(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2014/17 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/34 ( ) C12N 15/861 ( ) A61K 39/235 ( ) A61K 48/00 ( ) A61P 35/00 ( ) A61P 37/02 ( ) A61K 35/76 ( ) C12N 7/00 ( ) A61K 38/19 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Konstrukcja onkolitycznego rekombinanta adenowirusa swoiście eksprymującego czynnik immunomodulujący GM-CSF w komórkach nowotworowych i jego zastosowania (30) Pierwszeństwo: CN (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2007/13 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/08 (73) Uprawniony z patentu: Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd., Chengdu City, CN (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ZUNHONG KE, Chengdu City, CN (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Zofia Sulima SULIMA GRABOWSKA SIERZPUTOWSKA BIURO PATENTÓW I ZNAKÓW TOWAROWYCH SP.J. Skr. poczt Warszawa 10 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 SGS-5011/VAL EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy terapii genowej nowotworów. Konkretniej dotyczy on rekombinowanych onkolitycznych adenowirusów, które preferencyjnie replikują się w komórkach nowotworowych i eksprymują czynniki immunostymulatorowe do indukowania swoistych dla nowotworu odpowiedzi immunologicznych w organizmie ludzkim. Tło wynalazku [0002] Ponad stulecie upłynęło odkąd po raz pierwszy zastosowano wirusa do leczenia choroby nowotworowej. Lekarze zauważyli, że czasami pacjent został wyleczony po zakażeniu wirusem. Tej zagadki nie rozwiązano aż do początku lat 20-tych XX w. i od tamtej pory przyciągała uwagę naukowców i lekarzy klinicznych. Był to początek wirusoterapii (zastosowanie wirusów do leczenia nowotworu). Do lat 50-tych XX w. zbadano ponad 50 wirusów pod względem aktywności przeciwnowotworowej u zwierząt i ludzi (Mullen itanabe (2002) The Oncologist 7: ; McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1: ). W 1956, dr Smith i jego zespół leczyli ponad 30 pacjentek z rakiem szyjki macicy lizatem komórek HeLa lub komórek KB, które zakażono 10 serotypami adenowirusów typu dzikiego przez wstrzyknięcie do guza, wstrzyknięcie do tętnicy wątrobowej lub wstrzyknięcie dożylne. Nie zaobserwowano żadnych ciężkich skutków ubocznych poza objawami grypy u większości pacjentów; z drugiej strony, nowotwory kilku pacjentek skurczyły się i były martwicze. Niestety, ze względu na ograniczenia wytwarzania i oczyszczania wirusów, pracy tej nie kontynuowano. Praca dr. Smitha zachęciła wielu naukowców do badania możliwości zastosowania wirusów do leczenia nowotworów (Chiocca EA (2002) Nature Review Cancer 2: ). [0003] Razem z postępem dokonanym w biologii molekularnej i inżynierii genetycznej, w szczególności, wraz z lepszym zrozumieniem wirusów w związku z człowiekiem, od końca ubiegłego wieku naukowcy zyskali możliwość genetycznego manipulowania genomem wirusowym, w tym skutecznego tworzenia mutantów wirusa, które swoiście replikują się w komórkach nowotworowych (McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1: ). Przykładowo, mutant G207 wirusa opryszczki swoisty dla glejaka (Martuza i in., (1991) Science 252: ), adenowirus Add11520 (Onyx-015), mutant adenowirusa preferencyjnie replikujący się w komórkach nowotworowych z uszkodzonym p53 (Bischoff i in., (1996) Science 274: ) i CV706, mutant adenowirusa swoisty dla komórek raka gruczołu krokowego (Rodriguez i in. (1997) Cancer Research 57: ). Praca ta stworzyła fundamenty dla utworzenia nowej dziedziny: wirusoterapii nowotworu. Obecnie ponad 20 wariantów wirusów jest poddawanych badaniom klinicznym (Mullen i Tanabe (2002) The Oncologist 7: ). [0004] Istnieje kilka podejść do wytwarzania onkolitycznych wirusów swoistych dla komórek nowotworowych. Jednym podejściem do wytwarzania wariantu wirusa, który selektywnie replikuje się w komórkach nowotworowych, jest zastosowanie elementów regulatorowych swoistych dla komórek nowotworowych, takich jak promotory i wzmacniacze do kontrolowania ekspresji zasadniczych genów wirusowych, na przykład genów E1A, E1B, E2 i E4 adenowirusa (DeWeese i in. (2001) Cancer Research 61: ). W wyniku tego podejścia, niezbędne geny wirusowe i ostatecznie replikacja wirusa byłaby pod kontrolą elementów regulatorowych swoistych dla komórek nowotworowych, takie elementy regulatorowe obejmują promotor i wzmacniacze swoistego antygenu gruczołu krokowego (PSA), promotor i wzmacniacze alfa-fetoproteiny, promotor ludzkiego E2F-1 itd. (McCormick F (2001) Nature Review Cancer 1:130-14).

3 [0005] Telomeraza jest ważnym enzymem do kontrolowania długości końca chromosomu komórek, zdolnym do regulowania długości końca chromosomu podczas procesu podziału komórki. Telomeraza składa się głównie z trzech części, przy czym gen odwrotnej transkryptazy RNA i telomerazy (htert), która ma aktywność katalityczną, kontroluje aktywność telomerazy, podczas gdy promotor htert decyduje o ekspresji i aktywności telomerazy. [0006] Kolejni naukowcy wskazali, że ta telomeraza nie ma lub ma bardzo niską aktywność w normalnych komórkach u dorosłych. (Kim N W i in. Science. 23 grudnia 1994 r.; 266(5193):2011-5; Shay J W i in. European Journal of Cancer 1997, 33; ), podczas gdy występuje wysoki poziom dostarczania w ponad 90% komórek nowotworowych (Hahn i Weinberg (2002) Nature Review Cancer 2: ; Shay i Wright (1996) Current Opinion Oncology 8:66-71). W oparciu o te cechy htert, naukowcy pomyślnie utworzyli kilka wektorów, w których promotor htert włączono do genomu wirusowego dla dostarczenia genu, co obejmuje ostatnio publikowane prace opisujące zastosowanie promotora htert dla warunkowego replikowania się onkolitycznych adenowirusów (Lanson i in. (2003) Cancer Research 63: ; Kawashima i in., (2004) Clinical Cancer Research 10: ; Kim i in. (2003) Oncogene 22: ; Irving i in. (2004) Cancer Gene Therapy 11: ). [0007] Istnieje kilka endogennych elementów regulatorowych w genomie adenowirusowym, które regulują ekspresję genów wirusowych, na przykład, promotor i wzmacniacz genu E1A, wśród tych endogennych elementów regulatorowych sekwencja wzmacniacza E1A nakłada się na wirusowy sygnał pakujący. Aby zminimalizować wpływ endogennych elementów regulatorowych na regulację heterologicznego promotora, naukowcy przenieśli sygnał pakujący na prawe