PL B1. Sposób wytwarzania bionanocelulozy o właściwościach opatrunku na uszkodzenia skóry

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61L 15/28 ( ) A61L 15/36 ( ) A61F 13/00 ( ) (54) Sposób wytwarzania bionanocelulozy o właściwościach opatrunku na uszkodzenia skóry (73) Uprawniony z patentu: BOWIL BIOTECH SPÓŁKA Z OGRANICZONĄ ODPOWIEDZIALNOŚCIĄ, Władysławowo, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 10/13 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/14 (72) Twórca(y) wynalazku: MAGDALENA KUKOWSKA-KASZUBA, Wejherowo, PL ALDONA DŁUGA, Gdynia, PL DARIUSZ BOBIŃSKI, Jurata, PL WALDEMAR WILANDT, Jurata, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wiktoria Czerwińska-Czerniak

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania bionanocelulozy o właściwościach opatrunku na uszkodzenia skóry przeznaczonej do zastosowania dla wyrobów medycznych i dermatologiczno- -kosmetycznych jako płatki czyste, wilgotne, suszone, liofilizowane lub z użyciem substancji czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji, zwłaszcza do produkcji nowej generacji materiałów opatrunkowych stosowanych m. in. w leczeniu rozległych ran oparzeniowych, trudno gojących się ran chronicznych, w oczyszczaniu pola operacyjnego z martwiczych tkanek przed przeszczepem skóry oraz w łagodzeniu uszkodzeń i podrażnień skóry po zabiegach dermatologiczno-kosmetycznych. Bionanoceluloza może być także stosowana jako środek opatrunkowy w stomatologii i okulistyce. W literaturze opisanych jest wiele sposobów biosyntezy celulozy bakteryjnej (BC) jednakże wciąż istnieje potrzeba ich doskonalenia celem optymalizacji procesu otrzymywania biomateriału (pożywka hodowlana, warunki hodowli, czas produkcji, technika obróbki surowej błony) uwzględniających aspekty ekonomiczne oraz skalę produkcji. Z opisu patentowego PL znany jest sposób wytwarzania celulozy bakteryjnej w postaci błon na drodze hodowli powierzchniowej bakterii Acetobacter xylinum P 23 inkubowanej na skosie agarowym o składzie w częściach wagowych : 20 części agaru, 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2 części fosforanu dwusodowego, 1 część kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej, w temperaturze C, w czasie godzin, a następnie aktywacji szczepu na podłożu stałym lub płynnym z użyciem tych samych ilości glukozy, ekstraktu drożdżowego, peptonu, fosforanu dwusodowego, kwasu cytrynowego, etanolu, wody destylowanej. Uzyskanym inokulum szczepi się wysterylizowane podłoże produkcyjne o składzie w częściach wagowych: części glukozy technicznej, lub części glukozy z odcieku po krystalizacji glukozy, 2-5 części ekstraktu drożdżowego, 2-3 części peptonu, 2-3 części fosforanu dwusodowego, 1-1,5 części kwasu cytrynowego, części etanolu, 1000 części wody destylowanej i o ph 6,0-6,2, po czym prowadzi hodowlę stacjonarną w temperaturze C w czasie 4-5 dni. Uformowane błony odsącza się, przemywa wodą wodociągową, gotuje z 1-1,5% NaOH, przemywa wodą do uzyskania odczynu obojętnego i po wyżęciu oraz wysuszeniu w temperaturze C, sterylizuje się w temperaturze 120 C w czasie min. Błony celulozowe o zawartości 90-97% -celulozy mogą być stosowane jako środek opatrunkowy w chirurgii i dermatologii. W opisie patentowym PL dotyczącym otrzymywania celulozy bakteryjnej szczep bakterii Acetobacter xylinum przechowywanych na podłożu stałym z agarem, przenosi się na podłoże płynne o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2 części fosforanu dwusodowego, 10 części etanolu, 1000 części wody destylowanej i o ph 5,8-6 regulowanym kwasem solnym inkubuje dwustopniowo w temperaturze 30 C w czasie godz. Hodowla produkcyjna prowadzona jest na podłożu o składzie w częściach wagowych: 30 części sacharozy, 3 części ekstraktu drożdżowego, 2 części etanolu, 3 części KH 2 PO 4, 5 części (NH 4 ) 2 SO 4, 0,5 części MgSO 4 x7h 2 O do 1000 części wody destylowanej lub podłożu o składzie w częściach wagowych: 1000 części produktu odpadowego powstającego po wytrąceniu dekstranu z cieczy pofermentacyjnej zawierającego 5% wagowych fruktozy, ślady glukozy oraz białka, 0,2 części KH 2 PO 4, 0,04 części MgSO 4 x7h 2 O, 0,8 części (NH 4 ) 2 SO 4 i o ph 5,5-5,8. Otrzymane błony odsączono, przemyto wodą wodociągową, traktowano 1% NaOH przez 2 godziny, następnie usunięto nadmiar NaOH, płukano wodą wodociągową, destylowaną i poddano sterylizacji radiacyjnej. Błony celulozowe w postaci folii o grubości 0,01-0,5 mm stanowią prawie 97% wysokokrystalicznej -celulozy. W publikacji zgłoszenia PL A, także jako WO A ujawniono sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej z użyciem bakterii Acetobacter xylinum w warunkach stacjonarnych, na powierzchni ciekłej pożywki o składzie w częściach wagowych : części glukozy, części alkoholu etylowego, 0,5-3 części kwasu cytrynowego, 2,5-12,5 części ekstraktu drożdżowego, 2,5-12,5 części peptonu, 1,25-6,25 części MgSO 4 x7h 2 O, 1,25-7 części Na 2 HPO 4, do 1000 części wody destylowanej. Zgodnie z opisem zgłoszenia PL aktywację szczepu i hodowlę wstępną inokulum przeprowadzono w temperaturze C na podłożu o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,7 części Na 2 HPO 4, 2,5 części MgSO 4 x7h 2 O, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej. Otrzymanym inokulum zaszczepiono podłoże produkcyjne o składzie w częściach wagowych: 20 części substancji stanowiącej źródło węgla, substancję zawierającą źródło azotu, 2,5 części MgSO 4 x7h 2 O, 2,7 części Na 2 HPO 4,1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu do 1000 części

3 PL B1 3 wody destylowanej. Przed hodowlą produkcyjną stosowano wstępną preinkubację całej objętości podłoża w warunkach stacjonarnych w czasie 24 godzin w temperaturze C, a następnie po wymieszaniu i przelaniu do bioreaktorów przeprowadzono hodowlę właściwą stacjonarną w czasie 5-7 dni, stosując podłoże korzystnie uzupełnione karboksymetylocelulozą. Błony celulozowe poddano płukaniu w wodzie, gotowaniu w 1% NaOH, ponownym płukaniu do usunięcia NaOH, działaniu 1% kwasem octowym, przemyciu wodą destylowaną oraz odwodnieniu i ewentualnie sterylizacji. Proces biosyntezy prowadzono na podłożach produkcyjnych z udziałem namoku kukurydzianego, syropu glukozowo-fruktozowego, odcieku fruktozowego i melasy jako elementów będących źródłem węgla i azotu różnego pochodzenia, a także na podłożu z użyciem karboksymetylocelulozy (CMC). Błony celulozowe otrzymane tym sposobem mogą być stosowane np. jako nośnik do immobilizowania biokatalizatorów lub materiał opatrunkowy. W publikacjach zgłoszenia PL dotyczącego otrzymywania immobilizowanych biokatalizatorów i zgłoszenia PL dotyczącego modyfikacji błon celulozowych przedstawiono wykorzystanie celulozy bakteryjnej otrzymanej z hodowli powierzchniowej bakterii