(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 1646 (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (1) T3 Int.Cl. C07K /00 (06.01) A61K 38/00 (06.01) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 14/09 EP 1646 B1 (4) Tytuł wynalazku: Peptydy antygenu związanego z nowotworem HLA-A2 i kompozycje () Pierwszeństwo: US P (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 06/0 (4) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 14/06 (73) Uprawniony z patentu: Biotech Synergy, Inc., La Jolla, US (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP 1646 T3 JOHN D. FIKES, San Diego, US GLENN ISHIOKA, San Diego, US ALESSANDRO SETTE, La Jolla, US ROBERT W. CHESNUT, Cardiff-by-the-Sea, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-4837/VAL EP B1 Opis TŁO WYNALAZKU Dziedzina Wynalazku [0001] Wynalazek dotyczy dziedziny biologii. W szczególnych aspektach, wynalazek dotyczy peptydów, polinukleotydów i kompozycji użytecznych do monitorowania lub wywoływania odpowiedzi immunologicznej względem wybranych antygenów związanych z nowotworem. Powiązana dziedzina [0002] Domeną immunoterapii jest uzyskiwanie nowych podejść dla leczenia nowotworu, w tym opracowywanie ulepszonych szczepionek przeciwnowotworowych (Krul, K.G., Decision Resources,.1-.2 (1998)). Chociaż szczepionki zapewniają mechanizm ukierunkowania odpowiedzi immunologicznych na komórki nowotworowe, istnieją liczne mechanizmy, przez które komórki nowotworowe obchodzą procesy immunologiczne (Pardoll, D. M., Nature Medicine (Vaccine Supplement), 4:2-31 (1998)). Ostatni postęp wskazuje, że skuteczność szczepionek peptydowych można zwiększać, gdy połączy się je z podejściami, które wzmacniają stymulację odpowiedzi immunologicznych, takimi jak zastosowanie interleukiny-2 lub autologicznych komórek dendrytycznych (DC) (Abbas i in., red., Cellular and Molecular Immunology, 3. wydanie, W. B. Saunders Company, pub. (1997)). [0003] W badaniu I fazy, Murphy, i in., wykazali, że peptydy wiążące ludzki antygen leukocytarny (HLA)-A2 odpowiadające sekwencjom obecnym w swoistym antygenie gruczołu krokowego (PSA) stymulowały swoiste odpowiedzi limfocytów cytotoksycznych limfocytów T (CTL) u pacjentów z rakiem gruczołu krokowego (Murphy i in., The Prostate 29: (1996)). Rosenberg, i in., ocenili bezpieczeństwo i mechanizm działania syntetycznego peptydu HLA-A2 pochodzącego z antygenu związanego z czerniakiem, gp0, jako szczepionki przeciwnowotworowej do leczenia pacjentów z przerzutowym czerniakiem (Rosenberg i in., Nature Med., 4: (1998)). W oparciu o testy immunologiczne, 91% pacjentów skutecznie immunizowano syntetycznym peptydem. Dodatkowo, 42% (13/31) pacjentów, którzy otrzymali szczepionkę peptydową w połączeniu z leczeniem IL- 2, wykazało obiektywne odpowiedzi nowotworu. Dodatkowo, Nestle, i in. opisali szczepienie 16 pacjentów z czerniakiem z użyciem DC pobudzonych peptydem lub lizatem guza (Nestle i in., Nature Med 4: (1998)). Odpowiedzi immunologiczne indukowane DC pobudzonymi peptydem u 11/12 pacjentów immunizowanych szczepionką obejmowały 1-2 peptydy. Obiektywne odpowiedzi były widoczne u /16 (3 pobudzonych peptydem, 2 pobudzonych lizatem guza) pacjentów ocenianych w tym badaniu. Te badania bezpieczeństwa I fazy dostarczyły dowód, że peptydy wiążące HLA-A2 znanych antygenów związanych z nowotworem wykazują oczekiwany mechanizm działania. Szczepionki te są zazwyczaj bezpieczne i dobrze tolerowane. Ujawniono cząsteczki szczepionki związane z co najmniej czterema antygenami nowotworowymi, CEA, HER2/neu, MAGE2 i MAGE3. (Kawashima i in., Human Immunology, 9:1-14 (1998)) [0004] Badania przedkliniczne wykazały, że DC pobudzone szczepionką pośredniczą w działaniach przeciwnowotworowych przez stymulację swoistych dla antygenu CTL (Mandelboim i in., Nature Med., 1: (199); Celluzzi i in., J Exp Med 183: (1996); Zitvogel i in., J Exp Med 183:87-97 (1996); Mayordomo i in., Nature Med 1: (199)). CTL bezpośrednio lizują komórki nowotworowe, a także wydzielają szereg cytokin, takich jak interferon gamma (IFNγ), czynnik martwicy nowotworu (TNF) i czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (GM-CSF), które dalej wzmacniają reaktywność immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym. CTL rozpoznają antygeny związane z nowotworem (TAA) w postaci kompleksu złożonego z 8-

3 aminokwasowych epitopów peptydowych, związanego z cząsteczkami głównego kompleksu zgodności tkankowej (Schwartz, B. D., The human major histocompatibility Complex HLA in basic & clinical immunology Stites i in., red., Lange Medical Publication: Los Altos, str. 2-64, wyd. 4). Epitopy peptydowe powstają przez wewnątrzkomórkową obróbkę białek. Peptydy poddane obróbce wiążą nowo zsyntetyzowane cząsteczki MHC i kompleksy epitop-mhc są eksprymowane na powierzchni komórki. Te kompleksy epitop- MHC są rozpoznawane przez receptor limfocytów T na CTL. To zdarzenie rozpoznawania jest wymagane do aktywacji CTL, jak również indukcji funkcji efektorowych, takich jak liza docelowej komórki nowotworowej. [000] Cząsteczki MHC są wysoce polimorficznymi białkami, które regulują odpowiedzi limfocytów T (Schwartz, B. D., The human major histocompatibility Complex HLA in basic & clinical immunology Stites i in., red., Lange Medical Publication: Los Altos, str. 2-64, wyd. 4). Homologi MHC swoiste dla gatunku, które prezentują epitopy CTL u ludzi nazywa się ludzkim antygenem leukocytarnym ( HLA ). Cząsteczki HLA klasy I można podzielić na kilka rodzin lub nadtypów w oparciu o ich zdolność do wiązania podobnych repertuarów peptydów. Szczepionki, które wiążą się z wieloma nadtypami HLA, takimi jak na przykład A2, A3 i B7 zapewniają szerokie, nieobciążone etnicznie pokrycie populacji. Jak widać w Tabeli 1, pokrycie populacji wynosi w przybliżeniu 84-90% dla różnych grup etnicznych, ze średnim pokryciem przykładowych grup etnicznych wynoszącym w przybliżeniu 87%. [0006] Jednym z głównych czynników przyczyniających się do dynamicznego wzajemnego oddziaływania między gospodarzem i chorobą jest odpowiedź immunologiczna wytwarzana przeciwko patogenowi, zakażonej komórce lub komórce złośliwej. W wielu warunkach, takie odpowiedzi immunologiczne zwalczają chorobę. Kilka układów modeli zwierzęcych i perspektywicznych badań naturalnego zakażenia u ludzi sugeruje, że odpowiedzi immunologiczne przeciwko patogenowi mogą zwalczać patogen, zapobiegać rozwojowi do ciężkiej choroby i/lub usuwać patogen. Powszechnym tematem jest wymaganie wieloswoistej odpowiedzi limfocytów T i to, że węziej skupione odpowiedzi wydają się być mniej skuteczne. [0007] W przypadku nowotworu istnieje kilka odkryć, które wskazują, że odpowiedzi immunologiczne mogą wpływać na wzrost nowotworowy: [0008] Po pierwsze, wykazanie w wielu różnych modelach zwierzęcych, że limfocyty T przeciwnowotworowe, w restrykcji MHC klasy I, mogą zapobiegać lub leczyć nowotwory. [0009] Po drugie, uzyskano zachęcające wyniki z prób immunoterapii. [00] Po trzecie, obserwacje dokonane w przebiegu naturalnej choroby skorelowały typ i skład nacieku limfocytów T w guzach z pozytywnymi rezultatami klinicznymi (Coulie P G, i in. Antitumor immunity at work in a melanoma patient W: Advances in Cancer Research, , 1999). [0011] Ponadto, nowotwory mają powszechnie zdolność do mutacji, zmieniając w ten sposób ich rozpoznawanie immunologiczne. Przykładowo, obecność mono-swoistych CTL również korelowała z opanowaniem wzrostu guza, do czasu gdy nie pojawiła się utrata antygenu (Riker A, i in., Immune selection after antigen-specific immunotherapy of melanoma Surgery, sierpień: 126(2):112-, 1999; Marchand M, i in., Tumor regressions were observed in patients with metastatic melanoma treated with an antigenic peptide derived from the MAGE-3 gene and presented by HLA-A1 Int. J. Cancer 80(2):219-, styczeń. 18, 1999). Podobnie, utratę beta 2 mikroglobuliny wykryto w /13 założonych linii od pacjentów z czerniakiem po otrzymaniu immunoterapii w National Cancer Institute (Restifo NP, i in., Loss of functional Beta2 - microglobulin in metastatic melanomas from five patients receiving immunotherapy Journal of the National Cancer Institute, tom 88 (2), 0-8, styczeń 1996). Dawno rozpoznano, że HLA klasy I jest często zmieniony w różnych typach nowotworów. To zasłużenie doprowadziło do hipotezy, że to zjawisko może odzwierciedlać presję immunologiczną wywieraną na nowotwór przez CTL w restrykcji kla-

