Molekularne wskaźniki procesów nowotworowych w diagnostyce klinicznej

Transkrypt

1 1 Gawron K, Wiczkowski A, Adamek B. Molecular indicators of neoplasia in clinical diagnostics. Pol Merkur Lekarski. 2005; 18 (105): [Article in Polish] Katarzyna Gawron*, Andrzej Wiczkowski, Brygida Adamek Molekularne wskaźniki procesów nowotworowych w diagnostyce klinicznej Katedra i Zakład Ogólnej Biologii Lekarskiej Śląskiej Akademii Medycznej w Zabrzu Rokitnicy. Abstract In normal conditions growth and cell division processes in tissues and organs are precisely regulated. On the molecular level these processes demand coordination of protooncogenes, suppressor genes, mismatch repair system genes and apoptotic genes expression. Mutations presence leads to alteration or loss of their function. In the consequence of these lesions cumulation of DNA errors cumulation and loss of cellular proliferation control take place, what leads to genome instability and promotes selection of cells clone being able to hyperproliferate. Mutations presence in mentioned above groups of genes in high percentage had been detecting in cells of neoplasms described in this review. According to clinical observations presence of mutations in these genes influenced on the clinical course and prognosis. The aim of this review was to focus on mutations found in protooncogenes, suppressor genes, mismatch repair system and apoptotic genes, which in development of some genetically determined neoplasms, some syndromes predisposing to neoplasm development and in some sporadic neoplasms in high percentage had been detected. The presence of mutations in mentioned above groups of genes as molecular neoplasias indicators' in clinical diagnostics had been taking into account. Słowa kluczowe: nowotwór, mutacja, geny supresorowe nowotworów, protoonkogeny, geny naprawy, geny pro- i antyapoptotyczne Key words: neoplasm, mutation, suppressor genes, protooncogenes, repair genes, pro- and antyapoptotic genes

2 2 Liczba zachorowań i zgonów z powodu chorób nowotworowych w Polsce stanowi istotny problem natury medycznej i społecznej. W latach 80. współczynnik zgonów wynosił 182,7; w połowie lat 90. wzrósł do 205,2 osiągając w 1999 r. wartość 216,1. Wśród przyczyn zgonów nowotwory ustępują miejsca jedynie chorobom układu krążenia (24). Większość chorób nowotworowych stanowią nowotwory występujące sporadycznie. Nowotwory uwarunkowane genetycznie i zespoły genetycznie predysponujące do rozwoju nowotworów stanowią około 5-10% wszystkich przypadków raka w populacji (33, 36, 40). Celem pracy jest przedstawienie mutacji w protoonkogenach, genach supresorowych nowotworów, genach systemu naprawy błędnie sparowanych zasad oraz w genach pro- i antyapoptotycznych wykrywanych często w niektórych nowotworach uwarunkowanych genetycznie, zespołach predysponujących do rozwoju nowotworów oraz w niektórych nowotworach występujących sporadycznie (28, 33, 34, 36, 40). Rodziny genów oraz ich mutacje predysponujące do rozwoju nowotworów W warunkach prawidłowych procesy wzrostu i podziałów komórkowych w tkankach i narządach podlegają precyzyjnej regulacji. Na poziomie molekularnym procesy te wymagają koordynacji ekspresji genów z rodziny protoonkogenów, genów supresorowych nowotworów, genów systemu naprawy oraz genów pro- i antyapoptotycznych (7, 26, 34). Protoonkogeny Protoonkogeny warunkują kontrolę różnych szlaków metabolicznych i kolejnych faz proliferacji komórki. W warunkach prawidłowych niektóre z nich kodują czynniki wzrostowe, np. łańcuch czynnika wzrostowego płytek krwi PDGF (ang. platelet derived growth factor) kodowany przez protoonkogeny c-sis, inne kodują cząsteczki białek receptorowych. Receptory białkowe w błonie komórkowej pośredniczą w przenoszeniu sygnałów do wnętrza komórki, uczynniając grupy genów warunkujących swoistą odpowiedź na sygnał z zewnątrz. Inna grupa protoonkogenów koduje białka umiejscowione po wewnętrznej stronie błony komórkowej, które biorą udział w wytworzeniu energii potrzebnej, np. do proliferacji. Duża grupa protoonkogenów koduje enzymy fosforylujące inne białka (kinazy tyrozynowe i kinazy serynowo - treoninowe). Część protoonkogenów koduje czynniki transkrypcyjne, a niektóre z nich są niezbędne do prawidłowego rozwoju embrionalnego.

3 3 W następstwie mutacji protoonkogenów powstają onkogeny o zmienionej strukturze i/lub funkcji. Zmiana taka może prowadzić do zwiększenia ilości prawidłowego produktu białkowego lub wytworzenia zmutowanego białka o odmiennej funkcji (7, 26). Częstym typem mutacji są mutacje punktowe prowadzące do zastąpienia w białku kodowanym jednego aminokwasu przez inny (missense) lub powodujące powstanie kodonu stop, kończącego przedwcześnie translację. Następstwem tego jest skrócenie cząsteczki białka. Głębsze uszkodzenie struktury genów polegające na delecji jednego lub dwóch nukleotydów może spowodować błędny odczyt informacji genetycznej od miejsca delecji do końca genu. Powstałe białko będzie miało inną sekwencję aminokwasów, co prowadzi do zmiany lub utraty jego funkcji. Innym przykładem transformacji protoonkogenów w onkogeny jest tzw. insercja promotora. Proces ten polega na włączeniu w najbliższe sąsiedztwo genu silnych sekwencji promotorowych. Taki gen z dodatkowym promotorem będzie stale aktywny na skutek ciągłej stymulacji transkrypcji. Innym mechanizmem zaburzeń w strukturze protoonkogenu jest amplifikacja. Prawidłowo w diploidalnej komórce protoonkogeny występują w postaci dwóch alleli. W wielu nowotworach występuje zjawisko amplifikacji protoonkogenów, tzn. zwielokrotnienia liczby kopii genów o prawidłowej sekwencji, co zwiększa ilość produktu białkowego w komórce (7, 34, 39). Spotykane są również translokacje protoonkogenów, które polegają na przemieszczeniu genu z jego locus w danym chromosomie do innego chromosomu. Mutacje w protoonkogenach są mutacjami dominującymi. Jeżeli jeden z dwóch alleli genu ulegnie mutacji, to jego produkt dominuje funkcjonalnie nad produktem genu prawidłowego. Taka nadmierna stymulacja może prowadzić do rozregulowania cyklu komórkowego i następnie nowotworzenia. Z nielicznymi wyjątkami, nie spostrzega się przeniesienia takiej mutacji dominującej w obrębie onkogenów z rodziców na potomstwo. Dzieje się tak prawdopodobnie dlatego, że onkogeny spełniają główne funkcje w biologii komórki i jeśli zdarzy się, że w komórce jajowej lub w plemniku znajdzie się uszkodzony protoonkogen, to zarodek ginie we wczesnym okresie rozwoju (7, 39). Geny supresorowe Geny supresorowe nowotworów spełniają istotną rolę w złożonym systemie zabezpieczeń przed niekontrolowanym wzrostem. Ich produkty pełnią funkcję inhibitorów procesów proliferacji i różnicowania. Geny supresorowe nabierają właściwości onkogennych w wyniku