Acetobacter xylinum w trójetapowym procesie na podłożu o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO 4 x7h 2 O, 2,7 części Na 2 HPO 4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej ewentualnie modyfikowanym dodatkiem CMC, która następnie poddawana jest obróbce w dalszych etapach technologicznych, w zależności od przeznaczenia. Hodowla właściwa produkcyjna powadzona była w bioreaktorze o powierzchni cm 2 w temperaturze 30 C przez 7 dni. Otrzymane błony zwłaszcza na podłożu z użyciem CMC po oczyszczeniu poddawane były działaniu roztworu nadjadaniu sodu dając utleniony biozgodny i biodegradowalny produkt o zwiększonej chłonności wobec płynów oraz zwiększonej zdolności do wiązania białek (lizozymu), komórek skóry oraz leczenia rozległych ran oparzeniowych. Przedstawiono również sposób użycia sproszkowanej celulozy bakteryjnej w procesie kriożelowania w postaci sferycznej zawiesiny komórek drobnoustroju (drożdży Saccharomyces cerevisiae lub bakterii Bacillus subtilis). Opis patentowy PL B1 przedstawia sposób wytwarzania modyfikowanej celulozy bakteryjnej na podłożu płynnym, zawierającym w swoim składzie poliaminosacharydy lub oligosacharydy tj. chitozan i jego pochodne. Po zakończeniu procesu fermentacji błonki oddziela się od podłoża hodowlanego przemywa wodą destylowaną i następnie sterylizuje w 1% roztworze NaOH w temperaturze 121 C przez 15 min i ponownie przemywa wodą, działa 1% roztworem CH 3 COOH, wodą do uzyskania odczynu obojętnego. Kolejno odprasowuje się wodę i suszy w temperaturze 110 C. Tak otrzymywana celuloza bakteryjna z uwagi na korzystne właściwości może być wykorzystywana nie tylko w papiernictwie, ale także medycynie i kosmetyce. W opisie zgłoszeniowym P wynalazku PL ujawniony jest sposób wytwarzania biomateriału o właściwościach chrząstki przy użyciu celulozy mikrobiologicznej wytworzonej w hodowli stacjonarnej bakterii Gluconacetobacter xylinus na podłożu produkcyjnym o składzie w częściach wagowych: 20 części glukozy, 5 części ekstraktu drożdżowego, 5 części peptonu, 2,5 części MgSO 4 x7h 2 O, 2,7 części Na 2 HPO 4, 1,15 części kwasu cytrynowego, 10 części etanolu, do 1000 części wody destylowanej i oczyszczonej w drodze płukania w gorącej wodzie wodociągowej, gotowania z 1% wodnym roztworem ługu sodowego lub działania 1-2% wodnym roztworem ługu sodowego w temperaturze pokojowej, płukania w wodzie wodociągowej, działania 1% roztworem wodnym kwasu octowego i ponownego płukania najpierw wodą wodociągową i w końcu wodą destylowaną, po czym wytworzoną i oczyszczoną celulozę modeluje się w konstrukcję przestrzenną o żądanym kształcie i poddaje modyfikacji polegającej na działaniu 30% wodnym roztworem ługu sodowego, płukaniu w wodzie destylowanej, następnie działaniu 10% wodnym roztworem kwasu octowego i powtórnym płukaniu w wodzie destylowanej aż do uzyskania przez materiał celulozowy ph 5,6-6,8. Z publikacji Bielecki S., Kalinowska H. Post. Mikrobiol. 2008, 47(3): oraz Bielecki S., Krystynowicz A., Turkiewicz M, Kalinowska H. Biotechnology of Biopolymers 2005, 1: wiadomo, że istnieje kilka rodzajów bakterii produkujących celulozę, z których jednak najlepiej poznany jest szczep Acetobacter. Struktura tworzonego polimeru jest uzależniona od indywidualnych cech mikroorganizmu, chociaż mechanizm biosyntezy i jej regulacji jest prawdopodobnie wspólny dla większości mikroorganizmów produkujących celulozę. A. xylinum (synonim A. aceti spp. xylinum, A. xylinus) nowo sklasyfikowany jako Gluconacetobacter (G. xylinus razem z innymi szczepami m.in. G. hansenii, G. europaeus, G. oboedeins i G. intermedium) jest najwydajniejszym producentem celulozy. Właściwości celulozy tj. elastyczność, zawartość wody, stopień polimeryzacji i krystalizacji wynikają

4 4 PL B1 również z warunków hodowli, czasu jej trwania i składu stosowanego podłoża (różne źródła węgla i azotu). Parametry końcowe produktu decydują o możliwościach jego zastosowania w medycynie, kosmetyce, papiernictwie, elektronice, akustyce i przemyśle spożywczym. Z opisów patentowych US , CA znany jest sposób wytwarzania celulozy bakteryjnej w reaktorach o stałym przepływie. Otrzymaną masę celulozową poddawano działaniu dimetyloacetamidu i chlorku litu, a z uzyskanego roztworu odlewano płaską formę - błonę i wprowadzano ją do kąpieli żelującej pozwalającej na uzyskanie materiału o pożądanych właściwościach chłonnych. W opisach patentowych US , WO przedstawiono metodę wytwarzania celulozy na skalę przemysłową z zastosowaniem odpowiedniej aparatury. Sposób obejmuje dwa etapy polegające na przygotowaniu i sterylizacji cieczy hodowlanej, następnie zaszczepieniu cieczy zhomogenizowaną zawiesiną komórek pochodzących z hodowli wstrząsowej, a w drugim etapie następuje przeniesienie pożywki produkcyjnej do specjalnych tac zapewniających stałą temperaturę medium. Po zakończeniu hodowli maty celulozowe przenoszone są do wirówki, w której kolejno następuje pranie w ługu oraz siarczanie laurylu. Następnie błony są wyciskane i suszone w urządzeniu grzewczym pomiędzy wałkami powodującymi nacisk 0,5-0,8 kg/cm 2. Ostatecznie materiał poddawany jest sterylizacji. Metoda ta pozwala na otrzymanie błony o gramaturze g/m 2. Z opisu patentowego WO 2008/ A1 znany jest proces produkcji celulozy jako półproduktu używanego do wytwarzania biocelulozowych masek lub bioetanolu. Biosynteza polimeru prowadzona jest na podłożu pochodzącym z odpadów po fermentacji piwa (roztwór drożdżowy lub łuski słodowe). Do zaszczepienia cieczy produkcyjnej stosowane są bakterie z gatunku m.in. Agrobacterium sp., Rhizobium sp., Pseudomonas sp., Sarcina sp. Z opisu patentowego US 2009/ znany jest sposób otrzymywania celulozy bakteryjnej z użyciem bakterii Acetobaeter xylinum w systemie ciągłym, bez konieczności wymiany medium hodowlanego po jednym cyklu. Inokulum do procesu fermentacji przygotowuje się z czystej kultury bakteryjnej lub z liofilizatu z bakterii w ilości 10-20%. Standardowa pożywka w skład, której wchodzi glukoza (10-50 g/l), ekstrakt drożdżowy (0,5-4,0 g/l), KH 2 PO 4 (0-2 g/l), MgSO 4 x7h 2 O (0-1,5 g/l), etanol (0,5-2,0%) jest sterylizowana, ochładzana i zaszczepiona zawiesiną bakterii, a po preinkubacji rozprowadzona na metalowe tace, w których następuje wzrost polimeru. Po zakończeniu fermentacji błony są czyszczone, natomiast pozostająca sterylna pożywka hodowana podlega dalszej inkubacji, pozwalając na otrzymanie kolejnych mat celulozowych. Po zredukowaniu ilości podłoża w tacach do wartości 15-20% jest ono uzupełniane o nową ciecz i cykl jest powtarzany od momentu sterylizacji. Czas fermentacji trwa h i zapewnia gramaturę błon g/m 2. Przedstawione rozwiązanie wydaje się być bardzo obiecujące w kontekście zastosowania na skalę przemysłową. Z opisu patentowego BR wiadomo, iż