4 sy I. Zasięg i stopień zmian w ekspresji HLA klasy I wydaje się odzwierciedlać przeszłe presje immunologiczne i może mieć również wartość prognostyczną (van Duinen SG, i in., Level of HLA antigens in locoregional metastases and clinical course of the disease in patients with melanoma Cancer Research 48, 19-2, luty 1988; Möller P, i in., Influence of major histocompatibility complex class I and II antigens on survival in colorectal carcinoma Cancer Research 1, , styczeń 1991). Łącznie, obserwacje te zapewniają racjonalne uzasadnienie dla immunoterapii nowotworu i chorób zakaźnych i sugerują skuteczne strategie, które są konieczne do przeciwdziałania złożonym seriom zmian patologicznych związanych z chorobą. [0012] Częstość zamian w ekspresji klasy I jest przedmiotem licznych badań (Algarra I, i in., The HLA crossroad in tumor immunology Human Immunology 61, 6-73, 00). Rees i Mian szacują, że utrata alleliczna występuje ogólnie w 3-% nowotworów i delecja alleliczna występuje w 1-0% nowotworów. Należy zauważyć, że każda komórka niesie dwa oddzielne zestawy genów klasy I, przy czym każdy gen niesie jedno locus HLA-A i jedno HLA-B. Zatem, całkowicie heterozygotyczne osobniki niosą dwie różne cząsteczki HLA- A i dwie różne cząsteczki HLA-B. Odpowiednio, rzeczywista częstość utraty dla jakiegokolwiek swoistego allelu może być tak mała, jak jedna czwarta ogólnej częstości. Zauważają również, że zazwyczaj gradient ekspresji istnieje między komórkami normalnymi, pierwotnymi nowotworami i nowotworami przerzutowymi. W badaniu Natali i współpracowników (Natali PG, i in., Selective changes in expression of HLA class I polymorphic determinants in human solid tumors PNAS USA 86: , wrzesień 1989), guzy lite badano pod względem całkowitej ekspresji HLA, stosując przeciwciało W6/32, i pod względem ekspresji antygenu A2 swoistej dla allelu, jak oceniono przez użycie przeciwciała BB7.2. Próbki nowotworu pochodziły z guzów pierwotnych lub przerzutowych, dla 13 różnych typów nowotworów, i oceniono jako negatywne poniżej %, zmniejszone dla zakresu -80% i normalne powyżej 80%. Wszystkie nowotwory, zarówno pierwotne, jak i przerzutowe, były HLA-pozytywne przy stosowaniu W6/32. W odniesieniu do ekspresji A2, zmniejszenie zanotowano w 16,1% przypadków i A2 oceniono, jako niewykrywalne w 39,4% przypadków. Garrido i współpracownicy (Garrido F, i in., Natural history of HLA expression during tumour development Immunol Today 14():491-99, 1993) podkreślili, że zmiany HLA wydają się występować w konkretnym etapie postępu od łagodnego do najbardziej agresywnego. Jiminez i in. (Jiminez P, i in., Microsatellite instability analysis in tumors with different mechanisms for total loss of HLA expression. Cancer Immunol Immunother 48:684-90, 00) zanalizował 118 różnych nowotworów (68 jelita grubego, 34 krtani i 16 czerniaków). Częstości zanotowane dla całkowitej utraty ekspresji HLA wynosiły 11% dla jelita grubego, 18% dla czerniaka i 13% dla krtani. Zatem, ekspresja HLA klasy I zmienia się w dużej frakcji typów nowotworów, prawdopodobnie jako odzwierciedlenie presji immunologicznej lub po prostu odzwierciedlenie akumulacji zmian patologicznych i zmian w chorych komórkach. [0013] Większość nowotworów eksprymuje HLA klasy I z ogólną tendencją dla stwierdzania cięższych zmian w późniejszym stadium i mniej zróżnicowanych nowotworach. Ten wzór jest zachęcający w kontekście immunoterapii, szczególnie biorąc pod uwagę, że: 1) względnie niska wrażliwość technik immunochistochemicznych może zbyt nisko oszacować ekspresję HLA w nowotworach; 2) ekspresja klasy I może ulegać indukcji w komórkach nowotworowych w wyniku lokalnego zapalenia i uwalniania limfokin; i 3) komórki negatywne pod względem klasy I są wrażliwe na lizę przez komórki NK. [0014] W WO01/41741 ujawniono peptydy antygenowe HLA klasy I A2 związane z nowotworem pochodzące z CEA, HER2/new, MAGE2, MAGE32 lub p3, a wśród nich niniejsze peptydy SEQ. ID. No: 2-7 i peptyd PADRE. Ujawniono tam również peptydy typu dzikiego odpowiadające niniejszym peptydom heteroklitycznym SEQ. ID. No: 8-. W przykładzie 18 i 19 ujawniono szczepionki obejmujące kilka z tych peptydów. [001] Obecnie istnieje wiele niespełnionych potrzeb w obszarze leczenia nowotworów.

5 Dowodem na to są działania uboczne związane z istniejącymi terapiami stosowanymi do leczenia nowotworów i fakt, że mniej niż 0% pacjentów zostaje wyleczonych obecnymi terapiami. Zatem istnieje szansa dla produktu o zdolności do zwiększania stopnia odpowiedzi, czasu trwania odpowiedzi, ogólnego przeżycia, przeżycia wolnego od choroby i/lub jakości życia. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0016] Zakres niniejszego wynalazku jest określony przez zastrzeżenia i jakiekolwiek informacje, która nie wchodzą w zakres zastrzeżeń dostarcza się jedynie do wiadomości. [0017] W pewnej postaci, wynalazek dotyczy kompozycji obejmującej dziewięć peptydowych epitopów i/lub analogów. Peptydy i/lub analogi w tej postaci mogą obejmować ponadto dodatkowe reszty aminokwasowe obejmujące, lecz nie wyłącznie, inne epitopy CTL, epitopy HTL, uniwersalne epitopy HTL, łączniki, grupy rozdzielające, nośniki itd. [0018] W kolejnych postaciach, wynalazek dotyczy kompozycji obejmującej powyższe peptydy i jeden lub większą liczbę dodatkowych składników. Dodatkowe składniki obejmują rozcieńczalniki, zaróbki, epitopy CTL, epitopy HTL, nośniki, liposomy, łańcuchy ciężkie HLA, β2-mikroglobulinę, streptawidynę, komórki prezentujące antygen, adiuwanty itd. W kolejnych postaciach, ujawnienie dotyczy sposobów profilaktycznych, terapeutycznych, diagnostycznych i prognostycznych z użyciem peptydów i kompozycji według wynalazku. KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW/FIGUR [0019] Figura 1 przedstawia, że DC śledziony z myszy traktowanych ProGP indukują odpowiedzi CTL in vivo. Na Figurze 1, DC śledzony z myszy transgenicznych HLA-A2.1 traktowanych ProGP (33 µg/mysz, QD, SC przez 7 dni) pobudzono in vitro peptydem HBV Pol 4 ( 6 komórek na ml peptydu w µg/ml) w pożywce Opti-MEM I (Gibco Life Sciences) zawierającej 3 µg/ml β2-mikroglobuliny (Scripps Laboratories). Po pobudzeniu peptydem przez 3 h w temperaturze pokojowej, DC przemyto dwukrotnie i 6 komórek wstrzyknięto IV grupom po trzy myszy transgeniczne. DC namnożone w obecności GM-CSF/IL-4, pobudzone epitopem i fałszywie pobudzone DC pochodzące z ProGP również badano dla porównania. Siedem dni po otrzymaniu pierwotnej immunizacji DC, zwierzętom podano dawkę przypominającą z użyciem tych samych populacji DC. Czternastego dnia po pierwotnej immunizacji, komórki śledziony z immunizowanych zwierząt ponownie stymulowano dwukrotnie in vitro w obecności peptydu Pol 4. Aktywność CTL po ponownych stymulacjach mierzono stosując standardowy test uwalniania 1 Cr, w którym lizę docelowych komórek Jurkat transfekowanych HLA-A2.1 znakowanym 1 Cr mierzono w obecności (symbole kółek) lub bez peptydu (symbole kwadratów). Punkty danych przedstawione w panelach A-C reprezentują złożony wykres aktywności litycznej z zestawu trzech powtórzeń hodowli. Panel A, DC śledziony ze zwierząt traktowanych ProGP (SD-9427) pobudzonych peptydem HBV Pol 4. Panel B, DC namnożone w obecności GM-CSF/IL- 4, pobudzone peptydem HBV Pol 4. Panel C, fałszywie pobudzone DC ze zwierząt traktowanych ProGP. Badania przeprowadzono w Epimmune Inc., San Diego, CA. Figura 2 przedstawia schemat pobudzania komórki dendrytycznej i procedurę badawczą. Figura 3A przedstawia schemat technologiczny otrzymywania produktu leczniczego. Figura 3B przestawia wielo-epitopową indukcję CTL u myszy transgenicznych HLA- A2.1/K b immunizowanych szczepionką EP-21. Myszy immunizowano 0 µg EP- 21 (dawka emulsji mg/ml) lub jednocześnie immunizowano 0 µg każdego epitopu CTL pojedynczo z równą dawką epitopu PADRE w adiuwancie Montanide ISA 1 (ostatnie odpowiedzi oznaczono jako pojedynczo ). Jedenaście do 14 dni później, splenocyty od szczepionych pierwotnie zwierząt stymulowano każdym peptydem CTL in vitro i sześć dni później zmierzono aktywność CTL z hodowli w trzech powtórzeniach w teście IFN-γ ELISA in situ. Jako kontrolę, splenocyty z myszy naiw-

6 nych lub myszy, którym wstrzyknięto emulsję Montanide ISA 1 sporządzoną bez peptydu, również stymulowano peptydem in vitro i aktywność CTL zmierzono w identycznych warunkach (odpowiedzi oznaczono jako kontrola naiwna ). Dane przedstawione dla każdego epitopu są średnią geometryczną odpowiedzi CTL z 6- niezależnych doświadczeń. Odpowiedzi CTL wyraża się w jednostkach sekrecyjnych (SU), przy czym 1 SU zdefiniowano jako uwalnianie 0 pg/studzienkę IFN-γ przez 6 komórek efektorowych. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [00] Ujawnienie to dostarcza peptydy, które można stosować do monitorowania odpowiedzi immunologicznej na antygen związany z nowotworem lub do utworzenia szczepionki przeciwnowotworowej, która stymuluje komórkowe ramię układu immunologicznego, szczególnie, gdy łączy się jeden lub większą liczbę peptydów. W szczególnych postaciach, kompozycje pośredniczą w odpowiedziach immunologicznych przeciwko nowotworom u osobników, którzy niosą co najmniej jeden allel HLA-A2 i/lub nadtypu HLA- A2. Takie kompozycje zazwyczaj nazywa się kompozycjami A2 (lub ich połączeniami). [0021] Kompozycja A2 może, na przykład, działać jako szczepionka do stymulowania układu immunologicznego do rozpoznawania i niszczenia komórek nowotworowych, prowadząc do podniesionej jakości życia i/lub wskaźników przeżycia wolnego od choroby lub ogólnego dla pacjentów leczonych ze względu na nowotwór. W korzystnej postaci, kompozycję według wynalazku, taką jak szczepionka będzie się podawać osobnikom pozytywnym pod względem HLA-A2 lub nadtypu HLA-A2, którzy mają nowotwór, który eksprymuje co najmniej jeden z TAA, z których wybrano epitopy lub analogi (np. CEA, p3, HER2/neu, MAGE2/3), przy czym przykładami takich nowotworów są raki sutka, okrężnicy, płuca, jajników i żołądka, a w przypadku MAGE 2/3, niektóre czerniaki. W ten sposób, kompozycja A2, np. szczepionka, poprawia standard opieki nad pacjentami leczonymi ze względu na raki sutka, okrężnicy, płuca, jajników lub żołądka albo czerniaka. [0022] Kompozycje A2, np. szczepionki, zgodnie z ujawnieniem zawierają peptydy niosące motywy A2 lub nadmotywy A2 (epitopy A2 i/lub analogi A2), jak tu opisano. Takie kompozycje mogą również obejmować epitop PADRE. [0023] Peptydy i kompozycje według niniejszego wynalazku są użyteczne do stymulowania odpowiedzi immunologicznej na TAA przez stymulowanie wytwarzania odpowiedzi CTL i ewentualnie HTL, np. profilaktykę terapeutyczną, i stosuje się je również do monitorowania odpowiedzi immunologicznej, np. diagnozy i prognozy. Peptydy, które zawierają epitopy A2 pochodzące bezpośrednio lub pośrednio (tj. przez tworzenie analogów) z sekwencji aminokwasowych natywnego białka TAA, są zdolne do wiązania do cząsteczek HLA i stymulują odpowiedź immunologiczną na TAA. Pełną sekwencję analizowanych białek TAA opisanych tu jako SEQ ID NO:11-1 można uzyskać z GenBanku. Patrz Tabela 11. [0024] Epitopy zgodnie z ujawnieniem zidentyfikowano licznymi sposobami, jak zostanie omówione poniżej. Bardziej szczegółowo omówiono aspekt ujawnienia, w którym uzyskano analogi, przy czym aktywność wiązania dla cząsteczek HLA lub cząsteczek receptora limfocytów T modulowano przez modyfikowanie swoistych reszt aminokwasowych, aby utworzyć analogi, które wykazują zmienioną (np. ulepszoną) immunogenność. Definicje [002] Wynalazek można lepiej zrozumieć w odniesieniu do następujących definicji: W tym ujawnieniu, wyniki danych wiązania często wyraża się pod względem IC0. IC0 oznacza stężenie peptydu w teście wiązania, przy którym obserwuje się 0% hamowania wiązania peptydu odniesienia. Biorąc pod uwagę warunki w których prowadzi się testy (tj. ograniczenie stężeń białek HLA i znakowanego peptydu), wartości są w przybliżeniu jak wartości KD. Testy do określania wiązania opisano szczegółowo, np. w publikacjach PCT WO 94/127 i WO 94/03 i innych publikacjach, takich jak Sidney i in., Current Protocols in Immunology (1998); Sidney, i in., J. Immunol. 14:247 (199); oraz Sette, i in., Mol. Immunol. 31:813 (1994). Należy

