(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/EP01/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO01/85201 (13) B1 (51) Int.Cl. A61K 39/395 ( ) C07K 16/24 ( ) C07K 14/54 ( ) A61P 9/10 ( ) A61P 7/02 ( ) (54) Zastosowanie inhibitora IL-18, zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, zastosowanie genetycznie modyfikowanych komórek wytwarzających inhibitor IL-18 oraz zastosowanie IL-18 (30) Pierwszeństwo: , EP, (73) Uprawniony z patentu: LABORATOIRES SERONO SA, Coinsins, CH INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALA (INSERM), Paryż, FR (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 08/11 (72) Twórca(y) wynalazku: YOLANDE CHVATCHKO, Confignon, CH ALAIN TEDGUI, Paryż, FR ZIAD MALLAT, Herbeville, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Magdalena Tagowska PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inhibitora IL-18, zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18, zastosowanie genetycznie modyfikowanych komórek wytwarzających inhibitor IL-18 oraz zastosowanie IL-18. Niniejszy wynalazek dotyczy chorób naczyniowych, a w szczególności leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic. Miażdżyca tętnic jest najpopularniejszą i najpoważniejszą z chorób naczyniowych, mimo że rozpoznanych jest także wiele innych chorób naczyniowych. Miażdżyca tętnic jest chorobą przede wszystkim atakującą tętnice średniej i dużej wielkości, a uszkodzenia obejmują powstanie pasm tłuszczowych, blaszki miażdżycowej oraz inne bardziej złożone uszkodzenia. Miażdżyca tętnic jest przewlekłą chorobą zapalną błon wewnętrznych tętnic, charakteryzującą się postępującym odkładaniem się lipidów, takich jak cholesterol, komórek, takich jak makrofagi, limfocyty T lub komórek mięśni gładkich oraz matrycy zewnątrzkomórkowej [1]. Większe nagromadzenia są określane jako ogniska miażdżycowe bądź blaszki miażdżycowe, które zazwyczaj zawierają wapń. Tkanka tłuszczowa może uszkadzać ścianę naczynia, zmniejszać jego elastyczność oraz zmieniać przepływ krwi. Ewentualnie, wokół osadzających się blaszek miażdżycowych mogą formować się zakrzepy oddziaływujące później z przepływającą krwią co może doprowadzić do całkowitej okluzji naczyń krwionośnych. Zazwyczaj, miażdżyca tętnic jest związana z podwyższonymi poziomami stężenia we krwi cholesterolu LDL, fibrynogenu Lp(a) oraz czynnika VII, jak też z obniżonym poziomem cholesterolu HDL. Czynniki ryzyka obejmują wiek, płeć, palenie papierosów, cukrzycę, otyłość, wysoki poziom cholesterolu, dietę wysokotłuszczową oraz posiadanie w rodzinie przypadków chorób serca. Jest to główną przyczyną niedokrwienia organów wewnętrznych, takiego jak na przykład niedokrwienie mięśnia sercowego. Zakrzep zazwyczaj jest uszkodzeniem tętnic, które może ulegać dalszym komplikacjom prowadzącym do powstania zakrzepu z zatorami. Blaszki miażdżycowe zwężają zazwyczaj światło tętnic powodując niedokrwienie oraz czasami zanik tkanek w niedotlenionym obszarze. Poważne konsekwencje takiego stanu obejmują dusznicę bolesną wynikającą z niedokrwienia mięśnia sercowego, zawał serca wynikający z niedokrwistości bądź innych niezwiązanych przyczyn oraz nadciśnienie wynikające ze zwężenia tętnicy nerkowej i hipoperfuzji nerek, które fizjologicznie odpowiadają zwiększonym wydzielnictwem reniny. Czasami, miażdżyca i stwardnienie są opisywane jako rozróżnialne oddzielne przypadki zmian patologicznych, i wówczas miażdżyca tętnic jest definiowana jako twardnienie oraz utrata elastyczności przez tętnice na skutek specyficznego ogniska miażdżycowego, podczas gdy stwardnienie miażdżycowe jest to stwardnienie oraz utrata elastyczności tętnic z wszelkich innych przyczyn. Komplikacje i konsekwencje miażdżycy tętnic obejmują chorobę wieńcową (miażdżycę tętnic wieńcowych), niedobór w dostarczaniu krwi na skutek przeszkody (niedokrwienie/dusznica bolesna), ostre MI (zapalenie mięśnia sercowego, zawał serca), przejściowy atak niedokrwistości (TIA), bądź udar oraz zniszczenie naczyń krwionośnych, mięśni oraz innych narządów. Tętniaki, które są permanentnymi anormalnymi dylatacjami naczyń krwionośnych są także jedną z powszechnych konsekwencji miażdżycy tętnic. U starszych pacjentów zazwyczaj powstają odmiażdżycowe tętniaki aorty brzusznej. Mogą one ulec pęknięciu do przestrzeni zaotrzewnowej. W przypadku tętniaków odmiażdżycowych obserwowana jest zazwyczaj wyraźna utrata tkanki sprężystej oraz zwłóknienie mięśniówki przede wszystkim na skutek niedokrwienia mięśni mięśniówki tętnicy, powodującego uwalnianie enzymów makrofagów wywołujących fragmentację włókien sprężystych. Zalecenia w leczeniu i zapobieganiu miażdżycy tętnic obejmują obniżenie poziomu tłuszczu/cholesterolu we krwi. W szczególności, szeroko jest stosowane leczenie prowadzące do obniżenia poziomu cholesterolu LDL. Obecnie najpowszechniej wykorzystuje się specyficzne inhibitory reduktazy HMG-CoA. Inne obniżające poziom tłuszczu czynniki obejmują takie leki, jak cholestyramina, kolestypol, kwas nikotynowy, gemfibrozyl, probukol, lowastatynę oraz inne. Innym podejściem jest zminimalizowanie ryzyka powstania zatorów w uszkodzonych naczyniach miażdżycowych. Do zredukowania ryzyka powstawania skrzepu może być także wykorzystana aspiryna, która wydaje się być specyficznym inhibitorem agregacji płytek krwi, w której pośredniczy tromboksan A2, bądź inne środki przeciwkrzepliwe. Przezskórna angioplastyka balonikowa stosuje zakończony balonikiem cewnik w celu wyrównania płytki i zwiększenia przepływu krwi przez zwężenie w naczyniu. Technika ta jest podobna do techniki wykorzystywanej do otwierania tętnic serca, lecz może być stosowana do udrażniania licznych tętnic w innych częściach ciała. Zwężenia tętnicy wieńcowej są omijane przez wszycie fragmentów żyły