ramię od natywnego miejsca na lewym końcu (Bristol i in. (2003) Molecular Therapy 7(6): ; Jakubczak i in. (2003) Cancer Research 63: ). Niestety, ten rodzaj przeniesienia wirusowego sygnału pakującego z natywnego miejsca na prawy koniec zdestabilizowało genom wirusowy, skutkując utworzeniem wielu mutantów wirusowych (WO 02/067861; ASGT 2003 Annual Meeting, Molecular Therapy). Zatem wspomniane powyżej przeniesienie wirusowego sygnału pakującego nie jest odpowiednim podejściem do zminimalizowania wpływu endogennych elementów regulatorowych. Jak zminimalizować wpływ endogennych regulatorów wirusowych na elementy heterologiczne i zapobiec niepożądanemu wytwarzaniu wielu mutantów wirusowych, z utrzymaniem stabilnego genomu wirusowego? [0008] W odniesieniu do poziomu ekspresji telomerazy u ludzi, podczas rozwoju embrionalnego i różnicowania, naukowcy również rozpoznali, że istnieje pewien poziom aktywności telomerazy w niektórych komórkach, w tym komórkach szyjki macicy, progenitorach i komórkach macierzystych (Wright i in. (1996) Development Genetics 18: ; Sharma i in. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: ; Kolquist i in. (1996) British Journal of Cancer 80: ; Tahara i in. (1999) Oncogene 18: ; Tanaka i in. (1998) American Journal of Pathology 153: ). Niski poziom aktywności ekspresji telomerazy zaniepokoił naukowców, gdy stosowali promotor htert do dostarczenia terapeutycznego genu w wektorze do terapii genowej lub do wytwarzania onkolitycznych adenowirusów swoistych dla komórek nowotworowych przez kontrolowanie niezbędnych genów wirusowych (Hahm WC (2004) Clinical Cancer Research10: ). Ze względu na niski poziom ekspresji telomerazy w niedocelowych komórkach, takich jak progenitory, onkolityczne adenowirusy kontrolujące promotor htert mogą intensywnie replikować się w komórkach progenitorowych, skutkując ciężkimi skutkami ubocznymi (Huang i in. (2004) Clinical Cancer Research 10: ; Hahn WC (2004) Clinical Cancer Research 10: ; Masutomi i in. (2003) Cell 114: ). Zatem zwiększenie swoistości dla komórek nowotworowych promotora htert jest jednym z kluczowych projektów w wytwarzaniu onkolitycznego adenowirusa z zastosowaniem promotora htert.

4 [0009] W kilku dokumentach omówiono wytwarzanie i zastosowanie onkolitycznych wektorów adenowirusowych. Li i in. (Cancer Research, 2001, 61, str ) ujawniają wariant wirusa swoistą dla raka wątrobowokomórkowego, CV890, który usuwa dalekie nowotwory wątroby człowieka po podaniu w połączeniu z doksorubicyną. Green i in. (Int. J. Cancer, 2003, 104, str ) ujawnili bicistronowy wektor adenowirusowy i jego zastosowanie do immunologicznego wzmocnienia cytotoksyczności indukowanej nitroreduktazą. Kawashima i in. (Clinical Cancer Research, 2004, 10, str ) skonstruowali wektor adenowirusa numer 5, w którym element promotora htert kieruje ekspresją genów E1A i E1B do wirusoterapii selektywnej względem replikacji. WO 03/ ujawnia sposób wzmacniania ekspresji spod promotora swoistego dla komórki, takiego jak htert, który może zapewnić sposoby terapii nowotworów. WO 02/ dotyczy onkolitycznych wektorów adenowirusowych i ich zastosowania w sposobach terapii genowej, które to wektory zawierają promotor reagujący na E2F. WO 2005/ dotyczy wektora do ekspresji hybrydowego genu adenowirusowego obejmującego sekwencję promotora swoistego dla tkanki, jak również jego zastosowań. W CN-A ujawniono rekombinowany adenowirus do ekspresji ludzkiego GM-CSF i jego zastosowanie do immunoterapii. W opisie patentowym US numer opisano wektory adenowirusowe, które nadeksprymują białko śmierci adenowirusa i których ekspresja jest korzystnie ograniczona do komórek eksprymujących telomerazę. W WO 96/09399 opisano chimeryczny adenowirus zdolny do transdukcji komórek ssaczych DNA, który to adenowirus może być użyteczny do leczenia chorób i zaburzeń genetycznych ssaków. Opis patentowy US numer dotyczy technik nieinwazyjnej terapii genowej ukierunkowanej do skóry, przy czym wektorem jest W kilku dokumentach omówiono wytwarzanie i zastosowanie onkolitycznych wektorów adenowirusowych. Li i in. (Cancer Research, 2001, 61, str ) ujawniają wariant wirusa swoisty dla raka wątrobowokomórkowego, CV890, który usuwa dalekie nowotwory wątroby człowieka po podaniu w połączeniu z doksorubicyną. Green i in. (Int. J. Cancer, 2003, 104, str ) ujawnili bicistronowy wektor adenowirusowy i jego zastosowanie do immunologicznego wzmocnienia cytotoksyczności indukowanej nitroreduktazą. Kawashima i in. (Clinical Cancer Research, 2004, 10, str ) skonstruowali wektor adenowirusa numer 5, w którym element promotora htert kieruje ekspresją genów E1A i E1B do wirusoterapii selektywnej względem replikacji. WO 03/ ujawnia sposób wzmacniania ekspresji spod promotora swoistego dla komórki, takiego jak htert, który może zapewnić sposoby terapii nowotworów. WO 02/ dotyczy onkolitycznych wektorów adenowirusowych i ich zastosowania w sposobach terapii genowej, które to wektory zawierają promotor reagujący na E2F. WO 2005/ dotyczy wektora do ekspresji hybrydowego genu adenowirusowego obejmującego sekwencję promotora swoistego dla tkanki, jak również jego zastosowań. W CN-A ujawniono rekombinowany adenowirus do ekspresji ludzkiego GM-CSF i jego zastosowanie do immunoterapii. W patencie US numer opisano wektory adenowirusowe, które nadeksprymują białko śmierci adenowirusa i których ekspresja jest korzystnie ograniczona do komórek eksprymujących telomerazę. W WO 96/09399 opisano chimeryczny adenowirus zdolny do transdukcji komórek ssaczych DNA, który to adenowirus może być użyteczny do leczenia chorób i zaburzeń genetycznych ssaków. Opis patentowy US numer dotyczy technik nieinwazyjnej terapii genowej ukierunkowanej do skóry, przy czym wektorem jest adenowirusowy wektor kodujący interesujący gen. W CN-A opisano onkolityczny adenowirus, który preferencyjnie zabija nowotworowe, ale nie normalne komórki, przy czym wektor korzystnie zawiera promotor reagujący na E2F. Opis patentowy US numer dotyczy wektorów, które mogą być wektorami adenowirusowymi, obejmującymi sekwencję kodującą transferazę glikozylową pod kontrolą transkrypcyjnego elementu kontrolnego swoistego dla nowotworu lub tkanki. WO 99/46371 dotyczy wektorów adenowirusowych zawierających geny proapoptotyczne i zastosowania takich wektorów w terapii nowotworów.