zastosowanie pożywki hodowlanej zawierającej sacharozę jako źródło węgla pozwala na wydłużenie czasu fermentacji z wykorzystaniem bakterii Acetobacter xylinum. Sacharoza w warunkach hodowli ulega hydrolizie dając dwie cząsteczki cukrów prostych - glukozę i fruktozę, stanowiące dodatkowe źródło węgla. Z opisu patentowego US 2008/ A1 znana jest metoda wytwarzania celulozy bakteryjnej w specjalnie profilowanych tacach (formach) pozwalających na nadanie polimerowi kształtu maski na twarz. Ujawnione rozwiązanie umożliwia wyeliminowanie procesu formowania materiału za pomocą urządzeń tnących, często powodujących nierówności na brzegach. Z opisu patentowego US 2009/ A1 znany jest opatrunek celulozowy powlekany nanosrebrem, nadający polimerowi właściwości przeciwbakteryjne. Wynalazek ujawnia produkcję włókien celulozowych z zastosowaniem Acetobacter xylinum BPR 2001 hodowanych na pożywce zawierającej 2% fruktozy i 8% namoku kukurydzianego stanowiących źródło węgla i azotu. Włókna celulozowe po oczyszczeniu poddawane są kolejno działaniu nadjodanu sodu, 1% aminotiomocznika w kwasie octowym, proteinianu srebra w 2% boranie sodu i gorącego roztworu srebrowo-amonowego, a powstające w efekcie szeregu reakcji cząsteczki nanosrebra pokrywają celulozę. Z opisu patentowego US 7,390,499 B2 znany jest sposób otrzymywania celulozy mikrobiologicznej w warunkach statycznej hodowli z zastosowaniem szczepu Acetobacter xylinum na pożywce płynnej o ph 3,0-6,0 zawierającej sacharozę jako źródło węgla, nieorganiczne sole amonowe jako źródło azotu oraz namok kukurydziany jako kompleks składników odżywczych. Hodowla właściwa prowadzona jest w zamkniętych bioreaktorach minimalizujących skraplanie pożywki oraz dostęp tlenu przez 7-30 dni w temperaturze 30 C. Stężenie tlenu ma istotny wpływ na grubość i zawartość wody w gotowym materiale, dlatego powinien być utrzymywany na poziomie 5-21% na granicy faz pożywka-powietrze. Dowiedziono, że można zwiększyć wydajność procesu o 3,5-raza zwiększając stężenie

5 PL B1 5 cukru w pożywce. Błony poddawane są oczyszczaniu z użyciem 1-20% wodorotlenku sodu oraz 0,05-10% nadtlenku wodoru pozwalającego na wybielenie błony i usunięcie pirogenów. Opis ujawnia także, iż opatrunki z otrzymanej celulozy charakteryzują się zdolnością do oddawania nadmiaru płynów na rzecz stopniowego wysychania, ale i do pobierania nadmiaru płynu po wyschnięciu, a tym samym są zalecane do zastosowania w leczeniu ran przewlekłych, owrzodzeniowych, odleżynowych i stopy cukrzycowej. Z opisu patentowego WO 2007/ wynika, iż proces produkcji błon celulozowych z udziałem bakterii Acetobacter xylinum prowadzony jest na pożywce zawierającej 35% soku jabłkowego, 1% kwasu octowego i 10% roztworu cukru, najkorzystniej fruktozy. Przedstawiony sposób jest czasochłonny, ze względu na kilkudniową procedurę oczyszczania arkuszy obejmującą w pierwszym etapie moczenie w wodzie przez 1-2 dni oraz gotowanie we wrzącej wodzie przez min. Innym etapem determinującym długość czasu trwania procesu jest 1-2 dniowy etap nasączania błony substancjami pomocniczymi, aktywnymi substancjami leczniczymi, czy preparatami kosmetycznymi. Płaty otrzymanej biocelulozy wykazują zdolność do łagodzenia uszkodzeń i podrażnień skórnych, w szczególności mogą być stosowane na rany oparzeniowe. Bioceluloza może być aplikowana w formie czystego płata lub maski ewentualnie nasączonych substancjami aktywnymi, substancjami regulującymi wilgotność, wspomagającymi leczenie ran, czy substancjami przeciwutleniającymi. Gotowa kompozycja opatrunku stanowi 1-50% wagowych celulozy bakteryjnej, 1-10% wagowych substancji czynnych, 40-98% wagowych wody. Opis patentowy US ujawnia wytwarzanie nanomatrycy celulozowej z zastosowaniem szczepu Acetobacter xylinum NQ5 rosnącego na standardowej pożywce SH lub SH z dodatkiem CMC jako środka opatrunkowego do leczenia różnych typów ran od skaleczeń, stłuczeń, siniaków przez rany oparzeniowe, troficzne do ran po pobraniu fragmentu skóry do przeszczepu. W y- twarzane opatrunki antyalergiczne stanowią unikalny nośnik substancji aktywnych (antybiotyki, lipidy, hormony, białka, czynniki wzrostu komórek) i/lub dodatkowych (pochodne celulozy, chitozaniu, kwasu hialuronowego), wspomagających działanie celulozy bakteryjnej. Opis patentowy CN ujawnia wytwarzanie modyfikowanych opatrunków hydrożelowych z udziałem szczepu Gluconacetobacter xylinus. Opatrunek otrzymywany według wynalazku poza wysoko krystaliczną celulozą zawiera również rozpuszczalną w wodzie pochodną chityny o właściwościach antybakteryjnych i bakteriostatycznych do stosowania w leczeniu ran oparzeniowych, odleżynowych oraz operacyjnych zakażeń. W opisie patentu CN ujawniono wytwarzanie celulozy bakteryjnej z zastosowaniem wydajnego i tolerującego niskie ph pożywki szczepu Gluconacetobacter sp. SC-01, mogącego znaleźć zastosowanie w produkcji polimeru na skalę przemysłową. Bakterie Gluconacetobacter sp. SC-01 namnażane są w hodowli wstrząsowej przez 24 h w temperaturze C, na podłożu bogatym w źródło węgla np. glukozę, mannitol, sacharozę, galaktozę, fruktozę lub ksylozę oraz zawierającym źródło azotu np. sproszkowane drożdże, pepton lub suchy namok kukurydziany. Następnie podłoże produkcyjne szczepi się tak przygotowaną zawiesiną komórek w ilości 10% (v/v), a hodowlę właściwą prowadzi się w warunkach stacjonarnych przez 10 dni lub wstrząsowych przez 5 dni utrzymując odpowiednią temperaturę C. Otrzymaną w ten sposób celulozę bakteryjną oddziela się od medium hodowlanego, oczyszcza i suszy. Gotowy polimer charakteryzuje się wysoką czystością, higroskopijnością i wytrzymałością. Ze skrótu wynalazku CN znany jest szczep Gluconacetobacter xylinum 323 do produkcji celulozy bakteryjnej w obniżonej temperaturze. Zaproponowana metoda obejmuje kolejno przesiewanie mikroorganizmu produkującego grubą membranę celulozową z dużą aktywnością w temperaturze pokojowej, następnie chłodzenie zawiesiny komórek, ponowne hodowanie i ostatecznie wyizolowanie bakterii zdolnych do produkcji polimeru w temperaturze C. Sposób wytwarzania celulozy bakteryjnej przez tak przygotowany szczep bakteryjny składa się z podstawowych etapów: przygotowania kultury bakterii i pożywki, zaszczepienia pożywki oraz hodowli inokulum. Zaproponowana metoda produkcji polimeru w obniżonej temperaturze pozwala na zmniejszenie kosztów produkcji, zapobiega namnożeniu zanieczyszczeń podczas trwania procesu, a tym samym poprawia jego wydajność. Obecnie produkcja celulozy bakteryjnej na skalę przemysłową praktycznie nie funkcjonuje z uwagi na szereg napotykanych trudności związanych m. in. z aktywnością bakteryjnego producenta w określonych warunkach biosyntezy, kosztami podłoża hodowlanego, brakiem kontroli na poszczególnych etapach produkcji, zastosowaniem urządzeń stanowiących ciąg technologiczny oraz licznych

