmożoną ochronę przed roślinożercami i patogenami (SHAH i współaut. 2009). Zarówno korzenie roślin, jak i strzępki grzybów arbuskularnych uczestniczą w pobieraniu związków mineralnych z gleby. Strzępki mają jednak znacznie mniejszą średnicę oraz większy stosunek powierzchni do objętości. W związku z powyższym, nakłady wytworzonych w procesie fotosyntezy związków węgla na budowę grzybni są mniejsze w porównaniu z tymi przeznaczanymi przez roślinę na tworzenie rozbudowanego systemu korzeniowego. Dlatego też grzybnia mikoryzowa może zastępować w pewnym stopniu funkcje korzeni w pobieraniu związków mineralnych, pozwalając na przeznaczenie większych nakładów energii na obronę przed pasożytami i roślinożercami czy też tworzenie nasion (SHAH i współaut. 2009). Udowodniono, że w przypadku dwóch inwazyjnych chabrów Centaurea maculosa oraz Centaurea diffusa, grzyby arbuskularne odgrywają istotną rolę w pobieraniu przez nie fosforu, co może zwiększać konkurencyjność tych gatunków wkraczających w zbiorowiska łąkowe Ameryki Północnej (ZABINSKI i współaut. 2002, SHAH i współaut. 2009). Wpływ grzybów arbuskularnych na pobieranie fosforu przez rośliny badano również w przypadku wspomnianego już inwazyjnego gatunku Ambrosia artemisiifolia. FUMANAL i współaut. (2006), określając status mikoryzowy ambrozji we Francji stwierdzili, że osobniki z 94% populacji były kolonizowane przez grzyby arbuskularne. Autorzy przeprowadzili następnie eksperyment laboratoryjny, w którym udowodnili pozytywny wpływ symbiontów grzybowych na wzrost i witalność ambrozji bylicolistnej stwierdzając, że symbioza z grzybami arbuskularnymi może sprzyjać ekspansji tego gatunku w Europie. Sieć strzępek grzybów arbuskularnych w glebie może wpływać na konkurencyjność inwazyjnych i rodzimych gatunków roślin przez przekazywanie związków chemicznych między nimi. Siewka rośliny inwazyjnej może zostać włączona w sieć grzybni mikoryzowej w zbiorowisku roślinnym, które kolonizuje, i korzystać ze związków pobranych od roślin rodzimych (MARLER i współaut. 1999, RI- CHARDSON i współaut. 2000, VAN DER HEIJDEN 2004, GIOVANNETTI i współaut. 2006). CAREY i współaut. (2004) dostarczyli bezpośrednich dowodów na transfer węgla od gatunku autochtonicznego Festuca idahoensis do inwazyjnego Centaurea maculosa. Mikoryza może także wpływać na zdolność gatunku inwazyjnego do obrony przed pasożytami i roślinożercami poprzez zmiany jakie dokonują się w wydzielinach korzeniowych oraz w składzie i ilości metabolitów gromadzonych w pędach rośliny na skutek kolonizacji przez grzyba. Korzyści mogą wynikać również ze wspomnianego już pozytywnego wpływu grzybów arbuskularnych na witalność i wzrost danej rośliny, co zwiększa jej możliwości regeneracyjne w przypadku ataku patogenów czy też zwierząt roślinożer-

131 662 SZYMON ZUBEK nych (GOVERDE i współaut. 2000, MITCHELL i POWER 2003, KLIRONOMOS 2003, REINHART i współaut. 2003, SHAH i RESHI 2007). Należy jednak mieć na uwadze fakt, że symbioza mikoryzowa stanowi spektrum reakcji rośliny na obecność grzyba, które zależne jest od gatunku rośliny i szczepu grzyba oraz warunków fizyko-chemicznych gleby (SMITH i READ 2008). Dlatego też rośliny inwazyjne nie zawsze czerpią korzyści z obecności partnera grzybowego. Grzyby arbuskularne mogą bowiem spowodować obniżenie witalności i wzrostu danego gatunku rośliny, co związane jest ze zbyt wysokimi kosztami utrzymania symbionta grzybowego w stosunku do otrzymywanych korzyści w danym sie- dlisku (SHAH i współaut. 2009). Taką sytuację obserwowano w eksperymentach przeprowadzonych na Centaurea maculosa, gdzie rośliny nie inokulowane grzybami arbuskularnymi miały znacznie większą masę od mikoryzowych. Zastosowane szczepy grzybów nie zwiększyły również zdolności regeneracyjnych tego gatunku w przypadku symulowanej utraty masy na skutek aktywności zwierząt roślinożernych (WALLING i ZABINSKI 2006). Z kolei w innych badaniach stwierdzono, że symbioza mikoryzowa nie miała wpływu na inwazyjny gatunek wiesiołka Oenothera laciniata i jego zdolność do kolonizacji wydm u wybrzeży Japonii (FUNATSU i współaut. 2005). GRZYBY ARBUSKULARNE NA TERENACH EKSPANSJI ROŚLIN INWAZYJNYCH Podczas gdy grzyby arbuskularne mogą wpływać na inwazyjne gatunki roślin, również rośliny kolonizując dany obszar mogą mieć wpływ na funkcjonowanie grzybów arbuskularnych w tym siedlisku. Wynika to ze zróżnicowanej produkcji wydzielin korzeniowych przez mikoryzowe i niemikoryzowe gatunki roślin inwazyjnych (WOLFE i KLIRO- NOMOS 2005, SHAH i współaut. 2009), przy czym stwierdzono zarówno pozytywny, jak i negatywny wpływ różnych roślin na różnorodność gatunkową grzybów arbuskularnych i liczebność propagul tych mikroorganizmów w glebie. LIANG i współaut. (2004) stwierdzili pozytywny wpływ inwazji Solidago canadensis w Chinach na grzyby arbuskularne. Autorzy wykazali, że liczba gatunków grzybów arbuskularnych wzrastała na terenach kolonizowanych przez nawłoć kanadyjską. Podobną tendencję zaobserwowali HONG-BANG i współaut. (2007), którzy stwierdzili, że Ageratina adenophora, gatunek inwazyjny w lasach Azji, pozytywnie wpływał na wzrost strzępek grzybów arbuskularnych w badanych siedliskach. Zidentyfikowano nawet konkretne grupy związków chemicznych odpowiedzialnych za interakcje grzyb-roślina inwazyjna. Takimi metabolitami są m.in. seskwiterpeny, które stymulują wzrost i rozgałęzianie strzępek grzybów arbuskularnych, a także pozytywnie wpływają na kiełkowanie nasion gatunków inwazyjnych. Umożliwia to szybką kolonizację młodych korzeni przez grzyby (AKIYAMA i współaut. 2005, SHAH i współaut. 2009). Badając inwazję S. canadensis w Chinach, ZHANG i współaut. (2010) przeprowadzili eksperyment laboratoryjny, w którym dowiedli, że nawłoć oddziałuje w zróżnicowany sposób na gatunki grzybów arbuskularnych, wpływając pozytywnie na liczebność jednego gatunku i redukując występowanie innego, dominującego w glebie badanego siedliska. Zmieniając strukturę zbiorowiska grzybów arbuskularnych, S. canadensis wpływa na wzrost swojej konkurencyjności przez stymulację gatunku grzyba wpływającego pozytywnie na jej wzrost, jednocześnie redukując występowanie dominującego gatunku grzyba, który był najbardziej skuteczny w stymulacji wzrostu rodzimych roślin. W badaniach przeprowadzonych przez MUMMEYA i RILLIGA (2006) stwierdzono z kolei spadek różnorodności gatunkowej oraz liczby propagul grzybów arbuskularnych, jako wynik inwazji mikoryzowego gatunku Centaurea maculosa w zbiorowiskach łąkowych stanu Montana. Podobne wyniki otrzymano badając wpływ rodzimego w Polsce, lecz inwazyjnego w lasach Ameryki Północnej czosnaczka pospolitego (Alliaria petiolata), który nie tworzy mikoryzy (ROBERTS i ANDERSON 2001, STINSON i współaut. 2006, CALLAWAY i współaut. 2008). Powodując degradację lokalnych populacji grzybów arbuskularnych, gatunek ten zmieniał środowisko glebowe w kierunku, który był bardziej korzystny dla jego rozwoju niż dla taksonów rodzimych, zależnych od symbiozy z grzybami arbuskularnymi. Oprócz bezpośredniego wpływu roślin inwazyjnych na lokalne populacje grzybów arbuskularnych przez produkcję wydzielin korzeniowych, udowodnione zostało także

132 Czy symbiotyczne grzyby arbuskularne mogą sprzyjać inwazji roślin? 663 oddziaływanie pośrednie przez zmiany we właściwościach fizyko-chemicznych gleb. Zmiany struktury gleby, ph czy też zawartości niektórych pierwiastków mogą mieć znaczący wpływ na różnorodność gatunkową oraz liczebność propagul grzybów arbusku- larnych, co z kolei może oddziaływać zarówno na konkurencyjność roślin rodzimych, jak i inwazyjnych w danym siedlisku (ALLSOPP i HOLMES 2001, BLANK i YOUNG 2002, SHAH i współaut. 2009). PROPOZYCJE PRAKTYCZNEGO ZASTOSOWANIA GRZYBÓW ARBUSKULARNYCH W REWITALIZACJI TERENÓW PO USUNIĘCIU ROŚLIN INWAZYJNYCH W Europie realizowanych jest wiele projektów ochrony przyrody skoncentrowanych na zwalczaniu inwazyjnych gatunków roślin. Ekspansja roślin obcego pochodzenia stwarza szczególne zagrożenie w rezerwatach przyrody i parkach narodowych, gdzie chronione są m.in. najcenniejsze składniki flory. Właśnie na tych obszarach inicjatywy takie są najczęściej podejmowane. W ramach przeprowadzanych projektów przewiduje się trwałe niszczenie stanowisk roślin inwazyjnych poprzez mechaniczne lub ręczne usuwanie roślin (wycinka, wyrywanie, wykopywanie). Działania takie są obecnie praktycznie realizowane w wielu parkach narodowych w Polsce. Przyczyną podjęcia tego typu zabiegów aktywnej ochrony jest znaczny udział gatunków roślin inwazyjnych w szacie roślinnej danego parku, co stanowi duże zagrożenie dla środowiska przyrodniczego danego obszaru (DAJDOK i PAWLACZYK 2009). Po usunięciu z danego terenu roślin inwazyjnych może jednak pojawić się problem ograniczenia występowania lub braku propagul grzybów arbuskularnych w glebie, jako wynik tworzenia zwartych skupień przez niemikoryzowe, bądź też słabo zależne od symbiozy gatunki inwazyjne. Wzrost roślin rodzimych zależnych od symbiozy z grzybami i proces ponownego zasiedlania takiego terenu przez te rośliny może być więc utrudniony. Chcąc przyspieszyć proces kolonizacji roślin autochtonicznych na danym obszarze, istotna byłaby jego rewitalizacja, polegająca na przywróceniu obecności grzybów arbuskularnych i zapewnieniu odpowiedniej dostępności propagul tych mikroorganizmów w glebie. Najprostszym i jak się wydaje najbardziej korzystnym rozwiązaniem przy rewitalizacji terenu po usunięciu roślin inwazyjnych może być przeniesienie wierzchniej warstwy gleby z najbliższego otoczenia, w którym występuje zbiorowisko roślinne zbliżone do tego, które chcemy odtworzyć. Gleba taka zawierałaby bowiem nie tylko propagule lokalnych gatunków grzybów arbuskularnych, ale także inne mikroorganizmy, takie jak np. bakterie, mogące mieć istotne znaczenie dla rozwoju roślin. Wówczas pozostaje jednak problem zniszczenia siedliska, z którego taka warstwa gleby zostanie pobrana. Możliwe jest także zastosowanie gotowych, uniwersalnych inokulów, zawierających pospolite gatunki grzybów arbuskularnych, wyizolowane uprzednio z siedlisk zbliżonych do rewitalizowanego. Obecnie, głównie w Europie Zachodniej oraz Stanach Zjednoczonych Ameryki, działają firmy biotechnologiczne, które w sprzedaży mają tego typu inokula, a także oferują usługi w zakresie rewitalizacji z wykorzystaniem mikroorganizmów glebowych. Z europejskich firm można wymienić m.in. niemieckie Inoq i Mycotec, brytyjską PlantWorks, czeską Symbiom, francuską Biorize oraz szwajcarską Mycosym International. Firmy te specjalizują się głównie w produkcji inokulów do stosowania w ogrodnictwie i rolnictwie. Produkty firmy Inoq były także stosowane przy rewitalizacji terenów alpejskich zniszczonych po zejściu lawin. PlantWorks oraz Symbiom odniosły sukces w zastosowaniu swoich produktów w rewitalizacji hałd przemysłowych czy też terenów nadmorskich południowego wybrzeża Wielkiej Brytanii, na których zdeponowano materiał wydobyty przy budowie Eurotunelu (ZUBEK 2009). Problemem może jednak być koszt zakupu takich inokulów oraz to, czy pospolite gatunki grzybów arbuskularnych w nich zawarte będą skutecznymi symbiontami wspomagającymi rozwój roślin na rewitalizowanym terenie. Przygotowanie inokulum do celów rewitalizacyjnych może odbywać się także z użyciem autochtonicznych szczepów grzybów arbuskularnych i niekoniecznie z pomocą zagranicznych firm biotechnologicznych, a przez naukowców specjalistów zajmujących się mikoryzą. Przy produkcji inokulów używane są podłoża hodowlane będące zwykle mieszaniną piasku, torfu i wermikulitu

133 664 SZYMON ZUBEK (minerał zbliżony do minerałów ilastych). Grzyby arbuskularne jako obligatoryjne symbionty namnażane są w pojemnikach wraz z roślinami tworzącymi mikoryzę (najczęściej jest to kukurydza) w warunkach laboratoryjnych lub szklarniowych. Po okresie wzrostu mikroorganizmów, który trwa minimum trzy miesiące, usuwa się części nadziemne roślin, a podłoże wraz z korzeniami kolonizowanymi przez grzyby, zarodnikami oraz strzępkami grzybów wykorzystuje się jako inokulum (ZUBEK 2009). Przed podjęciem określonych zabiegów praktycznych związanych z zastosowaniem grzybów arbuskularnych w rewitalizacji terenów po usunięciu roślin inwazyjnych, konieczne jest przeprowadzenie badań dotyczących stopnia zmian jakie zaszły w składzie gatunkowym oraz dostępności propagul grzybów arbuskularnych w danym siedlisku na skutek jego kolonizacji przez rośliny inwazyjne. Istotne wydaje się także sprawdzenie, czy rodzime gatunki roślin, które mają ponownie zasiedlić określony teren, są gatunkami mikoryzowymi i w jakim stopniu grzyby arbuskularne wpływają na ich witalność i wzrost. Istotny może być także dobór odpowiednich szczepów grzybów arbuskularnych wykorzystywanych do procesu rewitalizacji, jako że nie wszystkie gatunki, a nawet szczepy grzybów z gromady Glomeromycota pozytywnie i w jednakowym stopniu wpływają na wzrost roślin w określonych warunkach edaficznych. Biorąc jednak pod uwagę pozytywny wpływ grzybów arbuskularnych na rośliny, w przypadku tych gatunków rodzimych, które wykazują zależność od symbiozy mikoryzowej, wskazane byłoby zastosowanie grzybów arbuskularnych na terenie rewitalizowanym. Przy braku tych mikroorganizmów, zapewnienie roślinom zależnym od mikoryzy dostępności propagul odpowiednich gatunków czy też szczepów grzybów, wydaje się być istotne. PODSUMOWANIE Mimo że w skali globalnej inwazje obcych gatunków stanowią obecnie jedno z najbardziej poważnych zagrożeń dla różnorodności biologicznej, a także istotny problem ekonomiczny i zdrowotny, interdyscyplinarne badania mechanizmów inwazji oraz próby kompleksowych rozwiązań problemu ekspansji roślin podejmowane są dopiero od niedawna. Interakcje inwazyjnych gatunków roślin z mikroorganizmami glebowymi są badane obecnie głównie w Ameryce Północnej i Azji Wschodniej. W Europie i w Polsce przeprowadzono do tej pory nieliczne badania na ten temat. W Instytucie Botaniki Uniwersytetu Jagiellońskiego od wielu lat realizowane są projekty naukowe dotyczące rozmieszczenia i ekologii gatunków inwazyjnych. Od 2011 r. badany jest także wpływ grzybów arbuskularnych na gatunki inwazyjne oraz ocena zmian różnorodności gatunkowej i liczebności tych mikroorganizmów glebowych jako skutek inwazji roślin. Być może przyczynią się one nie tylko do poszerzenia wiedzy na temat mechanizmów inwazji, ale będą miały również aspekt praktyczny w postaci opracowania metod rewitalizacji siedlisk po usunięciu gatunków obcych z zastosowaniem grzybów arbuskularnych. CZY SYMBIOTYCZNE GRZYBY ARBUSKULARNE MOGĄ SPRZYJAĆ INWAZJI ROŚLIN? Streszczenie Inwazje obcych gatunków roślin stanowią obecnie jedno z najbardziej poważnych zagrożeń dla różnorodności biologicznej, a także istotny problem ekonomiczny i zdrowotny. Jako że inwazje są wypadkową oddziaływania wielu czynników, badając ich mechanizmy, zwrócono uwagę na interakcje roślin inwazyjnych z symbiotycznymi grzybami arbuskularnymi (Glomeromycota). Rośliny inwazyjne mogą korzystać z obecności grzybów arbuskularnych poprzez (i) mniejsze nakłady na tworzenie systemu korzeniowego, (ii) większą dostępność fosforu, (iii) lepszy wzrost siewek, które zostają włączone w sieć mikoryzową w danym zbiorowisku, a także (iv) przez wzmożoną ochronę przed roślinożercami i patogenami. Symbioza mikoryzowa to spektrum reakcji rośliny na obecność grzyba, które zależne jest od gatunku rośliny i szczepu grzyba oraz warunków fizyko-chemicznych gleby. Dlatego też rośliny inwazyjne nie zawsze czerpią korzyści z obecności partnera grzybowego. Grzyby arbuskularne mogą bowiem spowodować obniżenie witalności i wzrostu danego gatunku rośliny inwazyjnej, co związane jest z wysokimi kosztami utrzymania symbionta grzybowego. Podczas gdy grzyby arbuskularne mogą wpływać na inwazyjne gatunki roślin, również rośliny kolonizując dany obszar mogą mieć wpływ na funkcjonowanie grzybów arbuskularnych w tym siedlisku. Wynika to ze zróżnicowanej produkcji wydzielin korzeniowych

