(54) Sposób transformowania komórek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITAPOLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) IntCl^5: C12N 15/55 A01H 1/00 Opis patentowy przedrukowano ze względu na zauważone błędy (54) Sposób transformowania komórek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy (30) Pierwszeństwo: ,FR, (73) Uprawniony z patentu: Rhȏne-Poulenc Agrochimie, Lyon, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 26/89 (74) Pełnomocnik: PATPOL - Spółka z o.o., Warszawa, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 06/93 PL B1 (57) 1. Sposób transform ow ania kom órek roślinnych w celu nadaw ania roślinom oporności na środek chwastobójczy oparty na 3,5-dichlorowco-4-hydroksy-benzonitrylu, znamienny tym, że doprow adza się do integracji genu chimerycznego obejmującego co najmniej jeden gen kodujący oporność na ten herbicyd, obcy prom otor pochodzący z genu ulegającego naturalnej ekspresji w kom órkach roślinnych, który jest wybrany z grupy obejmującej prom otor 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiora (CaM V 35S) i prom otor małej podjednostki (SSU) karboksylazy/oksygenazy rybulozo-1,5-dwufosforanu (RubisCO) słonecznika (Helianthus annuus) oraz region sygnałowy poliadenylacji, z m ateriałem genetycznym kom órki.

2 Sposób transformowania komórek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób transform ow ania komórek roślinnych w celu nadaw ania roślinom oporności na środek chwastobójczy oparty na 3,5-dichlorowco-4-hydroksy-benzonitrylu, znamienny tym, że doprowadza się do integracji genu chimerycznego obejm ującego co najmniej jeden gen kodujący oporność na ten herbicyd, obcy prom otor pochodzący z genu ulegającego naturalnej ekspresji w kom órkach roślinnych, który jest wybrany z grupy obejmującej prom otor 35S RNA z wirusa mozaiki kalafiora (CaM V 35S) i prom otor małej podjednostki (SSU) karboksylazy/oksygenazy rybulozo-l,5-dw ufosforanu (RubisCO) słonecznika (H elianthus annuus) oraz region sygnałowy poliadenylacji, z m ateriałem genetycznym kom órki. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny obejmujący nie ulegający translacji region pośredni (linker) między prom otorem i genem kodującym oporność na herbicyd, wybrany z grupy obejmującej nie ulegający translacji region pu C 19 modyfikowany przez klonowanie, nie ulegający translacji region małej podjednostki RubisCO kukurydzy i nie ulegający translacji region małej podjednostki R ubisc O słonecznika. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, który dodatkow o zawiera między regionem pośrednim i regionem kodującym oporność na herbicyd, region kodujący peptyd przejściowy zdolny do w prow adzenia białka do chloroplastu transform o- wanych roślin. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region kodujący peptyd przejściowy pochodzi z małej podjednostki R ubisc O kukurydzy. 5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region kodujący peptyd przejściowy pochodzi z małej podjednostki R ubisc O słonecznika. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region poliadenylacji pochodzi z genu syntazy nopalinowej. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny, w którym region poliadenylacji pochodzi z genu małej podjednostki R ubisc O kukurydzy. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się gen chimeryczny obejmujący gen kodujący oporność na bromoksynil lub joksynil lub jedną z ich pochodnych, soli lub estrów. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób transform ow ania kom órek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu transform ow ania kom órek roślinnych w celu nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy na bazie 3,5-dichlorowco-4-hydroksybenzonitrylu. Z opisu europejskiego zgłoszenia patentowego nr znany jest sposób nadawania roślinom oporności na środek chwastobójczy typu powyżej wspom nianego, w szczególności 3,5- dibrom o-4-hydroksybenzonitryl, czyli bromoksynil, polegający na wprowadzaniu do genomu rośliny genu kodującego nitrylazę, specyficznie rozkładającą środki chwastobójcze tego rodzaju. Mimo, że technika ta daje pożyteczne wyniki, wymaga ona ulepszenia w celu zwiększenia szans powodzenia i wzmożenia korzyści ekonomicznych, zwłaszcza pod względem poziom u ekspresji w roślinach, a także stosow nie do tego, charakteru oporności roślin na te środki chwastobójcze. W niniejszym opisie jak o rośliny" rozumie się każdy zróżnicow any organizm wielokomórkowy zdolny do fotosyntezy, a jako komórkę roślinną" każdą kom órkę pochodzącą z rośliny i zdolną do wytworzenia tkanek niezróżnicowanych, takich jak kalusy i zarodki, albo tkanek zróżnicow anych, takich ja k części roślin, rośliny, względnie nasiona.