3 PL B1 3 odpiszczelowej do bliższej aorty lub przez nacinanie wewnętrznej tętnicy piersiowej z klatki piersiowej i zespolenie jej dystalnego końca z tętnicą na przednim płacie serca. W niektórych przypadkach może być zalecane chirurgiczne usunięcie złogów (endarterektomia, na przykład, endarterektomia tętnicy szyjnej). Jednak, przede wszystkim zalecane jest stosowanie leczenia bądź kontroli czynników ryzyka, takie jak stosowanie niskotłuszczowej, ubogiej w cholesterol i sól diety popartej opieką medyczną dostarczającą zaleceń w leczeniu i kontroli nadciśnienia, cukrzycy oraz innych chorób, redukcja masy ciała, zaprzestanie palenia, jak też regularne ćwiczenia mające na celu poprawę kondycji serca i krążenia. Stan zapalny towarzyszy różnym etapom miażdżycy tętnic [1]. Uszkodzenie śródbłonka będące wynikiem działania licznych czynników, takich jak niewielki ucisk, działanie zmodyfikowanych cząsteczek lipoprotein oraz zapalnych cytokinez jest pierwszym etapem miażdżycy tętnic i jest pod kontrolą stanów zapalnych [1]. Liczne z ostatnich badań ukazują że oddziaływania pomiędzy komórkami naczyniowymi a komórkami wywołującymi zapalenie są decydujące dla rozwoju miażdżycy tętnic [1]. W szczególności blokowanie zdefiniowanych szlaków zakażenia redukuje rozwój miażdżycy tętnic [1]. Zapalenie odgrywa także istotną rolę w pękaniu blaszki miażdżycowej oraz powstawaniu zakrzepicy [2-5] i dlatego też wywiera wpływ na występowanie zespołu ostrej niedokrwistości i związanej z tym umieralności [6]. W rzeczywistości, ostre objawy kliniczne, takie jak zawał serca, niedokrwienie mózgu bądź innych organów zaatakowanych przez miażdżycę tętnic są przede wszystkim wynikiem zamykania światła naczynia poprzez skrzeplinę powstającą w kontakcie z uszkodzoną blaszką miażdżycową [3,4]. Badania patologiczne wskazują że naruszone lub niestabilne blaszki, tj. blaszki mające tendencję do pękania, bądź już pęknięte, znacznie się różnią zarówno budową komórki jak i składem płynu międzykomórkowego w porównaniu do stabilnych blaszek niewykazujących tendencji do pękania [7]. Liczne blaszki miażdżycowe są bogate w komórki zapalne (makrofagi oraz komórki T), zawierają tworzące skrzepliny jądro lipidowe i są otoczone poprzez włóknisty płaszcz tracący na masie w matrycy zewnątrzkomórkowej [7]. Zmniejszający się poziom syntezy kolagenu, czemu pośredniczą wywołujące stan zapalny cytokiny IFNγ, oraz zwiększona aktywność niszczących macierz mataloproteinaz pochodzących z makrofagów, są odpowiedzialne za zmniejszanie grubości i kruszenie włóknistego płaszcza [7]. Pęknięcie kruchego włóknistego płaszcza odsłania łatwo tworzące skrzepliny jądro lipidowe na kontakt z krwią w krwioobiegu, co prowadzi do powstawania skrzepliny [1,7]. Dlatego też, gęstość komórek zapalnych w uszkodzonej miażdżyca tętnicy wydaje się być dobrym wskaźnikiem jej niestabilności. Rokowanie kliniczne u pacjenta z miażdżycą tętnic jedynie w części zależy od rozmiaru skrzepliny [19,20]. Obecnie powszechnie wiadomo, że raczej jakość (skład blaszki), a nie wielkość skrzepliny, może być czynnikiem wskazującym na występowanie incydentów niedokrwiennych. W rzeczywistości poważne objawy kliniczne miażdżycy tętnic (zawał serca lub niedokrwienie mózgu) są przede wszystkim wynikiem zamknięcia światła naczynia poprzez skrzeplinę powstającą w miejscu, gdzie została uszkodzona blaszka miażdżycowa [19]. Badania patologiczne ukazują że naruszone lub niestabilne blaszki, tj. blaszki mające tendencję do pękania bądź też już pęknięte, są bogate w komórki zapalne i wykazują znaczną utratę komórek gładkich mięśni oraz zmniejszenie zawartości kolagenu [20,21]. Co więcej, blaszki takie wykazują zwiększoną zdolność apoptozy komórkowej prowadzącą do formowania się jądra lipidowego o wysokiej zdolności tworzenia skrzeplin [13,22]. W proces zapalny zaangażowane są pro-zapalne cytokiny. Cytokina, interleukina 18 (IL-18) była opisana początkowo jako czynnik indukujący interferon-γ (IFN-γ) [8]. Jest to wczesny sygnał w rozwijaniu odpowiedzi limfocytów-t pomocniczych typu 1 (Th1). IL-18 działa wspólnie z IL-12, IL-2, antygenami, mitogenami oraz potencjalnie z innymi czynnikami aby wywołać wytwarzanie IFN-γ. IL-18 wzmacnia wytwarzanie GM-CSF oraz IL-2, wzmaga proliferację komórek T wywołaną przez anty-cd3, oraz potęguje proces unicestwiania prowadzony przez komórki - naturalni zabójcy, któremu pośredniczy Fas. Dojrzały IL-18 jest wytwarzany ze swojego prekursora ll-1β poprzez enzym konwertujący (ICE, kaspaza-1). Receptor IL-18 składa się z co najmniej dwóch składowych współpracujących w wiązaniu ligandu. Miejsca wiążące IL-18 o wysokim i niskim powinowactwie odnaleziono w komórkach stymulowanych mysim IL-12 T [9], co sugeruje występowanie wielołańcuchowego kompleksu receptorowego. Jak dotąd zidentyfikowano dwie podjednostki receptora, obie należące do grupy receptorów IL-1 [10]. Sygnał transdukcji IL-18 obejmuje aktywację NF-κB [11].