6 6 PL B1 zakażeń pożywki. Główną przyczyną braku możliwości otrzymywania dużej ilości bionanocelulozy jest jednak niska stabilność stosowanego szczepu bakteryjnego. Szczep może zmutować pod wpływem określonych parametrów wprowadzonych w warunkach hodowlanych tj. stężenie tlenu, szybkość mieszania, wartość ph i temperatura. Wszystkie te czynniki mogą prowadzić do tworzenia nieaktywnych form bakterii Cel -, nie zdolnych do wytwarzania celulozy. Kolejny ważny problem stanowi powtarzalność syntezy biomateriału, jakość materiału i wydajność stosowanej metody produkcji. Mimo, iż powszechnie jest znane i stosowane użycie bakterii Acetobacter xylinum do wytwarzania celulozy bakteryjnej, to jego efektywność produkcji polimeru jest wciąż niezadowalająca. Ujawniony w powyższych opisach mikroorganizm stanowiący szczep bakterii Gluconacetobacter, użyty do produkcji, jako bardziej efektywny - wydajny - do wytwarzania nanostrukturalnej celulozy wymaga dopracowania warunków hodowli, aby zapewnić opłacalność produkcji błon celulozowych w skali przemysłowej, dla zaspokojenia zapotrzebowania na wysoce skuteczne wyroby medyczne, jak opatrunki, sztuczne narządy (implanty), czy płatki dermatologiczno-kosmetyczne. Celem wynalazku jest opracowanie rozwiązania umożliwiającego otrzymanie bionanocelulozy o właściwościach opatrunku na uszkodzenia skóry, o dużej zawartości -celulozy i o wysokiej czystości mikrobiologicznej do zastosowań medycznych i kosmetycznych, w warunkach ekonomicznej opłacalności produkcji żelowej, elastycznej membrany z użyciem wysoce aktywnego producenta bakterii Gluconacetobacter xylinus, w skali przemysłowej, zaspakajającej wciąż rosnące zapotrzebowanie na nową generację materiałów opatrunkowych. Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania bionanocelulozy o właściwościach opatrunku na uszkodzenia skóry, poprzez hodowlę wstępną drobnoustroju Gluconacetobacter xylinus w temperaturze C na pożywce hodowlanej zawierającej jako źródło węgla i energii 2% glukozy, 0,90% alkoholu etylowego, 0,10% kwasu cytrynowego, jako źródło azotu 0,50% ekstraktu drożdżowego, ponadto sole mineralne : 0,05% MgSO 4 x7h 2 O, 0,30% Na 2 HPO 4 oraz wodę do utworzenia inokulum starterowego, aktywację komórek bakterii i zaszczepienie nimi podłoża produkcyjnego, preinkubację biomasy w temperaturze C w warunkach produkcyjnej hodowli wgłębnej w biomieszalnikach, a następnie przeprowadzenie właściwej hodowli produkcyjnej w warunkach stacjonarnych, w temperaturze C przez 2-11 dni, w poziomych bioreaktorach wypełnionych pożywką hodowlaną w ilości S/V (powierzchni/objętości) = 0,50-0,85 cm -1, po czym oczyszczanie wytworzonej błony celulozowej w cieczach myjących w drodze płukania kolejno w gorącej wodzie wodociągowej, działania gorącym wodnym 1-3% roztworem NaOH, płukania w wodzie wodociągowej, działania wodnym 1-3% roztworem kwasu octowego, ponownego płukania wodą i odciśnięcie wody z wytworzonych błon charakteryzujący się tym że bionanocelulozę wytwarza się w drodze hodowli szczepu bakterii Gluconacetobacter xylinus E 25, przechowywanych w postaci liofilizatu z 5-15% odtłuszczonego mleka lub w postaci liofilizatu z 5-15% glicerolu, którym szczepi się sterylizowane podłoże hodowlane i prowadzi hodowlę dynamiczną z szybkością mieszania 5-50 obrotów na minutę (rpm - revolutions per minute), przy ph 4,5-5,0 regulowanym 2,5-5,0% roztworem kwasu octowego, w czasie godzin i otrzymuje zawiesinę starterową komórek bakterii, którą w ilości 5-20%, zaszczepia się nową porcję wysterylizowanego podłoża o tym samym składzie i prowadzi hodowlę w tych samych warunkach, przy czym aktywację komórek bakterii powtarza się w 3-6 cyklach hodowlanych. Tak przygotowanym inokulum starterowym zaszczepia się wysterylizowane podłoże produkcyjne i prowadzi preinkubację w warunkach trójstopniowego cyklu produkcyjnej hodowli wgłębnej, w trzech sterylnych biomieszalnikach procesowych wypełnionych podłożem produkcyjnym o wzrastającej kolejno od 5 I do 3000 I objętości, do których kolejno przenosi się namnożoną biomasę. Jako podłoże produkcyjne stosuje się pożywkę hodowlaną otrzymaną o składzie analogicznym jak podłoże do hodowli inokulum starterowego lub pożywkę hodowlaną zawierającą ciecz pohodowlaną po hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie dla hodowli inokulum starterowego, wodę wodociągową po myciu błon wodnym roztworem NaOH, etanol i ewentualnie uzupełnioną glukozą lub glukozą i karboksymetylocelulozą (CMC) oraz uzupełnioną wodą wodociągową. Każdy z trzech stopni cyklu produkcyjnej hodowli wgłębnej prowadzi się w podłożu produkcyjnym o wartości ph = 4,5-5,0, w czasie godzin, miesza całość z prędkością obrotów na minutę (rpm - revolutions per minute) i napowietrza w ilości 0-2 objętości doprowadzonego powietrza na objętość cieczy hodowlanej w ciągu minuty (vvm - volume per volume per minute, l/l/min). Po zakończeniu preinkubacji biomasę z biomieszalnika przesyła się porcjami do poziomych bioreaktorów, układanych w stosy w sterylnym, termostatowanym boksie fermentacyjnym, w którym przeprowadza się powierzchniową hodowlę produkcyjną. Wytworzone błony bionanocelulozowe oczyszcza się w przeciwprądowym przepływie cieczy myjących

7 PL B1 7 w urządzeniu myjącym, a także odzyskuje ciecz pohodowlaną po zakończeniu hodowli produkcyjnej z podłoża pohodowlanego o składzie analogicznym jak podłoże do hodowli inokulum starterowego. Następnie błony poddaje pęcznieniu w mieszalniku bębnowym w dejonizowanej wodzie o temperaturze C, w czasie min, a po usunięciu nadmiaru wody przez odciśnięcie w urządzeniu z regulacją grubości do 0,1-5 mm, z płatów bionanocelulozy wytwarza się opatrunki w postaci handlowej płatków czystych wilgotnych, suszonych, liofilizowanych lub napawanych z użyciem substancji biologicznie czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji. Korzystnie jako podłoże produkcyjne stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą 2% glukozy, 0,90% etanolu, a ponadto 50-70% cieczy pohodowlanej po hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie analogicznym jak podłoże dla hodowli inokulum starterowego, 20-50% wody wodociągowej i 10-25% wody wodociągowej z oczyszczania błon celulozowych po myciu wodnym roztworem NaOH. Korzystnie jako podłoże produkcyjne stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą 0,90% etanolu, a ponadto 50-70% cieczy pohodowlanej po hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie analogicznym jak podłoże dla hodowli inokulum starterowego, 20-50% wody wodociągowej i 10-25% wody wodociągowej z oczyszczania błon celulozowych po myciu wodnym roztworem NaOH. Korzystnie jako podłoże produkcyjne stosuje się pożywkę hodowlaną zawierającą 2% glukozy, 