Wykład 7 Przegląd najważniejszych enzymów

Transkrypt

1 ENZYMOLOGIA Kierunek: Technologia Żywności i Żywienie Człowieka semestr I Wykład 7 Przegląd najważniejszych enzymów WYDZIAŁ NAUK O ŻYWNOŚCI I RYBACTWA CENTRUM BIOIMMOBILIZACJI I INNOWACYJNYCH MATERIAŁÓW OPAKOWANIOWYCH

2 Zakres materiału ENZYMOLOGIA 1. Biochemia, Autor: Jeremy Berg, Lubert Stryer, John L. Tymoczko, PWN Warszawa (2005) Rozdziały: 8. Enzymy:: podstawowe pojęcia i kinetyka 9. Strategie katalityczne 10. Strategie regulacyjne:: enzymy i hemoglobina 2. Ćwiczenia z enzymologii i technik biochemicznych. Bartoszewska, Niziołek, Paszowski, Wydawnictwo SGGW 3. Handbook of Food Enzymology ed. John R. Whitaker et al., CRC Press; (2002) 4. Enzymes in Food Technology - ROBERT J. WHITEHURST, BARRY A. LAW, Editors Sheffield Academic Press CRC Press (2002) 3. Food chemistry - Hans- Dieter Belitz, Werner Grosch, Peter Schieberle, Springer (2004)

3 Nazewnictwo/klasyfikacja enzymów EC Enzymy dzieli się na 6 grup (mechanizm reakcji ): EC 1 oksydoreduktazy: katalizują reakcje utleniania i redukcji, EC 2 transferazy: przenoszą grupy funkcyjne, EC 3 hydrolazy: katalizują hydrolizę różnych wiązań, EC 4 liazy: rozcinają różne wiązania na drodze innej niż hydroliza czy utlenianie, EC 5 izomerazy: katalizują zmiany izomeracyjne cząsteczek, EC 6 ligazy: łączą cząsteczki wiązaniami kowalencyjnymi. EC1 oksydoreduktazy - AH 2 + B A + BH 2 ; EC2 transferazy - AB + C A + BC; EC3 hydrolazy - AB + H 2 O A + B; EC4 liazy - AB A + B; EC5 izomerazy - AB BA; EC6 ligazy - A + B AB; E.C (E.C. kod enzymu) Pierwsza liczba - klasa enzymu lub grupa Druga liczba grupa utleniona w donorze Trzecia liczba akceptor Czwarta liczba nazwa systematyczna (wskazuje działanie)

4

5 Nazewnictwo/klasyfikacja enzymów EC

6 Najważniejsze enzymy w technologii żywności Oko!o 4100 enzymów sklasyfikowanych Ok. 4-5% Oko!o enzymów znalaz!o zastosowanie w technologii "ywno#ci Ponad 80% to enzymy hydrolityczne 20% inne klasy g!ównie oksydoreduktazy 70% to proteinazy i amylazy 30% inne hydrolazy Jedynie ligazy nie znalazły do tej pory bezpośredniego zastosowania przemysłowego, lecz są przydatne w inżynierii genetycznej.

7 TERMOLIZYNA - hydrolza termostabilna metaloendoproteina (endoproteinaza) (Zn, Ca) z Bacillus thermoproteoly1cus, - preferuje hydrolizę wiązań peptydowych Aa/Leu, Aa,Phe, - katalizuje też syntezę wiązań peptydowych na drodze kondensacji hydrolitycznej, w większości przypadków reakcje katalizowane przez enzym są ODWRACALNE (synteza wiązań peptydowych). Aspartam zmetylowany dipeptyd

8 PEKTYNAZY hydrolazy hydrolizują wiązania glikozydowi w pektynach, ułatwiają uwalnianie soków z miazgi, klarowanie soków (usuwanie zmętnień pektynowych), pektyny są heteropolisacharydami, składają się głównie z połączonych ze sobą wiązaniami α 1,4 glikozydowymi jednostek kwasu D galakturonowego, w znacznej części zestryfikowanych gr. metylowymi, β D galaktozydaza hydrolaza (usuwanie laktozy z mleka) kwas galakturonowy powstaje na skutek utleniania α D galaktozy, posiada grupę aldehydową przy C1 i karboksylową przy C6.!