4 4 mutacji powodujących utratę ich funkcji. Są to najczęściej mutacje punktowe typu missense lub nonsense, opisywano również większe delecje (33). Mutacje w genach supresorowych są typu recesywnego, tzn. jeśli tylko jeden z dwóch alleli zostanie uszkodzony, to funkcja prawidłowego allela nie pozwala na ujawnienie się skutków takiej mutacji. Utrata aktywności supresorowej następuje w efekcie mutacji w obu allelach genu i określa się utratą heterozygotyczności - LOH (ang. loss of heterozygosity) (7, 26, 34). Przy braku supresji proliferacji wzrasta liczba podziałów komórkowych i równocześnie liczba błędów powstających podczas replikacji materiału genetycznego. Taka kumulacja błędów umożliwia wyselekcjonowanie klonu zdolnego do hiperproliferacji. Mutacje w genach supresorowych mogą zachodzić de novo podczas gametogenezy lub mogą zostać przekazane dziedzicznie z rodziców na potomstwo. Odziedziczenie mutacji w obrębie genów supresorowych związane jest ze skróceniem procesu transformacji nowotworowej nawet do kilku lat, podczas gdy zazwyczaj proces ten może trwać od kilkunastu do kilkudziesięciu lat (7, 26). Geny systemu naprawy błędnie sparowanych zasad Geny systemu naprawy błędnie sparowanych zasad - MMR (ang. mismatch repair) decydują o eliminacji zmian powstających w DNA zarówno na skutek błędów popełnianych przez enzymy biorące udział w replikacji, jak i w wyniku uszkodzeń spowodowanych czynnikami mutagennymi. Uszkodzenia tych genów mają wpływ na stabilność genomu, a pośrednio na cykl życiowy komórki. Ustalono, że pojedyncza mutacja w genie systemu naprawy będzie wpływać na powstanie mutacji w następnych genach naprawy DNA (26, 34). Rola systemu MMR polega na rozpoznawaniu i naprawie trzech rodzajów błędów: i) niewłaściwego sparowania pojedynczej pary zasad, ii) podstawień wywołanych chemicznie, iii) mutacji typu pętli. Na skutek błędnego włączenia przez polimerazę niekomplementarnego nukleotydu do nowej nici DNA, w podwójnej helisie powstaje wybrzuszenie. W przypadku podstawienia wywołanego chemicznie, polimeraza usiłuje syntetyzować nową nić na matrycy zawierającej zasadę zmodyfikowaną przez mutagen. Może wówczas powstać układ niekomplementarny, który zniekształci zarówno podwójną nić DNA, jak i zmieni zapis genetyczny nowej nici. Z mutacjami typu pętli mamy do czynienia wtedy, gdy polimeraza napotyka na nici matrycowej powtarzającą się sekwencję zasad, wówczas nowo syntetyzowana nić może zawierać błędy w sekwencji zasad.

5 5 Prawidłowe działanie systemu MMR zwiększa dokładność replikacji DNA o trzy rzędy wielkości, zmniejszając wskaźnik błędów do 1/10 10 par zasad, co daje ryzyko 1 2 błędów na każdy cykl replikacyjny DNA. Jeśli natomiast dojdzie do uszkodzeń w systemie MMR, liczba błędów zacznie wzrastać do setek, a nawet tysięcy na cykl podziałowy. Szczególnie istotne będą uszkodzenia genów mających wewnątrz regionu kodującego sekwencję powtarzalną (mikrosatelity). Podatność tych genów na mutacje, określana jest jako niestabilność mikrosatelitarna (ang. microsatellite instability, MSI). Dodanie lub utrata jednej lub kilku zasad spowoduje zmianę ramki odczytu i pojawienie się kodonu stop. W konsekwencji powstaje skrócony, niefunkcjonalny produkt białkowy. Zmiany tego rodzaju obserwowane są w procesie rozwoju wielu typów nowotworów (5). Molekularne podłoże i wskaźniki genetyczne wybranych nowotworów Rak sutka i jajnika Rak sutka i jajnika może być uwarunkowany wiekiem, stylem życia, stanem hormonalnym, ekspozycją na promieniowanie jonizujące, działaniem niektórych leków (12). Obecnie zwraca się uwagę na rodzinną skłonność do zachorowań na nowotwór sutka, jajnika i trzonu macicy. Wśród uwarunkowań genetycznych znaczenie mogą mieć zarówno defekty w określonych genach, jak i heterozygotyczne nosicielstwo uszkodzeń w genach systemu MMR. Występowanie rodzinnego raka sutka wiązane jest z uszkodzeniem genu BRCA1 (ang. breast cancer gene 1), zlokalizowanego w chromosomie 17. Mutacje w tym genie stwierdzane są w 60% dziedzicznych raków sutka (31). Dane statystyczne wskazują, że rak sutka rozwija się u około 85% kobiet mających mutacje w genie BRCA1, w 60% przypadków istnieje ryzyko rozwoju nowotworu w drugiej piersi oraz w 63% - ryzyko rozwoju raka jajnika. Mężczyźni będący nosicielami mutacji w genie BRCA1 nie wykazują zwiększonej skłonności do zachorowania na nowotwory sutka, niemniej jednak możliwe jest przekazanie zmutowanego genu potomstwu (34). Inny gen mający związek z rozwojem raka sutka, zlokalizowany w chromosomie 13, określono jako BRCA2 (ang. breast cancer gene 2). Dziedziczny rak sutka uwarunkowany mutacjami w genie BRCA2 stanowi 35% wszystkich stwierdzanych przypadków. Mutacje w tym genie predysponują do rozwoju raka sutka zarówno u kobiet, jak i u mężczyzn (31). Ryzyko zachorowania przed 70. rokiem życia u kobiet wynosi 80%, natomiast u mężczyzn - 6%.