0,90% etanolu, a ponadto 50-70% cieczy pohodowlanej po hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie analogicznym jak podłoże dla hodowli inokulum starterowego, 20-50% wody wodociągowej, 10-25% wody wodociągowej z oczyszczania błon celulozowych po myciu wodnym roztworem NaOH i 0,10% karboksymetylocelulozy (CMC). Korzystnie w przeciwprądowym przepływie cieczy myjących stosuje się kolejno wodę wodociągową o temperaturze C przez min, wodny roztwór wodorotlenku sodu o temperaturze C przez min, wodę wodociągową o temperaturze C przez min, wodny roztwór kwasu octowego o temperaturze C przez min, wodę wodociągową o temperaturze C przez min. Korzystnie wytwarza się płatki bionanocelulozy z użyciem substancji biologicznie czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji, wybranych z grupy substancji o działaniu leczniczym, wspomagającym lub pielęgnacyjnym, których zawartość w opatrunku stanowi 0-20% wagowych, a zawartość polimeru bionanocelulozy stanowi 0,5-10% wagowych i zawartość wody stanowi 50-98,5% wagowych. Substancje aktywne biologicznie wybiera się z grupy związków o działaniu przeciwmikrobiologicznym, które stanowią 0-5% wagowych i są to sulfonamidy, cząsteczki srebra, erytromycyna, gentamycyna, chloramfenikol, neomycyna, mupirocyna, tetracykliny, streptomycyna, gancyklowir, acyklowir, klindamycyna, klotrimazol, ketokonazol, nystatyna, ampicylina, amfoterycyna B, suralfat, pochodne nitrofuranu, chinoliny, pochodne imidazolowe i triazolowe, octan cynku, siarczan cynku, tlenek cynku, tlenek tytanu. Związki o działaniu przeciwzapalnym stanowią 0-5% wagowych i są to MNA (sole 1-metylonikotynamidu), allantoina i jej pochodne, kwas salicylowy i jego pochodne, fenazon, aminofenazon, metamizol, sulfinpirazon, pochodne kwasu antranilowego, kwas borny. Substancje pomocnicze wybiera się z grupy związków pozyskiwanych z roślin, owoców, warzyw, ziół, nasion, które stanowią 0-3,5% wagowych i są to ekstrakt z kasztanowca, ekstrakt z limby, ekstrakt z miłorzębu, ekstrakt z pokrzywy, ekstrakt z nagietka, ekstrakt z alg, ekstrakt z imbiru, ekstrakt z korzenia lukrecji, ekstrakt z oczaru wirginijskiego, ekstrakt z zielonego groszku, ekstrakt z bluszczu, ekstrakt z morwy, ekstrakt z rumianku, ekstrakt z dyni, ekstrakt z czerwonego wina, wyciąg z aloesu, wyciąg z ogórka, wyciąg z żeń-szenia, wyciąg z pieprzowca, wyciąg z czarnej herbaty, wyciąg z zielonej herbaty, wyciąg z białej herbaty, wyciąg z otrębów ryżowych, kofeina, β-glukan, arbutyna (β-glikozyd hydrochinonu). Z grupy witamin wybiera się związki, które stanowią 0-3% wagowych i są to kwas retinowy (pochodne witaminy A), witamina C, witamina E, nikotynamid, biotyna. Z grupy lipidów, nukleotydów, enzymów i fragmentów białek wybiera się związki, które stanowią 0-2% wagowych i są to aminokwasy, peptydy, acetylopeptydy, lipopeptydy, kompleksy peptyd-cu, liposomy, kwasy nukleinowe, oligonukleotydy, koenzym Q, hydrolizaty białek pszenicy, ceramidy. Z grupy środków konserwujących wybiera się związki, które stanowią 0-3% wagowych i są to PHMB (biguanid poliheksametylenu), glukonian chlorheksydyny, związki srebra, antybiotyki, kwas borny, heksanodiol, fenoksyetanol, kwas benzoesowy, DHA (kwas dehydrooctowy) Z grupy substancji regulujących nawilżanie wybiera się związki, które stanowią 0-20% wagowych i są to glicerol, DPG (glicerynian dipotasu), wazelina, glikol polietylenowy, glikol kaprylowy, sorbitol, mannitol, kwas linolowy, kwas hialuronowy i jego pochodne, sodowe lub potasowe sole kwasu etylenodiaminotetraoctowego. Z grupy środków chelatujących wybiera się związki, które stanowią 0-3% wagowych i są to EDTA (kwas etylenodiami-

8 8 PL B1 notetraoctowy), kwas cytrynowy, NTA (kwas nikotynowy). Z substancji przeciw-utleniających wybiera się związki, które stanowią 0-0,5% wagowych i są to tokoferol, BHT (butylowany hydroksytoluen), BHA (butylowany hydroksyanizol), kwas askorbinowy. Korzystnie błony bionanocelulozowe po odciśnięciu pakuje się w folię zabezpieczającą i modeluje w urządzeniu tnącym na płatki opatrunku o gładkich jednorodnych brzegach w żądanym kształcie i wymiarze, a po zapakowaniu poddaje sterylizacji radiacyjnej, wiązką przyspieszonych elektronów, dawka kgy lub sterylizacji termicznej w temperaturze 121 C przez 20 minut. Korzystnie błony bionanocelulozowe po odciśnięciu poddaje się suszeniu w urządzeniu z systemem dociskających błony wałków sterylnym powietrzem o temperaturze C i wytwarza pocięty w postaci suszonych płatków opatrunek, który pakuje się szczelnie i ewentualnie sterylizuje radiacyjnie, wiązką przyspieszonych elektronów, dawka kgy. Korzystnie błony bionanocelulozy po odciśnięciu poddaje się napawaniu 1-20% wodnym roztworem glicerolu, suszy strumieniem sterylnego powietrza o temperaturze C i wytwarza pocięty w postaci płatków opatrunek, który po zapakowaniu ewentualnie poddaje się sterylizacji radiacyjnej wiązką przyspieszonych elektronów, dawka kgy. Korzystnie błony bionanocelulozowe po odciśnięciu zamraża się w temperaturze -25 C, następnie poddaje liofilizacji przez godzin i wytwarza pocięty w postaci płatków liofilizowanych opatrunek, który po zapakowaniu poddaje się sterylizacji radiacyjnej wiązką przyspieszonych elektronów, dawka kgy. Korzystnie błony bionanocelulozy po odciśnięciu poddaje się napawaniu 1-20% wodnym roztworem glicerolu, zamraża w temperaturze -25 C, a następnie poddaje liofilizacji przez godz. po czym wytwarza pocięty w postaci płatków opatrunek, który po zapakowaniu ewentualnie poddaje się sterylizacji radiacyjnej wiązką przyspieszonych elektronów, dawka kgy. Korzystnie błony bionanocelulozowe po odciśnięciu zamraża się w temperaturze -25 C następnie poddaje liofilizacji przez godzin po czym napawa w mieszalniku bębnowym w roztworze substancji biologicznie czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji przez min i wytwarza pocięty w postaci płatków opatrunek, który po zapakowaniu ewentualnie poddaje się sterylizacji radiacyjnej, wiązką przyspieszonych elektronów, dawka kgy. Korzystnie błony bionanocelulozy po odciśnięciu poddaje się w temperaturze C napawaniu w mieszalniku bębnowym w roztworze substancji biologicznie czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji przez min, po czym wytwarza pocięty jako płatki opatrunek, szczelnie zapakowany. Korzystnie błony bionanocelulozy po odciśnięciu poddaje się w temperaturze C napawaniu przez naprzemienne pęcznienie i prasowanie w roztworze substancji biologicznie czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji przez min, po czym wytwarza pocięty jako płatki opatrunek, który pakuje się szczelnie. Korzystnie błony bionanocelulozy po odciśnięciu poddaje się w temperaturze C napawaniu poprzez rozpylenie na powierzchni błony roztworu substancji