3 Celem niniejszego w ynalazku jest zaspokojenie tego zapotrzebow ania. Sposób transform ow ania kom órek roślinnych według wynalazku polega na tym, że m ateriał genetyczny kom órki doprow adza się do integracji z genem chimerycznym obejmującym co najmniej jeden gen kodujący oporność na dany herbicyd, obcy prom otor pochodzący z genu ulegającego naturalnej ekspresji w kom órkach roślinnych, który jest wybrany z grupy obejmującej prom otor 35S RNA z w irusa m ozaiki kalafiora (CaM V 35S) i prom otor małej podjednostki (SSU) karboksylazy) oksygenazy rybulozo-1,5-dwufosforanu (RubisCo) słonecznika (Heliothus annuus) oraz region sygnałowy poliaidenylacji. Prom otor genu chimerycznego stosowanego w sposobie według wynalazku pochodzi z genu, który ulega naturalnej ekspresji w roślinach, to jest genu typu nieroślinnego, np. typu wirusowego, takiego jak gen 35S RNA wirusa mozaiki kalafiora (35S CaM V), lub alternatywnie i korzystnie, typu roślinnego, z roślin jednoliściennych lub dwuliściennych, zwłaszcza genu małej podjednostki karboksylazy/oksygenazy rybulozo-l,5-dw ufosforanu (R ubisc O ) słonecznika (H elianthus annuus). Możliwe jest zastosowanie tych prom otorów samych albo w kombinacji. W ybór ten zależy od charakteru roślinny, k tó ra m a być transform ow ana (roślina jednoliścienna lub dwuliścienna). I tak do transform acji rośliny dwuliściennej korzystne jest zastosowanie prom otora małej podjednostki R ubisc O słonecznika. Prom otory te m ożna otrzym ać następującymi sposobami. 1/ Prom otor 35 S RNA wirusa mozaiki kalafiora (35 S CaMV). W yodrębnianie tego prom otora opisali Odell i in. (1985). D o opisanej konstrukcji wybrano klon (pj05-2) zawierający około 850 par zasad w górę od miejsca inicjacji transkrypcji. W yodrębniono fragm ent E cor I-H indiii, końce przeprowadzono w tępe z użyciem polimerazy Klenowa i klonow ano ten fragm ent do w ektora puc 19 (Yannish - Perron i in., 1985) w miejscu H incii. Klon ten strawiono działaniem Xbal i PstI i na otrzymany fragm ent podziałano polimerazą faga T4 w celu przeprowadzenia końców w tępe. Fragment ten klonow ano do puc19 Cm (Buckley, 1985), przecięto Sm ai i X bai i poddano działaniu polimerazy Klenowa. T ak otrzym any klon oznaczono pr PA -B L 145. Za pom ocą działania na 3'-końcowe miejsce AccI polim erazą Klenowa i ligowania go z miejscem EcoRI, poddanym działaniu polimerazy Klenowa, z fragm entów położonych w dół od tego prom otora odtw arza się miejsce EcoRI, a otrzym ana w wyniku tego sekwencja, zaczynająca się od miejsca inicjacji transkrypcji, jest następująca: A C A C G C T G A C A A G C T G A C T C A G C T A G A G T C G A A T T C E c o R I 2 / Prom otor małej podjednostki rybulozo-1,5-bisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy (RubisC O) słonecznika (H elianthus annuus). G en, z którego otrzym uje się prom otor, wyodrębnili W acksm an i in. (1987). Fragm ent EcoRI zawierający prom otor tego genu klonowego do mp 18, 3'-część prom otora bezpośrednio w górę od polilinkera tego w ektora. Następnie przeprowadzono ten klon w postać liniową BstXI i poddano działaniu egzonukleazy B a131. Na mieszaninę tak otrzym anych fragm entów podziałano SalI, a następnie polim erazą Klenowa, a w końcu ligowano przy niskim stężeniu DNA. Klony otrzym ane w wyniku tego postępow ania sekwencjonowano i wybrano jeden z nich, mający w dół od dom niem anego miejsca inicjacji transkrypcji następującą sekwencję:... 