7 zauważyć, że wartości IC0 mogą się zmieniać, często dramatycznie, jeśli zmienia się warunki testu i w zależności od stosowanych poszczególnych odczynników (np. preparatu HLA, itd.). Przykładowo, nadmiarowe stężenia cząsteczek HLA zwiększą pozorne zmierzone IC0 danego liganda. [0026] Alternatywnie, wiązanie wyraża się względem peptydu odniesienia. Chociaż, gdy konkretny test staje się mniej lub bardziej wrażliwy, IC0 badanych peptydów mogą zmieniać się w pewnym stopniu, to wiązanie względem peptydu odniesienia nie zmienia się znacząco. Przykładowo, w teście przeprowadzonym w warunkach takich, że IC0 peptydu odniesienia zwiększa się -krotnie, wartości IC0 badanych peptydów również przesuną się w przybliżeniu -krotnie. Zatem, aby uniknąć niejednoznaczności, ocena czy peptyd wiąże się dobrze (np. wysoko), średnio, słabo lub wcale zazwyczaj opiera się o jego IC0 względem IC0 wzorcowego peptydu. Tabele załączone w tym zgłoszeniu prezentują dane w korzystnej, istotnej biologicznie postaci IC0 nm. [0027] Wiązanie można określić również stosując inne układy testowe, obejmujące te, w których stosuje się: żywe komórki (np. Ceppellini i in., Nature 339:392 (1989); Christnick i in., Nature 32:67 (1991); Busch i in., Int. Immunol 2:443 (1990); Hill i in., J. Immunol. 147:189 (1991); del Guercio i in., J. Immunol. 14:68(199)), układy wolne od komórki z użyciem lizatów detergentowych (np. Cerundolo i in., J. Immunol. 21:69 (1991)), unieruchomione oczyszczone MHC (np. Hill i in., J. Immunol. 12, 2890 (1994); Marshall i in., J. Immunol. 12:4946 (1994)), układy ELISA (np. Reay i in., EMBO J. 11:2829 (1992)), powierzchniowy rezonans plazmonowy (np. Khilko i in., J. Biol. Chem. 268:142 (1993)); testy wysokiego przepływu fazy rozpuszczonej (Hammer i in., J. Exp. Med. 180:233 (1994)) i pomiar stabilizacji lub składania MHC klasy I (np. Ljunggren i in., Nature 346:476 (1990); Schumacher; i in., Cell 62:63 (1990); Townsend i in., Cell 62:28 (1990); Parker i in., J. Immunol. 149:1896 (1992)). [0028] W stosowanym tutaj znaczeniu, wysokie powinowactwo w odniesieniu do cząsteczek HLA klasy I, określa się jako wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą 0 nm lub mniej, średnie powinowactwo jest wiązaniem z wartością IC0 lub KD wynoszącą między 0 i 00 nm, słabe powinowactwo jest wiązaniem z wartością IC0 lub KD wynoszącą między około 00 i około 000 nm. Wysokie powinowactwo w odniesieniu do wiązania do cząsteczek HLA klasy II określa się jako wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą 0 nm lub mniej; pośrednie powinowactwo oznacza wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą między około 0 i około 00 nm. [0029] Wiązanie reaktywne krzyżowo wskazuje, że peptyd wiąże więcej niż jedną cząsteczkę HLA; synonimem jest wiązanie zdegenerowane. [00] Określenie pochodzący, gdy stosuje się je do omawiania epitopu, jest synonimem dla otrzymany. Pochodzący epitop można wyizolować z naturalnego źródła lub można zsyntetyzować według standardowych protokołów z dziedziny. Syntetyczne epitopy mogą zawierać sztuczne reszty aminokwasowe mimetyki aminokwasów, takie jak izomery D naturalnie występujących reszt aminokwasowych L lub nienaturalne reszty aminokwasowe, takie jak cykloheksyloalanina. Pochodzący lub otrzymany epitop może być analogiem natywnego epitopu. Rozcieńczalnik obejmuje jałowe ciecze, takie jak woda i oleje, w tym te pochodzące z ropy naftowej, pochodzenia zwierzęcego, roślinnego lub syntetycznego, takie jak olej arachidowy, olej sojowy, olej mineralny, olej sezamowy i tym podobne. Woda jest korzystnym rozcieńczalnikiem dla kompozycji farmaceutycznych. Roztwory soli i wodne roztwory dekstrozy i glicerolu można również zastosować jako rozcieńczalniki, szczególnie do roztworów do wstrzykiwania. [0031] Epitop dominujący jest epitopem, który indukuje odpowiedź immunologiczną po immunizacji całkowicie natywnym antygenem (patrz np. Sercarz, i in., Annu. Rev. Immunol. 11: , 1993). Taka odpowiedź jest reaktywna krzyżowo in vitro z izolowanym epitopem peptydowym. [0032] Epitop oznacza zbiorowe cechy cząsteczki, takie jak pierwszorzędowa, drugorzę-

8 dowa i trzeciorzędowa struktura peptydu i ładunek, które razem tworzą miejsce rozpoznawane przez immunoglobulinę, receptor limfocytów T lub cząsteczkę HLA. Alternatywnie, epitop można zdefiniować, jako zestaw reszt aminokwasowych, który jest zaangażowany w rozpoznawanie konkretnej immunoglobuliny lub, w kontekście limfocytów T, te reszty, które są konieczne do rozpoznania przez białka receptora limfocytów T i/lub receptory głównego układu zgodności tkankowej (MHC). Epitopy są obecne w naturze i mogą być izolowane, oczyszczane, otrzymywane lub uzyskiwane w inny sposób przez ludzi. Przykładowo, epitopy można otrzymywać przez izolowanie z naturalnego źródła lub można syntezować według standardowych protokołów z dziedziny. Syntetyczne epitopy mogą obejmować sztuczne reszty aminokwasowe, mimetyki aminokwasów, takie jak izomery D naturalnie występujących reszt aminokwasowych L lub niewystępujące naturalnie reszty aminokwasowe, takie jak cykloheksyloalanina. W tym ujawnieniu, epitopy można nazywać w niektórych przypadkach peptydami lub epitopami peptydowymi. Epitopy i analogi według wynalazku przedstawiono w Tabeli 1. [0033] W pewnych aspektach, peptyd obejmuje fragment antygenu. Fragment antygenu lub fragment antygenowy lub po prostu fragment jest częścią antygenu, która ma 0 % identyczność z antygenem typu dzikiego lub jest występującym naturalnie wariantem. W korzystnych aspektach, peptyd ma długość 9, lub 11 reszt aminokwasowych. [0034] Ludzki antygen leukocytarny lub HLA jest białkiem ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I lub klasy II (patrz np. Stites, i in., IMMUNO- LOGY, wyd. 8, Lange Publishing, Los Altos, CA (1994). [003] Nadtyp HLA lub rodzina HLA, w stosowanym tutaj znaczeniu, opisuje zestawy cząsteczek HLA pogrupowanych w oparciu o wspólne swoistości wiązania peptydu. Cząsteczki HLA klasy I, które dzielą do pewnego stopnia podobne powinowactwo wiązania dla peptydów niosących pewne motywy aminokwasowe, pogrupowano do takich nadtypów HLA. Określenia nadrodzina HLA, rodzina nadtypu HLA, rodzina HLA i cząsteczki HLA xx-podobne (gdzie xx oznacza poszczególny typ HLA) są synonimami. Patrz np. motyw HLA-A2 i nadmotywy podano szczegółowo w Tabelach 4A, 4B, 4C i 4D. [0036] W stosowanym tutaj znaczeniu, wysokie powinowactwo w odniesieniu do cząsteczek HLA klasy I, definiuje się jako wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą 0 nm lub mniej, średnie powinowactwo oznacza wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą między około 0 i około 00 nm, słabe powinowactwo oznacza wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą między około 00 i około 000 nm. Wysokie powinowactwo w odniesieniu do wiązania do cząsteczek HLA klasy II definiuje się jako wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą 0 nm lub mniej; pośrednie powinowactwo oznacza wiązanie z wartością IC0 lub KD wynoszącą między około 0 i około 00 nm. Patrz dane dotyczące wiązania. [0037] IC0 oznacza stężenie peptydu w teście wiązania, przy jakim obserwuje się 0% hamowanie wiązania peptydu odniesienia. Biorąc pod uwagę warunki, w których przebiegają testy (tj. ograniczenie stężeń białek HLA i znakowanego peptydu), wartości te są w przybliżeniu wartościami KD. Patrz dane dotyczące wiązania. [0038] Określenia identyczny lub procent identyczności, w kontekście dwóch lub większej liczby sekwencji peptydowych lub fragmentów antygenu, dotyczy dwóch lub większej liczby sekwencji lub podsekwencji, które są takie same lub mają swoisty procent reszt aminokwasowych, które są takie same, gdy porównuje się i uliniowuje dla maksymalnego odpowiadania w oknie porównania, jak zmierzono stosując algorytm porównania sekwencji lub przez ręczne uliniowanie i badanie wzrokowe. [0039] Peptyd immunogenny lub epitop immunogenny lub epitop peptydowy oznacza peptyd, który obejmuje motyw lub nadmotyw swoisty dla allelu, taki jak peptyd zwiąże się z cząsteczką HLA i zaindukuje odpowiedź CTL i/lub HTL. Zatem, peptydy immunogenne według wynalazku są zdolne do wiązania się z odpowiednią cząsteczką HLA, a następnie indukowania odpowiedzi limofytów T cytotoksycznych (CTL) lub odpowiedzi