5 [0010] Adenowirusowy wektor kodujący interesujący gen. W CN-A opisano onkolityczny adenowirus, który preferencyjnie zabija nowotworowe, ale nie normalne komórki, przy czym wektor korzystnie zawiera promotor reagujący na E2F. Opis patentowy US numer dotyczy wektorów, które mogą być wektorami adenowirusowymi, obejmującymi sekwencję kodującą transferazę glikozylową pod kontrolą transkrypcyjnego elementu kontrolnego swoistego dla nowotworu lub tkanki. WO 99/46371 dotyczy wektorów adenowirusowych zawierających geny proapoptotyczne i zastosowania takich wektorów w terapii nowotworów. Streszczenie wynalazku [0011] W jednym aspekcie, niniejszy wynalazek dostarcza rekombinant, jak zastrzeżono w zastrzeżeniu 1. [0012] Onkolityczne adenowirusy swoiste dla komórek nowotworowych uzyskuje się poprzez połączenie onkolitycznego adenowirusa z elementem regulatorowym swoistym dla komórek nowotworowych metodą inżynierii genetycznej i rekombinant można skonstruować przez wprowadzenie promotora swoistego dla komórek nowotworowych o SEQ ID NO: 2 i genu regulatorowego odporności do genomu adenowirusa z wkorzystaniem technologii klonowania DNA, uzyskując w ten sposób połączoną sekwencję zdolną do replikacji w komórkach nowotworowych i ekspresji genu regulatorowego odporności w komórkach nowotworowych. [0013] W innym aspekcie, ten wynalazek dostarcza zastosowanie zastrzeżonego onkolitycznego rekombinanta adenowirusa do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu. [0014] W innym aspekcie, ten wynalazek dostarcza kompozycję farmaceutyczną zawierającą zastrzeżony rekombinant, np. jako lek do zapobiegania i/lub leczenia nowotworu. [0015] W innym aspekcie, wynalazek ten dostarcza promotor o sekwencji nukleotydowej SEQ ID NO: 2. [0016] Rekombinant według niniejszego wynalazku można stosować do kontrolowania adenowirusów w takim stopniu, że te adenowirusy replikują się jedynie w komórkach nowotworowych. Dzięki genetycznej modyfikacji promotora htert, rekombinant według wynalazku ma zasadniczo wzmocnioną swoistość promotora htert dla komórek nowotworowych. [0017] Onkolityczny rekombinant wirusa według wynalazku wykazujący swoistość dla komórek nowotworowych można otrzymać drogą inżynierii genetycznej genu czynnika immunostymulującego, który jest zdolny do indukowania swoistej odpowiedzi immunostymulującej ludzkiego organizmu względem komórek nowotworowych za pomocą replikującego genomu wirusowego swoistego dla komórek nowotworowych. Otrzymany rekombinant wirusa może selektywnie replikować się w określonej populacji komórek i może replikować się i rozprzestrzeniać w komórkach nowotworowych, a tym samym zabijać komórki nowotworowe, tak więc rekombinant można stosować do leczenia nowotworu i zapobiegania nowotworowi. [0018] W stanie techniki, konstrukcję i rozprzestrzenianie się warunkowo replikującego się onkolitycznego rekombinanta wirusa lub genetycznie modyfikowanych wektorów wirusowych prowadzi się w genetycznie modyfikowanych liniach komórkowych, takich jak linia komórkowa 293. Taka linia komórkowa eksprymuje adenowirusowe białka E1, aby dopełniać funkcję wektora adenowirusowego z delecją E1 z defektem replikacji lub warunkowo replikującego się onkolitycznego rekombinanta adenowirusa, w którym wirusowy E1 jest pod kontrolą regulatorowego elementu selektywnego względem komórek nowotworowych. Niestety, rekombinant wytwarzany w takiej linii komórkowej zazwyczaj zawiera pewną ilość adenowirusa typu dzikiego lub rekombinowanego (nazywanego adenowirusem kompetentnym pod względem replikacji, RCA). Powodem powstawania RCA w rekombinowanym produkcie jest to, że w wytwarzających komórkach, takich jak linia ko-

6 mórkowa 293 jest zawarta sekwencja genu adenowirusa; ta część sekwencji adenowirusa typu dzikiego ulegnie rekombinacji w komórce z adenowirusem z delecją E1 lub ulepszonym E1, skutkując albo adenowirusem typu dzikiego albo rekombinowanym adenowirusem. Taki produkt może nie spełniać wymagań i może powodować nieoczekiwane skutki uboczne związane ze względami bezpieczeństwa. Komórkę stosowaną do konstrukcji zastrzeżonego rekombinanta można wybrać tak, aby nie zawierała sekwencji genu adenowirusowego, a zatem można uniknąć RCA i rozwiązać problem bezpieczeństwa, jak wspomniano powyżej. [0019] W jednej postaci wynalazek dostarcza warunkowo replikujący się onkolityczny rekombinant adenowirusa, jak tu zastrzeżono, w którym białko kapsydu ulepszono, aby zwiększyć powinowactwo wiązania rekombinanta do komórek nowotworowych, co skutkuje wzrostem zakaźności rekombinanta względem komórek nowotworowych. Wiele ostatnich badań pokazało niską lub brak ekspresji receptora 5 adenowirusa (receptor wirusa coxsackie B i adenowirusa, CAR) w komórkach nowotworowych. Jednak wszystkie komórki nowotworowe eksprymują na wysokim poziomie CD46 (Shayakhmetov i in., Cancer Research 62: ). Kolejne badania wykazały, że receptorem dla adenowirusa serotypu 35 jest cząsteczka białka CD46 (Sirena i in. (2004) Journal of Virology 78(9): ). Zatem, proponujemy zastąpić główkę włókna o sekwencji białka w wirusowym rekombinancie adenowirusa serotypu 5 tą z adenowirusa serotypu 35, przy czym ta ostatnia jest zdolna do wiązania receptora białka CD46, w celu skonstruowania rekombinanta, który ma połączonego adenowirusa zdolnego do wiązania receptora. Uważa się, że taki rekombinant będzie miał lepszą zakaźność w szerszym zakresie komórek nowotworowych. [0020] Warunkowo replikującym się onkolitycznym wirusem według wynalazku może być którykolwiek z serotypów adenowirusa, w tym serotypu 5, 2, 35, 41 itd., korzystnie serotypu 5 lub ulepszony adenowirus. Przykładowo, rekombinant adenowirusa, w którym gen E1A i gen E1B połączono razem poprzez wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES, ang. internal