Wstęp. Abstract. Streszczenie

Transkrypt

1 Streszczenie Dokładna struktura chemiczna melanin wciąż nie jest do końca poznana. Wynika to między innymi z silnych połączeń węgiel-węgiel pomiędzy jednostkami monomerycznymi budującymi dany pigment. W niniejszej pracy w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat budowy polimerów melaninowych wykorzystano nowoczesne metody badawcze takie jak: pirolizę połączoną z chromatografią gazową i spektrometrią mas (Py-GC/MS) oraz mikroskopię sił atomowych (AFM). Badaniom poddano syntetyczną melaninę otrzymaną z tyrozyny (Tyr-melaninę) oraz naturalną melaninę z Sepia officinalis (sepiomelaninę), stanowiące model ludzkiego pigmentu eumelaninowego. Wyniki pracy uwidaczniają różnice strukturalne pomiędzy Tyr-melaniną a sepiomelaniną i wskazują, że skład chemiczny zależy przede wszystkim od rodzaju substratu oraz warunków w jakich te pigmenty powstają. Słowa kluczowe: Tyr-melanina, sepiomelanina, piroliza, termochemoliza, mikroskopia sił atomowych Abstract Chemical structure of melanin pigments is still not recognized accurately. This is largely due to strong carboncarbon bonds between melanin monomer units. In this study, the modern research methods, i.e. pyrolysis connected with gas chromatography and mass spectrometry (Py-GC/ MS), and atomic force microscopy (AFM) were used to get some additional structural information on melanin polymers. Two models of human eumelanin pigment were studied, namely: synthetic melanin obtained from tyrosine (Tyr-melanin) and natural melanin from Sepia officinalis (sepiomelanin). The results revealed structural differences between Tyr-melanin and sepiomelanin, and indicated that chemical composition of melanin depends eventually upon its precursor type and specific conditions under which the pigment has been formed. Key words: Tyr-melanin, sepiomelanin, pyrolysis, thermochemolysis, atomic force microscope Wstęp Melaniny są barwnikami występującymi zarówno w świecie roślin, jak i zwierząt. Należą do grupy polimorficznych i wielofunkcyjnych polimerów [1-3]. Ilość i typ melaniny w skórze, tęczówce, włosach decyduje o ich zabarwieniu [4, 5]. Melaniny pochodzenia zwierzęcego można podzielić na dwie główne grupy: nierozpuszczalne brązowo-czarne pigmenty eumelaniny i rozpuszczalne w wodorotlenkach żółto-pomarańczowe feomelaniny [6, 7]. Bardzo ważnym momentem w historii badań nad melaniną było określenie przez Bertranda w 1886 roku, że prekursorem melaniny jest tyrozyna [8]. Pomimo faktu, że melanina została opisana ponad 100 lat temu, to jednak jej skład chemiczny i strukturalny nadal nie jest w pełni poznany [9, 10]. Trudności te wynikają między innymi z faktu, że jest ona prawie nierozpuszczalna, bardzo trudno izoluje się ją oraz oczyszcza z białkowych i lipidowych komponentów melanosomu. Ustalono, że eumelanina składa się głównie z jednostek indolowych i pirolowych, natomiast feomelanina zawiera przede wszystkim jednostki benzotiazynowe i benzotiazolowe [11-13]. Jednakże, w rzeczywistości naturalne melaniny to kopolimery zawierające w różnych proporcjach eumelaninę i feomelaninę [14, 15]. W badaniach właściwości fizykochemicznych melanin zaleca się stosowanie dostępnego komercyjnie i dobrze scharakteryzowanego preparatu melaninowego, co umożli-