4 4 PL B1 Ostatnio wyizolowano z ludzkiego moczu rozpuszczalne białko o silnym powinowactwie wobec IL-18 i sklonowano zarówno mysie jak i ludzkie cdna [12; WO 99/09063]. Białko to oznaczono jako białko wiążące IL-18 (IL-18BP). IL-18BP nie jest żadną z zewnątrzkomórkowych domen białkowych jakiegokolwiek ze znanych receptorów IL-18, a wydzielonym, naturalnie występującym w krwioobiegu białkiem. Należy ono do nowej rodziny wydzielonych białek zawierającej dodatkowo kilka białek kodowanych przez wirus ospy [12]. IL-18BP jest konstytutywnie poddawane ekspresji w śledzionie [12]. Zarówno IL-18BP z moczu jak i rekombinowane IL-18BP wiąże się specyficznie IL-18 z dużym powinowactwem i moduluje biologiczne właściwości IL-18. Gen IL-18BP zlokalizowano w ludzkim chromosomie 11q13 i nie odnaleziono eksonu kodującego transmembranową domenę w 8,3 kb sekwencji genomu. U ludzi odkryto cztery warianty izoformy IL-18BP i oznaczono jako IL-18BP a, b, c, oraz d, wszystkie charakteryzujące się taką samą N- -końcową grupą i różnymi grupami C-końcowymi [12]. Cztery ludzkie i dwie mysie izoformy IL-18BP uzyskane przez składanie mrna i odnalezione w różnych bibliotekach cdna poddano ekspresji, a następnie oczyszczono i oceniono ich aktywność biologiczną względem wiązania i neutralizacji IL-18 [23]. Izoforma a ludzkiego IL-18BP (IL-18BPa) wykazywała największe powinowactwo wobec IL-18, ze znaczną szybkością wiązania i wolną uwalniania, o stałej dysocjacji (K(d)) wynoszącej 399 pm. IL-18BPc powiela domenę Ig IL-18BPa za wyjątkiem 29 C-końcowych aminokwasów; stała K(d) IL-18BPc jest dziesięciokrotnie mniejsza (2,94 nm). Niemniej jednak, IL-18BPa oraz IL-18BPc neutralizują w dwukrotnym nadmiarze molowym IL-18 w > 95%. Izoforma IL-18BPd nie posiada całej domeny Ig oraz zdolności wiązania i neutralizacji IL-18. Mysie izoformy IL-18BPc oraz IL-18BPd posiadające identyczne domeny Ig także w > 95% neutralizują mysią IL-18 w dwukrotnym nadmiarze molarnym. Jednak, mysia IL-18BPd, która posiada identyczny C-końcowy motyw, co ludzki IL-18BPa także neutralizuje ludzki IL-18. Modelowanie molekularne zidentyfikowało liczne mieszane elektrostatyczne oraz hydrofobowe miejsca wiążące w domenie Ig IL-18BP, które to mogą być odpowiedzialne za wysokie powinowactwo wiążące ligand [23]. Niniejszy wynalazek jest oparty na ujawnieniu, że inhibitor IL-18 posiada wyraźnie korzystny wpływ na rozwój blaszki miażdżycowej, postęp blaszki i jej stabilność w mysim modelu miażdżycy tętnic. Inhibitor IL-18 nie tylko zapobiega formowaniu się uszkodzenia w tętnicy piersiowej, lecz także wywołuje przekształcenie w stabilną blaszkę fenotypu z już ustabilizowaną blaszką miażdżycową Dlatego też, wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białek wiążących IL-18 (IL-18BP), mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18. Korzystnie lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do leczenia i/lub zapobiegania zakrzepicy blaszki miażdżycowej, do leczenia i/lub zapobiegania owrzodzeniu blaszki miażdżycowej, do leczenia i/lub zapobiegania destabilizacji blaszki miażdżycowej, do leczenia i/lub zapobiegania objawom niedokrwienia wynikającego z destabilizacji blaszki lub do leczenia i/lub zapobiegania pękaniu blaszki miażdżycowej. Korzystnie inhibitorem IL-18 stosowanym zgodnie z wynalazkiem jest przeciwciało przeciwko IL-18, korzystniej przeciwciało humanizowane, a najkorzystniej przeciwciało ludzkie. Również korzystnie inhibitorem IL-18 jest IL-18BP, muteina IL-18BP obejmująca konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białko fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, korzystniej immunoglobuliny izotypu IgG1 albo IgG2, lub IL-18BP modyfikowane PEG, przy czym muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18. Lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku korzystnie obejmuje ponadto inny czynnik do jednoczesnego, kolejnego albo oddzielnego zastosowania wybrany z grupy obejmującej interferon, np. interferon β, antagonistę czynnika martwicy nowotworu (TNF), np. TBPI i/lub TBPII, inhibitor-cox, np. inhibitor COX-2, inhibitor tromboksanu, np. aspirynę, czynnik zmniejszający stężenie lipidów, np. inhibitor HMG CoA, a korzystniej statynę. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest stosowany w kombinacji z niskotłuszczową i/lub ubogą w cholesterol i/lub ubogą w sól dietą.

5 PL B1 5 Zgodnie z wynalazkiem inhibitor IL-18 jest korzystnie stosowany w ilościach od około 0,0001 do 10 mg/kg wagi ciała, albo od około 0,01 do 5 mg/kg wagi ciała albo od około 0,1 do 3 mg/kg wagi ciała albo od około 1 do 2 mg/kg masy ciała, a korzystniej w ilości od około 0,1 do 1000 μg/kg wagi ciała albo od 1 do 100 μg/kg wagi ciała albo od około 10 do 50 μg/kg wagi ciała. Korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku jest przeznaczony do podawania podskórnie lub domięśniowo, codziennie lub co drugi dzień. Wynalazek dotyczy także terapii genowej. Zatem przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/albo zapobiegania miażdżycy tętnic, przy czym inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz IL-18BP, mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, a muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18. Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku wektor ekspresyjny jest podawany przez elektrotransfer, korzystnie ogólnoustrojowo, a najkorzystniej domięśniowo. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie komórek genetycznie modyfikowanych tak, aby wytwarzały określony powyżej inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic. Wynalazek dotyczy także zastosowania IL-18 jako markera diagnostycznego postępu miażdżycy tętnic. Krótki opis figur Figura 1 przedstawia histogram opisujący procent przeżycia ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej po inkubacji z samymi utlenionymi lipoproteinami lub też po inkubacji z kombinacją utlenionych lipoprotein oraz odpowiednio przeciwciała IL-18 i IL18-BP. Figura 2 przedstawia Western Biot przeprowadzony na ekstrakcie białek z tętnic objętych miażdżycą w porównaniu do tętnicy kontrolnej. W Western-Blottingu stosowano przeciwciała skierowane przeciwko IL-18BP (hil18bp), podjednostce a receptora IL-18 (hil18rα), IL18 (hll18) oraz kaspazie-1 (Kaspaza-1 p10). Figura 3 przedstawia wybarwiony bromkiem etydyny żel agarozowy ukazujący wyniki analizy RT-PCR mrna IL-18 oraz IL-18BP w komórkach blaszki miażdżycowej. Figura 4 Reprezentatywne wyniki RT-PCR dla IL-18BP oraz IL-18 w blaszkach miażdżycowych w porównaniu do ekspresji hα-aktyny (kontroli) w objawowych i bezobjawowych blaszkach. Figura 5 przedstawia mapę wektora ekspresyjnego wykorzystywanego do domięśniowego elektrotransferu u myszy. Figura 6 przedstawia histogram obrazujący lipidowy wybarwiony obszar w objętych miażdżycą tętnicach. Wspomagana przez komputer ilościowa analiza obrazu rozmieszczenia lipidów. Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. (n=19 dla pustych plazmidów, n=14 dla plazmidu IL-18BP). Poczwórne gwiazdki oznacza P > 0,0001. Figura 7 przedstawia histogram obrazujący uszkodzenie zatoki aortalnej po leczeniu IL-18BP w porównaniu z kontrolą (pusty plazmid). Wspomagana przez komputer ilościowa analiza obrazu uszkodzonego obszaru. Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. (n=19 dla pustych plazmidów, n=14 dla plazmidu IL-18BP). Podwójna gwiazdka oznacza P < 0,01. Figura 8 przedstawia wpływ traktowania IL-18BP zawartość komórek zapalnych zmiany chorobowej. Wspomaganą przez komputer analizę ilościową obrazu wykorzystano w celu oznaczenia procentu obszaru dodatniego względem makrofagów (słupki czarne) oraz liczby infiltrujących limfocytów T na mm 2 (słupki szare) w uszkodzonej zatoce aortalnej kontrolnej (n=12 dla wybarwienia makrofagów, n=15 dla wybarwienia limfocytów T) lub leczonej IL-18BP myszy (n=13 dla makrofagów, n=12 dla limfocytów T). Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. Potrójne gwiazdki oznaczają P < 0,005; a poczwórne gwiazdki oznaczają P < 0,0001. Figura 9 przedstawia wpływ leczenia IL-18BP na zmiany chorobowe komórek mięśni gładkich i zawartość kolagenu. Wspomaganą przez komputer analizę ilościową obrazu wykorzystano w celu oznaczenia procentu obszarów dodatnich względem komórek mięśni gładkich (czarne słupki) oraz obszarów akumulacji kolagenu (szare słupki) w zmianach chorobowych zatoki aortalnej u kontrolnych (n=6 dla komórek mięśni gładkich, n=11 dla kolagenu) oraz poddanych leczeniu IL-18BP myszy (n=6

6 6 PL B1 dla komórek mięśni gładkich, n=13 dla kolagenu). Dane reprezentują średnie wartości z s.e.m. Pojedyncze gwiazdki oznaczają P < 0,05; a podwójne gwiazdki oznaczają P < 0,01. Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek jest oparty o ujawnienie zwiększonych poziomów znajdującego się w krwioobiegu IL-18 u pacjentów z ostrymi objawami choroby wieńcowej oraz zwiększone wytwarzanie IL-18 przez odpowiedzialne za udar niestabilne blaszki miażdżycowe w tętnicach szyjnych. Dodatkowo, wykazano, że elektrotransfer in vivo ekspresyjnego plazmidu DNA kodującego IL-18BP zapobiega rozwojowi włókien tłuszczowych w tętnicy piersiowej oraz spowalnia postęp zaawansowanej blaszki miażdżycowej w zatoce aortalnej w przyjętym mysim modelu miażdżycy tętnic. Co ważniejsze, transfekcja plazmidu IL-18BP wywołuje poważne zmiany w składzie blaszki (maleje liczba makrofagów, komórek T, komórek ulegających śmierci komórkowej oraz zawartość lipidów oraz zwiększa się zawartość komórek mięśni gładkich oraz zawartość kolagenu) prowadzące do wytworzenia stabilnego fenotypu blaszki. Wyniki te prezentują po raz pierwszy niezwykle ważną rolę inhibitora IL-18 w redukcji rozwoju/postępowania blaszki oraz w propagacji stabilnej blaszki. Tak, więc wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic. W kontekście niniejszego wynalazku termin zapobieganie odnosi się nie tylko do całkowitego zapobiegania określonym skutkom, lecz także do częściowego bądź znacznego zapobiegania, osłabiania, redukcji, obniżenia lub zmniejszenia skutków przed lub we wczesnym stadium choroby. Termin leczenie w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do każdego korzystnego wpływu na rozwój choroby, obejmującego osłabienie, redukcję, obniżenie lub zmniejszenie patologicznego rozwoju po początku choroby. Określenie inhibitor IL-18 w kontekście niniejszego wynalazku odnosi się do dowolnej cząsteczki modulującej wytwarzanie i/lub działanie IL-18 w taki sposób, że wytwarzanie i/lub działanie IL-18 jest osłabione, zredukowane, lub częściowo, znacząco lub całkowicie zniesione lub zablokowane. Inhibitor wytwarzania może być dowolną cząsteczką wpływającą negatywnie na syntezę, przetwarzanie i dojrzewanie IL-18. Rozważanymi inhibitorami według wynalazku mogą być, na przykład supresory ekspresji genu interleukiny IL-18, antysensowne mrna redukujące lub zapobiegające transkrypcji IL-18 mrna, bądź prowadzące do degradacji mrna, białka osłabiające prawidłowe składanie, lub częściowo bądź znacząco zapobiegającymi dojrzewaniu i wydzielaniu IL-18, proteazy degradujące IL-18 po jego zsyntetyzowaniu i im podobne. Inhibitorem wytwarzania może być inhibitor kaspaza-1 lub inhibitor ICE, na przykład zapobiegający dojrzewaniu IL-18. Inhibitor działania IL-18 może być, na przykład, antagonistą IL-18. Antagoniści mogą zarówno wiązać się albo sekwestrować same cząsteczki IL-18 z dostateczną specyficznością i powinowactwem, aby częściowo lub w sposób znaczący zneutralizować IL-18 lub miejsca wiążące IL-18 odpowiedzialne za wiązanie IL-18 do jego ligandu (przykładowo do receptorów). Antagonista może także blokować drogę sygnalizacji IL-18 aktywowaną przez komórki po związaniu się układu IL-18/receptor. Inhibitorami działania IL-18 mogą być zarówno rozpuszczalne receptory IL-18, jak też cząsteczki naśladujące receptory, bądź czynniki blokujące receptory IL-18, przeciwciała IL-18, takie jak na przykład przeciwciała monoklonalne lub dowolne inne czynniki lub cząsteczki zapobiegające wiązaniu IL-18 do jego celu, zmniejszające i zapobiegające tym samym zachodzeniu wewnątrz i zewnątrzkomórkowych reakcji, w których pośredniczy IL-18. Miażdżyca tętnic jest określana także mianem arteriosklerozy lub stwardnienia naczyń. W kontekście niniejszego wynalazku termin miażdżyca tętnic obejmuje wszelkie choroby lub stany chorobowe naczyń zazwyczaj opisywane jako miażdżyca tętnic, w których materiał tłuszczowy jest odkładany w ściankach naczyń, ewentualnie choroby wynikające z zawężenia i osłabienia przepływu krwi, jak też pęknięcia i/lub erozji związanej z formowaniem się zakrzepów. Według niniejszego wynalazku miażdżyca tętnicza obejmuje zarówno stwardnienie jak i utratę elastyczności naczyń w wyniku miażdżycy (miażdżyca tętnic) oraz w wyniku innych przyczyn (stwardnienie tętnic). Zarówno warunki patologiczne towarzyszące miażdżycy tętnic, jak też komplikacje i konsekwencje miażdżycy tętnic, które w niniejszym użyciu obejmuje termin miażdżyca tętnic opisano szczegółowo w zamieszczonej powyżej części określonej jako tło wynalazku. Postęp miażdżycy tętnic obejmuje formowanie się blaszki miażdżycowej oraz jej przekształcanie się w coraz to bardziej niestabilne formy. Tak, więc wynalazek dotyczy także zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku mającego na celu zmniejszenie i przeciwdziałanie rozwojowi miażdżycy tętnic.