134 Czy symbiotyczne grzyby arbuskularne mogą sprzyjać inwazji roślin? 665 przez mikoryzowe i niemikoryzowe gatunki roślin inwazyjnych, przy czym stwierdzono zarówno pozytywny, jak i negatywny wpływ różnych roślin na różnorodność gatunkową grzybów arbuskularnych i liczebność propagul tych mikroorganizmów w glebie. Badanie interakcji roślin inwazyjnych z grzyba- mi arbuskularnymi może przyczynić się nie tylko do poszerzenia wiedzy na temat ekologii tej grupy roślin, ale również do opracowania metod rewitalizacji siedlisk po usunięciu gatunków obcych z zastosowaniem grzybów arbuskularnych. CAN ARBUSCULAR MYCORRHIZAL FUNGI FACILITATE PLANT INVASIONS? Summary Plant invasions are thought to be one of the most important factors threatening biodiversity on a global scale and also a serious economical and health problem. They are an outcome of interplay between biotic and abiotic factors. Elucidation of all the factors that mediate invasions is therefore of paramount significance in formulating effective strategies for their management. Like most native plants, the performance of many invasive plants may depend upon associations with symbiotic soil microbes such as arbuscular mycorrhizal fungi (AMF; Glomeromycota). Some invasive plants have been reported to be mycorrhiza-dependent and drive mycorrhizal associations to their own benefit in the invaded ecosystem, while others have been shown less responsive to AMF. While AMF have an impact on invasive plants, such plants may also in turn influence AMF community structure and functions in the invaded habitats. Some invasive species stimulate proliferation of AMF in soils due to root exudates that activate AMF. On the contrary, those the invasion of plants with low mycorrhizal dependency or that are non-mycorrhizal may lower AMF diversity and the abundance of propagules in soils, which may be detrimental to the performance of native mycorrhiza-dependent plants. The studies on AMF invasive plant interactions not only broaden the knowledge of ecology of invasive plant species but may also contribute to conservation projects for habitat restoration after invasions through AMF-based soil management. LITERATURA AKIYAMA K., MATSUZAKI K., HAYASHI H., Plant sesquiterpenes induce hyphal branching in arbuscular mycorrhizal fungi. Nature 435, ALLSOPP N. P., HOLMES M., The impact of alien plant invasion on mycorrhizas in mountain fynbos vegetation. S. Af. J. Bot. 67, BLANK R. R., YOUNG J. A., Influence of the exotic invasive crucifer, Lepidium latifolium, on soil properties and elemental cycling. Soil Sci. 167, CALLAWAY R. M., CIPOLINI D., BARTO K., THELEN G. C., HALLETT S. G., Novel weapons: invasive plant suppresses fungal mutualists in American but not in its native Europe. Ecology 89, CAREY E. V., MARLER M. J., CALLAWAY R. M., Mycorrhizae transfer carbon from a native grass to an invasive weed: evidence from stable isotopes and physiology. Plant Ecol. 172, DAJDOK Z., PAWLACZYK P. (red.), Inwazyjne gatunki roślin ekosystemów mokradłowych Polski. Wyd. Klubu Przyr., Świebodzin. DICKSON S., The Arum-Paris continuum of mycorrhizal symbioses. New Phytol. 163, FUMANAL B., PLENCHETTE C., CHAUVEL B., BRETAGNOLLE F., Which role can arbuscular mycorrhizal fungi play in the facilitation of Ambrosia artemisiifolia L. invasion in France? Mycorrhiza 17, FUNATSU Y., NAKATSUBO T., YAMAGUCHI O., HORIKOSHI T., Effects of arbuscular mycorrhizae on the establishment of the alien plant Oenothera laciniata (Onagraceae) on a Japanese coastal sand dune. J. Coast. Res. 21, GIOVANNETTI M., AVIO L., FORTUNA P., PELLEGRINO E., SBRANA C., STRANI P., At the root of the wood wide web. Self recognition and nonself incompatibility in mycorrhizal networks. Plant Signal. Behav. 1, 1 5. GOVERDE M., VAN DER HEIJDEN M. G. A., WIEMKEN A., SANDERS I. R., ERHARDT A., Arbuscular mycorrhizal fungi influence life history traits of a lepidopteran herbivore. Oecologia 125, HONG-BANG N. L., WAN-XUE W., FANG-HAO L. B., An invasive aster (Ageratina adenophora) invades and dominates forest understories in China: altered soil microbial communities facilitate the invader and inhibit natives. Plant Soil 294, KLIRONOMOS J. N., Variation in plant response to native and exotic arbuscular mycorrhizal fungi. Ecology 84, LAAIDI M., LAAIDI K., BESANCENOT J. P., THIBAUDON M., Ragweed in France: an invasive plant and its allergenic pollen. Ann. Allergy Asthma Immun. 91, LIANG J., YONGJIAN G., MING X., JIAKUAN C., BO L., The history of Solidago canadensis invasion and the development of its mycorrhizal associations in newly-reclaimed land. Funct. Plant Biol. 31, MARLER M. J., ZABINSKI C. A., CALLAWAY R. M., Mycorrhizae indirectly enhance competitive effects of an invasive forb on a native bunchgrass. Ecology 80, MIREK Z. (red.), Biological invasions in Poland. Tom 1. W. Szafer Institute of Botany, Polish Academy of Sciences, Kraków. MITCHELL C. E., POWER A. G., Release of invasive plants from fungal and viral pathogens. Nature 421, MUMMEY D. L., RILLIG M. C., The invasive plant species Centaurea maculosa alters arbuscular mycorrhizal fungal communities in the field. Plant Soil 288, OEHL F., SIEVERDING E., PALENZUELA J., INEICHEN K., AL- VES DA SILVA G., Advances in Glomeromycota taxonomy and classification. IMA Fungus 2,

135 666 SZYMON ZUBEK OKARMA H., SOLARZ W., Inwazje biologiczne niedoceniany problem w ochronie przyrody. Wszechświat 110, PIMENTEL D. (red.), Biological invasions: economic and environmental costs of alien plant, animal, and microbe species. CRC, New York. REINHART K. O., PACKER A., VAN DER PUTTEN W. H., CLAY K., Plant-soil biota interactions and spatial distribution of black cherry in its native and invasive ranges. Ecol. Lett. 6, RICHARDSON D. M., ALLSOPP N., D ANTONIO C. M., MIL- TON S. J., REJMANEK M., Plant invasions - the role of mutualisms. Biol. Rev. 75, ROBERTS K. J., ANDERSON R. C., Effect of garlic mustard [Alliaria petiolata (Beib. Cavara & Grande)] extracts on plants and arbuscular mycorrhizal (AM) fungi. Am. Midl. Nat. 146, SHAH M. A., RESHI Z., Invasion by alien Anthemis cotula L. in a biodiversity hotspot: Release from native foes or relief from alien friends. Curr. Sci. 92, SHAH M. A., RESHI Z., KHASA D., Arbuscular Mycorrhizas: Drivers or Passengers of Alien Plant Invasion. Bot. Rev. 75, SMITH S. E., READ D. J., Mycorrhizal symbiosis. Academic Press, London. SOLARZ W., Inwazje biologiczne jako zagrożenie dla przyrody. Postępy w Ochronie Roślin 47, STINSON K. A., CAMPBELL S. A., POWELL J. R., WOLFE B. E., CALLAWAY R. M., THELEN G. C., HALLETT S. G., PRATI D., KLIRONOMOS J. N., Invasive plant suppresses the growth of native tree seedlings by disrupting belowground mutualisms. PloS Biol. 4, c140. ŠTAJEROVÁ K., ŠMILAUEROVÁ M., ŠMILAUER P., Arbuscular mycorrhizal symbiosis of herbaceous invasive neophytes in the Chech Republic. Preslia 81, TOKARSKA-GUZIK B., The establishment and spread of alien plant species (kenophytes) in the flora of Poland. Wyd. Uniw. Śl., Katowice. TOKARSKA-GUZIK B., DAJDOK Z., ZAJĄC M., URBISZ A., DANIELEWICZ W., Identyfikacja i kategoryzacja roślin obcego pochodzenia jako podstawa działań praktycznych. [W:] Synantropizacja w dobie zmian różnorodności biologicznej. KĄCIK Z., STEFAŃSKA-KRZACZEK E. (red.). Acta Bot. Siles. 6, VAN DER HEIJDEN M. G. A., Arbuscular mycorrhizal fungi as support systems for seedling establishment in grassland. Ecol. Lett. 7, WALLING S. Z., ZABINSKI C. A., Defoliation effects on arbuscular mycorrhizae and plant growth of two native bunch grasses and an invasive forb. Appl. Soil Ecol. 32, WANG B., QIU Y. L., Phylogenetic distribution and evolution of mycorrhizas in land plants. Mycorrhiza 16, WOLFE B. E., KLIRONOMOS J. N., Breaking new ground: soil communities and exotic plant invasion. Bioscience 55, ZABINSKI C. A., QUINN L., CALLAWAY R. M., Phosphorus uptake, not carbon transfer, explains arbuscular mycorrhizal enhancement of Centaurea maculosa in the presence of native grassland species. Funct. Ecol. 16, ZHANG Q., YANG R., TANG J., YANG H., HU S., CHEN X., Positive feedback between mycorrhizal fungi and plants influences plant invasion success and resistance to invasion. PLoS ONE 5, e12380, ZUBEK S., Charakterystyka grzybów arbuskularnych i ich praktyczne zastosowanie w uprawach roślin leczniczych. Rośliny Lecznicze w Polsce i na Świecie 1-2,

136 Tom Numer 4 (297) Strony MICHAŁ BOGDZIEWICZ, ALEKSANDRA WRÓBEL Uniwersytet im. Adama Mickiewicza Zakład Zoologii Systematycznej Umultowska 89, Poznań michalbogdziewicz@gmail.com wrobel_a1@wp.pl EKOLOGICZNE ASPEKTY LAT NASIENNYCH U DRZEW* WSTĘP Zależności występujące między organizmami, obok czynników abiotycznych, miały ogromne znaczenie dla ewolucji wszystkich istot żywych i w dużej mierze ukształtowały wiele ich cech. Populacje jednych gatunków wpływają w jakiś sposób na populacje gatunków z nimi współbytujących, a wcale nie rzadko, na charakter tego oddziaływania wpływają pośrednio inne organizmy. Zależność pomiędzy dwoma gatunkami może mieć charakter skrajnie antagonistyczny, np. układ pomiędzy wilkiem a jeleniem, czy rysiem a sarną. W takim wypadku organizm numer jeden wyraźnie cierpi na skutek działalności organizmu numer dwa. Z tak jednostronnego układu przechodzimy przez gradient coraz mniej niekorzystnych układów, przez neutralność, w której organizmy są wobec siebie w pewnym stopniu obojętne, do mutualizmu. W tym przypadku oba gatunki odnoszą korzyść ze wzajemnej działalności. Wszystkim dobrze znane są tak skrajne przykłady mutualizmu, jak nasz ludzki układ z bakteriami jelitowymi, czy współpraca fasoli i bakterii asymilującej dla niej azot. W gradiencie tych oddziaływań mieszczą się też interakcje pomiędzy wieloma gatunkami roślin a ich potencjalnymi nasionożercami. Zależnie od kontekstu ekologicznego (ZWOLAK i CRONE 2012) może być to zależność zarówno antagonistyczna (zjadanie nasion), jak i mutualistyczna (rozpraszanie nasion). Orga- nizmy wzajemnie wpływają na swoją przeżywalność, a przez to na dobór naturalny, który doprowadził do powstania u nich współcześnie występujących cech jest to tzw. koewolucja, czyli współzależna ewolucja co najmniej dwóch gatunków, wskutek wzajemnego oddziaływania na siebie ich osobników. Wiele gatunków drzew na całym świecie nie rozmnaża się każdego roku. Te gatunki rok w rok gromadzą energię, by potem w trakcie jednego sezonu wytworzyć setki tysięcy kwiatów, a następnie nasion. Takie masowe rozmnażanie odbywa się często w ogromnej skali i nazywane jest rokiem nasiennym. Największe zróżnicowanie gatunkowe roślin, u których występuje to zjawisko, pojawia się na średnich szerokościach geograficznych i na półkuli południowej, przy jego jednoczesnym zmniejszaniu się ku równikowi. Przykładem takich gatunków mogą być drzewa z rodziny bukowatych (Fagaceae), jak buki czy dęby. Synchronizacja ta może mieć charakter lokalny, regionalny, a nawet kontynentalny. W Europie były lata, gdy dęby kwitły tej samej wiosny zarówno w Rosji, Polsce, jak i Wielkiej Brytanii. Badania oparte na pomiarach wielkości słojów drzewnych pokazują, że istnieje zauważalna synchronizacja w przechodzeniu z rozwoju wegetatywnego do generatywnego u ogromnej ilości gatunków drzew półkuli północnej (KOENIG i KNOPS 1998). Rodzi się więc pyta- *Praca finansowana z grantu MNiSW NN