ribosome entry site); rekombinant adenowirusa, w którym główkę włókna adenowirusa typu 5 zastąpiono tym adenowirusa serotypu 35; rekombinant adenowirusa, w którym sekwencję terminacyjną transkrypcji wprowadzono w dół od wirusowego ITR i miejsca pakującego, i w górę od promotora htert; adenowirus z usuniętą swoją sekwencją kodującą 10.4K, 14.5K i 14.7K w regionie E3. Ta sekwencja terminacyjna transkrypcji może kończyć transkrypcję genu za pośrednictwem jakiejkolwiek polimerazy RNA, tak jak wczesna sekwencja sygnałowa poli (A) SV40; tak że rekombinant adenowirusa ma usunięte jego sekwencje kodujące 10.4K, 14.5K i 14.7K we fragmencie E3. [0021] Ten element regulatorowy genu, który jest swoisty dla komórek nowotworowych jest ulepszonym promotorem htert o SEQ. ID NO. 2 i ten promotor ma miejsce wiązania dla czynnika transkrypcyjnego E2F-1. [0022] Tym elementem regulatorowym odporności może być jakikolwiek gen lub jego wariant, który może stymulować i indukować odpowiedź immunologiczną, wybrany spośród IL-2, IL-10, IL-12, IL-15, IL-24, IL-25, GM-CSF, G-CSF i INF-alfa, INF-beta, korzystnie GM-CSF, w tym ich postaci wydzielanych i związanych z błoną, jak również ich wariantów. [0023] Korzystnym rekombinantem adenowirusa według wynalazku jest taki rekombinant, w którym zasadniczym wektorem wirusowym jest taki ulepszony adenowirus, że w sekwencji adenowirusa, sekwencja terminacyjna transkrypcji jest wstawiona w dół od wirusowego ITR i miejsca pakującego, lecz w górę od promotora htert o SEQ ID NO. 2, genem immunostymulującym jest GM-CSF o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO. 3 (KH-901) lub będący związanym z błoną GM-CSF (KH-902). [0024] Innym korzystnym rekombinantem adenowirusa według wynalazku jest taki, w którym zasadniczym wektorem wirusowym jest taki ulepszony adenowirus, że w jego sekwencji, główka włókna jest z adenowirusa serotypu 35 zamiast tej z adenowirusa seroty-

7 pu 5 i elementem regulatorowym swoistym dla komórek nowotworowych jest promotor htert o sekwencji SEQ ID NO 2, a genem immunostymulującym jest GM-CSF (KH- 904), korzystnie GM-CSF związany z błoną (KH-905). [0025] W innym korzystnej postaci, gen E1A i gen E1B są połączone przez IRES, główka włókna jest z serotypu 35, element terminacyjny transkrypcji jest wstawiony w dół od ITR i miejsca pakującego, i w górę od promotora htert o SEQ ID NO. 2, przy czym genem immunostymulującym jest GM-CSF, korzystnie w jego postaci związanej z błoną. [0026] Innym korzystnym rekombinantem adenowirusa według wynalazku jest taki, w którym zasadniczym wektorem wirusowym jest taki ulepszony adenowirus, że w sekwencji adenowirusa, sekwencja terminacyjna transkrypcji jest wstawiona w dół od wirusowego ITR i miejsca pakującego, lecz w górę od promotora htert; adenowirus ma usuniętą jego sekwencję kodującą 0.4K, 14.5K i 14.7K w regionie E3; elementem regulatorowym swoistym dla komórek nowotworowych jest promotor htert o SEQ ID NO 2, genem stymulującym nowotwór jest GM-CSF, korzystnie GM-CSF związany z błoną (KH-903). [0027] Innym korzystnym rekombinantem wirusa według wynalazku jest taki, w którym sekwencja terminacyjna transkrypcji jest wstawiona w dół od wirusowego ITR i miejsca pakującego, i w górę od promotora htert i adenowirusowy gen E1A i gen E1B są połączone przez IRES, elementem regulatorowym swoistym dla komórek nowotworowych jest promotor htert o SEQ ID NO 2, a genem immunostymulującym jest GM-CSF (KH- 906). [0028] Rekombinanty adenowirusa według wynalazku obejmują, lecz nie wyłącznie, KH- 901, KH-902, KH-903, KH-904, KH-905 i KH-906, przy czym sekwencję KH-901 przedstawiono jako SEQ ID NO. 3, gdzie, 1) 1-103: adenowirusowy lewy ITR {adenowirus serotypu 5 o sekwencji przedstawionej w Genbank nr BK000408}; 2) : sekwencja pakująca adenowirusa i sekwencja wzmacniająca dla E1; 3) : sekwencja sygnałowa poli(a) SV40 i łącznik (sekwencja adenowirusa serotypu 5, z której usunięto nukleotydy 362 do 551); 4) : sekwencja genetycznie ulepszonego promotora htert i łącznika; 5) 812 do prawej: sekwencja adenowirusa obejmująca E1A, E1B, E2 itd.; 6) : immunostymulujący gen GM-CSF; 7) do prawej: sekwencja adenowirusa genu E4 i prawego końca; [0029] Sekwencja KH-900 jest podobna do sekwencji przedstawionej jako SEQ ID NO: 3, podczas gdy jego sekwencja promotora htert jest w typie dzikim bez transwersji zasad (należy odnieść się do SEQ ID NO. 1 i 2). Nie występuje sekwencja sygnałowa poli (A) SV40 między miejscem pakującym i promotorem htert. [0030] Sekwencja KH-902 jest podobna do KH-901, lecz immunostymulujący gen GM- CSF jest zastąpiony jego formą związaną z błoną o sekwencji przedstawionej w SEQ ID NO. 4. [0031] Sekwencja KH-903 jest podobna do KH-901, poza tym, że usunięto sekwencję kodującą 10.4Km 14.5K i 14.7K, przy czym usunięta sekwencja jest częścią genomu adenowirusowego od nukleotydu do Białka z tych sekwencji kodujących hamują odpowiedź immunologiczną, szczególnie odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem czynnika martwicy nowotworu (TNF). Zatem delecja tych regionów kodujących wzmocni ukierunkowane na nowotwór odpowiedzi immunologiczne indukowane przez warunkowo replikujące się onkolityczne adenowirusy. [0032] Sekwencja KH-904 jest podobna do KH-901, poza tym, że główka włókna jest zmieniona z adenowirusa serotypu 5 na serotyp 35, sekwencję przedstawiono w SEQ ID NO. 5. Ostatnie badania ujawniły, że wiele komórek nowotworowych nie eksprymuje receptorowego białka CAR adenowirusa serotypu 5, lecz eksprymuje na wysokim poziomie cząsteczkę CD46. Cząsteczka CD46 jest receptorem dla adenowirusa serotypu 35. Zatem