9 limfocytów T pomocniczych (HTL) na peptyd. [00] Wyrażenia izolowany lub biologicznie czysty dotyczą materiału, który jest istotnie lub zasadniczo wolny od składników, które normalnie towarzyszą materiałowi, gdy występuje w jego stanie natywnym. Zatem izolowane peptydy zgodnie z ujawnieniem korzystnie nie zawierają materiałów normalnie związanych z peptydami w ich środowisku in situ. Izolowany epitop dotyczy epitopu, który nie obejmuje całej sekwencji antygenu, z którego pochodzi epitop. Zazwyczaj izolowany epitop nie ma dołączonych dodatkowych reszt aminokwasowych, co skutkuje sekwencją, która ma 0% identyczności na całej długości natywnej sekwencji. Natywną sekwencją może być sekwencja, taka jak antygen związany z nowotworem, z którego pochodzi epitop. Zatem, określenie izolowany oznacza, że naturalny materiał usunięto z jego pierwotnego środowiska (np. naturalne środowisko, jeśli występuje naturalnie). Przykładowo, naturalnie występujący peptyd obecny w żywym zwierzęciu nie jest izolowany, lecz ten sam peptyd, oddzielony do niektórych lub wszystkich współistniejących materiałów w naturalnym układzie jest izolowany. [0041] Główny układ zgodności tkankowej lub MHC jest grupą genów, które odgrywają rolę w kontroli oddziaływań komórkowych odpowiedzialnych za fizjologiczne odpowiedzi immunologiczne. U ludzi, układ MHC jest również znany jako układ ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA). Szczegółowy opis układów MHC i HLA, patrz Paul, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, wyd. 3, Raven Press, Nowy Jork (1993). [0042] Sekwencja natywna lub typu dzikiego dotyczy sekwencji występującej w naturze. Taka sekwencja może obejmować w istocie dłuższą sekwencję. [0043] Negatywnie wiążąca reszta lub szkodliwa reszta jest resztą aminokwasową, która, jeśli obecna w pewnych pozycjach (zazwyczaj nie w pierwszorzędowych pozycjach kotwiczenia) w epitopie peptydowym, skutkuje zmniejszonym powinowactwem wiązania peptydu do jego odpowiadającej cząsteczki HLA. [0044] Określenia peptyd i epitop peptydowy stosuje się w niniejszym opisie zamiennie z określeniem oligopeptyd, aby określić szereg reszt, zazwyczaj reszt L-aminokwasów, połączonych ze sobą, zazwyczaj wiązaniami peptydowymi między grupami α-aminową i karboksylową sąsiadujących reszt aminokwasowych. [004] Peptyd syntetyczny dotyczy peptydu, który uzyskano z nienaturalnego źródła, np. jest wytworzony przez człowieka. Takie peptydy można wytwarzać stosując takie sposoby, jak synteza chemiczna lub technologia rekombinacji DNA. Peptydy syntetyczne obejmują białka fuzyjne. [0046] Peptyd wiążący PanDR, epitop wiążący PanDR lub peptyd PADRE (Epimmune, San Diego, CA) jest członkiem rodziny cząsteczek, które wiążą więcej niż jedną cząsteczkę DR HLA klasy II. Wzór, który definiuje rodzinę cząsteczek PADRE można nazywać nadmotywem HLA klasy II. Cząsteczka PADRE wiąże się z cząsteczkami HLA-DR i stymuluje in vitro i in vivo odpowiedzi ludzkich limfocytów T pomocniczych (HTL). Dalsza definicja rodziny PADRE, patrz będące jednocześnie rozpatrywane zgłoszenie patentowe US nr 7231; publikacje PCT nr WO 9/07707 i WO 97/26784; opisy patentowe US nr udzielony 7 kwietnia 1998 r.; 6796, udzielony 21 października 1997 r.; i , udzielony 2 lipca 02 r. [0047] Farmaceutycznie dopuszczalny dotyczy zazwyczaj nietoksycznej, obojętnej i/lub zgodnej fizjologicznie kompozycji lub składnika kompozycji. [0048] Farmaceutyczna zaróbka lub zaróbka obejmuje materiał, taki jak adiuwant, nośnik, środki regulujące ph lub buforujące, środki regulujące toniczność, środki zwilżające, środki konserwujące itd. Farmaceutyczna zaróbka oznacza zaróbkę, która jest farmaceutycznie dopuszczalna. [0049] Określenie motyw dotyczy wzoru reszt w sekwencji aminokwasowej o określonej długości, korzystnie peptydu o długości mniej niż około 1 resztach aminokwasowych lub długości mniej niż około 13 resztach aminokwasowych, zazwyczaj od około 8 do około 13

10 reszt aminokwasowych (np. 8, 9,, 11, 12 lub 13) dla motywu HLA klasy I i od około 6 do około 2 reszt aminokwasowych (np. 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24 lub 2) dla motywu HLA klasy II, które rozpoznaje konkretna cząsteczka HLA. Motywy są zazwyczaj różne dla każdego białka HLA kodowanego przez dany ludzki allel HLA. Motywy te często różnią się ich wzorem pierwszorzędowych i drugorzędowych reszt kotwiczących. W korzystnych aspektach, motyw MHC klasy I identyfikuje peptyd o długości 9, lub 11 resztach aminokwasowych. [000] Nadmotyw oznacza swoistość wiązania peptydu wspólną dla cząsteczek HLA kodowanych przez dwa lub większą liczbę alleli. Korzystnie, peptyd niosący nadmotyw jest rozpoznawany z wysokim lub pośrednim powinowactwem (jak tu zdefiniowano) przez dwa lub większą liczbę antygenów HLA. [001] Pierwszorzędowa reszta kotwicząca jest aminokwasem w swoistej pozycji wzdłuż sekwencji peptydowej, która, co jest zrozumiałe, zapewnia pierwszorzędowy punkt kontaktu między peptydem immunogennym i cząsteczką HLA. Dla peptydu immunogennego, w peptydzie o zdefiniowanej długości, motyw definiują minimalnie jedna, dwie lub trzy pierwszorzędowe reszty kotwiczące. Reszty te, co jest zrozumiałe, są odpowiednie dla bliskiego kontaktu z wiążącymi peptyd rowkami cząsteczki HLA, z ich łańcuchami bocznymi schowanymi w swoistych kieszeniach samych rowków wiążących. W jednym aspekcie motywu HLA klasy I, pierwszorzędowe reszty kotwiczące są zlokalizowane w pozycji 2 (od pozycji końca aminowego) i w pozycji końca karboksylowego epitopu peptydowego według tego ujawnienia. Pierwszorzędowe pozycje kotwiczące dla motywu A2 i nadmotywu HLA klasy I przedstawiono w Tabelach 4A, 4B, 4C i 4D. Przykładowo, peptydy analogów można utworzyć przez zmianę obecności lub nieobecności konkretnych reszt w tych pozycjach kotwiczących. Takie analogi stosuje się do modulowania powinowactwa wiązania epitopu obejmującego konkretny motyw lub nadmotyw. [002] Drugorzędowa reszta kotwicząca jest aminokwasem w pozycji innej niż pierwszorzędowa pozycja kotwicząca w peptydzie, która może wpływać na wiązanie peptydu. Drugorzędowa reszta kotwicząca występuje w znacząco wyższej częstości pośród peptydów związanych z HLA, niż oczekuje się przez losowe rozmieszczenia reszt aminokwasowych w danej pozycji. Drugorzędową resztę kotwiczącą można zidentyfikować, jako resztę, która jest obecna z wyższą częstością pośród peptydów o wysokim lub pośrednim powinowactwie wiązania lub resztę inaczej związaną o wysokim lub pośrednim powinowactwie wiązania. Mówi się, że drugorzędowe reszty kotwiczące występują w drugorzędowych pozycjach kotwiczących. Przykładowo, peptydy analogów można utworzyć przez zmianę obecności lub nieobecności poszczególnych reszt w tych drugorzędowych pozycjach kotwiczących. Takie analogi stosuje się do subtelnego modulowania powinowactwa wiązania epitopu obejmującego konkretny motyw lub nadmotyw. Terminologię zamocowanego peptydu zazwyczaj stosuje się, aby dotyczyła analogu peptydu, który ma zmiany w pierwszorzędowej pozycji kotwiczącej; nie drugorzędowej. Kryptyczny epitop wywołuje odpowiedź przez immunizację izolowanym peptydem, lecz odpowiedź nie jest reaktywna krzyżowo in vitro, gdy jako antygen stosuje się całe białko, które obejmuje epitop. [003] Rozpoznawanie mieszane przez TCR, występuje wtedy, gdy odrębny peptyd rozpoznaje różne klony limfocyty T w kontekście różnych cząsteczek HLA. Mieszane wiązanie przez cząsteczkę HLA jest synonimiczne do wiązania reaktywnego krzyżowo. [004] Ochronna odpowiedź immunologiczna lub terapeutyczna odpowiedź immunologiczna dotyczy odpowiedzi CTL i/lub HTL na antygen pochodzący z antygenu patogenu (np. antygen ze środka zakaźnego lub antygen nowotworowy), która w pewien sposób zapobiega lub co najmniej częściowo zatrzymuje objawy choroby, skutki uboczne lub postęp. Odpowiedź immunologiczna może również obejmować odpowiedź przeciwciała, która jest ułatwiana przez stymulację limfocytów T pomocniczych. [00] Określenie reszta dotyczy reszty aminokwasowej lub reszty mimetyku aminokwasu włączonej do peptydu lub białka przez wiązanie amidowe lub mimetyk wiązania