9 Reduktaza diacetylowa (RA) oksydoreduktaza Diacetyl + NADH + H + NAD + Acetoina Diacetyl (produkcja piwa) - diketon o nazwie systematycznej 2,3- butandion, zapachu maślanym, znajduje się w piwie jako produkt uboczny fermentacji przez drożdże, przy odpowiednim stężeniu wykazuje korzystne właściwości pozwala dłużej odczuwać w ustach smak piwa, - w stężeniu większym niż 0,2 mg/l nadaje piwu niekorzystny maślany posmak, powstaje w wyniku przetwarzania cukrów przez drożdże, czasami bakterie w procesie fermentacji, - w czasie leżakowania piwa te same drożdże redukują diacetyl do obojętnych smakowo produktów (acetoina, butandiol).!

10 PEPTYDAZY (enzymy proteolityczne, proteazy) - katalizują hydrolizę wiązań peptydowych w białkach i peptydach (podstawowe zadanie), - należą do klasy 3 hydrolaz, - niektóre z nich katalizują ponadto hydrolizę wiązań estrowych i amidowych oraz reakcję transpeptydacji i transamidacji, - w odpowiednich warunkach niektóre peptydazy mogą ponadto syntetyzować wiązanie peptydowe. Peptydazy niska specyficzność substratowa, jednakże charakteryzują się wybiórczością w stosunku do położenia rozkładanego wiązania w łańcuchu polipeptydowym oraz swoistością w stosunku do hydrolizy wiązań pomiędzy określonymi aminokwasami.!

11 PEPTYDAZY - klasyfikacja Egzopeptydazy - EC (odcinają 1 lub 2 aminokwasy od końca N lub C) aminopeptydazy EC : odcinające pojedyncze aminokwasy od końca aminowego, karboksypeptydazy EC : odcinające pojedyncze aminokwasy od końca karboksylowego, dipeptydazy EC : hydrolizują wiązania peptydowe w dwupetydach, dwupeptydylo- peptydazy lub tripeptydylo- peptydazy: odszczepiają jednostki dwupetydowe lub tripeptydowe od końca N (EC ) lub końca C (EC ), omega peptydazy EC : odcinające różnie podstawione reszty aminokwasowe. Egzopeptydazy ważne dla przemysłu spożywczego: Aminopeptydazy i karboksypeptydazy Lactococcus lac1s Aspergillus sp. Rhizopus oryzae Zastosowanie: usuwanie gorzkiego smaku z hydrolizatów białkowych, także przy produkcji sera.

12 PEPTYDAZY - klasyfikacja Endopeptydazy (proteinazy) EC , EC (hydrolizują wiązania wewnątrz łańcucha polipeptydowego) Na podstawie budowy centrum, wrażliwości na inhibitory oraz mechanizm katalizy wyróżniono: serynowe EC seryna oraz histydyna w centrum aktywnym, są hamowane przez DFP (diizopropylofluorofosforan) cysteinowe EC cysteina i histydyna w centrum aktywnym, wrażliwość na czynniki utleniające, hamowane przez PCMB (p- Chloromercuribenzoic Acid) reakcja z grupami - SH aspartylowe EC dwie reszty asparaginianu w centrum aktywnym, aktywność przy niskim ph metaloproteinazy EC inhibicja przez EDTA

13 Endopeptydazy o znaczeniu przemysłowym Enzym EC numer Preferencyjna hydroliza x Serynowe proteazy chymotrypsyna trypsyna subtylizyna Cysteinowe proteazy Katepsyna B* Papaina* Ficyna* Bromalina* Aspartylowe proteazy Pepsyna Chymozyna# Metaloproteazy Termolizyna Neutralne proteinazy Tyr-, Trp-, Phe-, Leu- Arg-, Lys-, G!ównie hydrofobowe Arg-Arg-, Lys-, Phe-X- Arg-, Lys-, hydrofobowe-x- Phe-, Tyr- Lys-, Arg-, Phe-, Tyr- Phe-, Tyr-, Leu-, Asp-, Glu- Phe1 05 -Met 106 w "-kazeinie Ile-, Leu-, Val-, Phe-, Leu-, Phe-, i inne * szeroka specyficzność w stosunku do aminokwasów hydrolizowanego wiązania peptydowego # specyficzność podobna do pepsyny x preferencyjna hydroliza

14 Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz roślinnych Papaina, bromelina, ficyna - wewnątrzkomórkowe proteazy cysteinowe, opymum ph 5-7 Enzym!ród"o Sok z niedojrza!ych owoców papai (Carica papaya) Skala produkcji G"ówne zastosowanie > 10 t/rok Kruszenie mi"sa, browarnictwo usuwanie zm"tnienia piwa Bromelina Sok (lateks) z pnia ananasa < 1 t/rok Browarnictwo, kruszenie mi"sa Ficyna Sok z niektórych odmian drzew figowych g!. Ficus glabrata < 1 t/rok Modyfikacja sk!adników #ywno$ci Papaina