8 obecność główki włókna z adenowirusa serotypu 35 wzmocni zakaźność warunkowo replikujących się onkolitycznych rekombinantów adenowirusa. [0033] KH-905 jest podobna do KH-904 poza tym, że immunostymulujący gen GM-CSF zmieniono z postacie wydzielanej na postać związaną z błoną. [0034] KH-906 wytworzono z KH-901 przez zastąpienie endogennego promotora E1B wewnętrznym miejscem wejścia rybosomu (Li i in., (2001) Cancer Research 62; Zhang i in. (2002) Cancer Research 62: ). [0035] Dostarczono również sekwencję ulepszonego promotora htert o SEQ ID NO. 2, ten promotor ma miejsce wiązania dla czynnika transkrypcyjnego E2F-1. [0036] Wspomniany powyżej ulepszony promotor htert wytworzono następująco. Dwa startery zsyntetyzowano w oparciu o sekwencję promotora htert, jak przedstawiono na Figurze 1: A. 5'-GTCTGGATCCGCTAGCCCCACG-3' B. 5'-CGACCGGTGATATCGTTTAATTCGC-3' Promotor htert zamplifikowano drogą PCR z aktywowanym ludzkim genomowym DNA jako matrycą i przedstawionymi powyżej starterami. Warunki reakcji PCR są następujące: dla pierwszego cyklu, 94 C przez 5 minut dla denaturacji, 81 C przez 1 minutę dla przyłączania, 72 C przez 2 minuty dla wydłużania; dla każdego z następnych 35 cykli: 93 C przez 1 minutę dla denaturacji, 68 C przez 1 minutę dla przyłączania, 72 C przez 2 minuty dla wydłużania. Produkt PCR zanalizowano w żelu agarozowym i fragment promotora htert odzyskano dla potwierdzenia przez zsekwencjonowanie. Sekwencję potwierdzono jak opublikowano (Figura 1). DNA oczyszczonego fragmentu PCR wklonowano do wektora puc19. Sposobem mutagenezy opisanym przez Stratagene (ukierunkowana mutageneza), sekwencję promotora htert zmieniono na taką, jak przedstawiono na Figurze 2. [0037] Wynalazek ten zapewnia zatem ulepszony promotor htert o sekwencji SEQ ID NO. 2, który można uzyskać wspomnianym powyżej sposobem. [0038] W promotorze htert według wynalazku, nie ma konserwatywnych par zasad TATA, lecz występują dwie sekwencje podobne do kasety E CACGTG i 4 bogate w GC regiony wiążące Sp-I. Te konserwatywne sekwencje są krytyczne dla ekspresji telomerazy, ponieważ transkrypcja telomerazy jest regulowana poprzez promotor htert przez C- Myc/Max i Sp-I (Cong i in. (1999) Human Molecular Genetics 8(1): ; Kyo i in. (2000) Nucleic Acids Research 28(3): ). Wiele badań ujawniło, że Myc odgrywa ważną rolę w proliferacji i cyklach komórkowych, zatem wspomniana powyżej modyfikacja promotora htert będzie dalej wpływać na transkrypcję i ekspresję telomerazy. [0039] Aby zminimalizować aktywność promotora htert w normalnych komórkach, takich jak progenitor i aby zwiększyć jego selektywność względem komórek nowotworowych, zanalizowaliśmy szczegółowo miejsca wiązania czynnika transkrypcyjnego w promotorze htert przez modelowanie komputerowe. W oparciu o modelowanie komputerowe wykonaliśmy analizę serii z mutagenezy, wśród nich zidentyfikowaliśmy jednego mutanta, w którym czwarty Sp-I zmieniono na miejsce wiązania E2F-1, sekwencję zmieniono z `...TTTCCGCGGCCCCGGCC...' (Figura 1) na '...TTTCCGCGGCAACGCCC...' (Fig. 2). [0040] Badanie in vitro pokazało, że ulepszony promotor htert utrzymuje aktywność w komórkach nowotworowych i znacząco zmniejsza pobudzanie aktywności w normalnych komórkach. Zatem ulepszony promotor ma znacznie zmniejszoną aktywność transkrypcyjną w komórkach normalnych w tym w komórkach progenitorowych. Wykazano w doświadczeniu przejściowej transfekcji stosując gen reporterowy w komórkach nowotworowych, że ulepszony promotor htert ma aktywność około 5 do 10 razy wyższą niż ta promotora htert typu dzikiego, podczas gdy w normalnych komórkach ulepszony promotor htert ma znacznie zmniejszoną aktywność (Figura 6). Następnie skonstruowaliśmy warunkowo replikujący się onkolityczny adenowirus przez kontrolowanie niezbędne-

9 go genu wirusowego za pomocą ulepszonego promotora htert, otrzymany onkolityczny wirus nie jest toksyczny dla komórek macierzystych (Figura 7); zatem otrzymany onkolityczny adenowirus znacznie poprawia bezpieczeństwo do stosowania klinicznego. [0041] Ponieważ promotor E2F-1 jest aktywny w komórkach nowotworowych z uszkodzonym szlakiem prb/e2f/p16, stosowano go szeroko w terapii genowej, szczególnie w konstrukcji warunkowo replikującego się onkolitycznego adenowirusa (Parr i in. (1997) Nature Medicine 3(10): ; Jakubczak i in. (2003) Cancer Research 63: ; Bristol i in. (2003) Molecule Therapy 7(6): ). Ulepszony promotor htert ma nie tylko miejsca wiązania dla czynników transkrypcyjnych E2F-1, lecz także miejsca wiązania Sp-I i NF-1, które ma promotor E2F-1, zatem ulepszony promotor htert jest aktywny w komórkach nowotworowych, które mają zwiększoną ekspresję telomerazy i uszkodzony szlak Rb. Zatem ulepszony promotor htert jest aktywny w tych dwóch rodzajach komórek nowotworowych, lecz nie jest aktywny w normalnych komórkach, takich jak komórki macierzyste; reprezentuje to wysoką swoistość dla nowotworu. [0042] W jednej postaci wynalazek dostarcza warunkowo replikujący się onkolityczny rekombinant adenowirusa, jak tu zastrzeżono, w którym gen E1A i E1B są połączone wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu (IRES), a zatem kieruje transkrypcję dwóch ważnych genów E1A i E1B rekombinanta adenowirusa pod kontrolę ulepszonego promotora htert, taki jak KH-906. [0043] W kolejnej postaci wynalazek dostarcza onkolityczny rekombinant adenowirusa, jak tu zastrzeżono, w którym sygnał terminacyjny transkrypcji jest umieszczony w dół od ITR i wirusowego miejsca pakującego i w górę od promotora htert swoistego dla komórek nowotworowych. Sygnał terminacyjny transkrypcji, taki jak wczesny poli (A) SV40 może blokować jakąkolwiek transkrypcję za pośrednictwem polimerazy RNA. Badania in vitro wykazały, że z powodu obecności sygnału terminacyjnego transkrypcji, takiego jak wczesny poli(a) SV40, ITR i sekwencja, która zachodzi na miejsce pakujące i działa jako wzmacniacz, ma