6 6 Stwierdzenie mutacji w obrębie genów BRCA1 i/lub BRCA2 w wielu krajach europejskich jest podstawą do profilaktycznej mastektomii. Rozwój raka sutka modyfikowany jest wpływem estrogenów i progesteronu, z dominującą rolą estrogenu pochodzenia jajnikowego (34). Uważa się, że zawartość receptorów dla estrogenów i progestagenów w komórkach raka sutka jest korzystnym czynnikiem prognostycznym (25). Prawdopodobny mechanizm interakcji w tkance nowotworowej opiera się na jej zapotrzebowaniu na estrogen do indukcji ekspresji genu dla receptora progesteronu (PR) (34). W 80% przypadków raka sutka związanych z mutacjami w genie BRCA1 obserwuje się słabe zróżnicowanie nowotworu i brak receptorów estrogenowych, podczas gdy w 80% raków sutka u nosicieli mutacji w genie BRCA2 wykrywa się ich obecność (18). W regulacji proliferacji komórek raka sutka istotną rolę odgrywają również hormony polipeptydowe i ich receptory receptor HER-2/neu i receptor dla naskórkowego czynnika wzrostu - EGFR (ang. epithelial growth factor receptor,). Pobudzenie receptora HER-2/neu o aktywności kinazy tyrozynowej powoduje stymulację podziałów komórki. Receptor ten kodowany jest przez gen c-erbb-2, którego amplifikacja stwierdzana jest u około 20-40% chorych na raka sutka. Efektem amplifikacji jest nadmierna ekspresja receptora, co wiąże się z szybszym wzrostem guza, rozwojem przerzutów i gorszym rokowaniem (18, 25). Nadekspresja receptora HER-2/neu wiązana jest z opornością na leczenie hormonalne i niektóre formy chemioterapii, jak również koniecznością zastosowania terapii wspomagającej (10, 18, 25). EGFR należy również do grupy transbłonowych receptorów o aktywności kinazy tyrozynowej. Jego nadekspresja stwierdzana jest u 35-60% chorych i wiąże się z bardziej agresywnym przebiegiem choroby i gorszym rokowaniem. W przypadkach równoczesnego występowania w tkance nowotworowej receptorów dla estrogenów oraz nadmiernej ekspresji EGFR obniża się prawdopodobieństwo uzyskania remisji po leczeniu hormonalnym (25). Nosiciele mutacji w genach BRCA1 i BRCA2 wykazują dużą skłonność do obustronnie występujących guzów sutka i jajnika w porównaniu z populacją ogólną (9, 31). Rak jajnika zajmuje czwarte miejsce pod względem liczby zgonów z powodu chorób nowotworowych u kobiet w Polsce. Wysoka śmiertelność z powodu raka jajnika wynika z faktu, że większość przypadków jest rozpoznawana w III lub IV stadium choroby, dla których wskaźnik pięcioletniego przeżycia wynosi niecałe 30% w porównaniu z 95% w przypadkach rozpoznania choroby w I stadium (17, 29). W 50% rodzinnych przypadków raka jajnika i dziedzicznego raka sutka nie stwierdza się związku z mutacjami w genach BRCA1 i/lub BRCA2, co sugerowałoby występowanie mutacji w innych genach (31). Modyfikacja funkcji genów BRCA1 i BRCA2

7 7 może mieć związek z polimorfizmem genu RAD51. Polimorfizm w obrębie pojedynczych nawet nukleotydów wiąże się ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia raka sutka i obniżonym ryzykiem zachorowania na raka jajnika u nosicieli mutacji w genie BRCA2 (37). W wielu przypadkach raka sutka nie mających związku z mutacjami w genie BRCA1 i/lub BRCA2, rolę w procesie rozwoju raka odgrywają mutacje typu missense lub nonsense w genie ATM (1, 26). U kilkunastu procent do ponad 50% chorych na raka sutka stwierdza się mutacje w genie p53. Zdaniem większości badaczy nieprawidłowa funkcja tego genu wiąże się z gorszym rokowaniem (22, 25). Podobnie jak zmutowane białko P53, nasilenie apoptozy warunkuje produkt genu bax. Brak lub słaba ekspresja tego genu związana jest z opornością komórek raka na apoptozę. Wstępne dane sugerują, że obniżenie ekspresji genu bax powoduje wzrost oporności na cytostatyki. Korzystnym czynnikiem prognostycznym ma być natomiast nadmierna ekspresja genu bcl-2. Istnieje być może zależność pomiędzy prognostycznym znaczeniem ekspresji genu bcl-2, a stanem pachowych węzłów chłonnych (25). Analiza uwarunkowań molekularnych rodzinnego raka jajnika sugeruje znaczenie mutacji w obrębie kilku genów zlokalizowanych w chromosomie 3: genu glikozylazy 8 oksoguaniny DNA (OGG1), genu topoizomerazy 2 (TOP2B), genu czynnika związanego z p-300/cbp (PCAF) oraz genu z rodziny onkogenów ras (RAB5A). Uważa się, że uszkodzenia tych genów mogą być związane z procesem kancerogenezy, ale sugestia ta wymaga jeszcze potwierdzenia. Zainteresowanie budzą również geny supresorowe nowotworów: NOEY2, PTEN, OVCA1 i OVCA2, których mutacje mogą odgrywać zasadniczą rolę w kancerogenezie raków jajnika występujących sporadycznie (2, 31). Rak rdzeniasty tarczycy Rak rdzeniasty tarczycy - MTC (ang. medullary thyroid carcinoma) jest nowotworem złośliwym wywodzącym się z wytwarzających kalcytoninę komórek C tarczycy. Dziesięcioletnie przeżycie całkowite zależy od wielkości guza i sięga około 70-85%, a w przypadku przerzutów do węzłów chłonnych obniża się do 50-60%. W około 25% przypadków MTC jest uwarunkowany genetycznie i związany z mutacjami protoonkogenu RET w linii zarodkowej (15, 39). Występuje jako rodzinny rdzeniasty rak tarczycy - FMTC (ang. familial medullary thyroid carcinoma) lub stanowi część zespołu mnogiej gruczolakowatości wewnątrzwydzielniczej typu 2 - MEN (ang. multiple endocrine neoplasia type 2). W obrębie zespołu MEN wyróżnia się odmianę 2A i 2B. U wszystkich chorych z