15 Komercyjne otrzymywanie papiny Zebranie mleczka kauczukowego z niedojrzałych owoców papai - (nacięcie rano, z 1 drzewa 1 l rocznie, mleczko przypomina wyglądem mleko krowie, po kilku minutach po wypływie z naciętego owocu ścina się i tworzy żel) Sch!odzenie Mieszanie mechaniczne " #el w p!yn Wst$pna filtracja i odwirowanie Ultrafiltracja Klarowny i przezroczysty przes%cz zag$szcza si$ w pró#ni oraz suszy w suszarni rozpy!owej Mielenie na proszek i pakowanie

16 Otrzymywanie i zastosowanie peptydaz zwierzęcych Zewnątrzkomórkowe enzymy trawienne: Enzym!ród"o Skala produkcji G"ówne zastosowanie Chymozyna!o"#dek m"odych cielaków > 1 t/rok Serowarstwo Pepsyna!o"#dek $wini < 1 t/rok Trypsyna Trzustka $wini lub byd"a < 1 t/rok Chymotrypsyna Trzustka $wini < 1 t/rok Modyfikacja sk"adników %ywno$ci, serowarstwo Modyfikacja sk"adników %ywno$ci, hydrolizaty bia"kowe, odw"asianie skór Modyfikacja sk"adników %ywno$ci, odw"asianie skór

17 Komercyjne otrzymywanie pepsyny przemysłowej Rozdrobnienie i mielenie surowca (wy!ció"ko #o"$dka!wini) Autoliza!luzówki #o"$dka w obecno!ci HCl Usuni%cie t"uszczu heksanem Wysolenie sol$ lub izopropanolem Rozpuszczenie w wodzie Filtrowanie, suszenie sublimacyjne (45-55 o C) w pró#ni (odparowanie heksanu i izopropanolu) Mielenie na proszek i pakowanie

18 Enzym!ród"o Skala produkcji G"ówne zastosowanie Neutralne peptydazy Bacillus subtilis > 100 t/rok Hydrolizaty bia!kowe, dodatek do proszków do prania, browarnictwo Kwa"ne peptydazy g!. koagulaty bia!ek mleka Kwa"ne peptydazy Otrzymywanie peptydaz z mikroorganizmów Rhizmucor miehei > 10 t/rok Serowarstwo Aspergillus niger, Aspergillus oryzae > 1 t/rok Piekarnictwo, wytrawianie skór Neutralne proteinazy Bacillus sub1lis; proteinazy serynowe, metaloproteinazy. Podpuszczka handlowa nazwa zalecana dla preparatów z żołądków przeżuwaczy zawierająca głównie chymozyną i w niewielkim stopniu pepsynę (Międzynarodowa Federacja Mleczarska). Peptydazy pochodzenia mikrobiologicznego zdolne do koagulacji białek mleka zaleca się nazywać koagulantami białek mleka.

19 Hydrolizaty bialkowe Produkcja hydrolizatów białkowych odbywa się w wyniku enzymatycznej lub kwasowej/ zasadowej hydrolizy białek) Enzymatyczne modyfikacja składu i właściwości białek - hydrolizaty białkowe Enzymatyczna hydroliza białek nie powoduje rozkładu aminokwasów, jest bardziej specyficzna od hydrolizy kwasowej i alkalicznej białek. W wyniku częściowej proteolizy Zmieniają się reologiczne, fizyczne, chemiczne właściwości białek, Powstają charakterystyczne cechy smakowe i zapachowe produktów. np. hydrofobowe aminokwasy schowane wewnątrz cząsteczki białka zostają odsłonięte, najczęściej powstaje gorzki smak, zwiększa się rozpuszczalność, obniża napięcie powierzchniowe, zwiększa się zdolność do emulgowania tłuszczów (tworzenia emulsji) i tworzenia piany, wzrasta strawność i przyswajalność produktu. Gdy jednak zbyt długo prowadzi się hydrolizę to właściwości emulgujące i tworzenia piany mogą spadać. Hydrolizaty białek na skalę przemysłową otrzymuje się z: białek mleka (kazeiny, albuminy, białka serwatkowe), białek mięsa, soi, glutenu pszenicy, fibrynogenu lub kolagenu.