tylko niewielki wpływ na promotor htert. [0044] Onkolityczne rekombinanty adenowirusa według wynalazku mają geny regulatorowe odporności. W kilku znanych onkolitycznych rekombinantach adenowirusa, gen GM- CSF zastosowano jako gen immunostymulujący, onkolityczne rekombinanty adenowirusa opisane w tym wynalazku zawierają również gen GM-CSF, jako gen immunostymulujący, chociaż nie są ograniczone do genu GM-CSF i można również zastosować inne geny immunostymulujące, takie jak cytokina. Jednak GM-CSF jest dobrze znanym induktorem długotrwałych odpowiedzi immunologicznych (Dranoff i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ). Jest to wydzielana glikoproteina, która może stymulować różnicowanie granulocytów, monocytów, makrofagów i komórek dendrytycznych, i zwiększać ekspresję MHC i cząsteczki kostymulatorowej B7 na komórkach prezentujących antygen. GM-CSF może również nasilać naciekanie komórek immunologicznych do tkanek i różnicowanie komórek B. Ze względu na właściwość GM-CSF opisaną powyżej, naukowcy zastosowali w minionych latach GM-CSF w połączeniu z chemioterapią do leczenia nowotworów. Wiele szczepionek przeciwnowotworowych składających się z komórek nowotworowych zdolnych do ekspresji GM-CSF obecnie jest w badaniach klinicznych (Armitage (1998) Blood 92: ; Mach i in. (2000) Cancer Research 60: ; Gilboa (2004) Nature Reviews Cancer 4: ). Warunkowo replikujący się onkolityczny adenowirus, który eksprymuje GM-CSF nie tylko zabija komórki nowotworowe, lecz także eksprymuje GM-CSF w komórkach nowotworowych, aby indukować odpowiedzi immunologiczne swoiste dla komórek nowotworowych, skutkując efektami immunoterapii nowotworów. Zatem ten sposób wytwarzania autologicznej szczepionki przeciwnowotworowej nie tylko wyeliminował skomplikowany sposób wytwarzania szczepionki przeciwnowotworowej, lecz także utrzymuje wysoką integralność komórek nowotworowych bez manipulacji in vitro, w tym ekspresji antygenu, która uczyniła szczepionkę przeciwnowotworową in situ bardziej skuteczną. Zatem onkolityczny wirus opisany powyżej może zabi-

10 jać komórki nowotworowe w miejscu, gdzie dostarcza się wirusa i jednocześnie będzie również zabijać odległe komórki nowotworowe poprzez odpowiedzi immunologiczne za pośrednictwem GM-CSF. Opisany tu sposób według wynalazku jest wyjątkowym podejściem wytwarzania lepszych onkolitycznych wirusów. [0045] Dwa onkolityczne rekombinanty adenowirusa, spośród tych według wynalazku, zawierają i eksprymują związany z błoną GM-CSF (mbgm-csf). Poprzednie badania ujawniły, że związany z błoną GM-CSF może wzmacniać oddziaływanie z komórkami dendrytycznymi i indukować lepsze odpowiedzi immunologiczne niż wydzielany GM-CSF (Soo Hoo i in. (1999) Journal of Immunology 169: ; Yei i in. (2002) Gene Therapy 6: ). Nie podano, żeby związany z błoną GM-CSF ulegał ekspresji w warunkowo replikujących się onkolitycznych adenowirusach z uzyskaniem genetycznie rekombinowanego składnika czynnego. [0046] Wynalazek ten dostarcza również sposób wytwarzania onkolitycznych rekombinantów wirusa, jak tu zastrzeżono, obejmujący następujące etapy: a) skonstruowanie lewego ramienia adenowirusa, które zawiera sekwencję promotora htert o SEQ ID NO: 2. b) skonstruowanie prawego ramienia adenowirusa, które zawiera gen regulatorowy odporności; i c) kotransfekcję komórek 293, komórek HeLa, komórek HeLa-S3 lub komórek A549 plazmidami zawierającymi prawe ramię i lewe ramię genomu adenowirusowego i wytworzenie rekombinanta drogą rekombinacji homologicznej. [0047] Rekombinant według wynalazku można uzyskać następującym sposobem: wirusowy rekombinant powstaje w komórkach ssaczych drogą rekombinacji homologicznej. Po pierwsze, endogenny promotor genu E1A usuwa się z pxc.1 (plazmidu zawierającego prawy koniec adenowirusa serotypu 5, zakupionego od Microbix, Kanada) i zastępuje sygnałem terminacyjnym poli(a) SV40 i ulepszonym promotorem htert powszechnie znanymi technikami klonowania, z otrzymaniem pkh-901a. W międzyczasie, sekwencję kodującą gp19k w pbhge3 (plazmid zawierający prawą część adenowirusa, zakupiony od Microbix, Kanada) zastąpiono genem GM-CSF, z otrzymaniem plazmidu o nazwie pkh-901b. [0048] Plazmidem DNA pkh-901a i pkh-901b kotransfekuje się komórki HeLa, wybiera się pojedynczy klon z płytki i nazwa KH-901. Według tej samej procedury skonstruowano rekombinanty KH-900, KH-902, KH-903, KH-904, KH-905 i KH-906. [0049] W rzeczywistości, rekombinanty można wytworzyć w jakichkolwiek komórkach ssaczych i innych niż ssacze. [0050] Według planu zarysowanego powyżej, fragment DNA z nukleotydu zamplifikowano drogą PCR w 362 do 551 pxc.1 odpowiednio z endonukleazami restrykcyjnymi SspI i PinAI (AgeI). Fragment DNA promotora htert zamplifikowano z ludzkiego genomowego DNA drogą PCR, połączono z poli(a). Dwie endonukleazy restrykcyjne SspI i PinAI dodano do dwóch końców fragmentu DNA. Fragment DNA trawiono SspI i PinAI i wligowano do pxc.1, który strawiono tymi samymi enzymami. Produktem ligacji transformowano komórki E. coli, komórki DH5-alfa (Invitro gene, USA). Pobrano dziesięć kolonii, hodowano w inkubatorze przez 24 godziny. DNA wyekstrahowano i poddano analizie z użyciem enzymów restrykcyjnych, plazmid potwierdzono przez zsekwencjonowanie i nazwano pkh-901a. [0051] Stosując startery 5'-ATAACCATGTGGCTGC-3' i 5'-AAATTACTCCTGGAC- TGG-3', fragment DNA kodujący GM-CSF zamplifikowano drogą PCR na matrycy cdna wyekstrahowanego z aktywowanego makrofaga. Pełnej długości gen GM-CSF wklonowano do puc19 i potwierdzono przez zsekwencjonowanie. Następnie, fragment cdna genu GM-CSF wklonowano do pbhge w regionie kodującym gp19k, otrzymany plazmid nazwano KH901b, zsekwencjonowano i potwierdzono przez analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych.

