PL B1. Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych, zwłaszcza do hodowli komórkowych 3D, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) Int.Cl. C12N 5/02 ( ) C12N 5/22 ( ) C12N 5/07 ( ) B29C 67/20 ( ) C08J 9/26 ( ) (54) Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych, zwłaszcza do hodowli komórkowych 3D, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 25/07 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/12 (73) Uprawniony z patentu: POLSKA AKADEMIA NAUK INSTYTUT BIOCYBERNETYKI I INŻYNIERII BIOMEDYCZNEJ, Warszawa, PL (72) Twórca(y) wynalazku: ANDRZEJ CHWOJNOWSKI, Warszawa, PL KONRAD DUDZIŃSKI, Warszawa, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Iwona Brodowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest szerokoporowaty podkład wykonany z polimerów syntetycznych, a przeznaczony do hodowli komórkowych, zwłaszcza do hodowli komórkowych 3D, a zwłaszcza komórek przeznaczonych do wszczepów wraz z podkładem i/lub konstruowania biosztucznych narządów przywracających i/lub zastępujących utracone funkcje, a także sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie. Znanych jest wiele typów podłoży, na których prowadzi się hodowle komórkowe i tkankowe. Jednakże są to wszystko hodowle płaskie" czyli typu 2D. W chwili obecnej coraz powszechniej przyznaje się, że nie jest to naturalna metoda hodowli i powinno się je prowadzić na podłożach przestrzennych, czyli typu 3D. Jest to bardzo wyraźnie akcentowane w hodowli hepatocytów [J. Hepatology 26(1997) , J. Biosc. Bioeng. 99(2005) ]. Jest to szczególnie ważne w przypadku takich hodowli komórkowych jak chondrocyty, gdzie konieczne jest uzyskanie dostatecznej masy komórkowej, aby można było zastąpić zniszczoną tkankę chrzestną, nową wyhodowaną in vitro. Okazało się, że można chondrocyty z powodzeniem namnażać nie tylko na podłożach kolagenowych, ale również na płaskich membranach polisulfonowych [M. Płończak, J. Czubak, J. Kawiak: Transplantation Proceedings (2006). Podczas przygotowania przez Zgłaszającego takich membran, okazało się niespodziewanie, że możliwe jest opracowanie szerokoporowatych podkładów polimerowych do hodowli komórkowych o grubości od ułamka milimetra do kilku milimetrów, w których w całej objętości narastają komórki. Dzięki temu można uzyskać dostateczną masę komórkową do wszczepu. Jednocześnie podkład jest na tyle wytrzymały mechanicznie, że jest w stanie utrzymać komórki w dostateczniej masie nawet pod obciążeniem, jak ma to miejsce w stawach. Dotychczas stosowane podłoża kolagenowe nie spełniały tego warunku. Stosując biozgodne materiały można w ten sposób przygotowywać odpowiednią masą komórkową w formie umożliwiającej jej implantację wraz z podkładem. Nieoczekiwanie, okazało się, że szerokoporowaty podkład i sposób według wynalazku wypełnia istniejącą do tej pory lukę, pozwalając na otrzymywanie podkładu biologicznie obojętnego i pozbawionego wad dotychczas stosowanych podkładów. Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych, według wynalazku charakteryzuje się tym, że stanowi szerokoporowatą membranę typu membran półprzepuszczalnych wykonaną z polimeru lub mieszaniny polimerów syntetycznych, dających się formować metodą inwersji faz, o porach niezapadających się podczas wielokrotnego suszenia, wybranych z grupy obejmującej polieterosulfony, polisulfony, poliamidy lub poliimidy, z dodatkiem poroforów wybranych z grupy obejmującej celulozę naturalną i przetworzoną oraz jej pochodne, oraz ewentualnie niskocząsteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i propylenowe oraz poliwinylopirolidony. Porofory te są usuwane w trakcie otrzymywania membrany, generując pory o wielkości odpowiadającej wielkościom zastosowanego prekursora porów (porofora). Sposób wytwarzania szerokoporowatego podkładu do hodowli komórkowych, według wynalazku polega na tym, że nasyca się w znany sposób podkład celulozowy z celulozy naturalnej, celulozy regenerowanej, korzystnie wiskozy, celulozy mikrokrystalicznej lub podkład wykonany z mieszaniny powyższych wersji celulozy, roztworem polimeru membranotwórczego wybranego z grupy obejmującej polieterosulfony, polisulfony, poliamidy lub poliimidy, w rozpuszczalniku polimeru, korzystnie wybranym z grupy obejmującej DMF (N,N-dimetyloformamid) DMA (N,N-dimetyloacetamid), NMP (N-metylopirolidon) lub ich mieszaninę, ewentualnie z dodatkiem poroforu, następnie membranę formuje się metodą inwersji faz, przez suszenie naniesionej cienkiej warstwy membranotwórczej, lub korzystnie przez wytrącanie nierozpuszczalnikiem, a po wypłukaniu z powstałej membrany poroforu, lub poroforów