20 Hydrolizaty białkowe zastosowanie Jako koncentraty spożywcze i przyprawowe, np. zupy instant, sosy sojowe, przyprawy do pieczenia mięsa, buliony mięsne w proszku, Dodatki do żywności wytwarzające i stabilizujące pianę, emulgujące tłuszcze, modyfikujące smak, poprawiające teksturę i ułatwiające krojenie, np. do parówek, Do otrzymywania żywności przeznaczenia specjalnego: - odżywki dla niemowląt, - preparaty odchudzające, - odżywki białkowe dla sportowców, - odżywki o obniżonej alergenności dla dzieci atopowych oraz z zaburzeniami - wchłaniania i trawienia o podłożu immunologicznym, niealergizującym, Wzbogacanie produktów w białko, np. chleba i żywności specjalnej. Laktoalbumina zawarta w białku serwatkowym mleka krowy oraz albumina jaja zostały uznane za białka o najwyższej wartości odżywczej przez FAO/WHO (nie tylko zawartość egzogennych aminokwasów, ale i proporcje aminokwasów egzogennych do endogennych) => ale RYZYKO REAKCJI ALERGICZNYCH!!!

21 PROCES PLASTEINOWANIA Proces plasteinowania, jako przykład polepszania jakości białek Enzymatyczna reakcja resyntezy wiązań peptydowych (w konkretnych warunkach), Enzymatyczne przeprowadzanie hydrolizatów białkowych w peptydy wielkocząsteczkowe, nierozpuszczalne w 10% TCA o konsystencji żelu nazwanego plasteiną. Proces dwuetapowy: ETAP 1: polega na częściowej hydrolizie wiązań peptydowych białek przy użyciu proteinaz, takich jak pepsyna, papaina, α- chymotrypsyna. ETAP 2: otrzymany uprzednio hydrolizat białkowy (mieszanina peptydów), po zatężeniu, poddaje się reakcji plasteinowania katalizowanej przez enzymy, takie same bądź inne niż stosowane w procesie hydrolizy, lecz przy ph innym niż w procesie hydrolizy w wyniku, czego otrzymuje się plasteinę charakteryzującą się, w porównaniu z białkiem wyjściowym, lepszym składem jakościowym oraz obniżoną zawartością substancji antyżywieniowych.

22 Schemat technologiczny otrzymywania plastein Roztwór bia!ek Endopeptydaza, np. pepsyna Cz%&ciowa hydroliza do peptydów Egzopeptydaza Odszczepienie niepo!"danych aminokwasów Rozdzielenie Niepo!"dane aminokwasy Estry etylowe po!"danych aminokwasów Rozpuszczalnik organiczny Zag%szczenie Reakcja plasteinowa w 50 % roztworze substratów Rozdzielenie Woda Frakcja zwi"zków ma#ocz"steczkowych NaOH Hydroliza wi"za$ estrowych Alkohol etylowy Plasteiny o po!"danym sk#adzie aminokwasowym

23 KIERUNKI WYKORZYSTYWANIA REAKCJI PLASTEINOWANIA - wbudowywanie aminokwasów egzogennych w białka, np. gluten (białko zapasowe zbóż) w lizynę, zeinę w lizynę, tryptofan, - usuwanie niepożądanych aminokwasów w przypadku szczególnych diet, np. w fenyloketonurii konieczne jest wyeliminowanie z produktów fenyloalaniny (do produkcji hydrolizatów wykorzystywane są rybny koncentrat białkowy i białko sojowe), - usuwanie gorzkiego smaku hydrolizatów białkowych usunięcie aminokwasów hydrofobowych lub ich ukrycie wewnątrz długich łańcuchów plastein, - usuwanie właściwości alergennych białek usunięcie części epitopów (z końca N lub C), - rozbicie epitopów lub ich ukrycie wewnątrz łańcuchów plastein => konieczność poznania sekwencji aminokwasowych uczulających.