7 PL B1 7 Okluzja naczyń przez skrzepy formujące się na blaszce miażdżycowej jest zjawiskiem poważnym w zawałach serca i udarach mózgu, które są najbardziej szkodliwymi konsekwencjami miażdżycy tętnic. Stąd też, wynalazek dotyczy także zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania tworzeniu się skrzepów na blaszce miażdżycowej. Stabilność blaszki wpływa na przekształcanie się blaszki miażdżycowej w szkodliwą i wrażliwą blaszkę, która posiada skłonności do inicjowania powstawania skrzepów. Tak więc wynalazek dotyczy ponadto zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub leczenia niestabilności blaszki miażdżycowej. Niestabilna blaszka miażdżycowa jest podatna na pękanie, a pęknięta blaszka może wywołać powstanie skrzepu. Dlatego też niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania erozji i pękania blaszki miażdżycowej. Niestabilność blaszki oraz zakrzepica mogą być wynikiem np. apoptozy komórek, która wiąże się z wysoką aktywnością prokoagulacyjną i może być zjawiskiem kluczowym prowadzącym zarówno do tworzenia się skrzepów i zerodowanych bądź popękanych blaszek miażdżycowych, jak też zjawiska zatorów [13,14]. Pokazano, iż utlenione lipoproteiny (oxldl) wywołują apoptozę komórek makrofagów oraz śródbłonka w hodowli [15]. Jak pokazano w zamieszczonych niżej przykładach ujawniono teraz, że inhibitor IL-18 jest zdolny do znacznej redukcji liczby komórek ulegających śmierci komórkowej wywoływanej przez oxldl. Niniejszym ujawniano w sposób zaskakujący, że poziom IL-18 we krwi jest znacznie wyższy u pacjentów z niewydolnością krążenia doświadczonych różnymi nawracającymi zdarzeniami takimi, jak np. śmierć, nawracająca niedokrwistość, rewaskularyzacja, rozwój miażdżycy tętnic bądź powtórna hospitalizacja po niewydolności krążenia w stosunku do pacjentów niepowracających do szpitala. Wzrost poziomu IL-18 był znacznie wyraźniejszy u pacjentów, u których wkrótce stwierdzono zgon w porównaniu do tych, którzy przeżyli. Podwyższone poziomy IL-18 we krwi zaobserwowano zarówno w przypadku pacjentów z niedokrwistością jak też u pacjentów niedotkniętych tą dolegliwością. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku inhibitor IL-18 jest wybrany z grupy składającej się z przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnej z podjednostek IL-18, białek wiążących IL-18 (IL-18BP), mutein IL-18BP obejmujących konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białek fuzyjnych IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowanych PEG, przy czym muteina, białko fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowuje aktywność biologiczną wiązania IL-18. Stosowane tu określenie luteina odnosi się do analogów IL-18BP, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych naturalnego IL-18BP została zastąpiona przez różne reszty aminokwasowe. Muteiny są wytwarzane dobrze znanym sposobem syntezy i/lub techniką ukierunkowanej miejscowo mutagenezy, bądź dowolną inną znaną odpowiednią techniką. Korzystnie, każda z tych mutein posiada sekwencję aminokwasów dostatecznie powielającą sekwencję IL-18BP, tak aby posiadać zasadniczo podobną aktywność do IL-18BP. Jedną z aktywności IL-18 BP jest zdolność wiązania IL-18. Tak długo, jak muteina posiada zasadniczą zdolność wiązania IL-18 może być stosowana w procesie oczyszczania IL-18, takim jak oczyszczanie z zastosowaniem chromatografii powinowactwa i dlatego może być istotnym posiadanie zasadniczo podobnej aktywności, co IL-18BP. Dlatego też może być określone czy dowolna dana muteina posiada zasadniczo taką samą aktywność co IL-18BP poprzez przeprowadzenie rutynowych eksperymentów obejmujących zastosowanie takich mutein np. w prostym teście kanapkowym, takim jak test radioimmunologiczny ELISA w celu oznaczenia czy dana muteina wiąże się do odpowiedniego znakowanego IL-18. Muteiny polipeptydów IL-18BP, które mogą być zastosowane zgodnie z niniejszym wynalazkiem, bądź też kwasy nukleinowe je kodujące, obejmują skończony zbiór zasadniczo zgodnych sekwencji jak podstawione białka lub polinukleotydy, które mogą być rutynowo otrzymane przez specjalistę w dziedzinie bez dodatkowych eksperymentów w oparciu o nauki i porady zaprezentowane w niniejszym wynalazku. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem korzystnymi zmianami mutein są te znane jako konserwatywne podstawienia. Konserwatywne podstawienia aminokwasów polipeptydów IL-18BP lub białek wirusowych IL-18BP mogą obejmować podstawienie synonimicznymi aminokwasami w obrębie grupy posiadającymi dostatecznie podobne właściwości fizykochemiczne, tak, że podstawienie pomiędzy elementami grupy będzie zachowywało biologiczną funkcję cząsteczki [16]. Jest bezsporne, że może również nastąpić insercja lub delecja aminokwasów w wymienionych powyżej sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie, gdy insercja lub delecja obejmuje zaledwie kilka aminokwasów, np. poniżej

8 8 PL B1 trzydziestu, korzystnie poniżej dziesięciu i nie usuwa i nie zmienia położenia aminokwasów istotnych dla funkcjonalnej konformacji, np. reszt cysteinowych. Białka i muteiny otrzymane przez taką delecję i/lub insercję są zgodne z rozwiązaniami według niniejszego wynalazku. Korzystnie, grupy synonimicznych aminokwasów są takie, jak zdefiniowano w Tabeli I. Korzystniej, grupy równoznacznych aminokwasów są takie, jak zdefiniowano w Tabeli II; i najkorzystniej, grupy równoznacznych aminokwasów są takie, jak zdefiniowano w Tabeli III. T a b e l a I Korzystne grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Grupa aminokwasów synonimicznych Ser Ser, Thr, Gly, Asn Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Pro Gly, Ala, Thr, Pro Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr Ala Gly, Thr, Pro, Ala Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Cys Ser, Thr, Cys His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln Asn Gln, Asp, Ser, Asn Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys Asp Glu, Asn, Asp Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu Met Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp Trp T a b e l a II Korzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Grupa aminokwasów synonimicznych Ser Ser Arg His, Lys, Arg Leu Leu, Ile, Phe, Met Pro Ala, Pro Thr Thr Ala Pro, Ala Val Val, Met, Ile Gly Gly Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu Phe Met, Phe, Val, Leu Tyr Phe, Tyr Cys Cys, Ser His His, Gln, Arg Gln Glu, Gln, His Asn Asp, Asn Lys Lys, Arg Asp Asp, Asn Glu Glu, Gln Met Met, Phe, Ile, Val, Leu Trp Trp