11 amidowego. [006] Epitop subdominujący jest epitopem, który wywołuje niewielką lub brak odpowiedzi po immunizacji całym antygenem lub fragmentem całego antygenu obejmującym epitop subdominujący i epitop dominujący, który obejmuje epitop, lecz dla którego odpowiedź można uzyskać przez immunizację izolowanym peptydem, i tę odpowiedź (w przeciwieństwie do przypadku epitopów kryptycznych) wykrywa się, gdy cały antygen lub fragment całego antygenu, obejmującego epitop subdominujący lub epitop dominujący, stosuje się do wywołania wtórnej odpowiedzi in vitro lub in vivo. [007] W stosowanym tutaj znaczeniu, szczepionka jest kompozycją stosowaną do szczepienia, np. dla profilaktyki lub terapii, która obejmuje jeden lub większą liczbę peptydów zgodnie z ujawnieniem. Istnieją liczne aspekty szczepionek zgodnie z ujawnieniem, takie jak koktajl jednego lub większej liczby peptydów; jeden lub większa liczba peptydów zgodnie z ujawnieniem objętych przez peptyd poli-epitopowy. Jeden lub większa liczba peptydów może obejmować jakąkolwiek liczbę całkowitą pełnych jednostek od 1-, np. co najmniej 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 3 1, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39,, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49, 0, 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9, 60, 6, 70, 7, 80, 8, 90, 9, 0,, 1, 11, 1, 12, 1, 13, 1, 14 lub lub większą liczbę peptydów zgodnie z ujawnieniem. Peptydy lub polipeptydy można ewentualnie modyfikować, tak jak przez lipidację, dołączenie sekwencji nakierowujących lub innych. Peptydy wiążące HLA klasy I zgodnie z ujawnieniem można związać lub inaczej połączyć z peptydami wiążącymi HLA klasy II, np. uniwersalnym peptydem wiążącym HTL PADRE, dla ułatwiania aktywacji zarówno limfocytów T cytotoksycznych i limfocytów T pomocniczych. Szczepionki mogą obejmować komórki prezentujące antygen pobudzone peptydem, np. komórki dendrytyczne. [008] Nazewnictwo stosowane do opisania peptydów lub białek jest zgodne z standardową praktyką, przy czym grupę aminową przedstawia się po lewej stronie (koniec aminowy lub N) i grupę karboksylową po prawej stronie (koniec karboksylowy lub C) każdej reszty aminokwasowej. Gdy pozycje reszty aminokwasowej dotyczą epitopu peptydu, numeruje się je w kierunku od amino do karboksy, przy czym pozycja jeden jest resztą zlokalizowaną na końcu aminowym epitopu lub peptydu albo białka, którego może być częścią. [009] We wzorach reprezentujących wybrane konkretne aspekty niniejszego ujawnienia, grupy końca aminowego i karboksylowego, chociaż nie jest to konkretnie przedstawione, są w postaci, którą przybierają w fizjologicznych wartościach ph, o ile nie określono inaczej. We wzorach struktury aminokwasowej, każdą resztę zazwyczaj reprezentują standardowe trzyliterowe lub jednoliterowe oznaczenia. Postać L reszty aminokwasowej reprezentuje pojedyncza wielka litera lub pierwsza wielka litera w symbolu trzyliterowym, a postać D tych reszt aminokwasowych, które mają postać D, reprezentuje pojedyncza mała litera lub symbol trzech małych liter. Jednak, gdy symbole trzyliterowe lub pełne nazwy stosuje się bez wielkich liter, mogą dotyczyć reszt aminokwasów L. Glicyna nie ma asymetrycznego atomu węgla i po prostu nazywa się ją Gly lub G. Przedstawione tu sekwencje aminokwasowe peptydów zazwyczaj oznacza się stosując standardowy symbol jednoliterowy. (A, alanina; C, cysteina, D, kwas asparaginowy; E, kwas glutaminowy; F, fenyloalanina, G, glicyna; H, histydyna, I, izoleucyna; K, lizyna; L, leucyna; M, metionina; N, asparagina; P, prolina; Q, glutamina; R, arginina; S, seryna; T, treonina; V, walina; W, tryptofan; i Y, tyrozyna). Dodatkowo do tych symboli, B w stosowanych tu skrótach jednoliterowych oznacza kwas α-aminomasłowy. W niektórych aspektach, kwas α-aminomasłowy można wzajemnie zamieniać z cysteiną. [0060] Zastosowane tu akronimy są następujące: APC: Komórka prezentująca antygen CD3: Pan-marker limfocytu T CD4: Marker limfocytu T pomocniczego CD8: Marker limfocytu T cytotoksycznego

12 CEA: Antygen karcinoembrionalny (patrz np. SEQ ID NO: 363) CTL: Limfocyt T cytotoksyczny DC: Komórki dendrytyczne. DC działają jako silne komórki prezentujące antygen przez stymulowanie uwalniania cytokin z linii CTL, które są swoiste dla modelowego peptydu pochodzącego z wirusa zapalenia wątroby typu B. Doświadczenia in vivo z użyciem DC pobudzonych ex vivo epitopem peptydowym HBV stymulowały odpowiedzi immunologiczne CTL in vivo po dostarczeniu do naiwnych myszy. DLT: Toksyczność ograniczająca dawkę, zdarzenie niepożądane związane z terapią. DMSO: Dimetylosulfotlenek ELISA: Test immunoenzymatyczny E:T: Stosunek efektor:cel G-CSF: Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów GM-CSF: Czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów-makrofagów (monocytów) HBV: Wirus zapalenia wątroby typu B HER2/neu: Antygen związany z nowotworem; c-erbb-2 jest synonimem (patrz np. SEQ ID NO: 364) HLA: Ludzki antygen leukocytarny HLA-DR: Ludzki antygen leukocytarny klasy II HPLC: Wysokosprawna chromatografia cieczowa HTC: Limfocyt T pomocniczy HTL: Limfocyt T pomocniczy. Synonim dla HTC. ID: Identyczność IFNγ: Interferon gamma IL-4: Interleukina-4 IV: Dożylnie LU%: Aktywność cytotoksyczna dla 6 komórek efektorowych wymagana, aby osiągnąć % lizę docelowej populacji komórek przy stosunku 0:1 (E:T). MAb: Przeciwciało monoklonalne MAGE: Antygen czerniaka (patrz np. SEQ ID NO: 36 i 366 odpowiednio dla MA- GE2 i MAGE3) MLR: Mieszana reakcja limfocytów MNC: Komórki jednojądrzaste PB: Krew obwodowa PBMC: Komórka jednojądrzasta krwi obwodowej ProGP : Produkt Progenipoietin (Searle, St. Louis, MO), agonista receptora chimerycznego flt3/g-csf. SC: Podskórnie S.E.M.: Błąd standardowy średniej QD: Dawkowanie raz dziennie TAA: Antygen związany z nowotworem TNF: Czynnik martwicy nowotworu WBC: Białe krwinki [0061] Poniżej opisano bardziej szczegółowo peptydy, odpowiadające cząsteczki kwasu nukleinowego, kompozycje i sposoby zgodne z ujawnieniem. PEPTYDY A2 I POLINUKLEOTYDY ANTYGENÓW ZWIĄZANYCH Z NOWO- TWOREM Epitopy A2 i analogi [0062] Wszystkie wyizolowane epitopy i analogi zgodnie z ujawnieniem są peptydami wiążącymi klasy I, tj. peptydami CTL. W szczególności, epitopy i analogi zgodnie z ujawnieniem obejmują motyw lub nadmotyw A2. Epitopy i analogi według wynalazku są tymi

13 przestawionymi w Tabeli 1 (SEQ ID NO: 1-). Epitopy A2 i analogi według wynalazku mogą być tu nazywane epitopami oraz analogami lub w odniesieniu do tabeli albo w odniesieniu do SEQ ID NO. Inne epitopy i analogi nazywa się tu epitopami CTL lub peptydami CTL i epitopami HTL lub peptydami HTL. [0063] Peptydy. W niektórych aspektach, ujawnienie opisuje izolowany peptyd obejmujący lub składający się z epitopu i/lub analogu, przy czym epitop lub analog składa się z sekwencji wybranej z tych w Tabeli 1 (SEQ ID NO: 1-). [0064] Korzystnie, peptyd obejmuje lub składa się z epitopu lub analogu składającego się z sekwencji z Tabeli 1. [006] Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą być białkami fuzyjnymi epitopu(-ów) i/lub analogu(-ów) z epitopem(-ami) CTL i/lub epitopem(-ami) HTL i/lub łącznikiem(-ami) i/lub grupą(-ami) rozdzielającą(-ymi) i/lub nośnikiem(-ami) i/lub dodatkową(-ymi) resztą(- ami) aminokwasową(-ymi) i/lub mogą obejmować lub składać się z homopolimerów epitopu lub analogu lub heteropolimerów epitopów i/lub analogów, jak opisano szczegółowo poniżej. [0066] Peptydy, które obejmują epitop i/lub analog zgodnie z ujawnieniem mogą obejmować lub składać się z fragmentu antygenu ( fragment lub fragment antygenowy ), przy czym fragment obejmuje epitop i/lub analog. Fragment może być częścią CEA, HER2/neu MAGE2, MAGE3 i/lub p3 (odpowiednio SEQ ID NO:11, 12, 13, 14 i 1). [0067] Fragment może obejmować lub składać się z regionu natywnego antygenu, który zawiera wysokie zagęszczenie epitopów klasy I i/lub klasy II, korzystnie zawiera największą liczbę epitopów na długość aminokwasową. Takie epitopy mogą być obecne w sposób z przesuniętą ramką odczytu, np. peptyd o długości aminokwasów mógłby zawierać dwa epitopy o długości 9 reszt aminokwasowych i jeden epitop o długości reszt aminokwasowych. [0068] W korzystnych aspektach, fragmenty mają długość 9, lub 11 reszt aminokwasowych. [0069] Peptydy, które obejmują epitop i/lub analog zgodnie z ujawnieniem mogą być białkiem fuzyjnym obejmującym jeden lub większą liczbę reszt aminokwasowych oprócz epitopu, analogu lub fragmentu. Białka fuzyjne obejmują homopolimery i heteropolimery, jak opisano poniżej. [0070] W pewnych aspektach, peptyd obejmuje lub składa się z wielu epitopów i/lub analogów, np. 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9 lub epitopów i/lub analogów zgodnie z ujawnieniem. W niektórych aspektach, peptyd obejmuje co najmniej 1, co najmniej 2, co najmniej 3, co najmniej 4, co najmniej, co najmniej 6, co najmniej 7, co najmniej 8, co najmniej 9 lub co najmniej epitopów i/lub analogów zgodnie z ujawnieniem. [0071] Peptyd może również być homopolimerem jednego epitopu lub analogu albo peptyd może być heteropolimerem, który zawiera co najmniej dwa różne epitopy i/lub analogi. Polimery mają zaletę zwiększonego prawdopodobieństwa reakcji immunologicznej i, gdy stosuje się różne epitopy/analogi do utworzenia polimeru, zdolności do indukowania przeciwciał i/lub limfocytów T, które reagują z różnymi determinantami antygenowymi antygenu(-ów) docelowego(-ych) dla odpowiedzi immunologicznej. [0072] Homopolimer może obejmować 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39,, 4, 0,, 60, 6, 70, 7, 80, 8, 90, 9, 0,, 1, 11, 1, 12, 1, 13, 1, 14 lub kopii tego samego epitopu lub analogu. [0073] Heteropolimer może obejmować jedną lub większą liczbę kopii pojedynczego epitopu lub analogu i jedną lub większą liczbę kopii jednego lub większej liczby różnych epitopów i/lub analogów zgodnie z ujawnieniem. Epitopy i/lub analogi, które tworzą heteropolimer, mogą być wszystkie z tego samego antygenu, np. mogą być z CEA, p3, MA- GE2/3, HER2/neu albo innych niniejszych antygenów lub znanych w dziedzinie albo mogą być z różnych antygenów, korzystnie TAA. Połączenia epitopów i/lub analogów, które mogą tworzyć heteropolimer, obejmują te połączenia opisane powyżej. Heteropolimery