137 668 MICHAŁ BOGDZIEWICZ, ALEKSANDRA WRÓBEL nie: jakie czynniki środowiskowe wpłynęły na powstanie tak zagadkowego zjawiska? Do tej pory naukowcy postawili wiele hipotez, które mogą tłumaczyć taką właśnie strategię rozrodczą roślin (KELLY 1994). ULTYMATYWNE PRZYCZYNY WYSTĘPOWANIA LAT NASIENNYCH Jednym z wyjaśnień jest hipoteza oparta na interakcji pomiędzy drzewami wydającymi nasiona a zjadającymi je organizmami. Przykładowo: duże, bogate w składniki pokarmowe nasiona buka (Fagus sylvatica) są oczywistym łakomym kąskiem dla żyjących w lasach myszy leśnych (Apodemus flavicolis), myszy zaroślowych (Apodemus sylvaticus) czy nornic rudych (Myodes glareolus). Potencjalnie więc te małe ssaki są ogromnym zagrożeniem dla próbującego rozmnożyć się drzewa. Odpowiednio duża populacja gryzoni mogłaby przecież zjeść wszystkie nasiona i w dłuższej perspektywie zakończyć egzystencję buków na danym terenie. Tak się jednak nie dzieje. Wiele do tej pory zebranych danych sugeruje, że jedną z ewolucyjnych korzyści lat nasiennych jest kontrolowanie populacji nasionożerców (ang. predator satiation hypothesis). W latach nasiennych buk potrafi zrzucić średnio ponad czterysta nasion na metr kwadratowy, co daje setki kilogramów pożywienia na hektar. Gryzonie, uwolnione jesienią spod czynnika ograniczającego wielkość ich populacji, jakim była dostępność pokarmu, zaczynają masowo się rozmnażać (OSTFELD i współaut. 1996). Zdarza się nawet, że rozmnażają się zimą, osiągając największe zagęszczenie w czasie nadchodzącego lata (PUCEK i współaut. 1993). Wtedy jednak nasion już nie ma. Kończy się więc dla nich okres pokarmowej obfitości i zaczyna ciężki okres, w którym zagęszczenia miejscowych populacji spadną niemal do zera. Jakie korzyści z tego wszystkiego odnosi buk? Potencjalnie, gdyby wydawał nasiona co roku, stały dopływ pokarmu utrzymywałby populacje nasionożerców na stabilnym, wysokim poziomie. Co za tym idzie, frakcja zjadanych przez gryzonie nasion mogłaby osiągnąć bardzo niekorzystną dla drzewa wielkość. Jednak dzięki okresowej produkcji opad nasion jest tak duży, że w danym momencie niewielka populacja gryzoni nie jest w stanie zjeść ich wszystkich. Następuje nasycenie konsumentów, a część nasion otrzymuje szansę ucieczki przed konsumpcją i wykiełkowania nadchodzącej wiosny. Kolejną hipotetyczną, ewolucyjną korzyścią wynikającą z lat nasiennych jest zwiększenie liczby nasion roznoszonych przez zwierzęta (ang. animal dispersal hypothesis). Zwierzęta magazynują pokarm na wiele sposobów (VANDER WALL 1990). W szerokim spektrum tych zachowań na jednym końcu jest znoszenie pokarmu w jedno miejsce, może być to na przykład nora znajdująca się w centrum areału. Zwierzęta, które stosują taką strategię, zazwyczaj aktywnie bronią tego miejsca, a w czasie niekorzystnej pory roku systematycznie wyjadają zmagazynowane pożywienie. Takie zachowanie wydaje się być niekorzystne dla rośliny, która wytworzyła nasiona. Jeśli nawet jakaś ich część nie zostanie zjedzona, spoczywają one najczęściej zbyt głęboko pod powierzchnią ziemi, by mieć szansę na wykiełkowanie. Takim behawiorem wykazuje się między innymi pręgowiec amerykański (Tamias striatus) czy wiewiórka czerwona (Tamiasciurus hudsonicus). Innym typem strategii jest magazynowanie zapasów niezbyt głęboko, w bardzo wielu miejscach. Zwierzę zapamiętuje, gdzie schowało swoje nasiona i liczy, że ewentualni złodzieje ich nie znajdą lub znajdą ich bardzo mało. Nie jest jednak w stanie zapamiętać i odnaleźć wszystkich swoich kryjówek. Magazynuje też zawsze jak największą ilość pokarmu, gdyż nie jest w stanie przewidzieć, jak ostry będzie nadchodzący niekorzystny okres. Jeśli zima okaże się względnie łagodna, prawdopodobnym jest, że nie będzie potrzebowała wszystkich zmagazynowanych nasion. Taką strategię stosują na przykład myszy leśne, czy inny amerykański gatunek wiewiórki Sciurus niger. Na jak dużą skalę odbywa się to zjawisko, pokazuje przykład orzechówki popielatej (Nucifraga columbiana) z zachodniej części Stanów Zjednoczonych. W trakcie jednego sezonu tworzy ona nawet do trzydziestu tysięcy kryjówek zawierających łącznie do stu tysięcy nasion sosny Pinus albicaulis (ALCOCK 2001). Zasugerowano więc, że w czasie, gdy zwierzęta zostaną nasycone przez ogromny opad nasion, zwiększy się frakcja orzeszków przez nie magazynowanych oraz że zwiększą się odległości, na jakie będą one wynoszone. Mniejsza też będzie ilość kryjówek, z których nasiona zostaną zjedzone. O ile wiele zebranych przez

138 Ekologiczne aspekty lat nasiennych u drzew 669 naukowców danych rzeczywiście potwierdza pierwszą część hipotezy, o tyle druga znalazła już dużo mniejsze poparcie empiryczne. Rzeczywiście, w latach nasiennych zwierzęta magazynują więcej nasion, lecz nie zawsze łączy się to z większym dystansem dyspersji (JANSEN i współaut. 2004, VANDER WALL 2010). Pozostaje jeszcze pytanie: dlaczego w danych warunkach środowiskowych dobór naturalny faworyzuje rozsiewanie na dalekie odległości? Oczywistą funkcją zoochorii (czyli roznoszenia diaspor roślin przez zwierzęta) jest zwiększenie dystansu, na jaki mogą nasiona zostać oddalone od rośliny macierzystej. Poza możliwością rozprzestrzeniania się gatunku i kolonizacji nowych terenów, pozwala to przyszłym siewkom uciec przed zwiększoną śmiertelnością na jaką narażone są u podstawy drzewa-matki. Tam bowiem, poza zwiększoną konkurencją, czyli zagrożeniem śmiertelnością zależną od zagęszczenia, czeka na nie też większe prawdopodobieństwo ataku przez patogeny, które w dużym skupieniu występują przy dorosłej roślinie macierzystej (tzw. hipoteza Janzen a-conell a). Patogeny wokół drzewa-matki są potencjalnie lepiej przystosowane do złamania bariery immunologicznej jej potomków. Dzieje się tak przez wielopokoleniowe przystosowanie do jej profilu genetycznego (oczywista różnica między długością wymiany pokoleń u drzew i np. bakterii czy grzybów). Wiele badań sugeruje również, że zwierzęta nie pozostawiają nasion w przypadkowych miejscach, a umieszczają je w mikrosiedliskach, gdzie zwiększone jest prawdopodobieństwo wykiełkowania (WENNY 2001). Podsumowując, w latach nasiennych większa liczba nasion zostaje rozniesiona przez zwierzęta, a ta część z nich, która została zakopana w odpowiednich mikrosiedliskach i doczekała tam spokojnie wiosny, otrzymała zwiększoną szansę na wykiełkowanie. Hipoteza, która jest dobrze udokumentowana i posiada duże poparcie wśród naukowców (np. KELLY 1994, 2001; HOULE 1999; KELLY i SORK 2002), sugeruje zwiększoną efektywność zapylania w czasie lat nasiennych (ang. wind pollination hypothesis). Według niej, lata nasienne powinny być silnie wspierane przez dobór naturalny u gatunków, które mogą osiągnąć większą efektywność zapylenia przez synchronizację kwitnienia. W tym kontekście mówi się głównie o gatunkach zapylanych przez wiatr, a w szczególności o tych, u których istotniejszą niż samozapylenie rolę odgrywa zapylenie krzyżowe. Natomiast u roślin, których pyłek przenoszony jest głównie przez zwierzęta, zachodzi ryzyko nasycenia zapylaczy. Działa tu ta sama zasada, o której pisaliśmy wyżej w kontekście hipotezy nasycenia drapieżników. Mówiąc krótko, ogromna ilość kwiatów mogłaby przerosnąć możliwości miejscowej populacji zapylaczy i duża część organów generatywnych roślin nie zostałaby odwiedzona przez zwierzęta. Oczywiście, nie dzieje się tak u wszystkich gatunków roślin. Istnieją dowody potwierdzające zwiększenie efektywności zapylania przez zwierzęta w czasie lat nasiennych (ang. animal pollination hypothesis). Dzieje się tak na przykład u pochodzącego ze wschodniej części Stanów Zjednoczonych gatunku rośliny kwitnącej Frasera speciosa (TAYLOR i INOUYE 1985). Podobny mechanizm zaobserwowano też u panamskiego gatunku rośliny zielnej Hybanthus prunifolius (AUGSPURGER 1981). Taki system sprawdza się też u niektórych gatunków roślin zapylanych przez pszczoły z rodzaju Apis sp., które są masowo przyciągane do kwiatów, zwiększając efektywność zapylania rośliny. Z kolei w lasach tropikalnych, populacje zapylaczy drzew z rodziny Dipterocarpaceae, dzięki krótkiemu czasowi powstawania kolejnych pokoleń, unikają nasycania ogromną ilością kwiatów przez bardzo szybką odpowiedź w postaci wzrostu liczebności na zmasowane kwitnienie tych roślin. Zwiększony wysiłek w postaci wytworzenia większej ilości kwiatów daje nagrodę w postaci większego prawdopodobieństwa zapylenia. Wysoki udział zapylonych kwiatów sprawia, że drzewo nie marnuje części wysiłku reprodukcyjnego. Jest to tak zwana ekonomia skali. Poza tymi trzema wiodącymi hipotezami zasugerowano jeszcze kilka wyjaśnień omawianego zjawiska. Nie znalazły one jednak aż tak silnego poparcia w danych jak twierdzenia omawiane wyżej. Sprawdzają się one jednak przynajmniej w części ekosystemów, w których były testowane. Warto na pewno wspomnieć tu o dwóch hipotezach wiążących lata nasienne z warunkami pogodowymi. Pierwsza z nich (ang. environmental prediction) sugeruje, że zmasowany wysiłek reprodukcyjny powinien odbyć się w latach, w których warunki pogodowe będą optymalne dla rozmnażania i w których późniejsza szansa na wykiełkowanie wzrośnie dzięki odpowiednim warunkom abiotycznym. Tu jednak nie zebrano zbyt wielu danych terenowych

139 670 MICHAŁ BOGDZIEWICZ, ALEKSANDRA WRÓBEL potwierdzających taki mechanizm. Kolejna (ang. resource matching) postuluje podążanie lat nasiennych za zasobami dostępnymi dla rośliny. Dostępność energii warunkuje wielkość wysiłku włożonego w rozwój organów generatywnych. Bardzo prawdopodobne, że jest to mechanizm ważny dla wielu roślin, u których występuje masowe owocowanie. Ważnym jest, aby podkreślić, że wszystkie te hipotezy nie muszą być rozpatrywane oddzielnie. Wręcz przeciwnie, mogą być komplementarne i nie wykluczać siebie nawzajem. Z doskonałym powodzeniem wszystkie omawiane oddziaływania mogą wpływać na eliminowanie corocznych kwitnięć na korzyść nieregularnych, występujących co kilka sezonów, lat nasiennych. PRZYCZYNY BEZPOŚREDNIE WYSTĘPOWANIA LAT NASIENNYCH Znamy już przypuszczalne ewolucyjne przyczyny omawianego zjawiska. Pozostaje jednak jeszcze jedno bardzo ciekawe pytanie, mianowicie: jak roślinom udaje się zsynchronizować kwitnienie na tak dużą skalę? Jednym z potencjalnych sposobów na synchronizację wielu osobników mogłaby być sygnalizacja chemiczna. Wiadomo, że rośliny wytwarzają i przesyłają różnego rodzaju związki chemiczne, na przykład w odpowiedzi na zgryzanie przez roślinożerców. Jednak, by taka komunikacja mogła zadziałać, rośliny musiałyby pozostawać w bliskiej odległości od siebie. Ten warunek bardzo często nie jest spełniany, zwłaszcza w pofragmentowanym przez człowieka środowisku. Mało prawdopodobnym wydaje się więc, że to komunikacja chemiczna odpowiada za synchronizację tak wielu osobników, w tak dużej skali. W roku 1997 ISAGI wraz z współpracownikami stworzyli prosty model tłumaczący, w jaki sposób mogłaby odbywać się synchronizacja kwitnienia roślin tego samego gatunku na danym obszarze. Model ten, później w dużej mierze rozwinięty przez SA- TAKE i IWASA (2000), zakłada powiązanie roślin przez pyłek. Mechanizm zatem kryje się w wzajemnej zależności roślin od produkowanych przez inne osobniki gamet. W skrócie: gdy roślinom z danej populacji uda się nazbierać odpowiednią ilość energii - kwitną. By kwiaty mogły przekształcić się w owoce, potrzebny jest pyłek, który może zostać dostarczony przez współwystępujących w danej okolicy przedstawicieli tego samego gatunku. Jeśli pyłek jest dostępny, rośliny wydają kolejną porcję energii na owoce i w ten sposób kończą sezon z podobnym deficytem energetycznym. Będą go musiały więc razem odrabiać przez najbliższe kilka lat. W momencie, gdy znów osiągną odpowiedni poziom, proces się powtórzy. Wszystkie inne osobniki, które zakwitną w innym czasie niż populacja na danym terenie, nie wytworzą owoców. W związku z tym, pozostanie im wystarczająca ilość energii, by zakwitnąć kolejnego lata. Teoretycznie więc będą kwitnąć rok w rok, dopóki nie nastąpi synchronizacja z innymi roślinami. Działanie takiego mechanizmu udowodniła CRONE ze współpracownikami (2005, 2009) na przykładzie amerykańskiego gatunku traganka (Astragalus scaphoides). Serią pomysłowych eksperymentów udało jej się wykazać, że zapobiegnięcie wytworzeniu owoców przez rośliny znacznie zwiększa prawdopodobieństwo ich zakwitnięcia kolejnej wiosny. Tego rodzaju mechanizm jest w stanie wyjaśnić, w jaki sposób mogłaby odbywać się synchronizacja populacji jednego gatunku. Jednak w przyrodzie często zdarza się, że lata nasienne mogą występować w tym samym czasie u wielu gatunków roślin. Badania prowadzone przez SCHAUBERA i współpracowników (2002) w Nowej Zelandii pokazują synchronizację tego zjawiska nawet u siedemnastu gatunków, należących do czterech różnych rodzin. CURRAN wraz z zespołem (1999) badała rośliny należące do dwuskrzydłowatych (Dipterocarpaceae), rodziny drzew dominującej na wyspie Borneo. Wykryła ona międzygatunkową zgodność w występowaniu lat nasiennych u przynajmniej pięćdziesięciu gatunków należących do tej rodziny. Tego rodzaju synchronizacji nie można już tłumaczyć powiązaniem roślin przez pyłek. W takich przypadkach zazwyczaj istnieje zależność pomiędzy warunkami pogodowymi (w szczególności takimi jak temperatura i wilgotność) jakie miały miejsce latem a prawdopodobieństwem wystąpienia roku nasiennego w kolejnym sezonie (lub też dwa lata później, zależnie od gatunku). U roślin tropikalnych sygnałem do wytworzenia kwiatów może być spadek najniższej temperatury w ciągu nocy o ok. 2 C przez co najmniej 4 kolejne noce, a w miejscach z regularnie występującymi pożarami

140 Ekologiczne aspekty lat nasiennych u drzew 671 takim czynnikiem może być ogień (KELLY i SORK 2000). Mechanizm ten nie jest jednak tożsamy z hipotezą o wpływie dostępności pierwiastków biofilnych na pojawianie się lat nasiennych. W tym przypadku warunki pogodowe są jedynie sygnałem, który inicjuje u roślin rozwój generatywny. Przykładowo, u naszego gatunku buka jest to prawdopodobnie wysoka temperatura połączona z niską wilgotnością w lipcu (oczywiście, te dwa czynniki są ze sobą skorelowane). Co ciekawe, adaptacyjną odpowiedzą buka na stres termiczny jest między innymi zmiana architektury korony oraz pozbycie się części liści z jej górnej warstwy. Zmniejsza to ilość ciepła, jakie przyjmuje drzewo, jednocześnie zmieniając warunki świetlne w podszycie na kilka lat. Sugeruje się więc, że mogłoby to zwiększyć szansę nasion na wykiełkowanie, a później przejście w stadium siewki (PIOVESAN i ADAMS 2005). Innym wyjaśnieniem międzygatunkowej synchronizacji może być model podobny do omawianej wcześniej koncepcji Satake i Iwasa. Ci naukowcy wraz z Yuuya Tachiki (TACHIKI i współaut. 2010) rozwinęli swój model, zastępując powiązanie przez pyłek, powiązaniem przez zapylaczy. W swojej pracy opisują oni model, według którego gatunki danego terenu będą razem kwitnąć jeśli liczba zapylaczy-generalistów będzie wzrastała odpowiednio szybko w odpowiedzi na ogromną ilość kwiatów dostępną w czasie takiego wydarzenia. Należy jednak również tutaj podkreślić, że wszystkie omówione czynniki sprzyjające synchronizacji roślin nie są rozłączne. Gatunki mogą być zarówno powiązane ze sobą przez pyłek, zapylaczy, jak i wykorzystywać pogodę jako wskazówkę do rozpoczęcia rozmnażania. KASKADY TROFICZNE Dostarczanie tak dużych ilości pożywienia w kilkuletnich odstępach czasu ma ogromny wpływ na środowisko. Pojawianie się lat nasiennych wyraźnie odbija się na funkcjonowaniu całych ekosystemów, a ich efekty są widoczne na poszczególnych ogniwach sieci troficznych. Nie sposób wymienić i opisać wszystkich, czy choćby większości z nich, ze względu na całą gamę mniej lub bardziej odmiennych środowisk. Opiszemy więc krótko kilka przykładów, które zarysują skalę zjawiska. Jak, ogólnie rzecz biorąc, lata nasienne mogą wpływać na organizmy koegzystujące z drzewami? Widoczne jest to szczególnie w roku następującym po tym zjawisku. Nagłe skoki liczebności nasionożerców są chyba najwyraźniejszym tego wynikiem. Niewielkie dotąd populacje mogą przeżyć swego rodzaju sezonowy boom liczebności. I tak, na przykład, w 2009 swój rok nasienny w zachodniej Polsce przeżył buk zwyczajny, co odbiło się w 2010 r. wyraźnym echem na populacjach gryzoni żerujących na jego nasionach. Według danych naukowców Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza, zagęszczenia myszy leśnych (Ryc. 1) w północno-zachodniej części Polski zwiększyły się z zaledwie kilku osobników na hektar w 2009 r. do kilkudziesięciu w 2010 r. Wcześniej, podobne wyniki uzyskali naukowcy z Instytutu Badania Ssaków w Białowieży (PUCEK i współaut. 1993). W swoich długoterminowych badaniach pokazali oni, w jak drastyczny sposób odpowiadają populacje myszy leśnych i nornic rudych na lata nasienne między innymi grabu (Carpinus betulus) i dębu (Quercus robur). Przenosząc się na północnoamerykańskie rejony możemy dostrzec podobne zależności. Populacja tamtejszego ekologicznego odpowiednika naszych myszy, rodzaju Peromyscus, gwałtownie się zwiększa w sezonie po roku nasiennym m. in. dębu czerwonego (Quercus rubra) i dębu białego (Quercus alba). Dlaczego tak się dzieje? Związek Ryc. 1. Mysz leśna (Apodemus flavicollis) fot. Ivan Baláž.