9 PL B1 9 T a b e l a III Najkorzystniejsze grupy synonimicznych aminokwasów Aminokwas Grupa aminokwasów synonimicznych Ser Ser Arg Arg Leu Leu, Ile, Met Pro Pro Thr Thr Ala Ala Val Val Gly Gly Ile Ile, Met, Leu Phe Phe Tyr Tyr Cys Cys, Ser His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Met Met, Ile, Leu Trp Met Przykłady substytucji aminokwasów w białkach, które mogą być zastosowane w celu uzyskania mutein polipeptydów bądź białek IL-18BP do zastosowania w niniejszym wynalazku obejmują dowolne znane sposoby, takie jak przedstawione w patentach USA , oraz Mark'a i wsp.; w Koths'a i wsp., w Namen'a i wsp.; Chong'a i wsp.; i w Lee i wsp; oraz podstawienie lizyny w białkach opisane w patencie USA Nr (Show i wsp.). Termin białka fuzyjne odnosi się do polipeptydów obejmujących IL-18BP połączonych z innym białkiem, które np. posiada wydłużony okres półtrwania w płynach ustrojowych. Tak, więc IL-18BP mogą być połączone z innym białkiem, polipeptydem i tym podobnymi, np. immunoglobinami bądź ich fragmentami. Funkcjonalne pochodne jak użyto w niniejszym wynalazku obejmują pochodne IL-18BP zawierające wprowadzenie glikolu polietylenowego do łańcucha bocznego, który może zakrywać miejsca antygenowe i wydłużać obecność IL-18BP w płynach ustrojowych. W bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku inhibitor IL-18 jest przeciwciałem IL-18. Przeciwciała anty-il-18 mogą być przeciwciałami poliklonalnymi, monoklonalnymi, chimerycznymi, zhumanizowanymi lub całkowicie ludzkimi. Rekombinowane przeciwciała lub ich fragmenty charakteryzują się wysokim powinowactwem wiązania in vivo IL-18 oraz niską toksycznością. Przeciwciała, które mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku charakteryzują się niską toksycznością oraz możliwością zastosowania w leczeniu pacjentów przez okres wystarczający do osiągnięcia od dobrej do doskonałej poprawy lub złagodzenia stanu patogenicznego lub dowolnego symptomu bądź grupy symptomów związanych ze stanem patogenicznym. Przeciwciała neutralizujące są wywoływane u zwierząt takich jak króliki, kozy lub myszy przez immunizację IL-18. Immunizowane myszy są szczególnie użyteczne w dostarczaniu komórek B do wytwarzania hybrydom, które to są przekształcane w hodowle do wytwarzania znacznych ilości przeciwciał monoklonalnych anty-il-18. Przeciwciałami chimerycznymi są cząsteczki immunoglobulin charakteryzujące się dwoma lub więcej segmentami bądź partiami pochodzącymi od innych gatunków zwierząt. Zasadniczo, zmienny region przeciwciała chimerycznego pochodzi z przeciwciał ssaków innych niż ludzie, takich jak mysie przeciwciała monoklonalne, a stały region immunoglobuliny pochodzi z cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, oba regiony i ich kombinacja posiadają jak rutynowo określono niską immunogenność [24]. Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin wytworzonymi technikami inżynierii genetycznej, w których stały mysi region jest zastąpiony ludzkim odpowiednikiem zachowującym

10 10 PL B1 mysi region wiążący antygenu. Uzyskane chimeryczne mysio-ludzkie przeciwciało korzystnie posiada zmniejszoną immunogenność i zwiększoną farmokinetykę u ludzi [25]. Dlatego też, w bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku przeciwciało IL-18 jest humanizowanym przeciwciałem IL-18. Korzystne przykłady humanizowanych przeciwciał anty-il-18 opisano na przykład w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym EP W jeszcze korzystniejszym wykonaniu niniejszego wynalazku przeciwciało IL-18 jest całkowicie ludzkim przeciwciałem. Technologię wytwarzania ludzkich przeciwciał opisano szczegółowo np. WO00/76310, WO99/53049, US lub Au Całkowicie ludzkie przeciwciała korzystnie są rekombinowanymi przeciwciałami wytworzonymi przez zwierzęta transgeniczne, np. ksenomyszy, obejmującymi wszystkie części loci funkcjonalnego ludzkiego Ig. W najkorzystniejszym wykonaniu niniejszego wynalazku, inhibitorem IL-18 jest IL-18BP, muteina IL-18BP obejmująca konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białka fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowane PEG. Te muteiny, białka fuzyjne lub funkcjonalne pochodne zachowują aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności zdolność wiązania IL-18 oraz korzystnie posiadają aktywność zasadniczo przynajmniej podobną do IL-18BP. Idealnie, białka takie posiadają aktywność biologiczną która jest nawet większa od aktywności niezmodyfikowanego IL-18BP. Sekwencje IL-18BP oraz ich mieszane warianty/izoformy mogą być wzięte z WO99/09063 lub z [12] jak też z [23]. Funkcjonalne pochodne IL-18BP są przyłączone do polimerów w celu poprawy właściwości białka, takich jak jego stabilność, okres półtrwania, biodostępność, tolerancja przez ludzki organizm lub immunogenność. W celu osiągnięcia tego celu IL-18BP jest łączone np. z glikolem polietylenowym (PEG). Modyfikacja PEG może być prowadzona na przykład znanymi sposobami opisanymi w WO 92/ Tak, więc w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku IL-18BP jest modyfikowane PEG. Wynalazek dotyczy także inhibitora IL-18 będącego białkiem fuzyjnym zawierającym białko wiążące IL-18, które jest połączone z częścią immunoglobuliny. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że ostatecznie uzyskane białko zachowuje aktywność biologiczną IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18. Połączenie może być bezpośrednie, bądź poprzez krótki łączący peptyd (linker), który może być tak krótki jak 1-3 reszty aminokwasowe, lub dłuższy, na przykład 13 reszt aminokwasowych. Omawiany łącznik może być na przykład trójpeptydem o sekwencji E-F-M (Glu-Phe-Met) lub łącznikiem o 13 grupach aminokwasowych o sekwencji Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met umieszczonym pomiędzy sekwencją aminokwasów IL-18BP a sekwencją immunoglobuliny. Uzyskane białko fuzyjne charakteryzuje się poprawionymi właściwościami, takimi jak wydłużony czas trwania w płynach ustrojowych (okres półtrwania), zwiększona specyficzna aktywność, podwyższony poziom ekspresji lub ułatwiony jest proces oczyszczania białka fuzyjnego. IL-18BP jest połączony do regionów łańcucha ciężkiego, na przykład domen CH 2 i CH 3 ludzkiego IgG1. Tworzenie specyficznych białek fuzyjnych zawierających IL-18BP oraz część immunoglobuliny opisano na przykład w przykładzie 11 WO 99/ Inne izoformy cząsteczek Ig, takie jak izoformy IgG 2 czy IgG 4, lub innych klas, takich jak IgM czy IgA są również odpowiednie do wytwarzania białek fuzyjnych według niniejszego wynalazku. Białka fuzyjne mogą być monomeryczne, multimeryczne, hetero- lub homomultimeryczne. Interferony są znane przeważnie ze swego blokującego wpływu na replikację wirusa i proliferację komórek. Na przykład, interferon-γ odgrywa ważną rolę w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej i zapalnej. Przyjmuje się, że interferon β (IFN-β, interferon typu I) odgrywa rolę przeciwzapalną. Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania kombinacji inhibitora IL-18 i interferonu do wytwarzania leku do leczenia miażdżycy tętnic. Interferony mogą być również przyłączone do polimerów w celu poprawy stabilności białek. Na przykład, połączenie interferonu β z alkoholem wielowodorotlenowym, takim jak glikol polietylenowy (PEG) było opisane w WO 99/ W innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku interferon jest i interferonem β, a korzystniej interferonem β 1a. Wytwarzanie i/lub działanie inhibitora IL-18 korzystnie jest prowadzone/stosowane jednocześnie, następczo lub oddzielnie z interferonem. W jeszcze innym wykonaniu wynalazku, inhibitor IL-18 jest stosowany w połączeniu z antagonistą TNF. Antagoniści TNF wywierają swoją aktywność wieloma sposobami. Po pierwsze, antagoniści