8 8 zespołem MEN2A rozwija się rak rdzeniasty tarczycy, ponadto u około 50% chorych powstają guzy części rdzennej nadnerczy (ang. phaeochromocytoma), a u około 5-10% chorych dochodzi do rozrostu lub gruczolaków przytarczyc. W zespole MEN2B rak rdzeniasty tarczycy rozwija się bardzo wcześnie i ma bardziej agresywny przebieg. W sytuacji, gdy rak rdzeniasty tarczycy stwierdzany jest przynajmniej u czterech członków rodziny i żaden z nich nie wykazuje innych objawów zespołu MEN2, rozpoznawany jest jako FMTC. Protoonkogen RET znajduje się w chromosomie 10 (10q11.2) i koduje białko receptora dla czynników wzrostowych. Ich funkcja polega na przekazywaniu sygnałów regulujących wzrost, proliferację i różnicowanie komórek. Receptory kodowane przez onkogen wysyłają ciąg sygnałów proliferacyjnych do cytoplazmy komórki nawet wówczas, gdy brak jest odpowiadających im czynników wzrostowych. Opisana sekwencja zdarzeń stanowi fazę inicjacji wieloetapowego procesu, jakim jest proces nowotworowy (15, 39). Wszystkie poznane mutacje są mutacjami typu missense i prowadzą do podstawienia cysteiny innym aminokwasem. Mutacje te znajdowane są u 86% chorych z FMTC i u 97% chorych z zespołem MEN2A. Ponadto opisano również delecję i delecję połączoną z insercją w obszarze bogatym w cysteiny. W kilku rodzinach obciążonych FMTC opisano ponadto mutacje niezwiązane z kodonami cysteinowymi. Prawie wszystkie dotychczas opisane przypadki MEN2B zawierają natomiast mutację prowadzącą do zastąpienia treoniny metioniną (15, 39). W przypadku osób z rozpoznanym MTC, u których stwierdzono mutację w protoonkogenie RET, badania genetyczne członków ich rodzin pozwalają zdiagnozować osoby obciążone dziedziczną skłonnością do raka rdzeniastego tarczycy. Jednocześnie osoby nieobciążone mutacją, jak również ich potomstwo wyłączane są z dalszych badań w kierunku MTC (15, 40). Sporadycznie występujący MTC uwarunkowany jest mutacjami somatycznymi protoonkogenu RET. Mutację taką stwierdzano w około 44% przypadków sporadycznego MTC oraz w zespole MEN2B. Ponadto somatyczne mutacje tego genu stwierdzane są w około 40% przypadków raka brodawkowatego tarczycy - PTC (papillary thyroid carcinoma). Protoonkogen RET jest wówczas aktywowany w wyniku rearanżacji chromosomowych, które powodują przyłączenie do niego końcowych regionów innych genów, dając w efekcie zmutowane geny, odpowiednio: RET/PTC-1, RET/PTC-2, RET/PTC-3 (15, 39, 40). Rak jelita grubego

9 9 Rak jelita grubego należy do najczęściej występujących nowotworów złośliwych. W populacji polskiej i w wielu krajach na świecie zajmuje drugie miejsce pod względem częstości występowania zarówno wśród kobiet (po raku sutka), jak i wśród mężczyzn, po raku płuc (19, 28, 32). Do grupy zwiększonego ryzyka zachorowania należą rodziny z rzadkimi zespołami uwarunkowanymi genetycznie, jak zespół rodzinnej polipowatości jelita grubego - FAP (ang. familial adenomatous polyposis) oraz niezwiązany z polipowatością dziedziczny rak jelita grubego - HNPCC (ang. hereditary nonpolyposis colorectal cancer). Wprawdzie zespoły te odpowiadają łącznie za 5% raków jelita grubego, ale określenie mutacji w zespołach dziedzicznych ma istotne znaczenie dla zrozumienia uwarunkowań genetycznych wszystkich innych przypadków. W zespole FAP udowodniono znaczenie mutacji genu APC (ang. adenomatous polyposis coli) w komórkach linii zarodkowej. Gen APC, zlokalizowany w chromosomie 5 (5q21-22), koduje wielofunkcyjne białko, biorące udział w procesach proliferacji i adhezji komórkowej (5, 11, 16, 30). W badaniach klinicznych zaobserwowano, że wystąpienie kodonu stop przed kodonem 157 powoduje zmniejszenie liczby polipów i łagodny przebieg choroby. Klasyczny przebieg polipowatości z licznymi polipami ma miejsce w przypadku wystąpienia sygnału stop między kodonami 169 a Mutacje występujące między kodonami 1403 i 1587 współistnieją z nasilonymi objawami pozajelitowymi. Mutacje genu APC w końcu 3 dają zróżnicowany obraz przebiegu choroby zarówno pod względem liczby polipów, jak i objawów pozajelitowych (27). Ponadto w jego obszarze wyróżniono region o podwyższonej częstości występowania mutacji - MCR (mutation cluster region), który obejmuje kodony W regionie tym występuje 23% wszystkich mutacji w linii zarodkowej. Większość (98%) mutacji to delecje lub insercje kilku par zasad oraz substytucje, prowadzące do skrócenia produktu białkowego. Charakterystyczna jest utrata heterozygotyczności w genie APC, powstająca w wyniku mutacji somatycznej w drugim allelu tego genu (27). W schemacie genetycznych uwarunkowań FAP i w około 85% sporadycznych przypadków raka jelita grubego po utracie heterozygotyczności (LOH) genu APC zwykle w ciągu ponad dwudziestu lat następuje delecja chromosomalnych fragmentów innych kluczowych genów. Uszkodzeniu ulega często gen K ras, co jest przyczyną pobudzenia komórek do wzmożonej proliferacji. Mutacje w jego obrębie stwierdzano w 50-70% przypadków nowotworów na wczesnym etapie rozwoju. Dlatego ich wykrywanie może służyć jako marker wczesnej detekcji oraz jako marker o znaczeniu prognostycznym (11, 13, 28, 33, 36, 38). W następnym etapie ulega uszkodzeniu gen MCC (ang. mutated in colorectal