141 672 MICHAŁ BOGDZIEWICZ, ALEKSANDRA WRÓBEL wydaje się oczywisty: im więcej dostępnego pokarmu, tym mniejsza jest konkurencja między gryzoniami, w tym lepszej kondycji zwierzęta się znajdują, tym więcej miotów są w stanie wychować i wykarmić w ciągu roku (OSTFELD 2002). W klimacie umiarkowanym drzewa owocują zwykle jesienią. W tym czasie zwierzęta nie próżnują i gromadzą opadłe owoce bądź nasiona w specjalnie przeznaczonych kryjówkach, zazwyczaj zakopując je w ściółce lub pozostawiając pod liśćmi. W trakcie trwania roku nasiennego siedlisko obfituje w pokarm, toteż ilość i jakość takich spiżarni się zwiększa. A, jak już wcześniej wspomnieliśmy, ilość i obfitość takich spiżarni sprzyja rozsiewaniu i kiełkowaniu drzew. Popielica (Glis glis), będąca gatunkiem obcym w Anglii razem z wiewiórką szarą (Sciurus carolinensis), jest skrajnym przykładem wpływu pojawiania się lat nasiennych na sukces rozrodczy. Żyje ona w lasach z przewagą buka zwyczajnego, zjadając ogromne ilości jego nasion. Z tym że, w przeciwieństwie do żerującej na ziemi wiewiórki szarej, zdobywa ona orzechy znajdujące się jeszcze w koronie drzew. Okazuje się, że jest ona w stanie odchować młode jedynie w roku nasiennym. W innych latach nie wydaje na świat młodych lub rodzi ich bardzo niewiele (THOMAS i PACKHMAN 2007). Podobnie sprawa wygląda w przypadku nowozelandzkich papug kaka (Nestor meridionalis) i kakapo (Strigops habroptilus). Oba gatunki rozmnażają się jedynie w czasie owocowania drzew, które są ich bazą pokarmową. Tutaj jednak pozostają inne kwestie do rozważenia, bowiem gatunki te, mimo dodatkowego dokarmiania, nie rozmnażają się, jeśli nie występuje rok nasienny. Może to oznaczać, że czynniki, które wpływają na wydanie owoców przez drzewa, oddziałują również na rozrodczość tych ptaków (THOMAS i PACKH- MAN 2007). Co ciekawe, w ten sposób stają się one jednymi z niewielu dotąd znanych przykładów kręgowców, u których występuje synchronizacja rozpoczęcia rozrodu, połączona z kilkuletnimi przerwami pomiędzy rozmnażaniem. Typowym przykładem tego typu strategii rozrodczych wśród zwierząt są amerykańskie cykady (Magicicada sp.). Owady te żyją w postaci poczwarki przez trzynaście bądź siedemnaście lat, by po upływie tego czasu wyjść na powierzchnię ziemi jako imago i rozpocząć rozród. Idąc dalej wzdłuż sieci zależności pokarmowych: zmiany w populacjach nasionożerców oraz roślinożerców siłą rzeczy muszą mieć swoje odzwierciedlenie, zarówno bezpośrednie, jak i pośrednie, w populacjach drapieżników. Wzrost populacji myszaków, czy pręgowca amerykańskiego, będący odpowiedzią na rok nasienny dębu, wywołuje kaskadę bezpośrednich i pośrednich efektów widocznych u innych organizmów współwystępujących z tymi zwierzętami. Zmniejszenie się ilości pokarmu w postaci nasion po upływie roku nasiennego w połączeniu z wysoką liczebnością populacji gryzoni powoduje ich zwiększone drapieżnictwo względem jaj różnych gatunków ptaków śpiewających, co może znacząco zmniejszyć ich sukces lęgowy (SCHMIDT i OSTFELD 2003). Tak dzieje się na przykład u północnoamerykańskich gatunków drozdowatych Catharus fuscescens czy wireonka czerwonookiego (Vireo olivaceus). Za zwiększoną liczebnością gryzoni na danym terenie podąża często zwiększona liczba drapieżników. Przykładowo, w Ameryce Północnej na terenach, gdzie nastąpił wysyp małych ssaków po roku nasiennym, odnotowuje się też więcej ptaków drapieżnych, takich jak jastrzębie Accipiter cooperii czy Accipiter striatus. Taka sytuacja ma ciekawe implikacje dla populacji wcześniej wspomnianych ptaków śpiewających. Jak pokazują badania SCHMIDTA i OSTFELDA (2008), populacje badanych gatunków drozdowatych mają się najlepiej w latach, gdy wielkość populacji gryzoni znajduje się na średnim poziomie. W sytuacji, gdy gryzoni jest mało, jastrzębie zmieniają obiekt polowań i przestawiają dietę z trudno znajdywanych gryzoni na ptaki. Natomiast w latach, gdy gryzoni jest wiele, mimo że drapieżniki zmniejszają swą presję na drozdach (na niekorzyść małych ssaków), znacząco zwiększają się straty w lęgach powodowane właśnie przez zwiększone populacje gryzoni. Podobną funkcjonalną odpowiedź w postaci zmiany diety wykazują europejskie gatunki leśnych drapieżników-generalistów; przykładowo: puszczyk zwyczajny (Strix aluco) czy kuna leśna (Martes martes). Gdy wielkość populacji gryzoni spadnie poniżej pewnej wartości krytycznej, przestawiają one się na inne ofiary, którymi bardzo często są małe ptaki. Natomiast im więcej myszy, tym mniejszy udział innych zwierząt w diecie tych drapieżników (JĘDRZEJEWSKA i JĘDRZEJEWSKI 1998). Jak się okazuje, lata nasienne wpływają również na pasożyty. We wschodniej części Stanów Zjednoczonych populacje inwazyjnego gatunku ćmy brudnicy nieparki (Lymantria dispar) mogą być kontrolowane

142 Ekologiczne aspekty lat nasiennych u drzew 673 przez współwystępujące z nimi na danym terenie myszaki. Jak pisaliśmy wcześniej, rok po owocowaniu dębu czerwonego znacznie zwiększają się zagęszczenia populacji tych gryzoni. W tym czasie też zwiększa się presja drapieżnicza, jaką wywierają te ssaki na poczwarkach brudnicy. Eksperymenty pokazały, że w latach, kiedy gryzoni jest dużo, ilość zjadanych przez nie poczwarek wzrasta na tyle, że mogą stać się one przyczyną zatrzymania gradacji tego owada (JONES i współaut. 1998). Brudnica nieparka jest groźnym pasożytem dębu, mogącym wyrządzić szkody na obszarze milionów hektarów, tak więc opisany proces może w pewien sposób chronić drzewa przed tym pasożytem. Z drugiej jednak strony, gdy do gradacji już dojdzie, występowanie lat nasiennych na danym terenie może zostać zatrzymane. Nie pozwoli więc to populacjom gryzoni na osiągnięcie zagęszczeń mogących chronić drzewa przed kolejnymi atakami ćmy. Jak widać, efekty masowego owocowanie drzew mogą być bardzo skomplikowane i trudne do przewidywania. Kolejnym, ważnym z punktu widzenia epidemiologicznego, skutkiem lat nasiennych są zwiększone zagęszczenia występowania kleszczy dwa lata po tym zjawisku. W przypadku amerykańskich gatunków dębów, ogromna ilość dostępnych żołędzi przyciąga zwierzęta kopytne, przykładowo jelenia wirgińskiego (Odocoileus virginianus). W czasie lat nasiennych spędza on nawet czterdzieści procent swojego czasu na żerowaniu w lasach dębowych (w latach, gdy nasion nie jest tak dużo, wynosi to około pięciu procent). Dorosłe kleszcze (Ixodes scapularis) żerują i rozmnażają się na jeleniach, zanim jesienią spadną na ziemię, by złożyć jaja. Wylęgające się młode natrafiają na zwiększoną po roku nasiennym populację myszaków amerykańskich (Peromyscus leucopus), które są dla nich jednym z gospodarzy. Jednocześnie są one w przeważającej mierze odpowiedzialne za infekowanie larw kleszczy krętkiem Borellia burgdorferi. Larwy te przeistaczają się w nimfy, które zimują na dnie lasu. Kolejnej wiosny na tym terenie zagęszczenia populacji kleszczy mogą być nawet sześć razy większe niż w zazwyczaj (JONES i współaut. 1998). Ciągnie to za sobą istotne konsekwencje - zagęszczenie zainfekowanych kleszczy może znacząco zwiększyć ryzyko zachorowań na boreliozę u ludzi odwiedzających dane lasy. Dzik (Sus scrofa) jest popularnym przykładem wszystkożercy, żyjącym w większości lasów klimatu umiarkowanego. Odżywia się m. in. owadami, korzeniami, grzybami oraz oczywiście nasionami. W latach, gdy następuje masowe owocowanie dębu, wyraźnie wzrasta jego sukces rozrodczy. Duża liczba i wysoka przeżywalność warchlaków wiosną i latem po roku nasiennym, powoduje gwałtowny wzrost zagęszczenia populacji tego gatunku. Jednakże, gdy kończą się nasiona i przychodzi zima, śmiertelność młodych dzików raptownie się zwiększa. Padłe zwierzęta stają się ważną częścią diety jenota (Nyctereutes procyonoides), który prawdopodobnie w czasie obfitości padliny zmniejsza swoją presję na innych zwyczajowych składnikach jego diety, którymi mogą być między innymi gryzonie, ryjówki, płazy, czy bezkręgowce (THOMAS i PACKHMAN 2007). PODSUMOWANIE Wyraźna zmienność w produkcji nasion od dawna fascynuje naukowców i przyrodników. Jesteśmy w stanie wysnuć wiele odmiennych hipotez odnośnie przyczyn powstania lat nasiennych u wielu gatunków drzew. Może mieć to na celu ograniczenie populacji organizmów mogących wyrządzić im szkody, umożliwienie rozprzestrzenienia się diaspor, ułatwienie zapylenia, zapewnienie dogodnych warunków do rozmnażania i wiele innych. Mimo konkurencji nasion lub siewek o zasoby po roku nasiennym i ich dużej utraty w wyniku skonsumowania ich przez zwierzęta, wydaje się to być dla nich dużo bardziej korzystne niż wydawanie co roku podobnej ilości diaspor. Część hipotez może być weryfikowana na podstawie wyników badań nad określoną grupą gatunków, pozostałe na podstawie wyników badań nad innymi grupami, ponieważ jedna cecha przystosowawcza nie wyklucza drugiej. Drzewa, jako podstawa ekosystemów leśnych, w ogromnym stopniu determinują dynamikę populacji innych gatunków począwszy od niewielkich pasożytów nasion, poprzez większych roślinożerców, a kończąc na drapieżcach. Niestety, już dziś wiadomo, że odstępy między latami nasiennymi maleją, jako że pogoda i klimat mogą wywierać wpływ na pojawianie się owocowania u drzew. Na przykład, dane zebrane w Szwecji ukazują, że jeszcze do początku lat 60. XX w. przerwy

143 674 MICHAŁ BOGDZIEWICZ, ALEKSANDRA WRÓBEL pomiędzy latami nasiennymi trwały średnio od czterech do sześciu lat. W wyniku ocieplenia klimatu w ciągu ostatnich trzech dekad przerwa ta zmniejszyła się do średnio dwóch i pół roku (OVERGAARD i współaut. 2007). Zmiany takie obserwuje się w wielu miejscach na świecie i z pewnością nie pozostaną one obojętne dla wielu opisanych wyżej gatunków, otwierając pole do nowych badań. EKOLOGICZNE ASPEKTY LAT NASIENNYCH U DRZEW Streszczenie Masowa, synchroniczna produkcja nasion, bardzo często w ogromnej skali, nazywana jest rokiem nasiennym. Przedstawiamy krótki przegląd głównych hipotez wyjaśniających, jakie czynniki ewolucyjne (ultimate factors) mogły wpłynąć na pojawianie się lat nasiennych u wielu gatunków w różnych częściach globu oraz oddziaływanie tego zjawiska na ekosystemy. Jedna z hipotez zakłada, że zjawisko to pozwala roślinom kontrolować populacje potencjalnych nasionożerców, przez co konsumowany jest mniejszy procent nasion i większa ich frakcja ma szansę wykiełkować w nadchodzącym sezonie wegetacyjnym. Inna podkreśla związek między latami nasiennymi a efektywnością rozsiewania na większe odległości, co wiąże się z m. in. mniejszym prawdopodobieństwem ich zjedzenia oraz zwiększonym prawdopodobieństwem wykiełkowania. Masowa zsynchronizowana produkcja jest być może skutkiem większej efektywności zapylania w tych latach, zarówno przez wiatr, jak i zwierzęta. Jednak wszystkie te wyjaśnienia nie są rozłączne, a lata nasienne mogą mieć więcej, jak jedną ewolucyjną przyczynę. Omawiamy również przypuszczalne uwarunkowania, które przyczyniają się do występowania tego fenomenu (proximate factors). Synchronizacja całych populacji może odbywać się m. in. przez powiązanie roślin przez pyłek lub zapylaczy. Ważną rolę w tym procesie odgrywają również warunki pogodowe. Zilustrowane zostały także wybrane kaskady troficzne spowodowane istnieniem lat nasiennych, przykładowo: obfity opad nasion bezpośrednio wpływa na populacje odżywiających się nimi gryzoni, a przez to pośrednio na sukces lęgowy ptaków śpiewających, hamowanie gradacji pasożytniczych owadów, a nawet ryzyko zakażeń boreliozą. Globalne ocieplenie wpływa na zmniejszanie się odstępów między latami nasiennymi, co może przyczyniać się do zachodzących zmian w interakcjach między organizmami związanymi z tym zjawiskiem. ECOLOGICAL ASPECTS OF MAST SEEDING IN TREES Summary We briefly review the evolutionary causes of mast seeding and the influence of masting on ecosystems. One of the first explanations of masting was the predator satiation hypothesis that states that the advantage of producing a large seed crop is satiation of seed predators, which thus destroy a lower percentage of the crop. Alternatively, animal dispersal hypothesis postulates that mast years result in wider dispersal of nuts by scatter hoarders, reduced probability of eating cached seeds by a hoarder, and thus enhanced likelihood of germination and seedling establishment. It is also documented that large flowering efforts increase chances of successful wind- and animal-mediated pollen transfer (wind and animal pollination hypotheses). However, these hypotheses are not mutually exclusive and it is possible that masting has more than just one evolutionary cause. We also present the proximate factors thought to explain the phenomenon of intermittent, synchronous seeding. We describe pollen and pollinator coupling model and the role of weather cues in synchronizing plant populations over large areas. Finally, we describe trophic cascades caused by mast seeding. For example, large seed crops directly influence populations of granivorous rodents and thus indirectly alter the nest success of song birds, stop the gradation of insect pests, and change the risk of Lyme disease transmission. Such interactions might be altered when the interval between masting events decreases due to global warming. LITERATURA ALCOCK J., Animal behavior: an evolutionary approach. Wyd. 7. Sinauer Associates, Sunderland. AUGSPURGER C. K., Phenology, flowering synchrony, and fruit set of six neotropical shrubs. Biotropica 15, CRONE E. E., POLANSKY L., LESICA P., Emperical models of pollen limitation, resource acquisition, and mast seeding by a bee-pollinated wildflower. Am. Natur. 166, CRONE E. E., MILLER E., SALA A., How do plants know when other plants are flowering? Resource depletion, pollen limitation and mastseeding in a perennial wildflower. Ecol. Lett. 12, CURRAN L. M., CANIAGO I., PAOLI G. D., ASTIANTI D., KUSNETI M., LEIGHTON M., NIRARITA C. E., HAERU- MAN H., Impact of El Nino and logging on conopy recruitment in Borneo. Science 286,