biologicznie czynnych i/lub pomocniczych lub ich kombinacji i pozostawia przez min do całkowitego wchłonięcia, po czym wytwarza pocięty jako płatki opatrunek, który szczelnie się pakuje. Otrzymywanie bionanocelulozy sposobem według wynalazku z użyciem wysoce aktywnego producenta bakterii Gluconacetobacter xylinus E 25 przechowywanego w formie liofilizatu z odtłuszczonego mleka lub glicerolu i wytworzenie z nich inokulum starterowego na pożywce hodowlanej o wskazanym składzie i ph 4,5-5,0 w ściśle kontrolowanej temperaturze C z kilkukrotnym pasażowaniem - jako inicjatora hodowli powierzchniowej i propagacja bakterii w biomieszalnikach w stopniowo zwiększanej objętości wysterylizowanego produkcyjnego podłoża hodowlanego z jego mieszaniem i napowietrzaniem zapewnia na etapie hodowli właściwej, stacjonarnej przeprowadzonej przez 2-11 dni, w temperaturze C w sterylnych bioreaktorach poziomych wytworzenie jednorodnych, o gładkiej powierzchni błon bionanocelulozowych w opłacalnej ekonomicznie skali przemysłowej na poziomie 150 m 2 błony w jednym cyklu produkcyjnym. Bionanoceluloza wytwarzana tym sposobem charakteryzuje się dużą zawartością -celulozy (>90%), wysoką adhezyjnością, higroskopijnością, elastycznością, jednorodnością, wysokim modułem Younga (maksymalnie 75,9 MPa) i te właściwości wskazują, iż może znaleźć szerokie zastosowanie w produkcji materiałów opatrunkowych oraz produktów dermatologiczno-kosmetycznych. Każdy cykl hodowli produkcyjnej prowadzony jest z użyciem jednego podłoża hodowlanego. Podłoża produkcyjne z użyciem cieczy pohodowlanej po zakończeniu hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie P 1 dla hodowli inokulum starterowego i wody wodociągowej po myciu błon wodnym roz-

9 PL B1 9 tworem NaOH stosowane są w cyklach hodowli produkcyjnej naprzemiennie, a wybór rodzaju podłoża P 2, P 3, P 4 (składy podłoży zestawiono w tabeli nr 1) zależy od przeznaczenia wytworzonych na tych podłożach błon. Np. błony celulozowe otrzymane na podłożu P 2 lub P 3 nadają się szczególnie na wytworzenie płatków o wysokich właściwościach adhezyjnych, jako łatwo formowalnych maseczek na twarz czy okalających inne części ciała. Błony celulozowe wytworzone na pożywce P 4 z użyciem CMC wykazują się rozluźnioną strukturą włókien celulozowych, a przez to zwiększoną higroskopijnością i przyleganiem do skóry w dowolnym miejscu ciała. Otrzymywane w tych warunkach błony bionanocelulozowe umożliwiają uzyskanie ultra cienkiej błonki (0,02-0,10 mm), która jako materiał opatrunkowy może znaleźć zastosowanie także w szeroko pojętej okulistyce. W stomatologii mogłyby znaleźć zastosowanie błony zarówno wilgotne o bardzo gęstej sieci włókien otrzymywane według wynalazku, ale także ich liofilizowane formy. Ze względu na swoje unikalne właściwości w tym wytrzymałość i elastyczność mogłyby posłużyć jako dobrze chłonące opatrunki po ekstrakcji lub w przygotowaniu do implantacji w celu uzupełniania ubytków. Zastosowanie hodowlanych podłoży produkcyjnych P 2, P 3, P 4 z użyciem cieczy pohodowlanej odzyskanej po zakończeniu cyklu hodowlanego na podłożu P 1, a także wody po myciu błon roztworem wodorotlenku sodu rozcieńczanej wodą wodociągową w stosunku (1:2, v/v) jest skutecznym zagospodarowaniem odpadów pohodowlanych, poprawiającym opłacalność produkcji, przy jednoczesnym zachowaniu unikalnych właściwości bionanocelulozy, w tym jej gramatury, a powstałe w trakcie biosyntezy metabolity stanowią bogate źródło węgla i azotu organicznego, zastępując stosowany w podłożach kosztowny baktopepton lub aminobak. Obniżenie ph podłoża hodowlanego do wartości 4,5-5,0 eliminuje jego zakażanie, uciążliwe zwłaszcza w hodowli na skalę przemysłową. A przeprowadzenie hodowli w bioreaktorach wypełnionych pożywką produkcyjną w ilości S/V (powierzchni/objętości) = 0,50-0,85 cm -1, korzystnie S/V = 0,67 cm -1 zapewnia właściwą zawartość tlenu na poziomie 5-15% określaną jako korzystną dla produkcji bionanocelulozy w postaci homogenicznego materiału. Czyszczenie błon celulozowych w urządzeniu z przeciwprądowym przepływem cieczy myjących ułatwia penetrację w głąb włókien i dobre odmycie, a oczyszczone błony spełniają wymaganą czystość mikrobiologiczną i chemiczną, o czym świadczą śladowe ilości białka i związków redukujących obecnych w ekstraktach wodnych i suchej masie badanych próbek. Ponadto tak przeprowadzone oczyszczanie umożliwia efektywną lizę komórek bakterii oraz usunięcie powstających endotoksyn. Dodatkowo w procesie oczyszczania odzyskuje się pożywkę pohodowlaną z podłoża pohodowlanego o składzie inokulum starterowego oraz wodę wodociągową z odmycia błon roztworem wodorotlenku sodu. Wydajność biosyntezy błon celulozowych z uwzględnieniem ilości glukozy zawartej w podłożu hodowlanym o czterech składach P 1, P 2, P 3, P 4 według wynalazku jest wysoka, rzędu 22-25%. Płaty celulozowe cechuje zawartość polimeru rzędu 0,5-10% (optymalnie 2%), wysoki stopień czystości i uwodnienie 90-98,5% (optymalnie 95%). A wykazujące śliskość płaty są opakowywane w folie zabezpieczające i w urządzeniu tnącym modelowane na płatki czy maseczki w dowolnym kształcie i wymiarze o gładkich i jednorodnych krawędziach, przeznaczonych na różne części ciała (na twarz, oczy, szyję i inne większe powierzchnie ciała). Wytworzone sposobem według wynalazku żelowe, elastyczne błony celulozowe są szczególnie przydatne w leczeniu rozległych ran oparzeniowych, owrzodzeń żylnych, pocukrzycowych, odleżynowych, w oczyszczaniu pola operacyjnego z martwiczych tkanek przed przeszczepem skóry oraz łagodzeniu uszkodzeń i podrażnień skóry po zabiegach leczniczych oraz dermatologiczno- -kosmetycznych np. po radioterapii, laseroterapii, czy mikrodembrazji. Bionanoceluloza według wynalazku może być matrycą dla różnych substancji o działaniu antymikrobiologicznym, przeciwzapalnym, nawilżającym lub łagodzącym do wytwarzania wyrobów dla celów medycznych oraz kosmetycznych o dowolnym kształcie i kompozycji. Bionanoceluloza otrzymana sposobem według wynalazku umożliwia wytworzenie opatrunków nowej generacji pozwalających na leczenie ran w środowisku wilgotnym, zapewniającym szybszą regenerację nabłonka i ułatwiającym demarkację naskórka. Przeprowadzone testy kliniczne wykazały, iż opatrunek z bionanocelulozy według wynalazku spełnia wszystkie wymogi dla opatrunków w tej klasie i przyśpiesza naturalny proces gojenia ran oparzeniowych i chronicznych o 25-40% w porównaniu ze stosowanymi standardowo procedurami leczenia. Ponadto stanowi ochronę przed infekcjami i urazami, gdyż elastyczna błona bionanocelulozy pozwala na łatwą aplikację i idealne dopasowanie do kształtu ciała. Dodatkowym atutem materiału opatrunkowego jest brak szpecących blizn i zgrubień pooparzeniowych, po jego regularnym stosowaniu w terapii.