14 mogą zawierać wiele kopii jednego lub większej liczby epitopów i/lub analogów. [0074] Zatem, peptydy zgodnie z ujawnieniem, takie jak heteropolimery mogą obejmować pierwszy epitop i/lub analog i co najmniej 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39,, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49 lub 0 innych (różnych) epitopów i/lub analogów. [007] Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą również obejmować dodatkowe reszty aminokwasowe. [0076] W niektórych aspektach, peptydy mogą również obejmować liczne epitopy CTL i/lub HTL, np. 1, 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39,, 41, 42, 43, 44, 4, 46, 47, 48, 49 lub 0 epitopów CTL i/lub HTL. [0077] Epitop CTL i/lub HTL i epitop/analog zgodnie z ujawnieniem może być z tego samego TAA lub z różnych TAA. Zatem, na przykład, jeśli epitop i/lub analog jest z CEA, peptyd CTL i/lub peptyd HTL mogą być również z CEA. Alternatywnie, peptyd CTL i/lub peptyd HTL mogą być z innego antygenu, korzystnie antygenu TAA, takiego jak p3, MAGE2/3 lub HER2/neu. Jako inny przykład, jeśli epitop i/lub analog jest z p3, peptyd CTL i/lub peptyd HTL może być z p3 lub, alternatywnie, może być z MAGE2/3, HER2/neu lub CEA. [0078] Peptyd CTL i/lub peptyd HTL mogą być z antygenów związanych z nowotworem, takich jak, lecz nie wyłącznie, antygeny czarniaka MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE- 11, MAGE-A, jak również BAGE, GAGE, RAGE, MAGE-C1, LAGE-1, CAG-3, DAM, MUC1, MUC2, MUC18, NY-ESO-1, MUM-1, CDK4, BRCA2, NY-LU-1, NY- LU-7, NY-LU-12, CASP8, RAS, KIAA-2-, SCCs, p3, p73, CEA, HER2/neu, Melan-A, gp0, tyrozynaza, TRP2, gp7/trp1, kalikreina, swoisty antygen błonowy gruczołu krokowego (PSM), kwaśna fosfataza gruczołu krokowego (PAP), swoisty antygen gruczołu krokowego (PSA), PT1-1, β-katenina, PRAME, telomeraza, FAK, białko cykliny D1, NO- EY2, EGF-R, SART-1, CAPB, HPVE7, p1, receptor folianu CDC27, PAGE-1 i PAGE-4 (patrz np. Tabela 16). [0079] Nieograniczające przykłady peptydów CTL i peptydów HTL ujawniono w WO 01/42270, opublikowanym 14 czerwca 01 r.; WO 01/41788, opublikowanym 14 czerwca 01 r.; WO 01/42270, opublikowanym 14 czerwca 01 r.; WO 01/4728, opublikowanym 28 czerwca 01 r.; i WO 01/41787, opublikowanym 14 czerwca 01 r. [0080] Peptyd HTL może obejmować peptyd syntetyczny, taki jak epitop wiążący Pan-DR (np. peptyd PADRE, Epimmune Inc., San Diego, CA, opisany, na przykład, w opisie patentowym US nr ), na przykład o wzorze akxvaaztlkaaa, gdzie X oznacza cykloheksyloalaninę, fenyloalaninę lub tyrozynę; Z oznacza tryptofan, tyrozynę, histydynę lub asparaginę; a a oznacza D-alaninę lub L-alaninę (SEQ ID NO: 746). Pewne epitopy wiążące pan-dr obejmują wszystkie naturalne reszty aminokwasowe L ; cząsteczki te można dostarczyć jako peptydy lub w postaci kwasów nukleinowych, które kodują peptyd. Patrz również, opisy patentowe US nr 6796 i [0081] Peptyd może obejmować dodatkowe reszty aminokwasowe. Takimi dodatkowymi resztami aminokwasowymi mogą być Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, Trp, Val, mimetyki aminokwasów i inne nienaturalne reszty aminokwasowe, takie jak te opisane poniżej. Dodatkowe reszty aminokwasowe można zapewnić dla łatwego łączenia ze sobą peptydów, dla łączenia epitopów i/lub analogów do siebie, dla łączenia epitopów i/lub analogów do epitopów CTL i/lub HTL, dla sprzęgania z podłożem nośnym lub większym peptydem, dla modyfikowania fizycznych lub chemicznych właściwości peptydu albo oligopeptydu lub tym podobnych. Reszty aminokwasowe, takie jak Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Gly, Glu, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Tyr, Trp lub Val, lub tym podobne, można wprowadzać na C- i/lub N-końcu peptydu i/lub można wprowadzać wewnętrznie. [0082] Peptyd może obejmować aminokwasową grupę rozdzielającą, którą można przyłą-

15 czyć do epitopów, analogów, epitopów CTL, epitopów HTL, nośników itd. w peptydzie lub można połączyć z peptydem na N- i/lub C-końcu. Zatem, grupy rozdzielające mogą być na N-końcu lub C-końcu peptydu lub mogą być wewnętrzne, tak że wiążą lub łączą epitopy, analogi, epitopy CTL, epitopy HTL, nośniki, dodatkowe reszty aminokwasowe i/lub fragmenty antygenowe jeden z drugim. [0083] Grupa rozdzielająca zazwyczaj składa się z jednej lub większej liczby względnie małych, obojętnych cząsteczek, takich jak reszty aminokwasowe lub mimetyki aminokwasów, które zasadniczo są nienaładowane w warunkach fizjologicznych. Grupy rozdzielające zazwyczaj wybiera się z np. Ala, Gly lub innych obojętnych grup rozdzielających z niepolarnych reszt aminokwasowych lub obojętnych polarnych reszt aminokwasowych. Należy rozumieć, że ewentualnie obecna grupa rozdzielająca może składać się z tych samych reszt lub może składać się z jednej lub większej liczby różnych reszt, a zatem może być homo- lub heterooligomerem reszt rozdzielających. Zatem, grupa rozdzielająca może zawierać więcej niż jedną resztę Ala (poli-alaninę) lub więcej niż jedną resztę Gly (poliglicynę) lub może zawierać reszty zarówno Ala i Gly, np. Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser-, Gly-Ser-, Ser-Gly- itd. Gdy jest obecna, grupa rozdzielająca będzie zazwyczaj miała co najmniej jedną lub dwie reszty, częściej trzy do sześciu reszt i czasami lub większą liczbę reszt, np. 3, 4,, 6, 7, 8, 9 lub lub nawet większą liczbę reszt. (Livingston, B.D. i in. Vaccine 19: (00)). [0084] Peptydy mogą obejmować nośniki, takie jak te dobrze znane w dziedzinie, np. tyreoglobulina, albuminy, takie jak ludzka albumina surowicza, toksoid tężcowy, reszty poliaminokwasowe, takie jak poli-l-lizyna, poli-l-kwas glutaminowy, białka wirusa grypy, białko rdzeniowe wirusa zapalenia wątroby typu B i tym podobne. [008] Dodatkowo, peptyd można zmodyfikować przez acylowanie końcowej grupy NH2, np. przez alkanoilo (C1-C) lub tioglikolilo-acetylowanie, amidowanie końcowego karboksylu, np. amoniakiem, metyloaminą itd. W pewnych przypadkach modyfikacje te mogą zapewnić miejsca do łączenia z nośnikiem lub inną cząsteczką. [0086] Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą zawierać modyfikacje, takie jak, lecz nie wyłącznie, glikozylowanie, utlenianie łańcucha bocznego, biotynylowanie, fosforylowanie, dodanie materiału powierzchniowo czynnego, np. lipidu, lub można je modyfikować chemicznie, np. drogą acetylowania itd. Ponadto, wiązania w peptydzie mogą być inne niż wiązania peptydowe, np. wiązania kowalencyjne, wiązania estrowe lub eterowe, wiązania disiarczkowe, wiązania wodorowe, wiązania jonowe itd. [0087] Peptydy według niniejszego ujawnienia mogą zawierać podstawienia dla zmodyfikowania właściwości fizycznej (np. trwałości lub rozpuszczalności) otrzymanego peptydu. Przykładowo, peptydy można modyfikować przez podstawienie cysteiny (C) kwasem α- aminomasłowym ( B ). Ze względu na jej chemiczną naturę, cysteina ma skłonność do tworzenia mostków disiarczkowych i wystarczająco zmienia peptyd strukturalnie, tak aby zmniejszyć zdolność wiązania. Podstawienie kwasu α-aminomasłowego na C nie tylko łagodzi ten problem, lecz faktycznie zwiększa zdolność wiązania i wiązania krzyżowego w pewnych przypadkach. Podstawienie cysteiny kwasem α-aminomasłowym może występować w jakiejkolwiek reszcie peptydu, np. albo w kotwiczących lub niekotwiczących epitopu lub analogu w peptydzie lub w innych pozycjach peptydu. [0088] Peptydy mogą obejmować mimetyki aminokwasów lub nienaturalne reszty aminokwasowe, np. D- lub L-naftyloalaninę; D- lub L-fenyloglicynę; D- lub L-2-tienoiloalaninę; D- lub L-1, -2, 3- lub 4-pirenoiloalaninę; D- lub L-3 tienoiloalaninę; D- lub L-(2-pirydynylo)alaninę; D- lub L-(3-pirydynylo)alaninę; D- lub L-(2-pirazynylo)alaninę; D- lub L-(4- izopropylo)fenyloglicynę; D-(trifluorometylo)fenyloglicynę; D-(trifluorometylo)fenyloalaninę; D-p-fluorofenyloalaninę; D- lub L-ρ-bifenylofenyloalaninę; D- lub L-p-metoksybifenylofenyloalaninę; D- lub L-2-indolo(alkilo)alaniny; i D- lub L-alkiloalaniny, gdzie grupa alkilowa może być podstawiona lub niepodstawiona metylem, etylem, propylem, heksylem, butylem, pentylem, izopropylem, izo-butylem, sec-izotylem, izo-pentylem lub nie-