144 Ekologiczne aspekty lat nasiennych u drzew 675 HOULE G., Mast seeding in Abies balsamea, Acer saccharum and Betula alleghaniensis in an old growth, cold temperate forest of northeastern North America. J. Ecol. 87, ISAGI Y., SUGIMURA K., SUMIDA A., ITO H., How does masting happen and synchronize? J. Theor. Biol. 187, JANSEN P. A., BONGERS F., HEMERIK L., Seed mass and mast seeding enhance dispersal by a neotropical scatter-hoarding rodent. Ecol. Monogr. 74, JĘDRZEJEWSKA B., JĘDRZEJEWSKI W., Predation in vertebrate communities: the Białowieża Primeval Forest as a case study. Ecol. Stud. 135, Springer, New York. JONES C. G., OSTFELD R. S., RICHARD M. P., SCHAUBER E. M., WOLFF J. O., Chain reactions linking acorn to gypsy moth outbreaks and Lyme disease risk. Science 279, KELLY D., The evolutionary ecology of mast seeding. Trends Ecol. Evol. 9, KELLY D., Evaluating the wind-pollination benefits of mast seeding. Ecology 82, KELLY D., SORK L., Mast seeding in perennial plants: why, how, where? Annu. Rev. Ecol. Syst. 33, KOENIG W. D., KNOPS J. M. H., Scale of mastseeding and tree-ring growth. Nature 396, OSTFELD R. S., Ecological webs involving acorns and mice. [W:] Oak forest ecosystems. ecology and management for wildlife. MCSHEA W. J., HEALY W. M. (red). The John Hopkins University Press, Baltimore, OSTFELD R. S., JONES C. G., WOLFF J. O., Of mice and mast. Bioscience 46, OVERGAARD R., GEMMEL P., KARLSSON M., Effects of weather conditions on mast year frequency in beech (Fagus sylvatica L.) in Sweden. Forestry 80, PUCEK Z., JĘDRZEJEWSKI W., JĘDRZEJEWSKA B., PUCEK M., Rodent population dynamics in a primeval decidous fores (Białowieża National Park) in relation to weather, seed crop, and predation. Acta Theriol. 38, PIOVESAN G., ADAMS J. M., The evolutionary ecology of masting: does the environmental prediction hypothesis also have a role in mesic temperate forests? Ecol. Res. 20, SATAKE A., IWASA Y., Pollen coupling of forest trees: forming synchronized and periodic reproduction out of chaos. J. thoer. Biol. 203, SCHAUBER E. M., KELLY D., TURCHIN P., SIMON C., LEE W. G., ALLEN R. B., PAYTON I. J., WILSON P. R., COWAN P. E., BROCKIE R. E., Masting by eighteen New Zealand plant species: the role of temperature as a synchronizing cue. Ecology 8, SCHMIDT K. A., OSTFELD R. S., Songbird populations in fluctuating environments: predator responses to pulsed resources. Ecology 84, SCHMIDT K. A., OSTFELD R. S., Numerical and behavioral effects within a pulse-driven system: consequences for shared prey. Ecology 89, TAYLOR O. R., INOUYE D. W., Synchrony and Periodicity of Flowering in Fraser Speciosa (Gentianaceae). Ecology 66, TACHIKI Y., IWASA Y., SATAKE A., Pollinator coupling can induce synchronized flowering in different plant species. J. Theor. Biol. 267, THOMAS P. A., PACKHMAN J. R., Ecology of woodlands and forests: description, dynamics and diversity. Cambrigde University Press, Cambridge. VANDER WALL S. B., Food hoarding in animals. University of Chicago Press, Chicago. VANDER WALL S. B., How plants manipulate the scatter-hoarding behavior of seed-dispersing animals. Phil. Trans. R. Soc. 365, WENNY D. G., Advantages of seed dispersal: a re-evaluation of directed dispersal. Evol. Ecol. Res. 3, ZWOLAK R., CRONE E. E., Quantifying the outcome of plant-granivore interactions. Oikos 121,

145

146 Tom Numer 4 (297) Strony ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA Katedra Mikrobiologii Uniwersytet Rolniczy w Krakowie Al. Mickiewicza 24/28, Kraków annalenart82@gmail.com WYKORZYSTANIE OSADU CZYNNEGO W OCZYSZCZANIU ŚCIEKÓW WSTĘP W porównaniu do krajów sąsiednich zasoby wodne Polski są ubogie. Raport Głównego Inspektoratu Ochrony Środowiska (AL- BINIAK 2010) podaje, że zasoby te wynoszą ok m 3 /rok/mieszkańca, co stanowi 36% średniej europejskiej. Profil przemysłowy państwa, liczba ludności, warunki geograficzne i hydrograficzne powodują, że mamy do czynienia z deficytem wód. Mimo że stan czystości wód Polski uważa się za stosunkowo zły, to wg raportu GIOŚ w ostatnich latach stan wód w polskich rzekach poprawia się. Niewątpliwie ma na to wpływ postęp w technologii oczyszczania ścieków i większa świadomość jak ważnym procesem jest oczyszczanie ścieków, które można rozumieć jako odzyskiwanie wody zdatnej do użytku. Znaczna część wód w Polsce jest skażona mikroorganizmami chorobotwórczymi, co dyskwalifikuje je pod względem przydatności do użytku w gospodarstwach domowych. Wpływ na ten stan ma fakt, że przeważająca ilość ścieków bytowo-gospodarczych odprowadzana jest bez oczyszczenia. Zanieczyszczenia mikrobiologiczne skutecznie usuwane są w procesie oczyszczania metodą osadu czynnego. Obecnie na terenie Polski obok przemysłowych oczyszczalni chemicznych przeważają oczyszczalnie biologiczne z wykorzystaniem tej właśnie metody. Metoda osadu czynnego jest jedną z najpopularniejszych i najskuteczniejszych metod biologicznego oczyszczania ścieków. Przy jej zastosowaniu usuwane są zanieczyszczenia chemiczne i biologiczne, bez szkodliwego wpływu na środowisko. Sam osad czynny to żywa kłaczkowata zawiesina mikroorganizmów, spośród których każdy odgrywa swoją rolę w procesie oczyszczania. Metoda osadu czynnego jest na tyle bezpieczna i uniwersalna, że może być stosowana w przydomowych systemach oczyszczania ścieków. PODZIAŁ I OGÓLNA CHARAKTERYSTYKA ŚCIEKÓW W ogólnym rozumieniu ściekami nazywa się wszystkie zużyte ciecze, koloidy, a także znajdujące się w nich odpadowe ciała stałe, które wskutek przemian fizycznych, chemicznych i biologicznych nie mogą być użyte do pierwotnego celu. Ze względu na pochodzenie ścieki dzielimy na bytowo-gospodarcze, przemysłowe, rolnicze oraz wody opadowe, infiltracyjne i podgrzane (BARTO- SZEWSKI 1997, CYWIŃSKI i współaut. 1983). Ścieki bytowo-gospodarcze powstają wskutek zaspokajania codziennych potrzeb człowieka. W przypadku takich ścieków dokonuje się podziału na tzw. odciek z urządzeń gospodarczych oraz odciek pochodzący z toalet, skażony dużą ilością patogenów, takich jak bakterie chorobotwórcze oraz jaja pasożytów (BŁASZCZYK 2007). Ścieki przemysłowe powstają w wyniku procesów produkcyjnych. Nie ma jednego,

147 678 ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA typowego składu ścieków przemysłowych, ponieważ zależy on od profilu działalności zakładu, z którego ścieki są odprowadzane. Są one jednym z najbardziej niebezpiecznych rodzajów ścieków, z uwagi na często toksyczny, trudny do neutralizacji skład. Na neutralizację ścieków przemysłowych kładziony jest szczególny nacisk; niejednokrotnie wymaga to skomplikowanych i drogich procesów. Ścieki rolnicze pochodzą z wód spływających z pól i gospodarstw rolniczych. Zawierają substancje pochodzenia naturalnego i technicznego o różnym stężeniu. Najpowszechniej odprowadzanym ściekiem rolniczym jest gnojówka. O ile duże gospodarstwa rolne są zwykle regularnie kontrolowane, to ścieki z tych małych gospodarstw często odprowadzane są nielegalnie. Do ścieków zalicza się także wody pochodzące z opadów atmosferycznych, topniejącego śniegu i lodu z terenów zanieczyszczonych, w tym z centrów miast, terenów przemysłowych, baz transportowych i dróg wraz z parkingami. Ścieki te nazywane są ściekami opadowymi. Ścieki deszczowe są stosunkowo czyste, niebezpieczne są jednak wody pochodzące z opadów atmosferycznych o odczynie mniejszym niż 5,6. Wody te mają w składzie kwasy powstałe wyniku reakcji wody z zawieszonymi w powietrzu gazami. Ponadto w zimie wody pochodzące ze spływów z ulic i chodników zawierają znaczne ilości chlorku sodu, co może być przyczyną nadmiernego zasolenia okolicznych gleb i wód. Wody infiltracyjne i drenażowe, to wody podziemne dostające się do ścieków w wyniku nieszczelności kanalizacji. Wody te mają duży udział w ściekach miejskich, rozrzedzając je, co w przypadku oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego jest zjawiskiem niekorzystnym. Wody podgrzane, wykorzystane uprzednio do chłodzenia często są traktowane jako wody umownie czyste, jednak bywają niebezpieczne dla flory i fauny zbiorników o słabym przepływie wody, gdyż przyczyniają się do eutrofizacji. Ścieki te są najczęściej ubocznym efektem działalności elektrowni i elektrociepłowni. Ścieki miejskie są połączeniem ścieków pochodzących z gospodarstw domowych, przemysłu, zakładów usług komunalnych, wód infiltrujących, opadów i nielegalnego dopływu ścieków. Cechuje je duża różnorodność składu z uwagi na zróżnicowany profil działalności przemysłowej miast. W dużych, uprzemysłowionych miastach udział ścieków zanieczyszczonych chemicznie jest większy niż w małych miasteczkach. Nie ma typowego składu ścieków miejskich, należy więc je monitorować, aby móc dobrać odpowiedni, skuteczny program ich oczyszczania (BAR- TOSZEWSKI 1997, CYWIŃSKI i współaut. 1983) Zanieczyszczenia ścieków można podzielić według kilku kryteriów. Ze względu na ich pochodzenie wyróżnia się zanieczyszczenia naturalne i antropogeniczne. Kolejnym kryterium jest stopień podatności na rozkład. Wyróżnia się łatworozkładalne substancje organiczne, substancje trudnorozkładalne (np. związki metali ciężkich) oraz trwałe, a do nich należą m.in. detergenty lub związki chloroorganiczne. Kluczowym kryterium doboru odpowiedniej metody oczyszczania ścieków jest podział na zanieczyszczenia fizyczne, chemiczne i biologiczne. Te pierwsze można ocenić wzrokowo i są to ciała nierozpuszczone, czyli zawiesiny. Zanieczyszczenia fizyczne mają wpływ między innymi na mętność, gęstość, barwę, temperaturę czy zapach ścieków. Za zanieczyszczenia chemiczne uznawane są rozpuszczone w ściekach związki nieorganiczne i organiczne. Parametry chemiczne w ściekach są oznaczane w warunkach laboratoryjnych na podstawie Polskich Norm, w których znajduje się szczegółowy opis postępowania. Jeśli nie ma podejrzeń o możliwość skażenia ścieków nietypowymi związkami, próbkę bada się najczęściej pod kątem obecności w niej azotu amonowego, azotanowego i azotynowego, fenoli, aldehydu mrówkowego, lotnych kwasów tłuszczowych, fosforu ogólnego czy manganu. Analizą, która dostarcza ogólnej informacji o stopniu zanieczyszczenia ścieków jest oznaczenie biochemicznego zapotrzebowania na tlen (BZT). Jest to umowny wskaźnik, który określa wymaganą ilość tlenu do utlenienia związków organicznych znajdujących się w ściekach przez bakterie tlenowe w temperaturze 20 C, w określonym czasie (najczęściej 5 dni, wówczas mamy do czynienia z zapisem BZT 5 ). Kolejnym równie ważnym parametrem jest ChZT (chemiczne zapotrzebowanie na tlen), czyli ilość tlenu pobranego z utleniaczy na utlenienie wszystkich związków organicznych i niektórych nieorganicznych. Równie ważną analizą jest OWO oznaczenie ogólnego węgla organicznego za pomocą urządzenia, w którym następuje spalenie próbki ścieków, a pomiar ilości wytworzonego CO 2 wykonywany jest automatycznie. Wśród zanieczyszczeń chemicznych wyróżnia się także zanieczyszczenia biogenne, które są w dużej mierze odpo-

148 Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków 679 wiedzialne za eutrofizację i pogorszenie warunków tlenowych w zbiornikach i ciekach wodnych, oraz zanieczyszczenia refrakcyjne, czyli niepodlegające rozkładowi biologicznemu lub podlegające mu w bardzo małym stopniu i są to np. związki metali ciężkich (BARTOSZEWSKI 1997). Zanieczyszczenia biologiczne to mikroorganizmy, zwłaszcza chorobotwórcze. Do najgroźniejszych dla zdrowia i życia człowieka drobnoustrojów mogących znajdować się w ściekach należą bakterie z grupy coli, szczególnie pałeczka okrężnicy Escherichia coli. Duże zagrożenie stanowią też promieniowce Mycobacterium tuberculosis (prątek gruźlicy), pałeczka Salmonella typhi wywołująca dur brzuszny czy przecinkowiec cholery Vibro choleare. Odprowadzanie ścieków zanieczyszczonych biologicznie bezpośrednio do odbieralnika jest nielegalne i może być tragiczne w skutkach, gdyż może prowadzić do rozprzestrzeniania się mikroorganizmów chorobotwórczych i stanowić zagrożenie epidemiologiczne. METODY OCZYSZCZANIA ŚCIEKÓW Dobór odpowiedniej metody oczyszczania ścieków jest możliwy dzięki analizie reprezentatywnych próbek ścieków. Jest ona konieczna, gdyż nie istnieje jeden standardowy program oczyszczania ścieków. Etapem oczyszczania, który ma miejsce w każdej oczyszczalni w przypadku każdego rodzaju ścieków i każdego stopnia zanieczyszczenia jest wstępne oczyszczanie mechaniczne (pierwszego stopnia). W ramach tej metody wyróżnia się cedzenie, sedymentację i flotację. Są to procesy, w których przy pomocy sit, krat, piaskowników i osadników ze ścieków wyodrębnione zostają grubsze i drobniejsze frakcje. Te pierwsze oddzielane są za pomocą krat i sit o różnej średnicy otworów, natomiast te drugie będące drobnoziarnistą opadającą zawiesiną wyodrębnia się w procesie sedymentacji w piaskownikach lub osadnikach. Odseparowane od ścieków zanieczyszczenia często poddawane są kompostowaniu, spalaniu lub są dołączane do osadu ściekowego. Następnym etapem mechanicznego oczyszczania ścieków jest ich odtłuszczanie w procesie flotacji. Proces ten ma za zadanie wydobyć na powierzchnię głównie tłuszcze przybierające postać kożucha, które następnie są usuwane mechanicznie. Kolejnymi etapami są dwa równorzędne sposoby: oczyszczanie chemiczne i biologiczne. Oczyszczanie chemiczne opiera się na neutralizacji (destylacji, ekstrakcji, koagulacji czy elektrolizie) szkodliwych związków lub ich wytrącaniu. W sposób chemiczny oczyszczane są głównie ścieki przemysłowe, które skażone są metalami ciężkimi i zawierają znaczną ilość związków organicznych. Procesy samooczyszczania wód zachodzące w sposób naturalny w zbiornikach wodnych zostały zintensyfikowane w oczyszczalniach ścieków i określone jako oczyszczanie biologiczne. Podczas biologicznego oczyszczania ścieków dochodzi do mineralizacji substancji organicznych, usuwania substancji biogennych i eliminowania drobnoustrojów chorobotwórczych. Najczęściej wykorzystywana jest metoda osadu czynnego, a zaraz po niej metoda złóż biologicznych. Obie metody wykorzystują działanie wybranych grup mikroorganizmów jednak na dwa różne sposoby. W przypadku złóż biologicznych drobnoustroje mają postać błony, która powstaje na powierzchni wypełnienia złoża. W metodzie osadu czynnego drobnoustroje mają postać kłaczkowatej zawiesiny. Jednak w obu systemach zasada oczyszczania biologicznego jest taka sama. Zanieczyszczenia są przetwarzane na energię a produkty końcowe rozkładu zanieczyszczeń są odprowadzane jako ścieki oczyszczone z oczyszczalni do odbiornika (BARTOSZEWSKI 1997, CYWIŃSKI i współaut. 1983). W procesie oczyszczania biologicznego metodą osadu czynnego zachodzi całkowita mineralizacja materii organicznej do H 2 O i CO 2, zatem do produktów zupełnie nieszkodliwych dla środowiska. WYKORZYSTANIE OSADU CZYNNEGO W OCZYSZCZANIU ŚCIEKÓW MIEJSKICH Najbardziej rozpowszechnioną z biologicznych metod oczyszczania ścieków jest metoda osadu czynnego. Jest to proces tlenowy i wykorzystuje się w nim mikroorganizmy w postaci kłaczków osadu czynnego. Kłaczki złożone są z heterotroficznych bakterii, two-