10 10 PL B1 Wytwarzane według wynalazku liofilizowane formy opatrunku mogą być stosowane w leczeniu ran wysiękowych, sączących się. Liofilizowana błona wykazuje większą zdolność do odbudowy właściwości absorpcyjnych w porównaniu z materiałem suszonym gorącym powietrzem, a przygotowane z niej opatrunki zarówno w czystej postaci jak i nasączone glicerolem mogą być wykorzystane jako preparaty kosmetyczne, które po zwilżeniu np. wodą termalną lub roztworem substancji aktywnych i/lub pomocniczych miałaby właściwości oczyszczające, odświeżające, łagodzące i wygładzające. T a b e l a 1. Procentowy udział wagowy poszczególnych składników podłoża hodowlanego: Składniki [%] P 1 P 2 P 3 P 4 glukoza 2,00 2,00-2,00 ekstrakt drożdżowy 0, MgSO 4x7H 2O 0, Na 2HPO 4 0, kwas cytrynowy 0, etanol 0,90 0,90 0,90 0,90 ciecz pohodowlana po hodowli na podłożu P woda wodociągowa 96, woda wodociągowa odzyskana po myciu roztworem NaOH CMC ,10 Sposób według wynalazku przedstawiony jest w poniższych przykładach realizacji: P r z y k ł a d 1 Szczep czystej kultury bakterii Gluconacetobacter xylinus E 25 przechowywany w formie liofilizatu z 10% odtłuszczonego mleka uaktywniono przenosząc go do 100 ml jałowego, płynnego podłoża P 1 zawierającego w swoim składzie: 2% glukozy, 0,90% etanolu, 0,10% kwasu cytrynowego, 0,50% ekstraktu drożdżowego, oraz sole mineralne: 0,30% wodorofosforanu disodu, 0,05% siedmiowodnego siarczanu magnezu o ph 4,5-5,0 regulowanym za pomocą 5% kwasu octowego. Po 96 godzinach hodowli dynamicznej z szybkością mieszania 10 obrotów na minutę (rpm), w temperaturze 30 C uwalnia się najaktywniejsze komórki związane z tworzącym się polimerem poprzez intensywne zmieszanie. Tak przygotowaną zawiesiną komórek bakteryjnych tzw. starter w ilości 5% v/v zaszczepiono nową porcję 100 ml wysterylizowanego podłoża P 1 i prowadzono 48 godzinną hodowlę w tych samych warunkach jak poprzednio. Po tym czasie procedurę uwalniania aktywnych komórek bakterii zakotwiczonych w celulozie powtórzono i taką zawiesiną w ilości 5% v/v zaszczepiono nową porcję podłoża. Aktywację komórek powtórzono w 5 cyklach hodowlanych przed rozpoczęciem hodowli produkcyjnej, przesiewając ostatnią porcję na 270 ml podłoża o składzie P 1 i inkubując w opisanych warunkach. Otrzymano 270 ml inokulum starterowego do zaszczepienia podłoża produkcyjnego. P r z y k ł a d 2 Szczep bakterii Gluconacetobacter xylinus E 25 przechowywany w formie liofilizatu z 15% roztworu glicerolu uaktywniono przenosząc go do 100 ml wysterylizowanego, płynnego podłoża P 1 o ph 4,5-5,0. Dalsze etapy prowadzono jak w przykładzie 1, otrzymując 270 ml inokulum starterowego. P r z y k ł a d 3 Przygotowanym według przykładu 1 inokulum starterowym przeprowadzono trójstopniowy cykl preinkubacji podłoża produkcyjnego w warunkach hodowli wgłębnej w trzech sterylnych biomieszalnikach procesowych wypełnionych podłożem produkcyjnym o wzrastającej kolejno objętości. W pierwszym stopniu hodowli wgłębnej zawiesiną aktywowanych bakterii Glueonacetobaeter xylinus E 25 w ilości 270 ml zaszczepiono 5,20 I wysterylizowanego podłoża P 1 o składzie analogicznym jak skład podłoża dla hodowli inokulum - tabela nr 1, umieszczonego w pierwszym biomieszalniku procesowym. Po wprowadzeniu inokulum starterowego całość dokładnie wymieszano z prędkością 150 obrotów na minutę (rpm) i prowadzono hodowlę w temperaturze 30 C przez 48 godzin stosując mieszanie z prędkością 75 obrotów na minutę (rpm). Po tym czasie namnożoną w całej objętości biomasę przesłano do drugiego biomieszalnika procesowego zawierającego 105 I wy sterylizowanej pożywki P 1, gdzie po wymieszaniu prowadzono hodowlę w temperaturze 30 C przez 48 godzin stosując mieszanie z prędko-

11 PL B1 11 ścią 150 obrotów na minutę (rpm), a następnie przesłano do trzeciego biomieszalnika procesowego właściwego zawierającego 2100 I wysterylizowanej pożywki P 1 i po zmieszaniu przeprowadzono trzeci stopień preinkubacji w temperaturze 30 C przez 48 godzin stosując mieszanie z prędkością 250 obrotów na minutę (rpm). W trakcie namnażania biomasy metodą wgłębną stosowano delikatne napowietrzanie 0-2 objętości doprowadzonego powietrza na objętość cieczy hodowlanej w ciągu minuty (vvm - volume per volume per minute, l/l/min), a ph podłoża produkcyjnego utrzymywano na poziomie wartości 4,5-5,0. Po zakończeniu preinkubacji całość biomasy z biomieszalnika porcjami po 2,80 I dozowano w ilości S/V (powierzchni/objętości) = 0,67 cm -1 do poziomych bioreaktorów z systemem ograniczającym parowanie i skraplanie cieczy hodowlanej układanych w stosy w sterylnych, wentylowanych i termostatowanych w temperaturze 30 C boksach fermentacyjnych. Hodowlę właściwą z zastosowaniem metody powierzchniowej prowadzono przez 7 dni. P r z y k ł a d 4 Inokulum starterowym komórek bakterii w ilości 270 ml przygotowanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono 5,20 I podłoża produkcyjnego o składzie P 2 : 2% glukozy, 0,90% etanolu, 61% cieczy pohodowlanej po zakończeniu hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie analogicznym jak podłoże dla hodowli inokulum starterowego - P 1, 24% wody wodociągowej i 12% wody wodociągowej z oczyszczania błon celulozowych po myciu wodnym roztworem NaOH znajdującego się w pierwszym biomieszalniku procesowym. Dalsze etapy trójstopniowego cyklu hodowli wgłębnej oraz właściwej hodowli powierzchniowej na podłożu hodowlanym o składzie P 2 prowadzono jak w przykładzie 3. P r z y k ł a d 5 Inokulum starterowym komórek bakterii w ilości 270 ml przygotowanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono 5,20 I podłoża produkcyjnego o składzie P 3 : 0,90% etanolu, 54% cieczy pohodowlanej po zakończeniu hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie analogicznym jak podłoże dla hodowli inokulum starterowego - P 1, 30% wody wodociągowej, 15% wody wodociągowej z oczyszczania błon celulozowych po myciu wodnym roztworem NaOH znajdującego się w pierwszym biomieszalniku procesowym. Dalsze etapy trójstopniowego cyklu hodowli wgłębnej oraz właściwej hodowli powierzchniowej na podłożu hodowlanym o składzie P 3 prowadzono jak w przykładzie 3. P r z y k ł a d 6 Inokulum starterowym komórek bakterii w ilości 270 ml przygotowanym jak w przykładzie 1 zaszczepiono 5,20 I podłoża produkcyjnego o składzie P 4 : 2% glukozy, 0,90% etanolu, 65% cieczy pohodowlanej po zakończeniu hodowli produkcyjnej na podłożu o składzie analogicznym