10 10 cancer), co prowadzi do dysplazji i powstania gruczolaka stopnia pierwszego. Następnie dochodzi do delecji genu DCC (ang. deleted in colorectal cancer). Utratę heterozygotyczności tego genu obserwowano w 13% małych gruczolaków, w 47% dużych gruczolaków i w 73% raków okrężnicy. DCC koduje związane z błoną białkoodpowiedzialne za adhezję komórek. Jego modyfikacja warunkuje utratę właściwości adhezyjnych komórek nowotworowych. W dalszej kolejności następuje utrata funkcjonalności produktu genu p-53, co umożliwia rozwój gruczolakoraka. Mutacje w genie p-53 pojawiają się na późnym etapie transformacji gruczolaka do gruczolakoraka jelita grubego. Mutacje genu p53 wykrywane są w około 80% raków jelita grubego, przy czym częstość mutacji znacznie wzrasta wraz z wiekiem chorych. W wielu badaniach wykazano związek pomiędzy mutacjami w tym genie, a gorszą prognozą, jednak ostatecznie wpływ mutacji genu p53 na przeżycie pozostaje tematem kontrowersyjnym (4, 5, 7, 11, 13, 26, 33, 38). Około 70% chorych z gruczolakorakami jelita grubego posiada również zmutowany allel genu K-ras. Uważa się, że mutacje genu APC w linii zarodkowej można przyjąć za marker wczesnej detekcji, ponieważ prawie u 100% nosicieli mutacji rozwija się rak jelita grubego. Ponadto mutacje w tym genie pojawiają się w 60% przypadków raka jelita grubego jako najwcześniejsza zmiana genetyczna promująca progresję nowotworu (27, 33). HNPCC odpowiada za 5-15% przypadków raka jelita grubego. W zespole tym oraz w około 15% przypadków sporadycznie występujących raków jelita grubego, licznym mutacjom w obrębie genomu sprzyja utrata funkcji któregoś z genów naprawy DNA. W szczególności mutacje genów hmsh2 (ang. human muts homologue 2) i hmlh1 (ang. human mutl homologue 1) w linii germinalnej, odpowiadają za około 50% wszystkich przypadków HNPCC. Ryzyko rozwoju raka jelita grubego wynosi 100% dla nosicieli mutacji w genach systemu MMR (4, 5, 23, 35, 38, 41). Mutacje w genach systemu MMR powodują utratę, a w najlepszym przypadku zaburzenie ich funkcji, co prowadzi do powstania MSI. Powstała niestabilność mikrosatelitarna powoduje gromadzenie mutacji w obrębie całego genomu, co stanowi podłoże molekularne rozwoju nie tylko znacznej części szlaku HNPCC i około 15% nowotworów jelita grubego występujących sporadycznie, ale także innych nowotworów złośliwych. Wykrywanie MSI może służyć jako marker wczesnej detekcji zmian w rozwoju HNPCC (33, 35). Rzadkie zespoły uwarunkowane genetycznie skojarzone z rozwojem raka jelita grubego są przyczyną około 2-5% wszystkich przypadków zachorowań na ten nowotwór. Przypadki sporadycznie występującego raka jelita grubego mają charakter losowy i nie wykazują cech sugerujących uwarunkowania dziedziczne (5, 7). Według najnowszych badań,