5' A T T G G A T T C 3 '... Linker C la I (A T C G A T) wprowadzono w miejscu PstI w tym klonie. Tak więc, przez działanie na to miejsce Cla I polim erazą Klenowa i ligowanie z miejscem EcoRI, poddanym działaniu polim erazy Klenowa, z fragmentów umieszczonych w dół od tego prom otora odtw arza się miejsce EcoRI, a otrzym ana w wyniku tego sekwencja, zaczynająca się od dom niemanego miejsca inicjacji transkrypcji, jest następująca: A T T G G A T T C T C G A C C A T C G A A T T C E c o R I

4 W innym sposobie realizacji wynalazku, gen chimeryczny obejm uje nie ulegający translacji region pośredni (linker) między genem kodującym a prom otorem, który m ożna wybrać z grupy złożonej: - z jednej strony z linkera pu C 19, zmodyfikowanego przez klonow anie i mającego następując ą sekwencję: G A A T T C G A G C T C G G T A C C C C A T G G Ec o R I N c o I - z drugiej strony, z nie ulegającego translacji regionu małej podjednostki R ubisc O kukurydzy; region ten pochodzi z D N A odpowiadającego genowi opisanem u przez Lebrun'a i in. (1987). Jest to fragment EcoR I-N coi o następującej sekwencji: G A A T T C C C A G C A A G C A A G C A G C G A G T E c o R I A C A T A C A T A C T A G G C A G C C A G G C A G C C A T G N c o I - z innej strony, z nie ulegającego translacji regionu małej podjednostki RubisCO słonecznika; region ten pochodzi z cdna wyodrębnionego przez W aksm ana i Freyssineta (1987). Nie został on wyodrębniony jako taki i zawsze jest, jak stwierdzono, poprzedzony peptydem przejściowym R ubisc O słonecznika. Sekwencja ta jest następująca: G A A T T C C G A A A G A C A A A G A T T A T C G Ec o R I T A A T G Met G en chimeryczny wytworzony sposobem według wynalazku ewentualnie obejmuje region, lub miejsce, poliadenylacji, które może stanow ić np.: 1/ Miejsce poliadenylacji genu syntezy nopalinowej pti 37 (Bevan i in., 1983). Miejsce to znajduje się we fragmencie M boi o 260 parach zasad, (Fraley i in., 1983, zgłoszenie patentowe PCT 84/ 02913), na który podziałano polim erazą Klenowa i klonowano do miejsca SmaI M 13m p18 w celu wprowadzenia miejsc Bam H I i EcoRI, odpowiednio, na końcach 5' i 3'. Na miejsce BamHI podziałano nukleazą Vigna radiata i klonow ano w miejscu SalI, po podziałaniu polimerazą Klenowa, puc 19. Fragm ent ten obecnie zawiera przy swoim końcu 5' miejsce H indiii, które może podlegać ligowaniu przy końcu 3' genu nitrylazy. 2/ Miejsce poliadenylacji genu małej podjednostki RubisCO kukurydzy. Miejsce to wyodrębniono w postaci fragm entu Sm ai-bgiii o 540 parach zasad z genu opisanego przez Lebrun'a i in. (1987). W prowadzono linker Cla I (A TC G A T) przy miejscu Sm ai. Po rozszczepieniu Cla I i wypełnieniu z użyciem polim erazy Klenowa, fragment ten klonowano do puc19 przeciętego PstI, a następnie podziałano na niego polim erazą faga T4 i ponownie przecięto Bam HI. Postępowanie to umożliwiło wprowadzenie miejsca H indiii przy końcu 5' miejsca poliadenylacji. Otrzym ana sekwencja jest następująca: 5 ' A A G C T T G C A T G C C C G A T G G G C A G... H i n d I I I 1/Sm ai