jak podłoże dla hodowli inokulum starterowego - P 1, 22% wody wodociągowej, 11% wody wodociągowej z oczyszczania błon celulozowych po myciu wodnym roztworem NaOH i 0,10% karboksymetylocelulozy (CMC) znajdującego się w pierwszym biomieszalniku procesowym. Dalsze etapy trójstopniowego cyklu hodowli wgłębnej oraz właściwej hodowli powierzchniowej na podłożu hodowlanym o składzie P 4 prowadzono jak w przykładzie 3. P r z y k ł a d 7 Przygotowanym według przykładu 2 inokulum starterowym przeprowadzono trójstopniowy cykl preinkubacji podłoża produkcyjnego w warunkach hodowli wgłębnej w trzech szeregowo połączonych, sterylnych biomieszalnikach procesowych wypełnionych podłożem produkcyjnym o wzrastającej kolejno objętości. W pierwszym stopniu hodowli wgłębnej zawiesiną aktywowanych bakterii Gluconacetobacter xylinus E 25 w ilości 270 ml zaszczepiono 5,20 I wysterylizowanego podłoża P 1 o składzie analogicznym jak skład podłoża dla hodowli inokulum - tabela nr 1, umieszczonego w pierwszym biomieszalniku procesowym. Po wprowadzeniu inokulum starterowego całość dokładnie wymieszano z prędkością 150 obrotów na minutę (rpm) i prowadzono hodowlę w temperaturze 30 C przez 48 godzin stosując mieszanie z prędkością 75 obrotów na minutę (rpm). Po tym czasie namnożoną w całej objętości biomasę przesłano do drugiego biomieszalnika procesowego zawierającego 105 I jałowej pożywki P 1, gdzie po wymieszaniu prowadzono hodowlę w temperaturze 30 C przez 48 godzin stosując mieszanie z prędkością 150 obrotów na minutę (rpm), a następnie przesłano do trzeciego biomieszalnika procesowego właściwego zawierającego 2100 I wysterylizowanej pożywki P 1 i po zmieszaniu przeprowadzono trzeci stopień preinkubacji w temperaturze 30 C przez 48 godzin stosując mieszanie z prędkością 250 obrotów na minutę (rpm). W trakcie namnażania biomasy metodą wgłębną stosowano delikatne napowietrzanie 0-2 objętości doprowadzonego powietrza na objętość cieczy hodowlanej w ciągu minuty (vvm - volume per volume per minute, l/l/min), a ph podłoża produkcyjnego utrzymywano na poziomie wartości 4,5-5,0. Po zakończeniu preinkubacji całość biomasy z biomieszalnika porcjami po 2,80 l dozowano w ilości S/V (powierzchni/objętości) = 0,67 cm -1 do poziomych bioreakto-

12 12 PL B1 rów układanych w stosy w sterylnych, wentylowanych i termostatowanych w temperaturze 30 C boksach fermentacyjnych. Hodowlę właściwą z zastosowaniem metody powierzchniowej prowadzono przez 7 dni. P r z y k ł a d 8 Wytworzone według przykładu 3 i przykładu 7 błony bionanocelulozowe w postaci płatów polimerowych o grubości mm oczyszczano w urządzeniu myjącym wyposażonym w perforowaną tacę z ociekaczem, z którego w wyniku odsączania odzyskano 70% cieczy pohodowlanej P 1 do ponownego użycia. Następnie odciśnięte, żółtawe maty celulozowe w urządzeniu myjącym poddano działaniu cieczy myjących w przeciwprądowym przepływie kolejno płucząc w wodzie wodociągowej o temperaturze 90 C przez 60 min, 2% roztworze wodorotlenku sodu o temperaturze 90 C przez 60 min, wodzie wodociągowej o temperaturze 20 C przez 120 min, 2% roztworze kwasu octowego o temperaturze 20 C przez 100 min oraz w wodzie wodociągowej o temperaturze 20 C przez 120 min. P r z y k ł a d 9 Wytworzone według przykładów 4-6 błony bionanocelulozowe w postaci płatów polimerowych o grubości mm oczyszczano w urządzeniu myjącym wyposażonym w perforowaną tacę z ociekaczem, z którego po odciśnięciu żółtawe płaty poddano działaniu cieczy myjących w przeciwprądowym przepływie kolejno płucząc w wodzie wodociągowej o temperaturze 90 C przez 60 min, 2% roztworze wodorotlenku sodu o temperaturze 90 C przez 60 min, wodzie wodociągowej o temperaturze 20 C przez 120 min, 2% roztworze kwasu octowego o temperaturze 20 C przez 100 min oraz w wodzie wodociągowej o temperaturze 20 C przez 120 min. P r z y k ł a d 10 Oczyszczone według przykładu 8-9 półprzeźroczyste lub białe płaty błon bionanocelulozy o obojętnym ph 6,5 poddano pęcznieniu w mieszalniku bębnowym w wodzie dejonizowanej o temperaturze 20 C przez 120 min, a następnie usunięto z nich nadmiar wody przy pomocy prasy taśmowej z regulowanym naciskiem wałków pozwalającym na otrzymanie błony grubości 0,1-5 mm. P r z y k ł a d 11 Odciśnięte z nadmiaru wody według przykładu 10 płaty bionanocelulozy otrzymane na pożywce P 1 przesłano do urządzenia, w którym płaty opakowywano w folie zabezpieczające, a następnie z użyciem noża formowano płatki o dowolnym kształcie i rozmiarze, np. prostokątów lub kwadratów, a następnie jako gotowe opatrunki pakowano pojedynczo w szczelne foliowe koperty, kartonowe opakowania zbiorcze i sterylizowano radiacyjne za pomocą wiązki przyspieszonych elektronów (25-35 kgy). Uzyskano następujące parametry opatrunków bionanocelulozowych, wilgotnych: gramatura g/m 2 (optymalnie 3000 g/m 2 ), grubość 0,1-5 mm (optymalnie 4 mm), wytrzymałość na rozciąganie w kierunku wzdłużnym N (optymalnie 180 N), wytrzymałość na rozciąganie w kierunku poprzecznym N (optymalnie 159 N). P r z y k ł a d 12 Odciśnięte z nadmiaru wody według przykładu 10 płaty bionanocelulozy otrzymane na pożywce P 2 lub P 3 lub P 4 przesłano do urządzenia, w którym opakowywano je w folie zabezpieczające, a następnie z użyciem noża formowano płatki o dowolnym kształcie i rozmiarze, jako płatki okalające różne części ciała, szczególnie jako maseczki na twarz, oczy, nos, szyję itp., a następnie jako gotowe opatrunki pakowano pojedynczo w szczelne foliowe koperty, kartonowe opakowania zbiorcze i sterylizowano radiacyjne za pomocą wiązki przyspieszonych elektronów (25-35 kgy). Uzyskano następujące parametry opatrunku bionanocelulozowego przeznaczonego w szczególności jako produkty kosmetyczne: g/m 2 (950 g/m 2 ), grubość 1-3,5 mm (optymalnie 1,5 mm), wytrzymałość na rozciąganie w kierunku wzdłużnym N (122 N), wytrzymałość na rozciąganie w kierunku poprzecznym N (101 N). P r z y k ł a d 13 Odciśnięte z nadmiaru wody według przykładu 10 płaty bionanocelulozy poddano suszeniu w urządzeniu z systemem dociskających błony wałków strumieniem sterylnego powietrza o temperaturze 60 C, następnie cięto i jako opatrunek suszony pakowano w papierowo-foliowe koperty, po czym poddano sterylizacji radiacyjnej za pomocą wiązki przyspieszonych elektronów (20-30 kgy). Uzyskano następujące parametry opatrunków bionanocelulozowych, wysuszonych: gramatura g/m 2 (optymalnie 50 g/m 2 ), grubość 0,02-0,95 mm (optymalnie 0,15 mm).