polimerowych i ewentualnie celulozy za pomocą tetraaminowego związku kompleksowego miedzi, usuwa się osadzone na powierzchni membrany nierozpuszczalne związki i doprowadza odczyn membrany do ph 7. W sposobie według wynalazku, korzystnie z membrany wypłukuje się porofory za pomocą nierozpuszczalnika polimeru, korzystnie wody i/lub alkoholu C 1-7, a celulozę za pomocą tetraaminowego związku kompleksowego miedzi korzystnie w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego. Roztwór polimeru membranotwórczego lub polimerów membranotwórczych, korzystnie zawiera poza polimerem membranotwórczym jeden lub kilka poroforów, wybranych z grupy obejmującej celulozę naturalną i przetworzoną oraz jej pochodne, ewentualnie niskocząsteczkowe alkohole poliwinylo-

3 PL B1 3 we, poliglikole etylenowe i propylenowe oraz poliwinylopirolidony. korzystnie wybrane z grupy obejmującej niskocząsteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i/lub propylenowe, celulozę mikrokrystaliczną oraz poliwinylopirolidony. Jako podłoże wsiąkliwe, korzystnie stosuje się bibułę jakości chromatograficznej, włókninę wiskozową lub włókninę bawełnianą. Dzięki wypłukaniu celulozy w podkładzie powstają makropory. Szerokoporowaty podkład według wynalazku może służyć do hodowli komórek zwierzęcych i/lub ludzkich takich jak np. hepatocyty, chondrocyty, komórki przytarczyc. Mogą to być również komórki genetycznie modyfikowane lub komórki patologicznie zmienione. Podkład szerokoporowaty może służyć również jako podłoże do hodowli mikroorganizmów, w tym GMO i tkanek roślinnych. Hodowle prowadzi się w typowych, używanych powszechnie pożywkach w naczyniach o powierzchni odpowiedniej do zamierzonej wielkości podkładu, w warunkach jałowych. Materiał i sposób według wynalazku przedstawiono w poniższych przykładach wykonania. P r z y k ł a d I. Bibułę chromatograficzną Whatman nr 3 nasyca się roztworem polimerów o składzie: 100 g dimetyloformamid 18 g polisulfonu Udel g poliwinylopirolidon K30 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę woda destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. P r z y k ł a d II. Bibułę chromatograficzną Whatman nr 2 nasyca się roztworem polimerów o składzie: 100 g dimetyloformamid 16 g polisulfonu Udel godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. P r z y k ł a d III. Bibułę chromatograficzną Whatman nr 1 nasyca się roztworem polimerów o składzie: 10 g dimetyloacetamidu 5 g metylopirolidonu 20 g polieterosulfonu Ultrason 2020 P 10 g poliwinylopirolidon K50 10 g celulozy mikrokrystalicznej 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami.

4 4 PL B1 P r z y k ł a d IV. Bibułę chromatograficzną Whatman nr 1 nasyca się roztworem polimerów o składzie: 50 g metylopirolidonu 50 g dimetyloformamidu 18 g polieterosulfon Ultrason 2020 P 23 g glikolu polieytlenowego D i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej całość zanurza się w wodzie demineralizowanej z dodatkiem 0,5% CaCl 2 i 0,5% MgCl 2 na około 2 godziny. Następnie membranę przenosi się do wody demineralizowanej na około 12 godzin. Po tym czasie, płucze się jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i zanurza w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego na 72 godziny, delikatnie mieszając roztwór, co 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. P r z y k ł a d V. Włókninę wiskozową prasowaną nasyca się roztworem polimerów o składzie: 50 g metylopirolidonu 50 g dimetyloformamidu 18 g polisulfon Ultrason 2020 P 15 g glikolu polipropylenowego D 5 g celulozy mikrokrystalicznej i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej całość zanurza się w wodzie demineralizowanej z dodatkiem 0,2% CaCl 2 i 1,1% MgCl 2 na około 2 godziny. Następnie membranę przenosi się do wody demineralizowanej na około 12 godzin. Po tym czasie, płucze się jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i zanurza w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego na 72 godziny, delikatnie mieszając roztwór, co 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. P r z y k ł a d VI. Włókninę wiskozową prasowaną nasyca się roztworem polimerów o składzie: 50 g kwasu mrówkowego 50 g kwasu octowego 18 g poliamidu 6 M g poliwinylopirolidon K30 10 g glikolu polipropylenowego D 5 g alkoholu poliwinylowego 5000 D i natychmiast po naniesieniu mieszaniny membranotwórczej całość zanurza się w wodzie demineralizowanej na około 12 godzin. Po tym czasie, płucze się jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i zanurza w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego na 72 godziny, delikatnie mieszając roztwór, co 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę woda destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. P r z y k ł a d VI. 150 g celulozy mikrokrystalicznej wymieszano dokładnie z roztworem o składzie: 50 g kwasu mrówkowego 50 g kwasu octowego 18 g poliamidu 6 M g poliwinylopirolidon K30