11 [0052] Plazmidem DNA pkh-901a i pkh-901b kotransfekowano komórki HeLa dla uzyskania rekombinacji homologicznej. Przed transfekcją, plazmid DNA zlinearyzowano z użyciem ClaI i transfekowano nim komórki HeLa za pośrednictwem Lipofektyny (USA Invitrogen), 10 dni po transfekcji komórki zebrano, 3 cykle zamrażania/rozmrażania, pobrano 100 ml do wykonania testu łysinkowego na komórkach HeLa. Osiem dni po wykonaniu testu łysinkowego, izolowane łysinki były widoczne pod agarem 8 dni wykonaniu testu łysinkowego. Pobrano sześć łysinek i inokulowano nimi komórki HeLa. Lizat komórkowy zebrano 4 do 6 dni po inokulacji. Adenowirusowy DNA wyesktrahowano z lizatu komórkowego (zestaw Qiagen) i strukturę wirusa potwierdzono przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, PCR i analizę Southern blot. Otrzymany wirus nazwano KH-901. [0053] Rekombinant wirusa według wynalazku można stosować do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia nowotworów i/lub do zapobiegania nowotworom. Rekombinant wirusa można stosować w połączeniu z promieniowaniem i chemioterapią, aby osiągnąć lepszą skuteczność terapeutyczną. [0054] Rekombinant wirusa według wynalazku można sformułować w kompozycję do wstrzykiwania do podawania dożylnego, wstrzykiwania do guza, wstrzykiwania domięśniowego, wstrzykiwania podskórnego, wstrzykiwania do organizmu, wstrzykiwania dootrzewnowego itd. [0055] W celu wytwarzania na dużą skalę, rekombinant wirusa według wynalazku można wytwarzać w komórkach HeLa, komórkach HeLa-S3 lub komórkach A549 przez hodowlę komórkową, zakażenie wirusem, propagację, zatężanie, oczyszczanie. Rekombinant wirusa wytwarzany tym sposobem można stosować, jako surowy materiał do formułowania klinicznej kompozycji do wstrzykiwania razem z farmaceutycznie dopuszczalnymi nośnikami z zastosowaniem standardowej technologii formulacji. [0056] Doświadczenia pokazujące potencjalne zastosowanie i korzystne skutki niniejszego wynalazku opisano następująco: Doświadczenie 1: Aktywność promotora htert i porównanie swoistości dla nowotworu między promotorami htert typu dzikiego i ulepszonymi [0057] Aby zbadać swoistość ulepszonej wersji promotora htert, promotor htert typu dzikiego (telo) i ulepszony promotor htert (Mtelo) połączono z genem reporterowym lucyferazy (luc), otrzymane plazmidy transfekowano do panelu ludzkich komórek nowotworowych i normalnych ludzkich komórek. Komórki zebrano 48 godzin po transfekcji i lizaty komórkowe zastosowano do określenia poziomu ekspresji lucyferazy. Podczas transfekcji, drugorzędowy gen reporterowy, reporterowy plazmid LacZ, zastosowano do znormalizowania wydajności transfekcji wśród różnych typów komórek. Wynik zaprezentowany na Fig. 6 pokazuje, że (1) w komórkach nowotworowych ulepszony promotor Mtelo wykazywał znacznie wyższą aktywność lucyferazy niż promotor htert typu dzikiego (telo). Przykładowo, w komórkach Hep3B (stymulowana telomeraza i uszkodzony szlak Rb), Mtelo wywoływał aktywność lucyferazy 6 razy większą niż ta telo,a w komórkach LNCaP (stymulowana telomeraza i uszkodzony szlak Rb), Mtelo wywoływał aktywność lucyferazy 18 razy większą niż ta promotora htert typu dzikiego; (2) w normalnych ludzkich komórkach, promotor typu dzikiego htert telo prowadził do niskiego poziomu aktywności transkrypcyjnrj, podczas gdy ulepszony promotor htert Mtelo wykazywał zasadniczo poziom tła aktywności transkrypcji. Przykładowo, w komórkach MRC-5 (negatywna telomeraza i normalny szlak Rb) promotor Mtelo wykazywał aktywność 6 razy mniejszą niż ta promotora htert typu dzikiego telo. Ten wynik wskazuje, że dodanie miejsc wiążących E2F znacząco zwiększyło selektywność względem komórek nowotworowych i zdolność transkrypcji promotora htert. [0058] Ten wniosek dalej potwierdzono badaniami, w których ulepszoną selektywność ulepszonego promotora htert, aktywność transkrypcyjną promotora określono w komórkach zakażonych rekombinantami przez pomiar liczby informacyjnych kopii E1A. Do ba-

12 dania włączono cztery wirusy: adenowirus typu dzikiego jak kontrolę pozytywną, adenowirus d1312 z uszkodzoną replikacją (usunięty E1A) jako kontrolę negatywną, KH-900 (z promotorem htert typu dzikiego) i KH-901 (z ulepszonym promotorem htert). Do badania zastosowano ludzkie keratynocyty napletka (hfks) i hfks-e6, komórki hfk transformowane genem E6 wirusa brodawczaka ludzkiego typu 16 (HPV-16). Wykazano wcześniej, że hfks-e6 mają zwiększoną aktywność telomerazy (Horikawa i in. (2001) Journal of Virology 75(9): ). Komórki zakażono wirusami przy krotności zakażenia (MOI) wynoszącej 1 jednostkę tworzącą łysinkę (pfu) na komórkę i liczbę informacyjnego RNA E1A określono drogą PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). Wynik przedstawiony na Fig. 7 pokazał, że nie wykryto żadnego informacyjnego mrna E1A w zakażonych dl312 komórkach hfks i hfks-e6; wykryto w przybliżeniu 4000 kopii informacyjnego RNA E1A w komórkach zakażonych Ad5 i nie było znaczącej różnicy w kopiach mrna między komórkami hfks i hfks-e6. Jednak, w przypadku komórek zakażonych KH-900, wykryto kilka kopii mrna E1A w komórkach hgk, podczas gdy 20 razy więcej kopii mrna E1A wykryto w komórkach hfks-e6. Co bardziej interesujące, więcej niż 100 razy więcej mrna E1A wykryto w zakażonych KH-901 komórkach hfks-e6 niż w komórkach hfks. Jednocześnie, liczba kopii mrna E1A była nawet niższa w komórkach hfks zakażonych KH-901 niż ta w komórkach hfks zakażonych KH-900. Podsumowując, wykazano, że promotor Mtelo, gdy łączy się z genem reporterowym, ma wyższy poziom aktywności i selektywności względem komórek nowotworowych niż ten promotora telo; jednocześnie, ulepszona selektywność względem nowotworu jest faktem, gdy promotor jest wstawiony do genomu adenowirusa. Promotor Mtelo ma lepszą swoistość dla nowotworu niż promotor typu dzikiego, gdy stosuje się go do kontroli niezbędnych genów wirusowych. [0059] Wynik ten był utrwalono dodatkowo w hodowanych komórkach ludzkiego szpiku kostnego. W teście żywotności komórki, KH-900 i KH-901 zastosowano do zakażenia komórek 293 i mezenchymalnych komórek macierzystych ludzkiego szpiku kostnego (hbmsc) przy MOI wynoszącej 1. Wynik przedstawiony na Fig. 8 pokazuje, że KH-901 zabija komórki 293 tak skutecznie jak KH-900, jednak KH-900 wykazywał pewien poziom zabijania komórek w komórkach hbmsc, podczas gdy KH-901 wcale nie wykazywał zabijania. Doświadczenie 2: Porównanie zdolności zabijania komórek nowotworowych czterech warunkowo replikujących się onkolitycznych rekombinantów adenowirusa [0060] Linię komórek raka płuca A549 zastosowano do