149 680 ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA rzących skupiska makroskopowych rozmiarów. Do ich tworzenia dochodzi w wyniku łączenia się martwych cząstek organicznych i nieorganicznych z mikroorganizmami. Do wykorzystania kłaczkowatej zawiesiny osadu czynnego zainspirowała ludzi sama natura. Osad czynny ma bowiem w przyrodzie swój naturalny odpowiednik. Kłaczki zasiedlone przez mikroorganizmy znajdują się w jeziorach, rzekach i oceanach, gdzie dokonuje się dzięki nim proces samooczyszczania wód (GROSSARD i SIMON 1993). Najwcześniej zwrócono na nie uwagę w środowisku morskim i z uwagi na skojarzenie ich wyglądu z płatkami śniegu nazwano je śniegiem morskim (AZAM i LONG 2001). Kłaczki osadu czynnego wykorzystywanego do oczyszczania ścieków nie różnią się znacząco od tych występujących w zbiornikach naturalnych. W śniegu morskim zaobserwowano gatunki bakterii znanych wcześniej właśnie z osadu czynnego (BOCKELMANN i współaut. 2000). Aby osiągnąć maksymalną skuteczność i wydajność osadu czynnego należy zapewnić mu jak najlepsze warunki. Do reaktorów biologicznych, w których znajduje się osad, doprowadzana jest odpowiednia ilość tlenu i substratów; panuje tam również optymalna dla rozwoju bakterii temperatura i ph. Osad jest stale mieszany, co zapobiega jego opadaniu na dno reaktora i pomaga w rozbudowywaniu powierzchni czynnej kłaczków. Kiedy do reaktora biologicznego trafiają oczyszczone mechanicznie ścieki, drobnoustroje zasiedlające kłaczki absorbują substancje rozpuszczone i zawiesiny. Mikrocząsteczki są asymilowane od razu. Inaczej jest w przypadku makrocząsteczek, które wymagają uprzedniego rozkładu do związków niskocząsteczkowych z udziałem enzymów znajdujących się na powierzchni komórek mikroorganizmów lub wydzielanych do środowiska. W wyniku procesów biochemicznych mikroorganizmy wykorzystują zaabsorbowane substancje jako źródło energii i budulec, co skutkuje usunięciem ich ze ścieków (FIJAŁKOWSKA i współaut. 2010). SCHEMAT BIOLOGICZNEJ OCZYSZCZLNI ŚCIEKÓW MIEJSKICH Pierwszym elementem, na który natrafiają doprowadzane do oczyszczalni ścieki są kraty, na których eliminowane są zanieczyszczenia stałe (oczyszczanie mechaniczne). Zanieczyszczenia, które osadzają się na kracie po zebraniu składowane są na wysypiskach. Po usunięciu grubszych frakcji ścieki trafiają do piaskownika, gdzie oddzielane są zawiesiny mineralne. Następnym etapem jest odtłuszczanie w procesie flotacji. Cząsteczki tłuszczu są wypychane na powierzchnię przez pęcherzyki powietrza, po czym unoszą się na powierzchni w postaci okresowo zgarnianej błony lub kożucha. Odtłuszczony ściek trafia do osadnika wstępnego, gdzie w procesie sedymentacji oddzielane są łatwoopadające zawiesiny organiczne. Wstępnie oczyszczone ścieki trafiają do komory osadu czynnego, gdzie proces oczyszczania ścieków przeprowadzany jest przez mikroorganizmy. W osadniku wtórnym oczyszczone ścieki są oddzielane od osadu czynnego. Część tego osadu jest odprowadzana do komory osadu czynnego jako osad recyrkulowany, a pozostały osad jest usuwany i nazywa się go osadem nadmiernym. Ścieki oczyszczone odprowadzane są do odbiornika, a osad nadmierny zostaje unieszkodliwiony i zagospodarowany (BARTOSZEWSKI 1997). USUWANIE SUBSTANCJI BIOGENNYCH Usuwanie ze ścieków pierwiastków biogennych, do których zalicza się azot i fosfor jest jednym z ważniejszych zadań oczyszczalni. Pierwiastki te w największym stopniu odpowiedzialne są za eutrofizację zbiorników wodnych, gdyż intensyfikują przyrost biomasy. Wzrost żyzności wód prowadzi do pogorszenia ich jakości, a zwłaszcza panujących w nich warunków tlenowych i bywa zgubny w skutkach dla ich fauny. Proces ten najbardziej zauważalny jest w jeziorach. Zeutrofizowane jezioro można rozpoznać między innymi po zakwitach, które pogarszają przejrzystość wody. Za występowanie zakwitów odpowiedzialny jest masowy rozwój fitoplanktonu (m.in. sinic i zielenic) w zbiorniku wodnym. Jego efektem jest występowanie kożuchów tworzonych przez sinice, czy też intensywny zielony kolor wody, który może być wynikiem rozwoju zielenic.

150 Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków 681 Do walki z tym problemem wykorzystuje się biologiczne metody usuwania azotu ze ścieków, a w przypadku fosforu także metody chemiczne (BARTOSZEWSKI 1997, FIJAŁKOW- SKA i współaut. 2010). W ściekach miejskich zawartość azotu ogólnego oscyluje średnio w granicach mgn/l. Przeważnie ok. 50% stanowi azot amonowy, resztę zaś azot organiczny. Azot usuwany jest w procesie denitryfikacji, w którym ulatnia się do atmosfery jako N 2. Proces denitryfikacji poprzedza proteoliza (proces hydrolizy białek do aminokwasów z udziałem enzymów proteolitycznych), amonifikacja (przekształcenie aminokwasów w amoniak) oraz nitryfikacja (utlenianie amoniaku do azotynów i kolejno do azotanów). Denitryfikacja jest sposobem oddychania niektórych mikroorganizmów, gdy w środowisku brakuje tlenu. Utlenione formy azotu są używane wówczas w zastępstwie tlenu cząsteczkowego, a zredukowany do formy lotnej azot jest produktem ubocznym. W procesie denitryfikacji konieczne jest występowanie utlenionych form azotu, który dopływa do oczyszczalni głównie w formie organicznej i amonowej. Organiczne formy azotu ulegają przekształceniu na jony amonowe w jednym z procesów mineralizacji, określanym jako amonifikacja. Jest on najefektywniej przeprowadzany przez heterotroficzne bakterie tlenowe. Za utlenianie jonów amonowych poprzez azotyny do azotanów odpowiedzialne są bakterie nitryfikacyjne autotrofy przeprowadzające chemosyntezę (FIJAŁKOWSKA i współaut. 2010). Usuwanie azotu ze ścieków przeprowadzane jest przez różne grupy bakterii. Ważne jest zapewnienie im odpowiednich warunków do rozwoju, aby proces ten był efektywny. Jest to niełatwe, gdyż poszczególne grupy mają różne, często wręcz przeciwstawne wymagania środowiskowe, np. obecność łatwo rozkładalnych składników organicznych, koniecznych do denitryfikacji może być czynnikiem zaburzającym nitryfikację. Zatem oba te procesy należy oddzielać od siebie w czasie lub przeprowadzać je na innym obszarze. Wyróżnia się dwa rodzaje układów ze względu na położenie strefy denitryfikacji w systemie oczyszczania ścieków. W pierwszym, zgodnym z rzeczywistą kolejnością przemian jakim ulega azot w oczyszczalni, strefa denitryfikacji jest umiejscowiona na końcu procesu. Najpierw następuje mineralizacja związków organicznych przez heterotroficzne bakterie tlenowe, czego wynikiem jest m.in. uwalnianie azotu w postaci jonów amonowych. Azot amonowy utleniany jest przez bakterie nitryfikacyjne do azotanów. Ostatni etap stanowi strefa denitryfikacji. Do przebiegu denitryfikacji konieczne są warunki beztlenowe, obecność azotanów oraz łatwo przyswajalny substrat organiczny, który na tym etapie w ściekach już nie występuje. Konieczne jest więc jego dostarczanie, przeważnie w postaci metanolu. W przypadku, gdy usuwanie azotu w strefie niedotlenionej ma miejsce na początku układu, wszystkie warunki niezbędne dla sprawnego przeprowadzenia procesu denitryfikacji zostają zapewnione. Ścieki są intensywnie mieszane z recyrkulowanym osadem pochodzącym z końca komory tlenowej w komorze wstępnej. Dopływające ścieki dostarczają substratów organicznych, natomiast azotany są obecne dzięki recyrkulacji z końca komory tlenowej. Układ, w którym niedotleniona komora denitryfikacji umieszczona jest na początku procesu jest o wiele korzystniejszy od tego, w którym mieści się ona na końcu. Wynika to z jego większej efektywności w sensie ekonomicznym i energetycznym oraz niższych kosztów, gdyż w układzie tym nie jest konieczne zapewnienie substratów organicznych w postaci kosztownego metanolu (BARTOSZEWSKI 1997, FIJAŁKOWSKA i współaut. 2010). Usuwanie fosforu ze ścieków w procesie oczyszczania w warunkach tlenowych jest wykonywane chemicznymi metodami wytrącania tego pierwiastka przez wapń, glin oraz żelazo. Sposób ten ma jednak wady. Konieczne jest bowiem stałe dozowanie odczynników, co generuje koszty. Wytrąceniu ulegają nie tylko fosforany, ale także substancje organiczne, co skutkuje produkcją większej ilości osadów, których zagospodarowanie generuje kolejne koszty. Czasami niemożliwe jest zagospodarowanie osadów ze względu na obecność w nich metali ciężkich. Te negatywne strony metod chemicznych są powodem wzrostu zainteresowania alternatywną defosfatacją biologiczną. Odkryto ją przypadkowo wskutek awarii aeratora, co spowodowało powstanie strefy beztlenowej na początku procesu. Zaobserwowano wówczas, że bakterie wiążą większą ilość fosforu, a jednocześnie wzrasta udział charakterystycznych dla tego procesu drobnoustrojów. Usuwanie fosforu metodą biologiczną polega na pochłanianiu i akumulowaniu przez bakterie reszt fosforanowych. Jest to możliwe dzięki stworzeniu naprzemiennych warunków tlenowych

151 682 ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA Ryc. 1. Usuwanie fosforu metodą biologiczną system A/O (anaerobic/ oxic) (FIJAŁKOWSKA i współaut. 2010) i beztlenowych. Ilość fosforu pochłanianego przez mikroorganizmy w etapie tlenowym jest wielokrotnie większa niż ilość fosforanów uwolnionych do środowiska w strefie beztlenowej. Z tej właśnie różnicy wynika fakt usuwania fosforu (Ryc. 1). Biologiczna defosfatacja nie jest też pozbawiona wad. W niektórych przypadkach proces ten wymaga dodawania substancji wytrącających fosfor. Same bakterie prowadzące ten proces są wciąż wielką niewiadomą. Od niedawna badana jest fizjologia mikroorganizmów jednoznacznie identyfikowanych za pomocą sond molekularnych. Dotychczasowe wyniki wskazują na duże zróżnicowanie genetyczne tych bakterii. Biologiczna defosfatacja nie jest nadal w pełni przewidywalnym procesem (SEVIOUR i współaut. 2000). Za jeden z powodów jej niepowodzeń uważana jest konkurencja ze strony tzw. bakterii G (MINO i współaut. 1998). Wiążą one proste związki organiczne bez obecności tlenu, tworząc z nich substancje zapasowe wykorzystywane w fazie tlenowej. Bakterie G nie magazynują jednak fosforu. Źródłem energii potrzebnej do wiązania substratów w fazie beztlenowej jest u nich glikogen. Konkurencja ze strony bakterii G o produkty fermentacji może ograniczać skuteczność lub prowadzić do całkowitego załamania defosfatacji (SEVIOUR i współaut. 2000). Obecnie usuwanie fosforu i azotu w oczyszczalniach przebiega najczęściej jednocześnie i polega na przepuszczaniu ścieków przez 3 oddzielone strefy. Pierwsza strefa jest całkowicie beztlenowa, kolejna niedotleniona, a ostatnia jest strefą tlenową (strefa nitryfikacji). Zastosowanie jednoczesnego usuwania azotu i fosforu w oczyszczalni, mimo iż jest skuteczne i praktyczne, niesie ze sobą kilka problemów. Na rynku światowym funkcjonuje wiele systemów, z których większość jest chroniona patentem, co utrudnia szerokie zastosowanie procesów jednoczesnego biologicznego usuwania biogenów. Pierwszą, najwcześniej opracowaną, stosowaną do dziś metodą kompleksowego usuwania ze ścieków związków biogennych jest A2/O, będąca modyfikacją systemu usuwania fosforu. Polega ona na wstawieniu między komorą tlenową i beztlenową komory niedotlenionej, w której stężenie tlenu jest niższe niż 0,5 mg/l. Równie rozpowszechniony jest pięciostopniowy proces Bardenpho. Ścieki wprowadzane są kolejno do strefy beztlenowej, niedotlenionej, tlenowej, drugiej niedotlenionej i drugiej tlenowej. Dodanie do poprzedniego systemu drugiej komory niedotlenionej zapewnia dodatkową denitryfikację azotanów wytwarzanych przez nitryfikatory w strefie natlenionej. SKŁAD GATUNKOWY OSADU CZYNNEGO Najważniejszym zadaniem w oczyszczalni ścieków jest zapewnienie dogodnych warunków dla rozwoju drobnoustrojów w niej pracujących. Sprzyja temu intensywne napowietrzanie, sprawna recyrkulacja i odpowiednie obciążanie oczyszczalni. Grupą dominującą w składzie gatunkowym osadu czynnego są bakterie heterotroficzne, żywiące się substancjami ściekowymi. Największą z towarzyszących bakteriom grup drobnoustrojów w osadzie są pierwotniaki. Dużą rolę w osadzie odgrywa obecność mikroorganizmów nitkowatych. Rozruch nowej oczyszczalni może ułatwić pewna ilość