16 kwasowymi resztami aminokwasowymi. Pierścienie aromatyczne nienaturalnego aminokwasu obejmują, np. tiazolilowe, tiofenylowe, pirazolilowe, benzimidazolilowe, naftylowe, furanylowe, pirolilowe i pirydylowe pierścienie aromatyczne. Modyfikowane peptydy, które zawierają różne mimetyki aminokwasów lub nienaturalne reszty aminokwasowe są szczególnie użyteczne, ponieważ mają tendencję do wykazywania zwiększonej trwałości in vivo. Takie peptydy mogą również posiadać poprawiony okres trwałości lub właściwości wytwarzania. [0089] Trwałość peptydu można badać na wiele sposobów. Przykładowo, do badania trwałości były stosowane peptydazy i różne ośrodki biologiczne, takie jak ludzkie osocze i surowica. Patrz np. Verhoef, i in., Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinetics 11:291 (1986). Okres półtrwania peptydów według niniejszego ujawnienia korzystnie określa się stosując test 2% ludzkiej surowicy (obj./obj.). Protokół zazwyczaj jest następujący: Z połączonej ludzkiej surowicy (typ AB, nieinaktywowana termicznie) przed zastosowaniem usuwa się lipidy przez odwirowanie. Surowicę następnie rozcieńcza się do 2% z użyciem RPMI- 16 lub innej pożywki do hodowli komórkowej. We wcześniej określonych odstępach czasu usuwa się małą ilość roztworu reakcyjnego i dodaje albo do 6% wodnego kwasu trichlorooctowego (TCA), albo etanolu. Mętną próbkę reakcyjną ochładza się (4 C) przez 1 minut, a następnie odwirowuje, aby osadzić wytracone białka surowicy. Obecność peptydów następnie określa się metodą HPLC w odwróconym układzie faz, stosując warunki chromatografii swoiste dla trwałości. Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą być różnych długości i są albo w ich obojętnej (nienaładowanej) postaci, albo w postaciach soli. Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą zawierać modyfikacje, takie jak glikozylacja, utlenianie łańcucha bocznego lub fosforylacja, zazwyczaj pod warunkiem, że modyfikacje nie niszczą aktywności biologicznej peptydów. [0090] Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą być liofilizowane lub mogą być w postaci krystalicznej. [0091] Zazwyczaj jest korzystne, że epitop jest tak mały jak to możliwe, wciąż utrzymując zasadniczo całą aktywność immunologiczną natywnego białka. Gdy to możliwe, może być pożądane optymalizowanie epitopów wiążących HLA klasy I zgodnie z ujawnieniem do długości wynoszącej około 8 do około 13 reszt aminokwasowych, na przykład 8, 9,, 11, 12 lub 13, korzystnie 9 lub. Należy docenić, że jeden lub większa liczba epitopów w tym zakresie wielkości może być objęta przez dłuższy peptyd (patrz określenie epitop w części Definicje dla dalszego omówienia długości peptydu). Epitopy wiążące HLA klasy II korzystnie optymalizuje się do długości wynoszącej około 6 do około reszt aminokwasowych długości np. 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29 lub, korzystnie do między około 13 i około reszt, np. 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19 lub. Korzystnie, epitopy są proporcjonalne pod względem wielkości do endogennie przetworzonych peptydów pochodzących z patogenu lub peptydów komórki nowotworowej, które są wiązane ze stosownymi cząsteczkami HLA. Identyfikację i otrzymywanie peptydów o różnych długościach można przeprowadzić stosując opisane tu sposoby. [0092] Peptydy zgodnie z ujawnieniem można otrzymywać syntetycznie, technologią rekombinacji DNA lub metodą syntezy chemiczneją lub można je izolować ze źródeł naturalnych, takich jak natywne nowotwory lub organizmy patogenne. Epitopy można syntezować pojedynczo albo połączyć bezpośrednio lub pośrednio w peptydzie. Chociaż peptyd korzystnie będzie zasadniczo wolny od innych naturalnie występujących białek komórki gospodarza i ich fragmentów, w niektórych aspektach peptydy można syntetycznie sprzęgać, aby połączyć z natywnymi fragmentami lub cząstkami. [0093] Peptydy zgodnie z ujawnieniem można otrzymać wieloma różnymi sposobami. Dla względnie małych wielkości, peptydy można syntetyzować w roztworze lub na stałym nośniku standardowymi technikami. Różne automatyczne syntetyzery są handlowo dostępne i można je stosować według znanych protokołów. (Patrz na przykład Stewart i Young, SO-

17 LID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2. wyd., Pierce Chemical Co., 1984). Ponadto, pojedyncze peptydy można połączyć stosując chemiczną ligację, aby wytworzyć większe peptydy, które nadal mieszczą się w granicach ujawnienia. [0094] Alternatywnie, można zastosować technologię rekombinacji DNA, gdzie sekwencję nukleotydową, która koduje peptyd wstawioną do wektora ekspresyjnego, którym transformuje się lub transfekuje odpowiednią komórkę gospodarza i hoduje się w warunkach odpowiednich do ekspresji. Procedury te są ogólnie znane w dziedzinie, jak opisano ogólnie w Sambrook i in., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nowy Jork (1989). Zatem, rekombinowane peptydy, które obejmują lub składają się z jednego lub większej liczby epitopów zgodnie z ujawnieniem, można zastosować do prezentowania odpowiedniego epitopu limfocytu T. [009] Polinukleotydy, kodujące każdy z peptydów powyżej, są również częścią ujawnienia. Jak doceniają specjaliści, różne kwasy nukleinowe kodują ten sam peptyd ze względu na nadmiarowość kodu genetycznego. [0096] Polinukleotydy kodujące rozważane tu peptydy można syntezować sposobami chemicznymi, na przykład, metodą fosfotriestrową Matteucci, i in., J. Am. Chem. Soc. 3:318 (1981). Polinukleotydy kodujące peptydy obejmujące lub składające się z analogu można wytworzyć po prostu przez podstawienie odpowiednich(-ej) i pożądanych(-ej) zasad(-y) kwasu nukleinowego za te, które kodują natywny epitop. [0097] Polinukleotyd, np. minigen (patrz poniżej) można wytworzyć przez składanie oligonukleotydów, które kodują nici plus i minus polinukleotydu, np. minigenu. Zachodzące na siebie oligonukleotydy (1-0 zasad długości) można syntetyzować, fosforylować, oczyszczać i przyłączać w odpowiednich warunkach stosując dobrze znane techniki. Końce oligonukleotydów można łączyć, na przykład, stosując ligazę DNA T4. Polinukleotyd, np. minigen, kodujący peptyd zgodnie z ujawnieniem, można wklonować do pożądanego wektora, takiego jak wektor ekspresyjny. Sekwencję kodującą można następnie dostarczyć z odpowiednimi łącznikami i ligować z wektorami ekspresyjnymi powszechnie dostępnymi w dziedzinie i wektorami stosowanymi do transformowania odpowiednich gospodarzy do wytwarzania pożądanego peptydu, takiego jak białko fuzyjne. [0098] Duża liczba takich wektorów i odpowiednich układów gospodarza jest znana specjalistom w dziedzinie i dostępna w handlu. Jako przykłady dostarcza się następujące wektory. Bakteryjne: pqe70, pqe60, pqe-9 (Qiagen), pbs, pd, phagescript, psix174, pbluescript SK, pbsks, pnh8a, pnh16a, pnh18a, pnh46a (Stratagene); ptrc99a, pkk223-3, pkk233-3, pdr, prit (Pharmacia); pcr (Invitrogen), eukariotyczne: pwlneo, psv2cat, pog44, pxt1, psg (Stratagene) psvk3, pbpv, pmsg, psvl (Pharmacia); p7.6 (Valentis); pcep (Invitrogen); pcei (Epimmune). Jednak, można zastosować jakikolwiek inny plazmid lub wektor, o ile ulega replikacji i jest żywotny w gospodarzu. [0099] Jako reprezentatywne przykłady odpowiednich gospodarzy, można wspomnieć: komórki bakteryjne, takie jak E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium i różne gatunki z rodzaju Pseudomonas, Streptomyces i Staphylococcus; komórki grzybów, takich jak drożdże; komórki owadzie, takie jak Drosophila i Sf9; komórki zwierzęce, takie jak linie COS-7 małpich fibroblastów nerki, opisane przez Gluzman, Cell 23:17 (1981) i inne linie komórkowe zdolne do ekspresji zgodnego wektora, na przykład linie komórkowe C127, 3T3, CHO, HeLa i BHK lub czerniak Bowes; komórki roślinne, itd. Uważa się, że wybór odpowiedniego gospodarza na podstawie podanych tu informacji mieści się w zakresie umiejętności specjalistów w dziedzinie. [00] Zatem, niniejsze ujawnienie opisuje wektory, korzystnie wektory ekspresyjne użyteczne do wytwarzania peptydów według niniejszego ujawnienia i komórki gospodarzy zwierające takie wektory. [01] Komórki gospodarzy modyfikuje się genetycznie (transdukuje lub transformuje lub transfekuje) wektorami według tego ujawnienia, którymi mogą być, na przykład, wektor

18 do klonowania lub wektor ekspresyjny. Wektor może być, na przykład, w postaci plazmidu, cząstki wirusowej, faga itd. Modyfikowane komórki gospodarzy można hodować w standardowej pożywce odżywczej, jak jest odpowiednie dla aktywowania promotorów, selekcji transformantów lub amplifikowania polinukleotydów. Warunki hodowli, takie jak temperatura, ph i tym podobne, są tymi uprzednio stosowanymi dla wybranej do ekspresji komórki gospodarza i są oczywiste dla zwykłego specjalisty. [02] Dla ekspresji peptydów, sekwencję kodującą dostarcza się z funkcjonalnie połączonymi kodonami start i stop, regionami promotora i terminatora i zazwyczaj systemem replikacji, aby zapewnić wektor ekspresyjne do ekspresji w pożądanym gospodarzu komórkowym. Przykładowo, sekwencje promotorowe zgodne z bakteryjnymi gospodarzami dostarcza się w plazmidach zawierających dogodne miejsca restrykcyjne do wstawiania pożądanej sekwencji kodującej. Otrzymane wektory ekspresyjne transformuje się do odpowiednich gospodarzy bakteryjnych. [03] Zazwyczaj rekombinowane wektory ekspresyjne będą obejmowały miejsca początku replikacji i markery selekcyjne pozwalające na transformację komórki gospodarza, np. gen oporności na ampicylinę z E. coli i gen TRP1 S. cerevisiae i promotor pochodzący z wysoce eksprymowanego genu, aby kierować transkrypcją dalszych sekwencji strukturalnych. Takie promotory można wyprowadzić z operonów kodujących enzymy glikolityczne, takie jak między innymi kinaza 3-fosfoglicerynianu (PGK), czynnik A-odwrócony, kwaśna fosfataza lub białka szoku cieplnego. Heterologiczną sekwencję strukturalną składa się w odpowiedniej fazie z sekwencjami inicjacji translacji i terminacji, i korzystnie z sekwencją liderową zdolną do kierowania sekrecją ulegającego translacji białka do przestrzeni peryplazmatycznej lub pożywki zewnątrzkomórkowej. Ewentualnie, sekwencja heterologiczna może kodować białko fuzyjne obejmujące N-końcowy peptyd identyfikacyjny przekazujący pożądane cechy, np. stabilizację lub uproszone oczyszczanie eksprymowanego rekombinowanego produktu. [04] Można również zastosować drożdżowe, owadzie lub ssacze komórki gospodarzy stosując odpowiednie wektory i sekwencje kontrolne. Przykłady ssaczych układów ekspresyjnych obejmują linie COS-7 małpich fibroblastów nerki, opisane przez Gluzman, Cell 23:17 (1981), i inne linie komórkowe zdolne do eksprymowania zgodnego wektora, na przykład linie komórkowe C127, 3T3, CHO, HeLa i BHK. Ssacze wektory ekspresyjne obejmują miejsce początku replikacji, odpowiedni promotor i wzmacniacz, jak również jakiekolwiek konieczne miejsca wiązania rybosomów, miejsce poliadenylacji, donorowe i akceptorowe miejsca splicingowe, transkrypcyjne sekwencje terminatorowe i flankujące nietranskrybowane sekwencje '. Takie promotory mogą również pochodzić ze źródeł wirusowych, takich jak np. ludzki cytomegalowirus (promotor CMV-IE) lub wirus opryszczki typu 1 (promotor HSV TK). Sekwencje kwasu nukleinowego uzyskane ze splicingu SV i miejsc poliadenylacji można zastosować, aby zapewnić wymagane nietranskrybowane elementy genetyczne. [0] Polinukleotydy kodujące peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą również obejmować sekwencję sygnału ubikwitynacji i/lub sekwencję nakierowującą, taką jak sekwencję sygnałową siateczki endoplazmatycznej (ER) do ułatwiania poruszania się otrzymanego peptydu do siateczki endoplazmatycznej. [06] Polinukleotydy zgodnie z ujawnieniem, np. minigeny, mogą ulegać ekspresji u ludzi. Jako wskazówkę do wyboru kodonu dla każdego aminokwasu można zastosować tabelę wykorzystania kodonów u ludzi. Takie polinukleotydy korzystnie obejmują rozdzielające reszty aminokwasowe między epitopami i/lub analogami, takie jak te opisane powyżej lub mogą obejmować naturalnie występujące sekwencje flankujące sąsiadujące z epitopami i/lub analogami (i/lub epitopy CTL i HTL). [07] Peptydy zgodnie z ujawnieniem mogą ulegać ekspresji z użyciem wektorów wirusowych lub bakteryjnych. Standardowe sekwencje regulatorowe dobrze znane specjalistom w dziedzinie korzystnie są włączone do wektora, aby zapewnić ekspresję w ludzkich ko-