porównania zdolności do zabijania czterech warunkowo replikujących się onkolitycznych adenowirusów. Komórki wysiano na 6-cm płytkach i wirusy naniesiono przy MOI wynoszącej 1, gdy komórki wyhodowano do 85% konfluencji. Żywotność komórek określono w różnych punktach czasowych po zakażeniu (Hallenbeck i in. (1997) Human Gene Therapy 11: ). Wynik przedstawiony na Fig. 9 pokazuje, że KH-904 zabijał komórki skuteczniej niż KH-901 i KH- 902, podczas gdy KH-900 był najsłabszy. [0061] Wynik ten wskazuje, że ulepszony promotor htert ma silniejszą aktywność niż promotor htert typu dzikiego. Wskazuje on również, że to zastąpienie główki w genie włókna z serotypu 35 może mieć lepszą zakaźność niż serotypu 5. Wniosek potwierdzono w panelu komórek nowotworowych i normalnych ludzkich komórek (Tabela 1). Panel ludzkich komórek nowotworowych i normalnych zakażono różnymi wariantami adenowirusa przez 72 godziny i żywotność komórek zmierzono, jak opisano powyżej. EC50 obliczono dla ilości wirusa wymaganej do zabicia 50% komórek. Im mniejsze EC50, z tym lepszą skutecznością wirus zabija komórki. Wynik przestawiony w Tabeli 1 wskazuje, że (1) KH-901 zabija komórki nowotworowe skuteczniej niż KH-900, potwierdzając dalej, że ulepszony promotor htert ma lepszą swoistość dla nowotworu; (2) KH-902 i KH-903 zabijały komórki podobnie do KH-901, podczas gdy KH-904 był najsilniejszy. Przeciwnie,

13 12 5 wirusy zawierające ulepszony promotor Mtelo (KH-901, KH-902, KH-903 i KH-904) zabiły mniej normalnych komórek w porównaniu z KH-900, który to wirus ma promotor htert typu dzikiego. Dla KH-906, w którym wirusowy gen E1B połączono z E1A przez IRES, ma dobrą swoistość dla komórek nowotworowych chociaż zdolność zabijania była względnie niższa. Tabela 1. Ekspresja GM-CSF w komórkach zakażonych KH-901 Komórka Jednostka zakażenia KH-901/komórkę ELISA (ng/10^6 komórek/24 h) LNCaP ±21 195±34 LNCaP 1 30±9 15±4 Hep3B ±13 355±44 Hep3B 1 94±6 85±12 SW ±19 325±44 SW ±4 135±21 A ±17 625±94 A ±2 55±24 HeLa ±11 105±56 HeLa 1 9±1 2±0,3 hfks 10 5±0,25 3,5±0,4 Test biologiczny (ng/10^6 komórek/24 h) hfks 1 niewykrywalny niewykrywalny Tabela 2. EC50 dla KH-900, KH-901, KH-902, KH-903, KH-904 i KH906 Komórka KH-900 KH-901 KH-902 KH-903 KH-904 KH-906 LoVo 1,25 0,92 0,85 0,97 0,35 1,01 A549 0,58 0,19 0,28 0,49 0,08 0,39 LNCaP 2,31 0,22 0,36 0,15 0,01 1,75 Hep3B 4,03 0,31 0,53 0,71 0,03 1,71 HeLa 3,85 0,62 0,55 0,73 0,25 0,89 SW620 2,04 0,20 0, ,04 2,53 CA-33 3,40 1,15 1,17 0,75 0,20 3,15 HepG2 0,91 0,37 0,41 0,97 0,21 1,17 SCC4 9,21 2,10 3,28 2,30 0,61 8,10 HUVEC 27,9 99,3 130,4 83,5 70,6 268,3 BJ 60,8 295,4 260,5 75,4 1801,8 435,4 RPE 35,4 231, ,7 295,3 531,7 WI38 46,5 92,33 79,5 82,33 69,2 192,33 MRC5 51,54 121,20 135,84 91,20 61,74 266,23

14 [0062] Bardziej interesujące jest to, że względem ludzkiej normalnej komórki, rekombinanty wirusowe zmodyfikowane tak, aby obejmowały genetycznie ulepszony promotor Mtelo, w tym HK-901, HK-902, HK-903, HK-904, przy czym wszystkie wykazują słabszą zdolność zabijania (wskazywaną przez wyższą EC50) niż HK-900, który zmodyfikowano tak, aby obejmował promotor htert typu dzikiego. [0063] Dodatkowo, rekombinanty adenowirusa KH-906, w których wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu wstawiono między geny E1A i E1B, a zatem transkrypcja genów E1A i E1B jest pod kontrolą ulepszonego promotora Mtelo, wykazały wyższą selektywność względem komórek nowotworowych niż inne rekombinanty wirusowe, chociaż ich zdolność do zabijania komórek nowotworowych jest trochę słabsza niż innych. Doświadczenie 3: KH-901 produkuje wysoki poziom biologicznie czynnego GM-CSF w komórkach nowotworowych [0064] Pięć nowotworowych linii komórkowych i jedną normalną ludzką linię komórkową zakażono KH-901 przy MOI wynoszącej 1 lub godzin po zakażeniu, komórki zebrano w celu określenia stężenia GM-CSF w teście ELISA i teście TF-1, jak opisano poprzednio (Li i in. (2001) Cancer Research 61: ). Wynik przedstawiony na Fig. 14 pokazuje, że 5 komórek nowotworowych zakażonych KH-901 wytwarzało wysoki poziom GM-CSF. Przykładowo, w komórkach LNCaP zakażonych KH-901 ilość wykryta w komórkach wynosiła 231 ng/10^6 komórek/24 h. Przeciwnie, bardzo niski poziom GM-CSF wykrywato w normalnych ludzkich komórkach zakażonych KH-901. Test biologiczny dalej ujawnił, że GM-CSF eksprymowany w komórkach nowotworowych był biologicznie czynny (patrz Tabela 2). Doświadczenie 4: Skuteczność przeciwnowotworowa onkolitycznych rekombinantów adenowirusa w modelach nowotworu [0065] Skuteczność przeciwnowotworową onkolitycznych adenowirusów oceniono w modelu guza LNCaP raka gruczołu krokowego u nagich myszy. Sześcioma milionami komórek LNCaP inokulowano podskórnie nagie myszy i wirusy wstrzykiwano do guza trzy razy dnia 1, 5 i 9 w dawce wynoszącej 3x10^10 cząstek różnych wirusów (KH-901, KH-904 i addl1520, onkolityczny adenowirus z delecją E1B-p55), gdy objętość nowotworu osiągnęła 200 mm^3 w ciągu 4 tygodni. Objętość nowotworu mierzono dwa razy na tydzień i wynik przedstawiono na Fig. 10. [0066] W tym teście, trzy rekombinanty, to jest KH-901, KH-904 i KH-907 (nie przedstawiono, taki sam co KH-901, ale bez genu GM-CSF), zastosowano do wstrzykiwania do guza; Add1520 badano również jako kontrolę. [0067] Jak można zobaczyć na Fig. 10, guz rósł bardzo szybko w przypadku leczenia placebo, 48 dnia objętość guza osiągnęła 1200% objętości wyjściowej. W grupie leczonej KH-901 guz pozostaje taki sam jak wyjściowo, podczas gdy guzy leczone KH-904 zmniejszały objętość do 15% objętości wyjściowej. Podczas tego samego okresu, nowotwory leczone addl1520 urosły do 850% objętości wyjściowej. [0068] Ten wynik wskazuje, że KH-901 i KH-904 mają lepszą aktywność przeciwnowotworową niż Addl1520 (Onyx-015). Co interesujące, jak przedstawiono w badaniu in vitro, KH-904 ma lepszą skuteczność przeciwnowotworową niż KH-901. [0069] W tym samym badaniu udokumentowano również ekspresję GM-CSF. Nie wykryto GM-CSF w zwierzętach leczonych KH-907 i Addl1520, podczas gdy wysoki poziom GM- CSF był wykrywalny w zwierzętach leczonych KH-901 lub KH-904. Przykładowo, dnia 14, ilość GM-CSF wykrywanego w zwierzętach leczonych KH-901 lub KH-904 wynosiła odpowiednio 2,322 g/ml lub 2,776 g/ml. Wynik ten sugeruje, że onkolityczny wirus KH- 901 i podobne wytwarzały GM-CSF nie tylko w komórkach nowotworowych, lecz także wysoką ekspresję in vivo w zwierzętach mających nowotwór. [0070] Wyniki tych badań pokazują replikację KH-901 i podobnych w różnych komórkach nowotworowych, gdzie po zakażeniu wykrywa się wysokie poziomy ekspresji GM-CSF.