152 Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków 683 osadu czynnego z innej, funkcjonującej już oczyszczalni (szczepienie osadu czynnego). Nie jest to jednak konieczne, gdyż z czasem osad rozmnożyłby się do odpowiedniej ilości sam. Każda oczyszczalnia wytwarza charakterystyczny dla siebie osad. Jego skład jest uwarunkowany składem jakościowym i ilościowym substratów dostarczanych do oczyszczalni, a także wiekiem osadu czy ilością substratów dostarczanych do oczyszczalni. Proces kształtowania się osadu jest nazywany jego dojrzewaniem. Po- lega on na sukcesji ekologicznej, w której skład gatunkowy osadu czynnego różnicuje się zarówno pod względem ilościowym jak i jakościowym. W zależności od warunków pewne grupy mikroorganizmów namnażają się, a inne mogą zanikać (CICHOWICZ 1995). Początkowo osad złożony jest z bakterii i jednokomórkowych pierwotniaków. Po pewnym czasie przybywa bakterii nitkowatych i pierwotniaków osiadłych. Stopniowo wytwarza się równowaga między mikroorganizmami osadu czynnego. MORFOLOGIA KŁACZKÓW Czynnikami stymulującymi i ułatwiającymi powstawanie kłaczków poprzez łączenie się komórek bakterii są: śluz wytwarzany przez bakterie zooglealne, związki polisacharydowe wydzielane przez niektóre bakterie oraz obecność dodatnio naładowanych jonów odpowiedzialnych za łączenie się ujemnie naładowanych komórek bakterii. W skład kłaczków wchodzą głównie żywe organizmy, ale także martwe komórki oraz nierozłożone, duże cząstki organiczne i nieorganiczne. Ze względu na kształt kłaczki dzieli się na zaokrąglone i te o nieregularnych konturach. Tworzeniu się nieregularnych form sprzyja wzmożone obciążenie oczyszczalni oraz duża obecność organizmów nitkowatych. Wyróżnia się trzy struktury kłaczków. Pierwszą, najbardziej pożądaną, jest struktura zwarta (zbita), ale występuje także struktura luźna oraz z aglomeratami. Struktura kłaczków decyduje w dużej mierze o zdolnościach sedymentacyjnych osadu. Kolejnym kryterium oceny morfologii kłaczków jest ich trwałość i tu wyróżnia się kłaczki słabe oraz mocne. O trwałości kłaczków decyduje obciążenie oczyszczalni. Kłaczki słabe są wynikiem niskiego obciążenia substratowego, a mocne średniego. Wielkość kłaczków szacuje się zwykle w granicach od 100 μm do 300 μm, jednak spotykane są też kłaczki mniejsze (<100 μm) i większe (nawet do 500 μm). Na wielkość kłaczków wpływają przede wszystkim: obciążenie i wiek osadu, czas zatrzymania ścieków w komorze napowietrzania, zawartość związków azotowych w ściekach, sposób i szybkość mieszania w komorze napowietrzania oraz liczebność i aktywność organizmów odżywiających się bakteriami (głównie pierwotniaki). Morfologia kłaczków ma wpływ na zdolności sedymentacyjne. Według tego kryterium osad dzieli się na typowy, zdyspergowany oraz spuchnięty. Typowy osad charakteryzuje się występowaniem mikroorganizmów nitkowatych w obrębie kłaczka, mocnymi kłaczkami oraz klarownym odpływem. W przypadku osadu zdyspergowanego mamy do czynienia ze słabymi kłaczkami, mętnym odpływem i brakiem organizmów nitkowatych. W osadzie spuchniętym obserwuje się nadmierny rozwój organizmów nitkowatych, mocne kłaczki, i klarowny odpływ (KOCWA- -SALUCH i WOŹNIAKIEWICZ 2011). Większość mikroorganizmów typowego osadu czynnego skupiona jest w kłaczkach, niewielka ich ilość pływa poza ich obrębem. Głównym składnikiem osadu są heterotroficzne bakterie właściwe, oprócz nich w skład kłaczków wchodzą mikroorganizmy nitkowate, pierwotniaki i zwierzęta tkankowe. PIERWOTNIAKI Pierwotniaki to jeden z najbardziej zaniedbanych aspektów procesu osadu czynnego. Zawsze są widoczne w mikroskopie, rzadko w literaturze, nigdy nie widać ich w modelach (VAN LOOSDRECHT i HENZE 1999). Udział pierwotniaków w całkowitej masie osadu wynosi kilka procent, a ich zagęszczenie waha się od kilku do kilkudziesięciu komórek na mililitr. Mimo iż najważniejszą z grup drobnoustrojów osadu czynnego są bakterie, to pierwotniaki dostarczają największej ilości informacji na temat osadu. Najczęściej spotykanymi gromadami pierwotniaków są orzęski (Ciliata), sysydlaczki (Suctoria), korzenionóż-

153 684 ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA ki (Rhisopoda), wiciowce (Flagellata) oraz słonecznice (Heliozoa). Obserwacja zmian zachodzących w ich składzie gatunkowym oraz ilościowym jest kluczowa w ocenie pracy osadu. Obecnie powszechnie wiadomym jest, że mają one duży udział w procesie oczyszczania ścieków. Liczne badania przeprowadzone przez naukowców w osadzie czynnym wykazywały, że w przypadku braku tych organizmów lub ich niewielkiej liczebności, jakość odpływu z oczyszczalni charakteryzuje się o wiele gorszymi parametrami. Podstawową rolą większości wolno żyjących pierwotniaków jest rola konsumentów. W osadzie występują zarówno orzęski osiadłe (Carchesium spp., Epistylis spp., Opercularia microdiscum), pełzające (np. Aspidisca cicada), swobodnie pływające (np. Colpoda spp., Colpidium colpoda), jak i drapieżne (np. Holotricha). Orzęski pochłaniają bakterie i wolnopływające cząsteczki organiczne rozproszone w osadzie. Pokarm dla orzęsków stanowią między innymi pałeczki okrężnicy (Escherichia coli). W eksperymentalnym systemie w obecności pierwotniaków redukcja E. coli wynosiła 95%, podczas gdy w systemie ich pozbawionym redukcja ta osiągnęła pułap 45% (CURDS 1992). Orzęski pełzające żywią się także bakteriami osiadłymi na powierzchni kłaczków i wybranymi grupami bakterii nitkowatych. Konsekwencją działalności konsumpcyjnej pierwotniaków, jest znacznie obniżona mętność odpływu i zminimalizowanie w nim liczebności bakterii wolnopływających, ale także odmłodzenie i uaktywnienie populacji bakterii (FIJAŁKOWSKA i współaut. 2010). W obecności bakteriożernych pierwotniaków rozkład martwej materii organicznej może przebiegać znacznie szybciej niż w przypadku obecności jedynie bakterii (FENCHEL 1977). Pierwotniaki uczestniczą też w procesie bioflokulacji, czyli tworzenia się kłaczków. Ponadto, niektóre z nich są organizmami wskaźnikowymi. Liczebność orzęsków jest odwrotnie proporcjonalna do liczebności wiciowców. Obecność dużej liczby wiciowców wskazuje na złą pracę oczyszczalni wynikającą zwykle z jej nadmiernego obciążenia ładunkiem zanieczyszczeń, a występowanie orzęsków jest świadectwem dobrej kondycji osadu. Orzęski swobodnie pływające, głównie z rzędu Hymenostomata wskazują na duże obciążenie osadu czynnego. Ich występowanie w tych warunkach wynika nie tylko z ich zwiększonej tolerancji na deficyt tlenu, ale także z obecności w osadzie czynnym dużej ilości bakterii, którymi się żywią. Orzęski osiadłe z rzędu Peritrichida są jedną z najbardziej charakterystycznych grup osadu występującą w szerokim zakresie jego obciążenia. Ich masowy rozwój (wówczas gdy stanowią nawet do 80% wszystkich mikroorganizmów osadu) świadczy o dużych wahaniach stopnia obciążenia oczyszczalni. Bakteriożerne orzęski pełzające z rodzaju Aspidica czy Euplotes, występują głównie w warunkach średnich i niskich obciążeń. Drobne wiciowce heterotroficzne są najliczniejszą grupą w ściekach dopływających i zawsze dominują w fazie rozruchu oczyszczalni. Są także wskaźnikami wysokiego obciążenia substratowego. Przy niskim obciążeniu ich liczebność spada, co spowodowane jest konkurencją ze strony orzęsków oraz drapieżnictwem pierwotniaków. W dobrze pracującym osadzie zagęszczenie drobnych wiciowców nie przekracza 50 tys. osobników/ml (MADONI 1994). Wskaźnikami dobrej pracy są także ameby skorupkowe, w tym najpowszechniej występujące w osadzie Arcella i Euglypha, które świadczą o długim wieku osadu, jego małym obciążeniu, odpowiednich warunkach tlenowych oraz o bardzo niskim stężeniu azotu amonowego. Wskaźnikiem dobrej pracy osadu czynnego, jest różnorodność występujących w nim pierwotniaków. BAKTERIE WŁAŚCIWE Bakterie właściwe (Eubacteriae) są najliczniejszą i najważniejszą grupą drobnoustrojów osadu czynnego. Większość z nich nie występuje w postaci pojedynczych komórek, lecz tworzy mikrokolonie, które często są monokoloniami (kolonie tego samego gatunku). Wyróżnia się około 300 gatunków bakterii właściwych mogących występować w osadzie i są to głównie heterotrofy, ale także chemoautotrofy, saprofity i patogeny. Do najczęściej spotykanych bakterii właściwych zalicza się: Nitromonas spp., Nitrobacter spp., Bacillus spp. czy Pseudomonas spp. Przy niskim obciążeniu i ciepłej pogodzie występują także bakterie z rodzaju Spirillum i Spirochaeta. Bakterie zooglealne przede wszystkim należące do gatunku Zooglea ramigera, odpowiedzialne są za produkcję śluzu ułatwiającego tworzenie się kłaczków.

154 Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków 685 Dzięki bakteriom możliwe jest usuwanie ze ścieków substancji biogennych i innych zanieczyszczeń (BAZELI 2001). Przeważającą grupą są heterotroficzne bakterie tlenowe, które usuwają ze ścieków różnego rodzaju związki organiczne. ORGANIZMY NITKOWATE I ZJAWISKO PUCHNIĘCIA OSADU Organizmy nitkowate występują w osadzie czynnym powszechnie i należą do nich głównie bakterie (rzadziej grzyby i promieniowce). Spośród przeszło 80 gatunków bakterii nitkowatych najczęściej spotykanymi są Microthrix parvicella, Sphaerotilus natans, Thiotrix spp. czy Beggiatoa spp.. Dobrą stroną obecności tej grupy organizmów jest udział w tworzeniu się i utrzymywaniu kłaczków. Dzięki nim agregaty są bardziej trwałe i mniej wrażliwe na rozrywanie np. podczas mieszania. Na tym jednak pozytywna rola w tych organizmów w osadzie się kończy. Obecność promieniowców z rodzaju Nocardia i Rhodococcus jest przyczyną powstawania trudnego do usunięcia kożucha oraz nadmiernego pienienia się ścieków, co jest jednym z najtrudniejszych do zwalczenia problemów. Nadmierny wzrost populacji organizmów nitkowatych jest przyczyną zjawiska puchnięcia osadu. Polega ono na rozpulchnieniu osadu, co wpływa niekorzystnie na strukturę agregatów i sedymentację. Osad spuchnięty wolniej opada na dno zbiornika (czasem nawet kumuluje się na jego powierzchni) i przez to nie jest wystarczająco zagęszczony. Skutkuje to utrudnieniem lub uniemożliwieniem oddzielenia osadu od oczyszczonych ścieków, a to znacznie pogarsza jakość odpływu. W skrajnych przypadkach może również poważnie utrudniać funkcjonowanie całej oczyszczalni, ze względu na zaburzenie procesu recyrkulacji osadu. Gęstość osadu i jego właściwości sedymentacyjne ocenia się na podstawie Indeksu Objętościowego Osadu (SVI). Jest to objętość jednego grama suchej masy osadu po 30-minutowej sedymentacji w standardowych warunkach mierzona w cm 3. Przyjęto, że wartości poniżej 100 cm 3 /g świadczą o dobrej kondycji osadu, wartości wyższe wskazują na gorszą sedymentację. Przyczyną nadmiernego rozwoju organizmów nitkowatych jest zwykle poważny niedobór jednego lub kilku z ważnych składników takich jak tlen czy węgiel organiczny. Innymi czynnikami sprzyjającymi puchnięciu jest zbyt niskie lub zbyt wysokie obciążenie oczyszczalni, niedobór azotu lub fosforu, zagniwające ścieki bogate w siarkę i niskie ph ścieku. Czasami rozpulchnienie osadu bywa wynikiem obecności zbyt dużej ilości substancji śluzowych wydzielanych przez bakterie zooglealne. Jednak w większości przypadków to niekorzystne zjawisko jest spowodowane nadmiernym rozwojem organizmów nitkowatych. W praktyce puchnięcie osadu zwalcza się najczęściej środkami chemicznymi, w skrajnych przypadkach stosuje się silnie utleniający chlor czy nadtlenek wodoru, mające na celu zmniejszenie populacji organizmów nitkowatych. Bywa, że używane są substancje wytrącające np. sole glinu, które skupiają kłaczki w większe, a przez to i cięższe agregaty, co sprzyja ich opadaniu. Stosowanie metod chemicznych ma jednak szereg negatywnych skutków. Nie zwalczają one przyczyny, a jedynie doraźnie łagodzą objawy puchnięcia. Z uwagi na powszechność i znaczenie problemu puchnięcia osadu i związanej z tym efektywności oczyszczania metodą osadu czynnego, nieustannie prowadzone są liczne badania w tej dziedzinie (LEMMER 2000). ORGANIZMY TKANKOWE Najpowszechniejszymi z organizmów tkankowych w osadzie są nicienie (Nematoda), oraz wrotki (Rotatoria). Nicienie i wrotki w osadzie odpowiedzialne są za utrzymywanie biocenotycznej równowagi w układzie, odżywiając się bakteriami i mniejszymi pierwotniakami odmładzają ich populację i nie dopuszczają do nadmiernego przyrostu bakterii i niniejszych pierwotniaków. Kolejnym pozytywnym skutkiem wyjadania przez nie wolnopływających drobnoustrojów jest klarowanie odpływu. Nicienie i wrotki wydzielają również śluz, który uczestniczy w procesie tworzenia się kłaczków. Jednak zbyt duża liczba organizmów tkankowych w osadzie może prowadzić do rozbijania kłaczków. W niewielkich ilościach spotykane są także pajęczaki (Arachnoidea), skąposzczety