11 11 dla inicjacji sporadycznego nowotworu jelita grubego nie musi wystąpić LOH w genie APC. W połowie sporadycznych nowotworów, w których nie zaobserwowano zmian w APC, powstanie nowotworu związane jest z heterozygotycznymi mutacjami w genie -kateniny - CTNNB1. Powodują one wyłączenie regulacyjnej funkcji genu APC, kumulację -kateniny z obserwowaną następnie ekspresją genu myc i rozwojem nowotworu jelita grubego. - katenina znajduje się za genem APC w szlaku kontaktowego hamowania wzrostu i w przypadku mutacji w tym genie proces nowotworowy przebiega niezależnie od stanu APC (27). Shivapurkar i wsp. (32) wykryli cztery odrębne regiony w chromosomie czwartym, które często ulegają delecji na wczesnym etapie rozwoju raka jelita grubego. Prawdopodobnie regiony te zawierają wiele genów supresorowych nowotworu, których inaktywacja odgrywa istotną rolę w patogenezie raka jelita grubego. Boland (5) zwraca uwagę na rolę zgrupowania genów MADR2 i DPC4, których mutacje są bardzo silnie związane z rakiem jelita grubego. Geny te kodują białka związane z wewnątrzkomórkowymi szlakami wrażliwymi na transformujący czynnik wzrostu - TGF- (ang. transforming growth factor ), który jest sygnałem hamującym wzrost komórki. Obydwa geny mogą więc funkcjonować jako supresory wzrostu guza. Rak trzustki Rak trzustki nie należy w Polsce do najczęstszych nowotworów złośliwych, jednak wskaźnik pięcioletnich przeżyć, który wynosi około 5,5%, plasuje go w grupie nowotworów o najgorszym rokowaniu (2, 3, 29). Zwiększone ryzyko zachorowania obejmuje ludzi w starszym wieku - 80% raków trzustki jest diagnozowanych w przedziale wiekowym lat. Zazwyczaj są to chorzy z przewlekłym zapaleniem trzustki oraz z chorobami dziedzicznymi. Za potencjalny marker molekularny rozwoju raka trzustki uważa się onkogen K-ras. Mutacje w genie K-ras są wykrywane w ponad 80% nowotworów trzustki. Pojawiają się one na wczesnym etapie rozwoju nowotworu (3, 28). Berndt i wsp. (3) wykryli mutacje w genie K-ras w ponad 90% gruczolakoraków trzustki i ich zdaniem wskazane byłoby wstępne badanie na obecność mutacji w tym genie wśród chorych ze zwiększonym ryzykiem zachorowania na raka trzustki. Wśród genów supresorowych nowotworów w rakach trzustki często stwierdza się inaktywację genów p16, p53 oraz DPC4. Sugeruje się, że wykrycie pojedynczego wskaźnika molekularnego na etapie wczesnej diagnostyki raka trzustki jest badaniem zbyt mało

12 12 specyficznym. Sensownym wydaje się wykrywanie mutacji w genach: p16, p53, DPC4 i K- ras. Wykrycie komórek nowotworowych na wczesnym etapie procesu nowotworowego może poprawić prognozę w przypadku raka trzustki, zwiększając wskaźnik pięcioletniego przeżycia do ponad 20% (3, 5). Rak płuca Rak płuca jest obecnie jednym z najczęściej występujących nowotworów złośliwych (29). W ciągu ostatnich 60 lat zaobserwowano trzydziestokrotny wzrost zapadalności w większości krajów świata. Występuje najczęściej po 40 roku życia i ma ścisły związek z paleniem tytoniu. Rak płuc jest chorobą o prawie 90-procentowej śmiertelności, 80% chorych umiera w ciągu pierwszego roku od rozpoznania. Chorzy z nieznacznym stopniem zaawansowania nowotworu stanowią około 20% wszystkich wykrywanych przypadków (2, 20). Za rozwój i progresję raka płuc odpowiadają złożone zmiany na poziomie genów. W większości zmiany dotyczą genów biorących udział w regulacji cyklu komórkowego. Uwaga skupiona jest na genach supresorowych nowotworów: p53 i p16 oraz protoonkogenach: K-ras, H-ras i N-ras (20, 21). W surowicy chorych na raka płuca pojawiają się przeciwciała przeciwko p53, prawdopodobnie w następstwie nagromadzenia zmutowanego białka P53 w komórkach nowotworowych. W badaniach przeprowadzonych w ostatnich latach mutacje w genie p53 stwierdza się w 20-60% przypadków raka płuc. Niektórzy autorzy zwracają uwagę na związek mutacji w tym genie z gorszym rokowaniem. Znaczenie mutacji opisano w przypadkach raka niedrobnokomórkowego płuca. Mutacje w genie p53 stwierdzono u 49% badanych i ich obecność skojarzona była z gorszym rokowaniem. Wykazano, że zmniejszenie ekspresji genu p53 może odgrywać rolę w poprawie przeżywalności chorych z niedrobnokomórkowym rakiem płuca po leczeniu operacyjnym, choć nie wszystkie obserwacje potwierdzają taką zależność (20, 21). W 10-40% przypadków raka niedrobnokomórkowego płuca stwierdza się również mutacje punktowe i delecje w obrębie genu p16. Postuluje się znaczącą rolę mechanizmu hipermetylacji promotora genu p16 w procesie nowotworzenia. Zmetylowane regiony DNA stają się podatne na mutacje, a sam proces metylacji wiąże się z wyciszeniem ekspresji i inaktywacją genów. Wykazano, że inaktywacja genu p16 spowodowana metylacją jest wczesną i prawdopodobnie decydującą zmianą w rozwoju nowotworów płuc. Ponadto metylację genu p16 stwierdzano w komórkach nabłonkowych znajdujących się w powietrzu wydychanym u chorych o zwiększonym ryzyku rozwoju raka płuca. Obserwacja ta może