5 PL B1 5 5 g glikolu polipropylenowego D 1 g alkoholu poliwinylowego 5000 D Taką mieszaninę rozprowadza na podkładzie stałym, np. na płytce szklanej formując warstwę o żądanej grubości np. 0,4 mm i natychmiast po uformowaniu tej warstwy całość zanurza się w wodzie. Po upływie 30 minut oddziela się powstałą membranę od podłoża szklanego i płucze się ją w wodzie demineralizowanej na około 12 godzin. Po tym czasie, płucze się jeszcze raz w wodzie demineralizowanej i zanurza w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego na 72 godziny, delikatnie mieszając roztwór, co 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę wodą destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze l100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. P r z y k ł a d VII Sprasowaną warstwę waty bawełnianej nasyca się roztworem polimerów o składzie: 10 g dimetyloacetamidu 10 g metylopirolidonu 20 g polieterosulfonu Ultrason 2020 P 5 g poliwinylopirolidon K60 5 g celulozy mikrokrystalicznej 4 godziny. Po tym czasie płucze się otrzymaną membranę woda destylowaną, aż do zaniku niebieskiego zabarwienia i następnie zanurza na 15 minut w 0,5% roztworze kwasu azotowego V. Po kąpieli kwasowej membranę płucze się wodą demineralizowaną lub destylowaną, aż odciek będzie miał odczyn obojętny. Membrana po wysuszeniu w temperaturze 100 C przez 30 minut jest gotowa do sterylizacji za pomocą dowolnie wybranej typowej metody np. termicznie, parą, chemicznie, tlenkiem etylenu, alkoholami. Zastrzeżenia patentowe 1. Szerokoporowaty podkład do hodowli komórkowych, zwłaszcza do hodowli komórkowych 3D, znamienny tym, że stanowi on szerokoporowatą membranę typu membran półprzepuszczalnych wykonaną z polimeru lub mieszaniny polimerów syntetycznych, wybranych z grupy obejmującej polieterosulfony, polisulfony, poliamidy lub poliimidy, z dodatkiem poroforów wybranych z grupy obejmującej celulozę naturalną i przetworzoną oraz jej pochodne, ewentualnie z dodatkiem poroforów wybranych z grupy obejmującej niskocząsteczkowe alkohole poliwinylowe, poliglikole etylenowe i propylenowe oraz poliwinylopirolidony. 2. Sposób wytwarzania szerokoporowatego podkładu do hodowli komórkowych, zwłaszcza do hodowli komórkowych 3D, znamienny tym, że nasyca się w znany sposób podkład celulozowy z celulozy naturalnej, celulozy regenerowanej, korzystnie wiskozy, celulozy mikrokrystalicznej lub podkład wykonany z mieszaniny powyższych wersji celulozy, roztworem polimeru membranotwórczego wybranego z grupy obejmującej polieterosulfony, polisulfony, poliamidy lub poliimidy w rozpuszczalniku polimeru, korzystnie wybranym z grupy obejmującej DMF (N,N-dimetyloformamid) DMA (N,N-dimetyloacetamid), NMP (N-metylopirolidon) lub ich mieszaniny, ewentualnie z dodatkiem poroforu, następnie membranę formuje się metodą inwersji faz, przez suszenie naniesionej cienkiej warstwy membranotwórczej, lub korzystnie przez wytrącanie nierozpuszczalnikiem, a po wypłukaniu z powstałej membrany poroforu, lub poroforów polimerowych i ewentualnie celulozy za pomocą tetraaminowego związku kompleksowego miedzi, usuwa się osadzone na powierzchni membrany nierozpuszczalne związki i doprowadza odczyn membrany do ph Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako podłoże wsiąkliwe stosuje się bibułę jakości chromatograficznej. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako podłoże wsiąkliwe stosuje się włókninę wiskozową.

6 6 PL B1 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako podłoże wsiąkliwe stosuje się włókninę bawełnianą. 6. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako porofor stosuje się poliwinylopirolidon i/lub glikol polietylenowy i/lub glikol polipropylenowy i/lub niskocząsteczkowy alkohol poliwinylowy lub/i celulozę mikrokrystaliczną, którą wypłukuje się za pomocą tetraaminowego związku kompleksowego miedzi, korzystnie w kąpieli zawierającej nasycony roztwór wodorotlenku tetraaminomiedziowego. 7. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako nierozpuszczalnik stosuje się pojedyncze indywiduum chemiczne, lub mieszaninę kilku substancji, wybranych z grupy obejmującej wodę i alkohole od C 1 do C Zastosowanie szerokoporowatego podkładu według zastrz. 1, do hodowli komórkowych, 3D. Departament Wydawnictw UP RP Cena 2,46 zł (w tym 23% VAT)