5 W jeszcze innym sposobie realizacji w ynalazku, gen chim eryczny m oże ew entualnie i korzystnie obejm ow ać, między regionem pośrednim, a genem nitrylazy, region kodujący peptyd przejściowy, wybrany z grupy złożonej z peptydu przejściowego małej podjednostki RubisCO kukurydzy i peptydu przejściowego małej podjednostki RubisCO słonecznika. F unkcją peptydu przejściowego w genie naturalnym jest pozwalanie na wnikanie małej podjednostki RubisCO do strony chloroplastów. Peptydy te powinny, podobnie, kierować nitrylazę do tego kom partm entu w przypadku, gdy zostaną wprowadzone między region pośredni opisany powyżej i gen struktury nitrylazy: 1/ Peptyd przejściowy małej podjednostki RubisCO kukurydzy: fragm ent ten pochodzi z cdna odpowiadającego genowi opisanemu przez L ebrun'a i in. (1987). Jest on fragmentem NcoI-S phi o 141 parach zasad, przy czym miejsce NcoI pokryw a kodon inicjacji translacji i miejsce SphI, miejsce rozszczepiania peptydu przejściowego. Za pom ocą podziałania na koniec SphI tego fragm entu polim erazą faga T4 i ligowania go z poddanym działaniu polim erazy Klenowa końcem N coi genu nitrylazy, odtw arza się sekwencję pozwalającą na wytwarzanie nie zmodyfikowanej nitrylazy w strom ie chloroplastów. 2 / Peptyd przejściowy małej podjednostki RubisCO słonecznika: fragm ent ten pochodzi z cdna wyodrębnionego przez W aksm ana i Freyssineta (1987). Sekwencja ta nie ma, wyjściowo, miejsca SphI przy miejscu rozszczepiania peptydu przejściowego. Sekwencja w tym zakresie jest następująca: 5 ' C A A T G C A T G A * A G 3 ' Za pom ocą C zastąpiono na drodze bezpośredniej mutagenezy A wskazaną gwiazdką, w wyniku czego utw orzono miejsce SphI. W celu przeprowadzenia tego postępow ania użyto m etody Zollera i Sm itha (1984). Fragm ent E cor I-SalI o 270 parach zasad klonow ano do M 13m p19am4. W ektor ten, wywodzący się z M 13m p19, zawiera mutację am ber w genie 4 przy zasadzie 5327 i nie m ożna go nam nażać w szczepach nie zawierających supresora m utacji tego typu. Po oczyszczeniu jednoniciowej postaci tego faga rekom binantowego, hybrydyzow ano trzy oligonukleotydy w pojedyńczym stadium. Sekwencji tych fosforylowanych oligonukleotydów jest następująca: S p h I 1 : 5 ' G T T C A A T G C A T G C A G T G T G G C C A C 3' 2 : 5 ' A A G A G T C T G T C C A T C A C 3 ' 3 : 5 ' G T A A A A C G A C G G C C A G T 3 ' Umożliwiają one, odpowiednio: 1: mutację fragmentu przy miejscu rozszczepiania peptydu przejściowego; 2: skorygowanie m utacji amber; 3: prymowanie sekwencji w górę od fragm entu, w którm następuje m utageneza. Po jednoczesnym działaniu polim erazą Klenowa w obecności czterech nukleotydów i ligazą faga T4 otrzym aną m ieszaniną transform ow ano szczep HB2154, a następnie umieszczono na m urawie HB2I51 (C arter i in., 1985). Spośród otrzymanych klonów sekwencjonowano te, które miały dodatkow e miejsce SphI, w celu potwierdzenia tej struktury, i jednego z nich użyto do wytworzenia genu chimerycznego. W zakresie miejsca rozszczepiania peptydu przejściowego, sekwencja jest obecnie ja k następuje: 5 ' C A A T G C A T G C Fragm ent ten stosuje się w sposób identyczny do wykorzystanego w przypadku fragm netu kodującego peptyd przejściowy małej podjednostki RubisCO kukurydzy. M ontowanie genów chimerycznych prowadzi się według schem atu na Figurach 1-4 z uwzględnieniem elementów powyżej opisanych. Tak utworzone rozm aite geny umieszczono w jednym lub dwóch typach wektorów i każdą konstrukcję oznaczono num erem odnośnikowym. T ak wytworzone różne w ektory opisano w tabeli 1.