13 13 stanowić podstawę wczesnej diagnostyki molekularnej nowotworów układu oddechowego (21). Stopień ekspresji genów H-ras, K-ras i N-ras koreluje z ciężkością przebiegu choroby i jest niekorzystnym markerem prognostycznym. U chorych z niedrobnokomórkowym rakiem płuca, leczonych operacyjnie, ze stwierdzoną ekspresją genów z rodziny ras, notowano przeżywalność niższą niż u chorych ras-negatywnych (20). W przebiegu raka drobnokomórkowego płuca Shivapurkar i wsp. (32) wykazali obecność regionów często podlegających delecji w obrębie chromosomu 4. Ponadto Pławski i wsp. (27) zwracają uwagę na rolę utraty heterozygotyczności w obrębie genu APC w rozwoju raka płuca. Zmiany na poziomie genów w rzadko występujących nowotworach złośliwych Rak przewodów żółciowych i pęcherzyka żółciowego Rak przewodów żółciowych - BDC (ang. biliary duct carcinoma) i pęcherzyka żółciowego - GBC (ang. gall bladder carcinoma) występuje stosunkowo rzadko, jednak charakteryzuje się złym rokowaniem (2, 29). Hidaka i wsp. (14) badali utratę heterozygotyczności genów zaangażowanych w proces nowotworowy. BDC podzielono na dwa typy w zależności od obecności komórek poliploidalnych w nacieku lub ich braku. U chorych, u których stwierdzono obecność takich komórek, w 73% przypadków występowała utrata heterozygotyczności w obrębie genu APC. Utratę heterozygotyczności w 63% stwierdzano dla genu p16, w 55% dla genu p53, a dla genu DPC4 tylko w 20%. W grupie chorych z typem BDC niezawierającym komórek poliploidalnych utrata heterozygotyczności genu APC dotyczyła tylko 26% badanych, a genu DPC4-18%. W obrębie genu p16 LOH stwierdzano u 59% badanych, natomiast dla genu p53 u 50%. Mutacje punktowe w obrębie genu K-ras wykryto u 25% chorych z guzem poliploidalnym i u 27% chorych z typem niepoliploidalnym raka. Znamienne statystycznie różnice pomiędzy dwoma badanymi typami BDC dotyczyły tylko utraty heterozygotyczności w obszarze genu APC. Hidaka i wsp. (14) wnoszą, że zjawisko to może mieć ścisły związek ze wzrostem guza typu poliploidalnego w przebiegu raka przewodów żółciowych. W przypadkach raka pęcherzyka żółciowego LOH z podobną częstością stwierdzano w genach p16 i p53. Wyraźne różnice dotyczyły natomiast LOH w obrębie genów APC i DPC4.

14 14 Siatkówczak Siatkówczak jest nowotworem wieku dziecięcego i może obejmować jedną lub obydwie gałki oczne. Za rozwój nowotworu odpowiadają uszkodzenia genu Rb1 (ang. Retinoblastoma), należącego do rodziny genów supresorowych nowotworów. Uszkodzenie genu Rb1 w linii germinalnej sprawia, że już w obrębie zygoty znajduje się jeden uszkodzony allel genu Rb1. W okresie życia płodowego następuje uszkodzenie drugiego allela genu Rb1, prowadzące do całkowitego zniesienia jego funkcji. W takich przypadkach obustronny siatkówczak rozwija się szybko po urodzeniu. Na 100 urodzin w rodzinach obciążonych genetycznie, 95 dzieci choruje na siatkówczaka w postaci dwugałkowej, natomiast dziecko z niedziedzicznym jednostronnym siatkówczakiem trafia się raz na urodzin. Uszkodzenie jednego allela Rb następuje albo w życiu płodowym, albo we wczesnym okresie noworodkowym. Do rozwoju choroby prowadzi uszkodzenie drugiego allela w okresie rozwoju siatkówki (7, 8). Rak przełyku Rak przełyku cechuje się znacznym wzrostem zachorowalności w ostatnich 10 latach. Ponad połowę wszystkich przypadków stanowi gruczolakorak przełyku Barretta - BEAd (ang. Barret s esophagus associated adenocarcinoma). Pięcioletnie przeżycie notowane jest tylko w 25% przypadków. Wydaje się, że adekwatnym wskaźnikiem prognostycznym jest gen HER2/neu. Jego nadekspresję stwierdzono w 73% przypadków BEAd. Ocena amplifikacji genu wydaje się być pomocnym i niezależnym czynnikiem prognostycznym. Nadekspresja genu HER2/neu wiąże się z gorszym rokowaniem nie tylko w gruczolakorakach przełyku, ale również w rakach sutka, prostaty, żołądka i macicy (6). Nerwiak zarodkowy współczulny Nerwiak zarodkowy współczulny (ang. Neuroblastoma) cechuje zwiększona amplifikacja genu n-myc i c-myc. Obserwowana jest korelacja tego zjawiska z progresją nowotworu i gorszym rokowaniem. Przyjmuje się, że jeżeli liczba kopii genu n-myc przekracza 10, należy zastosować bardziej radykalne metody leczenia. Opisano przypadek, w którym wykryto 1200 kopii genu c-myc (7). Podsumowanie

15 15 Rozwój nowotworu złośliwego jest procesem złożonym i wieloetapowym. Wymaga wystąpienia kolejnych mutacji w protoonkogenach, genach supresorowych nowotworów i genach naprawy DNA, z których każda przyspiesza rozwój nowotworu. W wyniku mutacji dochodzi do utraty kontroli procesów proliferacji, adhezji międzykomórkowej, ekspresji enzymów trawiących błonę podstawną i przerzutów, jak również przeżycia w innej lokalizacji (5, 34). Pomimo intensywnego rozwoju metod leczenia chorób nowotworowych, wskaźniki wyleczenia i 5-letniego przeżycia nie są satysfakcjonujące (25). Nadzieję na skuteczną modyfikację leczenia budzą badania nad doskonaleniem metod diagnostycznych, opartych na wynikach badań molekularnych, które pozwoliłyby na wczesne rozpoznanie choroby nowotworowej i podjęcie skutecznych działań zapobiegających jej rozwojowi (4, 6, 8, 12, 15, 16, 21, 22, 28, 33). PIŚMIENNICTWO 1. Angele S. i wsp.: What do we know about ATM protein expression in breast tissue? Bull Canc., 2001, 88, 7, Bailar J., Gornik H.: Cancer undefeated. N. Engl. J. Med., 1997, 336, 22, Berndt Ch. i wsp.: K-ras mutations in stools and tissue samples from patients with malignant and nonmalignant pancreatic diseases. Clin. Chem., 1998, 44, 10, Bocker Edmonston T. i wsp.: Colorectal carcinomas with high microsatellite instability: defining a distinct immunologic and molecular entity with respect to prognostic markers. Hum. Pathol., 2000, 31, Boland C.: Genetyczne uwarunkowania raka jelita grubego. Medycyna po dyplomie, 1999, 8, 2, Brien T. i wsp.: HER-2/neu gene amplification by FISH predicts poor survival in Barrett s esophagus-associated adenocarcinoma. Hum. Pathol., 2000, 31, Chorąży M.: Molekularne aspekty kancerogenezy. Nowotwory, 1997, 47, Dundar M. i wsp.: Detection of mutations in the Rb1 gene by single strand conformation polymorphism (SSCP) analysis, amplification mismatch detection (AMD) analysis and polymerase chain reaction sequencing. Proc. Natl. Sci. Counc. Repub. China B., 2001, 25, 3,