19 mórkach docelowych. Pożądanych jest kilka elementów wektora: promotor z dalszym miejscem do klonowania polinukleotydu, np. insercji minigenu; sygnał poliadenylacji dla skutecznej terminacji transkrypcji, miejsce początku replikacji E. coli; i marker selekcyjny E. coli (np. oporność na ampicylinę lub kanamycynę). Do tego celu można zastosować liczne promotory, np. ludzki promotor cytomegalowirusa (hcmv). Inne odpowiednie sekwencje promotorowe, patrz np. opisy patentowe US nr 8089 i Korzystnym promotorem jest promotor CMV-IE. [08] Polinukleotydy, np. minigeny, mogą obejmować jeden lub większą liczbę syntetycznych lub naturalnie występujących intronów w regionie transkrybowanym. Można również rozważać włączenie sekwencji stabilizujących mrna i sekwencji do replikacji w komórkach ssaczych, aby zwiększyć ekspresję polinukleotydu, np. minigenu. [09] Dodatkowo, polinukleotyd, np. minigen, może obejmować sekwencje immunostymulatorowe (ISS lub CpG). Sekwencje te mogą być włączone do wektora, poza polinukleotydową sekwencją kodującą (np. minigenem), aby wzmocnić immunogenność. [01] W niektórych aspektach można zastosować bi-cistronowy wektor ekspresyjny, który pozwala na wytwarzanie zarówno peptydów kodowanych przez polinukleotyd (np. minigen) zgodnie z ujawnieniem i drugie białko (np. takie, które moduluje immunogenność). Przykłady białka lub polipeptydy, które mogą wzmacniać odpowiedź immunologiczną, jeśli ulegają wspólnej ekspresji z peptydami zgodnie z ujawnieniem, mogą obejmować cytokiny (np. IL-2, IL-12, GM-CSF), cząsteczki indukujące cytokiny (np. LeIF), cząsteczki kostymulatorowe lub białka wiążące pan-dr (cząsteczki PADRE, Epimmune, San Diego, CA). Epitopy limfocytu T pomocniczego (HTL), takie jak cząsteczki PADRE można połączyć z wewnątrzkomórkowymi sygnałami nakierowującymi i eksprymować oddzielnie od eksprymowanych peptydów zgodnie z ujawnieniem. W pewnych chorobach może być korzystne swoiste zmniejszanie odpowiedzi immunologicznej przez wspólną ekspresję cząsteczek immunosupresorowych (np. TGF-β). [0111] Gdy wybrano wektor ekspresyjny, polinukleotyd, np. minigen, wklonowuje się do regionu polilinkera w dół od promotora. Plazmidem tym transformuje się odpowiedni szczep bakteryjny i preparuje się DNA, stosując standardowe techniki. Orientację i sekwencję DNA polinukleotydu, np. minigenu, jak również wszystkie inne elementy włączone do wektora, potwierdza się stosując mapowanie restrykcyjne, analizę sekwencji DNA i/lub analizę PCR. Komórki bakteryjne niosące prawidłowy plazmid można przechowywać, jako banki komórkowe. [0112] Zatem, ujawnienie obejmuje peptydy, jak tu opisano, polinukleotydy kodujące każdy ze wspomnianych peptydów, jak również kompozycje obejmujące peptydy i polinukleotydy, i obejmuje sposób wytwarzania i sposoby stosowania peptydów, polinukleotydów i kompozycji, jak dalej opisano poniżej. [0113] Kompozycje. W innych aspektach, wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej peptydy według wynalazku i ewentualnie inny(-e) składnik(-i). [0114] W niektórych aspektach, kompozycja zawiera lub składa się z wielu peptydów, tj. peptydów według wynalazku. [011] Kompozycja może zawierać co najmniej peptydów wybranych z tych opisanych powyżej lub poniżej. Co najmniej jeden spośród tych jednego lub większej liczby peptydów może być heteropolimerem lub homopolimerem. Dodatkowo, kompozycja może zawierać epitop CTL i/lub HTL, który może pochodzić z antygenu związanego z nowotworem. Dodatkowy epitop może również być cząsteczką wiążącą PanDR (np. uniwersalnym epitopem limfocytu T pomocniczego PADRE ). [0116] Ewentualne składniki obejmują zaróbki, rozcieńczalniki, białka, takie jak peptydy obejmujące epitop CTL i/lub epitop HTL, taki jak peptyd wiążący pan-dr (np. uniwersalny epitop limfocytu T pomocniczego PADRE ) i/lub nośnik, polinukleotydy kodujące takie białka, lipidy lub liposomy, jak również inne opisane tu składniki. Istnieją liczne aspekty kompozycji zgodnie z ujawnieniem, takie jak koktajle peptydów; peptydy i/lub

20 analogi i jeden lub większa liczba epitopów CTL i/lub HTL. [0117] Kompozycje obejmują peptydy według wynalazku, razem z jednym lub większą liczbą składników, jak opisano powyżej i w tym miejscu. Jeden lub większa liczba dotyczy jakiejkolwiek liczby całkowitej pełnych jednostek od 1-, np. co najmniej 2, 3, 4,, 6, 7, 8, 9,, 11, 12, 13, 14, 1, 16, 17, 18, 19,, 21, 22, 23, 24, 2, 26, 27, 28, 29,, 31, 32, 33, 34, 3, 36, 37, 38, 39,, 4, 0,, 60, 6, 70, 7, 80, 8, 90, 9, 0,, 1, 11, 1, 12, 1, 13, 1, 14 lub peptydów, polinukelotydów lub innych składników. [0118] Kompozycjami zgodnie z ujawnieniem mogą być, na przykład, polipeptydy według wynalazku połączone lub skompleksowane z kationowymi preparatami lipidowymi. Można również zastosować technologie dostarczania nakierowane na toksynę, znane również jako nakierowane za pośrednictwem receptora, takie jak te z Avant Immunotherapeutics, Inc. (Needham, Massachusetts) lub przyłączone do białka stresowego, np. HSP 96 (Stressgen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canada). [0119] W pewnych aspektach, składniki, które indukują odpowiedzi limfocytu T łączy się ze składnikami, które indukują odpowiedzi przeciwciała na interesujący antygen docelowy. Korzystny aspekt takiej kompozycji obejmuje epitopy klasy I i klasy II według tego ujawnienia. Alternatywnie, kompozycja zawiera epitop klasy I i/lub klasy II zgodnie z ujawnieniem, razem z cząsteczką PADRE (Epimmune, San Diego, Calif.). [01] Kompozycje zgodnie z ujawnieniem mogą obejmować komórki prezentujące antygen, takie jak komórki dendrytyczne. Komórki prezentujące antygen, np. komórki dendrytyczne, można transfekować, np. polinukleotydem, takim jak konstrukt minigenu zgodnie z ujawnieniem, aby wywołać odpowiedzi immunologiczne. Peptyd może być związany z cząsteczką HLA na komórce prezentującej antygen, przy czym gdy obecny jest cytotoksyczny limfocyt T (CTL) w restrykcji HLA, receptor CTL wiąże się z kompleksem cząsteczki HLA i peptydu. [0121] Kompozycje zgodnie z ujawnieniem mogą również zawierać leki przeciwwirusowe, takie jak interferon-α lub adiuwanty immunologiczne, takie jak IL-12, GM-CSF itd. [0122] Kompozycje mogą obejmować łańcuch ciężki HLA, mikroglobulinę β2, streptawidynę i/lub biotynę. Streptawidynę można znakować fluorescencyjnie. Kompozycje mogą zawierać tetramery (patrz np. opis patentowy US nr 63363; Science 274:94-96 (1996)). Kompozycja tetrameru obejmuje łańcuch ciężki HLA, mikroglobulinę β2, streptawidynę i biotynę. Streptawidynę można znakować fluorescencyjnie. Kompozycje mogą również zawierać dimery. Kompozycja dimeru obejmuje cząsteczkę MHC i cząsteczkę Ig (patrz np. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 9: (1998)). [0123] W niektórych aspektach, może być pożądane włączenie do kompozycji zgodnie z ujawnieniem co najmniej jednego składnika, który pierwotnie pobudza cytotoksyczne limfocyty T. Lipidy zidentyfikowano jako środku zdolne do pierwotnego pobudzania CTL in vivo względem antygenów wirusowych. Przykładowo, reszty kwasu palmitynowego można przyłączyć do grup ε- i α-aminowych reszty lizyny i następnie połączyć, np. przez jedną lub większą liczbę reszt łączących, takich jak Gly, Gly-Gly-, Ser, Ser-Ser lub tym podobnych, z peptydem immunogennym. Lipidowany peptyd można następnie podawać bezpośrednio w miceli lub cząstce, wprowadzać do liposomu lub emulgować w adiuwancie, np. niekompletnym adiuwancie Freunda. Korzystna kompozycja zawiera kwas palmitynowy przyłączony do grup ε- i α-aminowych Lys, która jest przyłączona przez połączenie, np. Ser-Ser, do aminowego końca peptydu. [0124] Jako inny przykład lipidu pierwotnie pobudzającego odpowiedzi CTL, można zastosować lipoproteiny E. coli, takie jak tripalmitoilo-s-glicerylo-cysteinylo-serylo-seryna (P3CSS) do pierwotnego pobudzania CTL swoistych dla wirusa, gdy jest ona kowalencyjnie przyłaczona do odpowiedniego peptydu (patrz np. Deres, i in., Nature 342:61, 1989). Peptydy zgodnie z ujawnieniem można następnie sprzęgać na przykład z P3CSS i lipopeptyd podaje się osobnikowi, aby swoiście pierwotnie pobudzać odpowiedź CTL na docelowy antygen. Ponadto, ponieważ indukcję przeciwciał neutralizujących można również