6 Tabela 1 M o n to w a n ie ro zn v c h T D N A z aw ierajacych g e n y c h im e ry c z n e d o n a d a w a n ia o p o rn o śc i na b ro m o k s y n il Prom otor Region łą c z ą c y Peptyd przejściow y Id e n ty fikacja pr P A -B L W ektor 35S C am V SSU sło n e c z n ik a K ukurydza Słonecznik 5' Linker 5 K ukurydza Słonecznik BR X N N O S p o lia K u k u ry d z a S S U polia A T A A A T A T T A A A Użyte wektory: Różne konstrukcje chimeryczne, które prow adzą do wektorów prpa-bl-142 i prpa-bl-150a α 1 pokazanych na Figurach 1-4 w prow adzono do roślin stosując układ przenoszący Agrobacterium tumefaciens. W ektory przenoszące skonstruow ane w tym celu m ają następujące cechy znamienne: - początek replikacji i przenoszenia pochodzący z pbr 322, - gen do selekcji w bakteriach, np. oporność na gentam ycynę, - miejsce COS pochodzące z faga λ, - obydwa, prawy i lewy, brzegi T DNA ptia6, - ewentualnie, eukariotyczny gen selekcyjny, taki jak oporność na kanam ycynę, - ewentualnie, fragm ent zawierający gen lac α kom plem entacyjny puc18. K onstrukcja prpa-bl-142 (Figury 1-4). Prawy i lewy brzeg (Fig. 1) lewoskrętnego T DNA ptia6 najpierw subklonowano: - prawy brzeg: Fragm ent Bam HI-EcoRI rozciągający się od do w systemie numerowania Barkera i in. (1983) klonowano do pgem 1 (Prom ega Biotech) w odpowiednich miejscach, w wyniku czego otrzym ano pbl-17. Plazmid ten straw iono N rui (14276 i 14475) oraz EcoRI (16202) i poddano działaniu polimerazy Klenowa. Ligacja miejsca N rui i wypełnionego miejsca EcoRI regeneruje miejsce EcoRI przy 14276, w wyniku czego otrzymuje się plazmid pbl lewy brzeg: Fragment H indiii rozciągający się od 602 do 3390 w systemie Barkera i in. (1983) klonowano do odpowiedniego miejsca pg EM 1, w wyniku czego otrzymuje się pbl-21, w którym lewy brzeg znajduje się po stronie przeciwnej od polilinkera. Plazm id ten straw iono Acc 1 (1161 i 2687) i poddano działaniu polim erazy Klenowa przed ligowaniem. Powstały plazmid, pbl-26, zawiera fragment rozciągający się od 602 do 1161 między miejscami H indiii i X bai. Tworzenie T DNA: Przez wprowadzenie fragmentu EcoRI-Bam H I z pbl-19 do odpowiednich miejsc pbl-26 został ponow anie utworzony T DNA, mając prawy i lewy brzeg z ptia6 w ich naturalnej orientacji. O trzym any plazm id oznaczono pbl-70. W prowadzenie T DNA dp pbr 322 (Fig. 2): Po przecięciu pbl-70 z użyciem H indiii, miejsce to poddano działaniu polimerazy Klenowa i plazmid ponownie przecięto EcoRI. Otrzymany fragm ent klonowano do pbr 322 przeciętego PruII-EcoR I. Powstały klon oznaczono prpa-b L-112.