155 686 ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA (Oligochaeta), niesporczaki (Tardigrada) oraz brzuchorzęski (Gastrotricha). Czynnikami sprzyjającymi wzrostowi liczebności populacji organizmów wielokomórkowych jest niskie stężenie tlenu oraz deficyt substancji pokarmowych (KOCWA-SALUCH i WOŹNIAKIEWICZ 2011). PRZYDOMOWE OCZYSZCZANIE ŚCIEKÓW Dzięki rozwojowi techniki oczyszczanie ścieków nie jest już zarezerwowane tylko dla publicznych zakładów i swoją własną, przydomową oczyszczalnię może mieć prawie każdy z nas. W niektórych przypadkach opróżnianie zbiornika na nieczystości ciekłe przez samochód asenizacyjny jest wręcz niemożliwe ze względu na utrudniony dojazd do posesji, a ma to miejsce szczególnie zimą. W takiej sytuacji dogodnym rozwiązaniem jest wybudowanie oczyszczalni przydomowej. Przydomowe oczyszczalnie ścieków są alternatywą dla zbiorników na nieczystości ciekłe nazywanych potocznie szambami. Koszt budowy szamba jest znacznie niższy od kosztu budowy oczyszczalni, jednak koszty eksploatacji szamba są wyższe, co powoduje, że posiadanie oczyszczalni po pewnym czasie staje się bardziej opłacalne. Dodatkowym plusem jest fakt, że na konstrukcję przydomowej oczyszczalni można uzyskać dotacje przyznawane przez Gminny Fundusz Ochrony Środowiska i Gospodarki wodnej, a także przez Unię Europejską (BRZOSTKOWSKI i GALICKI 2008). Przydomowa oczyszczalnia może obsługiwać jeden, lub kilka domów, sprawdzi się też przy hotelu czy pensjonacie. Wyróżnia się kilka rodzajów przydomowych oczyszczalni (Ryc. 2) (BRZOSTKOWSKI i GALICKI 2008). Przy projektowaniu konkretnej instalacji należy wziąć pod uwagę liczbę mieszkańców, szacowaną ilość doprowadzanych ścieków oraz ich profil. W przydomowej oczyszczalni w pierwszym etapie usuwane są zanieczyszczenia stałe. Proces ten zachodzi w osadniku gnilnym i jest dwuetapowy. Pierwszy etap polega na oddzieleniu zanieczyszczeń stałych przy wykorzystaniu metod fizycznych, drugi zaś przeprowadzany jest przez bakterie beztlenowe. Jeśli ścieki zawierają duże ilości tłuszczów konieczne jest zastosowanie tzw. separatorów oddzielających tłuszcz od ścieku, co usprawnia dalszą pracę układu. Drugim etapem jest oczyszczanie z udziałem mikroorganizmów tlenowych. Tak oczyszczone ścieki odprowadza się do odbieralnika, którym zazwyczaj jest woda lub grunt. Najprostszym przydomowym systemem jest oczyszczalnia z zastosowaniem drenażu rozsączającego. Bardziej skomplikowanym systemem jest oczyszczalnia z zastosowaniem filtra piaskowego. Montaż takiego układu wybiera się w sytuacji, gdy mamy do czynienia ze zbyt przepuszczalnym lub zbyt nieprzepuszczalnym podłożem. Działanie filtra piaskowego opiera się na osadzonych na żwirze mikroorganizmach (głównie bakteriach) tlenowych i beztlenowych, które przeprowadzają ostatni etap oczyszczania. Rzadziej stosowanym, ale równie skutecznym rozwiązaniem jest wykorzystanie oczyszczalni gruntowo-roślinnych. Ich działanie opiera się na procesach biochemicznych oraz filtracji. Na filtrach uprawia się rośliny bagienne, w naszych warunkach najczęściej jest to trzcina pospolita (Phragnites communis). Wzrostem popularności cieszą się oczyszczalnie ze złożem biologicznym. Za ich zastosowaniem przemawia bardzo wysoka skuteczność w usuwaniu zanieczyszczeń, niskie koszty eksploatacji, łatwość w obsłudze i serwisie, a także brak konieczności posiadania dużej powierzchni przeznaczonej na oczyszczalnię. Przydomowe oczyszczalnie z osadem czynnym działają jak zminiaturyzowane oczyszczalnie miejskie wykorzystujące tą metodę. W odróżnieniu od poprzednich metod mikroorganizmy pracujące w oczyszczalni nie są osadzone na stałym podłożu, a unoszą się w postaci kłaczkowatej zawiesiny. W tym systemie konieczne jest stałe doprowadzanie tlenu, a do tego celu służą membrany, przez które pompy napowietrzania wpompowują tlen do komory osadu. Ten element znacznie intensyfikuje procesy oczyszczania i powoduje stałe unoszenie się kłaczków osadu. Pierwszym etapem jest przetransportowanie ścieku z budynku do osadnika gnilnego. Osadnik gnilny to szczelnie zamknięty zbiornik, wykonany najczęściej z trwałego polietylenu. Czasami stosuje się zbiorniki betonowe jednak wymagają one specjalnego uszczelnienia. Osadnik gnilny składa się z dwóch lub trzech komór. Ściek znajduje się w nim od 48 do 72 godzin i poddawany jest tam procesom beztlenowym. Na oczyszczanie wstępne jakie ma miejsce w tym zbiorniku składa się szereg procesów fizycznych, biologicznych i chemicznych. W

156 Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków 687 Ryc. 2. Rodzaje przydomowych oczyszczalni ścieków (BRZOSTKOWSKI i GALICKI 2008)

157 688 ANNA LENART, AGNIESZKA KOWALSKA osadniku gnilnym usuwane są części stałe ze ścieku oraz zachodzi fermentacja beztlenowa, wskutek której następuje rozkład substancji organicznych i ich częściowa mineralizacja. Dobrze funkcjonujący osadnik pozwala na pozbycie się do 80% zanieczyszczeń stałych i do 40% zanieczyszczeń organicznych. Ponieważ podczas przeprowadzanych w osadniku procesów beztlenowych powstają gazy takie jak metan czy siarkowodór, konieczna jest jego wentylacja. Ostatnim elementem osadnika jest króciec wylotowy, którym wstępnie oczyszczone ścieki są transportowane do kolejnych elementów oczyszczalni (RYŃSKA 2011). Drugi etap oczyszczania zachodzi w komorze osadu czynnego. Następnie ścieki wędrują do osadnika wtórnego, w którym osad jest odseparowywany od oczyszczonych ścieków. Oczyszczone ścieki są następnie odprowadzane do odbieralnika, jakim może być zbiornik wodny lub grunt. W prawidłowo funkcjonującej oczyszczalni w końcowym etapie oczyszczania jest więcej mikroorganizmów niż w jego początkowej fazie. Osad przepompowywany jest za pomocą pompy recyrkulacyjnej do osadnika wstępnego. Nadmiar osadu w osadniku wstępnym jest okresowo usuwany tak, aby proces oczyszczania był możliwie jak najbardziej efektywny. Przydomowa oczyszczalnia z wykorzystaniem osadu czynnego charakteryzuje się zdolnością do wysokiej redukcji zróżnicowanych zanieczyszczeń, w znacznym stopniu unieszkodliwiane są w niej zanieczyszczenia biologiczne takie jak wirusy, bakterie chorobotwórcze czy grzyby. Dużą zaletą jest mała powierzchnia potrzebna do jej budowy oraz stosunkowo długa żywotność. Ścieki odprowadzane z tych oczyszczalni ze względu na bardzo dobre ich oczyszczenie można jeszcze gospodarczo wykorzystać. Obok wszystkich zalet istnieją także poważne wady. Jedną z najważniejszych jest duża wrażliwość na nierównomierne dostarczanie ścieków oraz przerwy w dostawach prądu. Taka oczyszczalnia jest stosunkowo droga w eksploatacji, co wynika głównie z kosztów energii elektrycznej niezbędnej do jej funkcjonowania, konieczności zakupów biopreparatów usprawniających jej działanie i awaryjności podzespołów. Dodatkowo konieczne jest przeszkolenie posiadaczy takiego systemu, aby możliwe było zachowanie jak najlepszej kondycji osadu, a to jest kluczowym czynnikiem warunkującym jakość odpływu. PODSUMOWANIE Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków z pewnością ma więcej zalet niż wad. W dzisiejszych czasach nie brakuje specjalistów mających odpowiednie kwalifikacje do kierowania obiektami specjalizującymi się w tej dziedzinie. Warunkiem prawidłowego funkcjonowania tego typu oczyszczalni jest utrzymywanie osadu w dobrej kondycji, co wymaga fachowej wiedzy ze strony administratora. Najbardziej istotnym czynnikiem mającym wpływ na prawidłową pracę osadu jest odpowiednie obciążenie oczyszczalni, oraz zapewnienie odpowiednich warunków dla mikroorganizmów i procesów zachodzących w komorze napowietrzania. W przeciwieństwie do oczyszczalni chemicznych, oczyszczalnie biologiczne generują mniej szkodliwych odpadów, a powstający jako skutek działalności tego typu oczyszczalni osad nadmierny jest unieszkodliwiany i zagospodarowywany jako nawóz organiczny, substrat w produkcji biogazu lub spalany dla celów energetycznych. Popularność tej metody jest niewątpliwie pozytywnym dla środowiska zjawiskiem. Oczyszczalnia ma stosunkowo długą żywotność i jest w porównaniu do innych działających na dużą skalę obiektów tania w eksploatacji. Obecnie na terenie Polski funkcjonuje kilkaset takich oczyszczalni i stale ich przybywa, podobna sytuacja ma miejsce na całym świecie. Metoda ta została zaczerpnięta z dokonań samej natury, w której kłaczkowata zawiesina przeprowadzająca procesy oczyszczania ma swój naturalny odpowiednik nazywany czasami śniegiem morskim. W obiektach działających na skalę przemysłową mamy do czynienia z dostosowanymi do potrzeb ludzi, zintensyfikowanymi procesami oczyszczania, które z mniejszą wydajnością zachodzą w naturalnych zbiornikach wodnych, gdzie proces ten nosi nazwę samooczyszczania. Atutem tej metody jest fakt, że z równą skutecznością usuwa ona ze ścieków zanieczyszczenia chemiczne jak i biologiczne. Z bardzo dobrą skutecznością usuwane są zarówno metale ciężkie, biogeny jak i drobnoustroje chorobotwórcze.

158 Wykorzystanie osadu czynnego w oczyszczaniu ścieków 689 WYKORZYSTANIE OSADU CZYNNEGO W OCZYSZCZANIU ŚCIEKÓW Streszczenie W pracy opisano mechanizm biologicznego oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego. Opisane zostały cechy oraz rola głównych grup mikroorganizmów wchodzących w skład osadu. Przedstawiony został schemat i mechanizmy usuwania poszczególnych rodzajów zanieczyszczeń w miejskiej oczyszczalni ścieków z wykorzystaniem metody osadu czynnego. Opisane zostało zastosowanie powyższej metody w przydomowych oczyszczalniach oraz sposoby postępowania z powstałym w wyniku procesu oczyszczania osadem nadmiernym. THE USE OF ACTIVATED SLUDGE IN SEWAGE TREATMENT Summary The study describes biological wastewater treatment method using activated sludge. It presents the features and the role of major groups of microorganisms included in the sludge. Additionally, a scheme and mechanisms of removal of various pollutants in municipal wastewater treatment plant using activated sludge method were presented. The study describes the application of this method in domestic sewage treatment, and the ways of dealing with excess sludge resulting from the treatment process. LITERATURA ALBINIAK B. (red.), Raport o stanie środowiska w Polsce Biblioteka Monitoringu Środowiska, Warszawa AZAM F., LONG R. A., Oceanography Sea Snow Microcosm. Nature 414, BARTOSZEWSKI K., Poradnik eksploatatora oczyszczalni ścieków. Polskie Zrzeszenie Inżynierów i Techników Sanitarnych, Poznań. BAZELI M., Mikroorganizmy osadu czynnego: klucz. Gdańska Fundacja Wody, Gdańsk. BŁASZCZYK M. K., Mikroorganizmy w ochronie środowiska. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. BOCKELMANN U., MANZ W., NEU T. R., SZEWCZYK U., Characterization of the Microbial Community of Lotic Organic Aggregates (,,river snow ) in the Elbe River of Germany by Cultivation and Molecular Methods. Fems Micr. Ecol. 33, BRZOSTKOWSKI N., GALICKI P., Przydomowe oczyszczalnie ścieków- poradnik, Wydawnictwo PSP Narew, Białystok. CICHOWICZ M., Organizmy osadu czynnego katalog. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. CURDS C. R., Protozoa in the Water Industry, Cambridge University Press, New York CYWIŃSKI B., GADUŁA S., KEMPA E., KURBIEL J., PŁOSZAŃSKI H., Oczyszczanie mechaniczne i fizyczne. Arkady, Warszawa. FENCHEL T., The Significance of Bacterivorous Protozoa in the Microbial Community of Detrital Particles [W:] Aquatic Microbial Communites. CARINS J. (red.). Garland Publishing, New York FIJAŁKOWSKA E., FYDA J., PAJDAK-STÓS A., WIĄCKOWSKI K., Osad czynny biologia i analiza mikroskopowa, Seidel i Przywecki, Piaseczno. GROSSART H., SIMON M Limnetic macroscopic organic aggregates (lake snow): occurrence, characteristics and microbial dynamics in Lake Constance. Limnol. Oceanogr. 38, KOCWA-SALUCH R., WOŹNIAKIEWICZ T., Analiza mikroskopowa osadu czynnego i jego rola w kontroli procesu technologicznego oczyszczania ścieków Środowisko 6, LEMMER H., Przyczyny powstawania i zwalczania osadu spęczniałego. Seidel-Przywecki, Piaseczno MADONI P., A Sludge Biotic Index for the Evaluation of the Biological Performance of Activated Sludge Plants Based on the Microfauna Analysis. Water Res. 28, MINO T., VAN LOOSDRECHT M. C. M., HEIJNEM J. J., Microbiology and Biochemistry of the Enhanced Biological Phosphate Removal Process. Water Res. 32, RYŃSKA J., SEVIOUR R. J., MASZENAN A. M., SODDELL J. A., TAN- DOI V., PATEL B. K. C., KONG Y. H., SCHUMANN P., Microbiology of the G-bacetria in Activated Sludge Environ. Microbiol. 2, VAN LOOSDRECHT M. C. M., HENZE M., Maitenance, Endogeneous Respiration, Lysis, Decay and Predation. Water Sci. Technol. 39,

159

160 Tom Numer 4 (297) Strony Józef Motyka, Ostatni wykład, Lublin-Poznań, 2012, ss. 341, czarno-białe fotografie. Wydano nakładem Rodziny, Bogucki Wydawnictwo Naukowe, ISBN W maju 2012 r. ukazał się długo oczekiwany, bo napisany przed 40-tu laty, tom wspomnień prof. dr. hab. Józefa Motyki, pracownika trzech uniwersytetów: Jagiellońskiego (Instytut Botaniczny), im. Jana Kazimierza we Lwowie (Ogród Botaniczny) oraz Marii Curie-Skłodowskiej w Lublinie (Katedra Systematyki i Geografii Roślin, którą kierował od 1945 r. aż do przejścia na emeryturę). Prof. J. Motyka ( ) urodził się w galicyjskiej wsi Kąclowa koło Grybowa, w wielodzietnej rodzinie chłopskiej. Kilka pierwszych rozdziałów obszernego tomu wspomnień poświęca uwarunkowaniom naturalnym, historii i obyczajom panującym w rodzinnej miejscowości, dowodząc tym samym wielkiej dociekliwości w poszukiwaniu własnych korzeni. Edukacja Autora wiodła od szkoły powszechnej w Kąclowej, przez gimnazja o profilu klasycznym w Gorlicach, Tarnowie i Nowym Sączu, gdzie w 1920 r. uzyskał świadectwo dojrzałości. Egzamin dojrzałości składał z trzech języków: polskiego, łacińskiego i greckiego oraz historii i matematyki. Nie było egzaminu z języka niemieckiego, który uczeń J. Motyka opanował jednak znakomicie, gdyż jego nauka rozpoczynała się wraz z wstąpieniem do szkoły powszechnej. Doskonale znał także łacinę i chociaż system jej nauczania (po 6 godzin tygodniowo przez 8 lat) uznawał po latach za czas stracony, to jednak podkreślał, że właśnie łacina nauczyła go ścisłego myślenia i formułowania myśli. Znajomość łaciny mógł w przyszłości wykorzystać przygotowując monografię rodzaju Usnea, która zyskała światowy rozgłos. Wspomnieniom z lat nauki, przerywanej zresztą parokrotnie na skutek trudności życiowych lub działań I wojny światowej, poświęcił Autor ponad jedną trzecią objętości tomu. Chociaż bywało głodno i chłodno, piął się coraz wyżej, nie poddając zniechęceniu. Wyznaje w pewnym momencie: Miałem tak zwany chłopski upór, czyli zwykłą wytrwałość. Warto podkreślić, że przez większość gimnazjum, pomimo zmiany szkół bądź nauki w trybie eksternistycznym, był tzw. celakiem (od ocen celujących), a i na świadectwie maturalnym miał tylko nieliczne oceny dobre, pozostałe zaś bardzo dobre. Nie było Mu jednak dane celebrować tego sukcesu. Pół wieku później napisze: [ ] Nie brałem udziału w pożegnalnej uczcie, koledzy nie zawiadomili mnie o wspólnej maturalnej fotografii nie miałem odpowiedniego ubrania, nosiłem przerobioną wojskową pokrzywianą bluzę. Nie byłem na uroczystości rozdania świadectw. Podjął je za mnie i przesłał mi jeden z kolegów. Problemy absolwenta gimnazjum klasycznego nie skończyły się wraz z uzyskaniem świadectwa dojrzałości. Podobnie jak dzisiaj, ukończenie gimnazjum nie dawało żadnego zawodu. Pytanie Co dalej? pozostawało aktualne, jednak życie przyniosło tyleż szybką, co nieoczekiwaną odpowiedź: właśnie wybuchła wojna polsko-bolszewicka i J. Motyka zgłosił się ochotniczo do wojska. Krótki epizod wojskowy, trwający od początku sierpnia do połowy listopada 1920 r., miał zadecydować o przyszłych losach Autora wspomnień. Dzięki zaoszczędzonemu żołdowi oraz uzyskanemu relutum (ekwiwalent za wyżywienie, przyznawany maturzystom i akademikom urlopowanym z wojska) mógł On rozpocząć studia, na które nie stać było ubogiej chłopskiej rodziny. Wstąpił na Wydział Filozoficzny Uniwersytetu Jagiellońskie-