24 ZASTOSOWANIE PEPTYDAZ PIEKARNICTWO - rozluźnienie zbyt mocnego białka glutenowego mąki, co prowadzi do skrócenia czasu wyrabiania ciasta, - polepsza jego pulchność i konsystencję (peptydazy grzybowe i bakteryjne), BROWARNICTWO - podczas przerobu zbożowych surowców niesłodowanych w celu zapewnienia odpowiednich właściwości organoleptycznych (zapachu, pienistości, klarowności) => stabilizacja piwa (szczególne znaczenie przy schładzaniu piwa), - przy słodowaniu jęczmienia i w początkowej fazie zacierania słodu => odpowiedni stopień rozkładu substancji białkowych, PRZEMYSŁ MIĘSNY - przyspieszenie procesu dojrzewania mięsa, głównie wołowego, poprzez częściowy rozkład... białka włókna mięśniowego uzyskuje się poprawę konsystencji (delikatność, kruchość), poprawę wartości odżywczej i cech organoleptycznych => 2-3 x skrócony czas dojrzewania => zwiększona strawność, - oddzielenie resztek mięsa od kości zwiększenie odzysku białka, - zmiękczanie, odwłasianie skór, - zwiększenie wydajności ekstrakcji tłuszczu,

25 ZASTOSOWANIE PEPTYDAZ PRZEMYSŁ RYBNY - dojrzewanie solonych, marynowanych śledzi (pleśnie Aspergillus), MLECZARSTWO - koagulacja białek mleka w produkcji sera, - produkcja hydrolizatów kazeiny, - produkcja mleka sojowego, mleka w proszku, - w procesie dojrzewania sera proces złożony, proteoliza niezbędna do uzyskania prawidłowej struktury, głębokiego smaku, - dostarczenia aminokwasów niezbędnych do wytworzenia charakterystycznego smaku i zapachu.

26 Jedynym producentem enzymatycznych preparatów amylolitycznych, pektynolitycznych i proteolitycznych w Polsce są Zakłady Przemysłu Ococowo- Warzywnego PEKTOWIN w Jaśle. Enzymy proteolityczne otrzymywane głównie w wyniku biosyntezy bakterii Bacillus sub1lis, szczepu Aspergillus niger. Transglutaminaza Reakcje katalizowane przez transglutaminazę - sieciowanie łańcuchów polipeptydowych. - występuje w krwi ssaków, uczestniczy w wytwarzaniu skrzepów; - produkowana także przez drobnoustroje; - jako acylotransferaza, katalizuje reakcje łączenia reszty acylowej glutaminy wbudowywanej w białko lub w peptyd z pierwszorzędową grupą aminową aminokwasu wolnego lub wbudowanego w białko lub peptyd (lizyna). O O bia!ko 1 -(CH 2 ) 2 -C-NH 2 + H 2 N-(CH 2 ) 4 -bia!ko 2! bia!ko 1 -(CH 2 ) 2 -C-N-(CH 2 ) 4 -bia!ko 2 + NH 3 H O O bia!ko-(ch 2 ) 2 -C-NH 2 + H 2 NR! bia!ko-(ch 2 ) 2 -C-N-R + NH 3 wolny aminokwas H

27 Novozymes niekwesmonowany lider produkcji enzymów

28 Historia firmy Novozymes

29 Znaczenie innowacji w rozwoju firm

30 Każda nowo projektowana linia biotechnologiczna poprzedzona jest fazą badawczą i wdrożeniową

31

32

33

34 Dla dynamicznego rozwoju firmy biotechnologicznej należy zwiększać swoją zdolność innowacyjną poprzez posiadanie własnego ośrodka badawczo- wdrożeniowego (od 10-30% zysku ze sprzedaży powinno być inwestowane w takie badania).

35

36 Bio- produkty na bazie chemicznej są korzystne dla emisji dwutlenku węgla i innych kryteriów środowiskowych Mniejszy wpływ na środowisko produktów bio- spowodowało gwałtowny wzrost biotechnologii przemysłowej - Redukcja emisji gazów cieplarnianych w porównaniu do emisji dwutlenku surowców kopalnych - Mniejsze zużycie energii podczas produkcji (np. poprzez zastosowanie enzymów) - Mniejszy wpływ na środowisko (''zielonych''rozpuszczalników, zmniejszenie zużycia wody, degradacji produktów ubocznych, itp.) - Surowce odnawialne Prawdziwe korzyści wymagają oceny dla każdego związku, w zależności od - Typ surowca (np. trzciny cukrowej vs kukurydziane) - Pochodzenie surowca (np. produkcji na gruntach rolnych vs wylesianie) - Techniki rolniczej (np., nawożenie, nawadnianie, stosowanie pestycydów)

37

38 Projektowana linia biotechnologiczna powinna opierać się o określone standardy bezpieczeństwa (farmacja vs. produkcja bioetanolu) oraz zakąłdać możliwe pełne wykorzystanie surowców i odpadów produkcyjnych (surowce wtórne/pośrednie).