11 PL B1 11 mogą się wiązać albo sekwestrować cząsteczki TNF z dostatecznym powinowactwem i specyficznością, aby częściowo lub w sposób znaczący zneutralizować epitop lub epitopy TNF odpowiedzialne za wiązanie receptora TNF (określanych tutaj terminem antagonistów sekwestrujących ). Antagonistą sekwestrującym może być, na przykład, przeciwciało działające przeciw TNF. Alternatywnie, antagoniści TNF mogą hamować szlak sygnalizowania TNF aktywowany przez powierzchniowe receptory komórkowe po związaniu TNF (określane tutaj terminem antagonistów sygnalizacyjnych ). Obie grupy antagonistów są użyteczne zarówno same, jak i razem, w kombinacji z inhibitorem IL-18 w leczeniu miażdżycy tętnic. Antagoniści TNF są łatwo identyfikowani i oznaczani przez standardowe badania przesiewowe na wrażliwych liniach komórkowych in vitro, na przykład ludzkich komórek B, w których TNF powoduje proliferację i wydzielanie immunoglobulin. Test obejmuje preparat TNF przy różnych rozcieńczeniach kandydujących antagonistów np. od 0,1 do 100-krotnego w stosunku do molowej ilości TNF zastosowanej w teście oraz kontrole niezawierające TNF lub jedynie zawierające antagonistę [26]. Do zastosowania zgodnie z niniejszym wynalazkiem antagoniści sekwestrujący są korzystnie antagonistami TNF. Wśród antagonistów sekwestrujących preferowane są te polipeptydy, które wiążą TNF z dużym powinowactwem i posiadają niską immunogenność. Szczególnie korzystne są rozpuszczalne cząsteczki receptora TNF i przeciwciała zobojętniające TNF. Dla przykładu, użyteczne w niniejszym wynalazku są rozpuszczalne TNF-RI oraz TNF-RII. W szczególności korzystnymi antagonistami według niniejszego wynalazku są skrócone formy tych receptorów obejmujące zewnątrzkomórkowe domeny receptorów lub ich części funkcjonalnych. Skrócone rozpuszczalne receptory TNF typu I i typu II opisano na przykład w zgłoszeniu EP Skrócone formy receptorów TNF są rozpuszczalne i zostały oznaczone w moczu oraz osoczu jako białka wiążące inhibitor TNF o masie 30 kda i 40 kda, które nazwano odpowiednio TBPI oraz TBPII [27]. Ich jednoczesne, następcze oraz rozdzielne zastosowanie inhibitora IL-18 z antagonistą TNF i/lub interferonem zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest korzystne. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem TBPI oraz TBPII są korzystnymi antagonistami TNF stosowanymi w połączeniu z inhibitorem IL-18. Pochodne, ich fragmenty, obszary i aktywne biologicznie porcje cząsteczek receptora są podobne do cząsteczek receptora także mogą być zastosowane w niniejszym wynalazku. Taki aktywny biologicznie odpowiednik lub pochodna cząsteczki receptora odnosi się do części polipeptydu, lub sekwencji kodującej cząsteczkę receptora, która jest wystarczających rozmiarów i jest zdolna do wiązania TNF z takim powinowactwem, że oddziaływanie ze związanym z błoną receptorem TNF jest inhibitowane lub zablokowane. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku ludzki rozpuszczalny TNF-RI (TBPI) jest antagonistą TNF do zastosowania według niniejszego wynalazku. Naturalne oraz rekombinowane cząsteczki rozpuszczalnych receptorów TNF oraz sposoby ich wytwarzania opisano w europejskich zgłoszeniach patentowych EP , EP oraz EP Inhibitor IL-18 może być stosowany jednocześnie, następczo lub oddzielnie z inhibitorem TNF. Korzystnie jest stosowane połączenie przeciwciała IL-18 lub surowicy odpornościowej i rozpuszczalnego receptora TNF posiadającego aktywność blokowania TNF. W jeszcze bardziej korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku lek dodatkowo zawiera inhibitor COX, korzystnie inhibitor COX-2. Inhibitory COX są znane w dziedzinie. Specyficzne inhibitory COX-2 ujawniono na przykład w zgłoszeniu WO 01/ Inhibitory tromboksanu, w szczególności tromboksanu A2 są obecnie powszechnie używane w leczeniu miażdżycy tętnic. Dlatego też, w jeszcze korzystniejszym wykonaniu wynalazku lek dodatkowo zawiera inhibitor tromboksanu, a w szczególności inhibitor tromboksanu A2 w celu jednoczesnego, następczego i oddzielnego zastosowania. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem szczególnie korzystnym jest użycie kombinacji inhibitora IL-18 i aspiryny. Jednym z powodów powstawania miażdżycy tętnic wydaje się być wysokie stężenie lipidów we krwi. Dlatego też, w dalszym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku lek ponadto zawiera czynnik zmniejszający stężenie lipidów do jednoczesnego, kolejnego bądź oddzielnego zastosowania. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być stosowany dowolny znany w dziedzinie czynnik zmniejszający stężenie lipidów we krwi. Dalsze czynniki obniżające poziom tłuszczu obejmują kolestyraminę, kolestypol, kwas nikotynowy, gemfibrozil, probukol oraz inne. Szczególnie korzystny jest inhibitor HMG CoA reduktazy, a korzystniej tak zwane statyny. Wiele statyn jest znanych w dziedzinie, takich jak symwastatyna lub lowastatyna.

12 12 PL B1 Korzystne wykonanie niniejszego wynalazku w celu jeszcze lepszego zapobiegania i/lub leczenia miażdżycy tętnic, odnosi się do zastosowania inhibitora IL-18 w połączeniu z dietą niskotłuszczową i/lub dietą niskocholesterolową i/lub ubogą w sól. W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała bądź około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała czy około 1 do 2 mg/kg masy ciała. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu inhibitor IL-18 jest używany w ilości około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała lub 1 do 100 μg/kg masy ciała bądź około 10 do 50 μg/kg masy ciała. Niniejszy wynalazek dotyczy ponadto zastosowania wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencją kodującą inhibitor IL-18 do wytwarzania leku do zapobiegania i/lub leczenia miażdżycy tętnic. Podejście terapii genowej jest też wykorzystywane do leczenia i/lub zapobiegania chorobie. Korzystnie, ekspresja inhibitora IL-18 będzie następowała in situ, blokując skutecznie w ten sposób Il-18 bezpośrednio w tkance(kach) lub komórkach dotkniętych chorobom. Jak opisano szczegółowo w przykładach zamieszczonych poniżej wykazano, że wydajna ekspresja IL-18BP może być pokazana na mysim modelu choroby po elektrotransferze wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą IL-18BP. Dlatego też, w korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku wektor ekspresyjny jest podawany poprzez elektrotransfer, korzystniej domięśniowo. Zastosowanie wektora w celu wywołania i/lub wspomagania endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórkach normalnie niewykazujących ekspresji inhibitora IL-18, lub, w których ilości wyrażanego inhibitora są niewystarczające, są również rozważane zgodnie z wynalazkiem. Wektor może zawierać sekwencje kontrolne użyteczne w komórkach wymagających ekspresji inhibitora IL-18. Takie kontrolne sekwencje mogą być na przykład promotorami bądź wzmacniaczami. Kontrolne sekwencja może być wprowadzona do właściwego locus genomu poprzez rekombinację homologiczną funkcjonalnie łącząc sekwencje kontrolną z genem, dla którego pożądane jest wywołanie lub wzmocnienie ekspresji. Technologia ta jest zazwyczaj określana jako endogenna aktywacja genowa (EGA, ang. endogenous gem activation) i jest opisana w np. zgłoszeniu WO 91/ Będzie to zrozumianym przez specjalistów w dziedzinie, że stosując tą samą technikę istnieje możliwość przerwania ekspresji IL-18, tj. poprzez wprowadzenie elementu wyciszacza, takiego jak np. element wyciszający, w locus genu IL-18 prowadząc tym samym do obniżenia lub uniemożliwienia ekspresji IL-18. Specjalista w dziedzinie zrozumie, że takie obniżenie lub wyciszenie ekspresji IL-18 wykazuje taki sam efekt jak zastosowanie inhibitora IL-18 do zapobiegania i/lub leczenia choroby. Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania zmodyfikowanych genetycznie komórek do wytwarzania inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic. Kompozycje farmaceutyczne użyteczne w szczególności do zapobiegania i/lub leczenia miażdżycy tętnic, zawierają efektywne terapeutycznie dawki inhibitora IL-18 oraz efektywne terapeutycznie dawki interferonu. Jako inhibitor IL-18 kompozycja może zawierać przeciwciała przeciwko IL-18, przeciwciała przeciwko dowolnej z podjednostek receptora IL-18 oraz białka wiążące IL-18, muteiny IL-18BP obejmujące konserwatywne podstawienia aminokwasowe, białka fuzyjne IL-18BP z regionami łańcucha ciężkiego immunoglobuliny, IL-18BP modyfikowane PEG, przy czym muteiny, białka fuzyjne lub IL-18BP modyfikowane PEG zachowują aktywność biologiczną wiązania IL-18. IL-18BP, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne jak opisano powyżej są korzystnymi składnikami aktywnymi kompozycji farmaceutycznych. Interferonem zawartym w kompozycji farmaceutycznej jest korzystnie IFN-p. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu kompozycja farmaceutyczna zawiera efektywne terapeutycznie dawki inhibitora IL-18, ewentualnie interferonu i antagonisty TNF. Antagoniści TNF mogą być przeciwciałami neutralizującymi aktywność TNF, lub rozpuszczalnymi skróconymi fragmentami receptora TNF, nazywanymi także TBPI i TBPII. Kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać jeden lub więcej inhibitorów COX, korzystnie inhibitory COX-2. Dodatkowo, kompozycja farmaceutyczna może zawierać inhibitor tromboksanu, taki jak aspiryna i/lub czynnik zmniejszający stężenie tłuszczu taki jak statyna. Definicja dopuszczalny farmaceutycznie obejmuje dowolny nośnik, który nie zakłóca efektywnie aktywności biologicznej składnika aktywnego i który nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Dla przykładu, do podawania pozajelitowego aktywne białko może być przygotowane w postaci jednostkowej dawki do iniekcji w nośnikach, takich jak roztwór soli, roztwór dekstrozy, albumina osocza krwi i roztwór Ringer'a.

13 PL B1 13 Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej mogą być podawane osobnikom na rozmaite sposoby. Drogi podawania obejmują podawanie śródskórne, przezskórne, (np. wolno uwalniające preparaty), domięśniowe, śródotrzewnowe, dożylne, podskórne, doustne, nadtwardówkowe, miejscowe i donosowe. Dowolne inne efektywne terapeutycznie drogi podawania mogą być użyteczne, na przykład, absorpcja przez tkankę nabłonkową lub śródbłonkową lub na drodze terapii genowej, w której pacjentowi podawana jest cząsteczka DNA kodująca czynnik aktywny (np. w postaci wektora), która dostarcza czynnika aktywnego na drodze ekspresji i wydzielania in vivo. Ponadto, zgodnie z niniejszym wynalazkiem białka mogą być podawane wraz z innymi składnikami czynników aktywnych biologicznie takimi jak dopuszczalne farmaceutycznie środki powierzchniowo czynne, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki oraz podłoża. Do podawania pozajelitowego (np. dożylnego, podskórnego, domięśniowego) białka aktywne mogą być podawane jako roztwory, zawiesiny, emulsje bądź liofilizowany proszek w połączeniu dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem do podawania pozajelitowego (np. woda, roztwór soli, roztwór dekstrozy) oraz dodatkami zapewniającymi izotoniczność (np. mannitem) lub chemiczną stabilność (np. środkami ochronnymi i buforami). Dostępność biologiczna aktywnego białka zgodnie z niniejszym wynalazkiem może być poprawiana przez zastosowanie procedur koniugacji, które zwiększają okres półtrwania cząsteczki w ludzkim organizmie, na przykład łącząc cząsteczkę z polietylenoglikolem jak ujawniono w zgłoszeniu patentowym PCT WO 92/ Skuteczne terapeutycznie dawki aktywnego białka zależą od wielu czynników, obejmujących typ antagonisty, powinowactwo antagonisty wobec IL-18, jakąkolwiek pozostałą aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistów, drogę podawania, stan i cechy pacjenta (płeć, wiek, masa ciała, stan zdrowia, wielkość), zakres objawów, jednoczesne leczenie, częstotliwość leczenia i pożądany efekt. Zarówno regulacja jak i manipulacja ustalonych przedziałów dawek, jak też sposoby określania hamowania IL-18 u osobników in vivo i in vitro mieści się w zakresie umiejętności specjalistów w dziedzinie. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem inhibitor IL-18 jest stosowany w ilości około 0,0001 do 10 mg/kg masy ciała lub około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała bądź około 0,01 do 5 mg/kg masy ciała lub około 0,1 do 3 mg/kg masy ciała bądź około 1 do 2 mg/kg masy ciała. Jeszcze korzystniej używana ilość inhibitora IL-18 jest ilością około 0,1 do 1000 μg/kg masy ciała lub 1 do 100 μg/kg masy ciała bądź około 10 do 50 μg/kg masy ciała. Drogą podawania, która jest korzystna zgodnie z niniejszym wynalazkiem jest droga podawania podskórnego. Zgodnie z wynalazkiem podawanie domięśniowe jest jeszcze korzystniejsze. W jeszcze korzystniejszym wykonaniu inhibitor IL-18 jest podawany codziennie lub co drugi dzień. Dzienne dawki są zazwyczaj podawane w dawkach dzielonych lub w postaci o przedłożonym uwalnianiu skutecznych w uzyskiwaniu pożądanych rezultatów. Za drugim lub kolejnym razem podawania podawana dawka może być taka sama, mniejsza lub większa niż pierwsza lub poprzednia dawka podawana pacjentowi. Pierwsza lub kolejne dawki mogą być podawane przed początkiem lub podczas choroby. Zgodnie z niniejszym wynalazkiem inhibitor IL-18 może być podawany w skutecznych terapeutycznie dawkach zapobiegawczo lub leczniczo pacjentowi przed, podczas lub następczo z innymi reżimami leczenia i czynnikami (np. w trybie wielolekowym). Aktywne czynniki podawane jednocześnie z innymi czynnikami leczniczymi mogą być podawane w tej samej, jak i różnych kompozycjach. Niniejszym opisano sposoby leczenia i/lub zapobiegania miażdżycy tętnic obejmujące podawanie wymagającemu tego gospodarzowi skutecznej hamującej dawki inhibitora IL-18 i podawanie wymagającemu tego gospodarzowi wektora ekspresyjnego zawierającego sekwencję kodującą inhibitor IL-18. Wektor ekspresyjny może być podawany ogólnoustrojowo, a korzystniej, na drodze wstrzyknięcia domięśniowego. Wynalazek dotyczy ponadto zastosowania IL-18 jako markera diagnostycznego postępu miażdżycy tętnic. Posiadając opisany wynalazek będzie łatwiejszym do zrozumienia poprzez odniesienie się do następujących przykładów.