7 Klonowanie genu oporności na gentamycynę (Fig. 3): Gen oporności na gentamycynę otrzymano z p P H 1 J 11 (H irsh i Bringer, 1984). Plazmid ten strawiono Bam HI i H indiii, a zbiór fragm entów klonow ano do puc 19 przeciętego tymi samymi enzymami. Po selekcji na ampicylinie + gentamycynie wyodrębniono kilka klonów zawierających fragment o 2,45 kiloparach zasad. Klon wybrany do dalszej obróbki nazwano prpa-bl-133. W prowadzono w miejsce Bam HI tego klonu fragm ent BgIII o 1,6 kiloparach zasad wyodrębniony z phc 79 (Hohn i Collins, 1980) i zawierający miejsce COS faga λ. Ten fragm ent wprowadzony w dwóch orientacjach, umożliwia otrzym anie dwóch klonów: prpa-bl-134 o prpa-bl-135. W ytwarzanie w ektora integracyjnego (Fig. 3): W celu połączenia w jeden i ten sam wektor różnych powyżej opisanych części, plazmidy prpa-bl-134 i prpa-bl-135 straw iono Sm ai i H indiii i insert zawierający gen oporności na gentamycynę i miejsce COS faga λ poddano działaniu polimerazy Klenowa. Plazmid prpa-bl-112 strawiono PstI i EcoRI i poddano działaniu polimerazy faga T4. Obydwa fragmenty ligowano i wyselekcjonowano klony zawierające jednocześnie gen oporności na gentamcynę, miejsce COS, T D N A i początek replikacji pbr 322. Plazmid prpa -BL-134 doprow adził do powstania prpa -BL-141 i prp A-BL-142, a pr PA -B L-135 doprowadził do pow stania prpa-bl-143 i prpa-bl-144. prpa-bl-142 wybrano do wprowadzania genów chimerycznych, które m iano przenieść do roślin. Z tego wektora otrzym ano konstrukcję zawierającą gen m arkerow y NOS-NPTII-NOS (Fig. 4). Plazmid prpa-bl-142 strawiono X bai, a końce zmniejszono działaniem nukleazy Vigna radiata. Oddzielnie, pen D 4 K (Klee i in., 1985) strawiono EcoRI i poddano działaniu polimerazy Klenowa. W yodrębniono fragm ent o 1,6 kilopary zasad zawierający gen chimeryczny nadający oporność na kanamycynę i w prow adzono do prpa-bl-142. Plazmid będący wynikiem jednej z tych fuzji nazwano prpa-bl-150 A i wybrano go do dalszego postępow ania. W celu ułatwienia klonowania do tego wektora, fragm ent H acii poddany działaniu polim erazy faga T4 i zawierający gen lac α kom plementacyjny wyodrębniony z puc18 (Y annish-perron i in., 1985), wprowadzono przy miejscu Bam HI, które poddano działaniu nukleazy Vigna radiata. Otrzym ane dwa wektory nazwano prpa-bl-150a α 1 i prpa-bl-150a α2. prpa-bl-150a α 1 był wektorem użytym jako podstaw a do wprowadzania genów do roślin. Zastosowanie prpa-bl-142 i prpa-bl-150a α 1. W ektorów tych nie utrzym ywano jako takich w A grobacterium. Aby mogły one być utrzymywane, muszą zostać zintegrowane na drodze pojedyńczej rekom binacji w plazmidzie stale istniejącym w tej bakterii. Może to zachodzić za pośrednictwem jednego z fragm entów, takiego jak miejsce obecne w kosmidach, takich jak pvk 102, lub podobnych, albo fragment pbr 322 dla plazmidów mających te sekwencje. Jest tak w przypadku plazm idu Ti szczepu GV3850 (Zambryski i in., 1983), który jest również gospodarzem prpa-bl-142 i prpa-bl-150a α 1. Przy użyciu początku replikacji pbr 322, plazmidy te przenosi się do A grobacterium, stosują trzyczęściowy układ opisany przez