16 16 9. Einbeigi Z. i wsp.: A founder mutation of the BRCA1 gene in Western Sweden associated with a high incidence of breast and ovarian cancer. Eur. J. Canc., 2001, 37, 15, Emi Y. i wsp.: Metastatic breast cancer with HER-2/neu - positive cells tends to have a morbid prognosis. Surgery, 2002, 131, 1-2, Fujimori T. i wsp.: Precancerous lesions of the colorectum. J. Gastroenterol., 2001, 36, Górnaś M.: Rak sutka - rys kliniczny. Omówienie podstawowych metod diagnostycznych i terapeutycznych. Klinika, 1996, 3, 8, Halaschek-Wiener J. i wsp.: A novel Ras antagonist regulates both oncogenic Ras and the tumor suppressor p53 in colon cancer cells. Mol. Med., 2000, 6, 8, Hidaka E. i wsp.: Genetic alterations and growth pattern in biliary duct carcinomas: loss of heterozygosity at chromosome 5q bears a close relation with polyploid growth. Gut, 2001, 48, Jarząb B. i wsp.: Wczesna diagnostyka zespołu mnogiej gruczolakowatości wewnątrzwydzielniczej typu 2 poprzez analizę genetyczną germinalnych mutacji protoonkogenu RET. Polish J. Endocrinol., 1999, 50, 2-4, Kapitanović S. i wsp.: Submerged gel electrophoresis on Spreadex gels - a new method for APC gene mutation detection. J. Mol. Med., 2001, 79, Kim J. i wsp.: Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. Jama, 2002, 287, 13, Kuter I.: Breast cancer. The Oncologist, 2001, 6, Landis S. i wsp.: Cancer statistics CA Cancer J. Clin., 1998, 48, 1, Ławicki S. i wsp.: Markery nowotworowe przydatne w diagnostyce i monitorowaniu raka płuca. Post. Hig. Med. Dośw., 2002, 56, 1, Niklinska W. i wsp.: New molecular approaches to lung cancer: biological and clinical implications of P53, P16 and K-RAS studies. Folia Histochem. Cytobiol., 2001, 39, 2, (tu tez dobrze, bo chodzi prawdopodobnie o produkty bialkowe) 22. Norberg T. i wsp.: Enzymatic mutation detection method evaluated for detection of p53 mutations in cdna from breast cancers. Clin. Chem., 2001, 47, 5, Nystrom L. i wsp.: Functional analysis of MLH1 mutations linked to hereditary nonpolyposis colon cancer. Genes Chrom. Canc., 2002, 33, 2, Ochrona zdrowia w województwie śląskim, Śląskie Centrum Zdrowia Publicznego w Katowicach. Ośrodek Analiz i Statystyki Medycznej. Katowice

17 Pieńkowski T.: Znaczenie ekspresji receptora HER-2, białek P53, BCL-2, BAX, stopnia proliferacji i zawartości receptorów dla estrogenów i progestagenów jako czynników prognostycznych i predykcyjnych u chorych na raka piersi. Nowotwory, 2002, 52, 1, (tu jest prawidlowo-mowa o bialkach) 26. Pławski A, Słomski R.: Geny supresorowe nowotworów. Post. Biol. Kom., 1998, 25, 10, Pławski A. i wsp.: Gen APC. Post. Biol. Kom., 2000, 27, 14, Prix L. i wsp.: Diagnostic biochip array for fast and sensitive detection of K-ras mutations in stool. Clin. Chem., 2002, 48, 3, Rocznik Statystyczny Ochrony Zdrowia Główny Urząd Statystyczny. Warszawa Scott R. i wsp.: Familial adenomatous polyposis: more evidence for disease diversity and genetic heterogeneity. Gut, 2001, 48, Sekine M. i wsp.: Localization of a novel susceptibility gene for familial ovarian cancer to chromosome 3p22-p25. Hum. Mol. Genet., 2001, 10, 13, Shivapurkar N. i wsp.: Deletions of chromosome 4 occur early during the pathogenesis of colorectal carcinoma. Hum. Pathol., 2001, 32, Srivastava S. i wsp.: Biomarkers for early detection of colon cancer. Clin. Canc. Res., 2001, 7, Szczylik C.: Molekularne przyczyny powstawania nowotworów ze szczególnym uwzględnieniem raka piersi. Klinika, 1996, 3, 8, Thomas H.: Genetic instability in colorectal cancer. Gut, 1998, 43, 4, Traverso Giovanni B. i wsp.: Detection of APC mutations in fecal DNA from patients with colorectal tumors. N. Engl. J. Med., 2002, 346, 5, Wang W. i wsp.: A single nucleotide polymorphism in the 5 untranslated region of RAD51 and risk of cancer among BRCA1/2 mutation carriers. Canc. Epidemiol. Biomarkers Prev., 2001, 10, 9, Wheeler J. i wsp.: An insight into the genetic pathway of adenocarcinoma of the small intestine. Gut, 2002, 50, Wiench M., Jarząb B.: Protoonkogen RET: rola w fizjologii i patologii. Polish J. Endocrinol., 1999, 50, 1-4, Wiench M. i wsp.: Analiza genetyczna rodziny obciążonej zespołem mnogiej gruczolakowatości wewnątrzwydzielniczej typu 2A. Nowotwory, 1998, 48,

18 Yuan Z. i wsp.: Polymorphisms and HNPCC: PMS2-MLH1 protein interactions diminished by single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat., 2002, 19, 2, Otrzymano: 1 lipca 2003 r. *Adres do korespondencji: Katarzyna Gawron, Katedra i Zakład Ogólnej Biologii Lekarskiej ŚAM w Zabrzu, Zabrze, ul. Jordana 19, katarzyna.gawron1@wp.pl