D itte'a i in. (1980). T ransform acja m ateriału roślinnego. W celu zbadania skuteczności tych genów chimerycznych, przeniesiono je do m ateriału według sposobów postępow ania opisanych poniżej: A. Sposoby transform acji. 1. Tytoń. W ektor w prow adzono do nieonkogennego szczepu Agrobacterium EHA 101 (H ood i in., 1987) niosącego kosmid ptvk 291 (Komari i in., 1986). Podstawą techniki transform acji jest sposób postępow ania H orscha i in. (1985). Sposób regeneracji przemysłowego tytoniu PBD6 (źródło: SEITA, Francja) ja k opisano poniżej. Regenerację tytoniu PBD6 z eksplantów liści prowadzi się na podłożu podstawowym M urashige i Skoog (MS) zawierającym sacharozę w stężeniu 30 g/litr. Eksplanty liści podbiera się z roślin hodowanych w szklarni lub in vitro i transform owanych zgodnie z techniką krążków liściowych [Science, 227, (1985)] w trzech kolejnach stadiach. Stadium pierwsze obejmuje indukcję pędów na MS g sacharozy zawierającym 0,05 mg NAA i 2 m g/litr BAP w ciągu 15 dni. Stadium drugie umożliwia rozwój pędom utworzonym w stadium pierwszym; prowadzi się je na M S + 30 g /litr sacharozy, nie zawierającym jakiegokolwiek horm onu, w ciągu 10 dni.

8 Stadium trzecie umożliwia pędom, pobranym indywidualnie, wytworzenie korzeni. To podłoże, w którym tworzą się korzenie, zawiera sole, witaminy i cukier w dwukrotnym rozcieńczeniu, a nie zawiera hormonów. Po upływie 10 do 15 dni, implantowane pędy wprowadza się do gleby. Ustalenie równowagi hormonalnej. O ptym alną częstość regeneracji uzyskuje się przez badanie 25 stanów równowagi hormonalnej BAP 0,2-0,5-1-1,5-2 i NAA 0-0,5-0,05 obserwowanych dla BAP 1,5 i 2 m g/litr i NAA 0,05 i 0,1 m g/litr. Przyjmuje się mieszaninę NAA 0,05i BAP 2m g/ litr. 2. Inne rośliny dwuliścienne. Rośliny dwuliścienne przedstawione w Tabeli 2 transform owano z użyciem onkogennego szczepu Agrobacterium A 281 niosącego kosmid z odpowiednim wektorem i stosując materiał roślinny jak wskazano w Tabeli 2. B. Pom iar oporności na bromoksynil. 1. Tytoń. Odporność oceniono in vitro na podstawie wzrostu kalusów w obecności bromoksynilu w stężeniu 20 m g/litr w postaci oktaw ianu i in vivo za pom ocą opryskiwania liści bromoksynilem lub joksynilem w dawkach reprezentujących 10-krotną dawkę polecaną w działaniu w otw artym polu. Otrzymane wyniki zreasumowano w Tabeli 1a. 2. Inne rośliny dwuliścienne. O porność oceniano in vitro na podstawie wzrostu kalusów w obecności bromoksynilu (w postaci oktanianu) w stężeniu 10 m g/litr podłoża. We wszytkich przypadkach wyniki były pozytywne (tabela 2). Tabela 1a O porność tiansform ow anego tytoniu n brom oksynil identyfikacja prpa -BL Oporność tytoniu Kalus Rośliny Tabela 2 O porność różnych roślin dwuliściennych na brom oksynil Rośliny M ateriał roślinny prpa -BL Licopcrsicom esculentum hipokotyl Solanum tuberosum bulwa Glycine max hipokotyl Beta vulgaris korzeń Helianthus annuus hipokotyl Pisum sativum międzywęźle Brassica cam pestris olcacera hipokotyl Daucus carota korzeń Phascolus vulgaris hipokotyl + + +

9 FIG. 1

10 FIG. 2

11 F IG. 3

12 FIG. 4 Departament Wydawnictw UP RP Nakład 90 egz: Cena zł