2 wia badaczom wzajemne porównywanie wyników. Melaniny otrzymane z woreczków atramentowych mątwy (Sepia officinalis) i guzów czerniaka złośliwego (melanoma malignum) są powszechnie używanymi modelami naturalnych eumelanin [16, 17]. Ze względu na specyficzne właściwości naturalnego pigmentu w badaniach biochemicznych i fizjologicznych często wykorzystuje się syntetyczne melaniny, otrzymane z takich prekursorów, jak: tyrozyna, 3,4-dihydroksyfenyloalanina (DOPA), 5,6-dihydroksyindol (DHI) i kwas 5,6-dihydroksyindolo-2-karboksylowy (DHICA) [4, 18-19]. Celem pracy było wykorzystanie techniki pirolizy i termochemolizy w różnicowaniu profili pirolitycznych syntetycznej melaniny z tyrozyny i melaniny naturalnej z Sepia officinalis oraz obrazowanie i charakterystyka nanostruktury badanych biopolimerów za pomocą mikroskopii sił atomowych. Materiał i metody W badaniach wykorzystano komercyjnie dostępne wzorce pigmentu eumelaninowego: - syntetyczną melaninę otrzymaną z tyrozyny w obecności H 2 O 2 (SIGMA) - naturalną melaninę z Sepia officinalis (SIGMA). Piroliza i termochemoliza w badaniu struktury modelowych eumelanin Do degradacji biopolimerów melaninowych wykorzystano pirolizer firmy Pye Unicam bezpośrednio zainstalowany do układu GC-MS. Melaninę w ilości 50 μg nanoszono na drut ferromagnetyczny o średnicy 0,5 mm i długości 10 cm, o temperaturze Curie 770 C. Proces pirolizy prowadzono w atmosferze helu, który pełnił także rolę gazu nośnego w rozdziale chromatograficznym. Temperatura komory pirolizera wynosiła 220 C, a czas trwania pirolizy 8 sekund. W technice termochemolizy dodatkowo na drut pirolityczny po nałożeniu melaniny wprowadzano 5 μl 10% wodorotlenku tetrametyloamoniowego (TMAH) jako czynnika metylującego. W celu rozdzielenia produktów pirolizy i termochemolizy melanin zastosowano chromatograf gazowy model HP 5890 seria II firmy Hewlett Packard. Produkty termicznej degradacji melanin rozdzielono na kolumnie kapilarnej Rtx - 5MS (firmy Restek) o wymiarach: długość 60 m, średnica wewnętrzna 0,32 mm, grubość filmu 0,5 μm. Szybkość przepływu gazu nośnego wynosiła 1,8 cm 3 /min. Analizę chromatograficzną prowadzono wykorzystując programowane ogrzewanie kolumny (początkowa temperatura 40 o C była utrzymywana przez 5 min., następnie wzrastała z prędkością 10 o C/min do 220 o C). Identyfikacji produktów pirolizy i termochemolizy melanin po ich rozdziale chromatograficznym dokonano przy użyciu spektrometru mas model HP 5989A firmy Hewlett Packard. Temperatura źródła jonów wynosiła 200 C, a kwadrupola 100 C. Jonizację prowadzono strumieniem elektronów przy standartowej energii 70 ev. Obrazowanie nanostruktury modelowych eumelanin za pomocą AFM Obrazowanie nanostruktury biopolimerów melaninowych prowadzono za pomocą mikroskopii sił atomowych (ang. Atomic force microscopy AFM) przy użyciu zestawu NanoScope III d MultiMode (di-veeco, CA). Badania te przeprowadzono w Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych Polskiej Akademii Nauk w Zabrzu. Próbki melanin nanoszono w formie suchego zmikronizowanego proszku na szklane krążki. Skanowanie powierzchni polimerów odbywało się w temperaturze pokojowej w powietrzu przy użyciu skanera piezoelektrycznego 10 μm. W tym celu zastosowano ostrze wykonane z krzemu (Model TESP, Veeco, CA). Częstotliwość skanowania wynosiła 1 Hz. Badania topografii naniesionych próbek wykonano techniką przerywanego kontaktu (ang. tapping mode). Do analizy obrazów AFM wykorzystano oprogramowanie WsxM 4.0 (Nanotec Electronica, Spain) [20]. Każdorazowo uzyskiwano dwa rodzaje obrazów Height i Deflection. Obraz Height pozwala na określenie topografii badanego biopolimeru, natomiast obraz Deflection umożliwia bezpośrednią obserwację cech morfologicznych. Wyniki Na ryc. 1A przedstawiono chromatogram produktów termicznej degradacji wzorca melaniny otrzymanej z tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru (Tyr-melaniny). Łatwo zauważyć, że w obrazie chromatograficznym Tyr-melaniny wśród produktów pirolizy dominuje związek o czasie retencji 9,43 min, zidentyfikowany jako pirydyna. Dodatkowo pod względem ilościowym wyróżniają się: kwas octowy (5,22 min), 3 (4)-pirydynokarbonitryle (15,41 i 16,12 min). W mniejszych ilościach wykryto: benzen (7,07 min), pirol (9,70 min), toluen (10,09 min), fenol (15,37 min), benzoni- Ryc. 1. Chromatogram rozdziału produktów (A) pirolizy, (B) termochemolizy Tyr-melaniny.

3 Ryc. 2. Chromatogram rozdziału produktów (A) pirolizy, (B) termochemolizy melaniny z Sepia officinalis. tryl (15,71 min) oraz 3,4-pirydynodikarbonyloimid (24,03 min). Zaobserwowano także nieznaczny udział produktu o czasie retencji 17,35 min, którego nie udało się zidentyfikować. Znacznie bogatszy profil pirolityczny (ryc. 1B) charakteryzuje Tyr-melaninę poddaną termochemolizie w obecności TMAH. Analizując pirogramy (ryc. 1A-B) można zauważyć, że do wspólnych produktów pirolizy i termochemolizy Tyr-melaniny należą: kwas octowy, benzen, pirydyna, pirol, fenol i benzonitryl. Zaobserwowano, że podczas termochemolizy Tyr-melaniny zwiększa się udział metylowych pochodnych pirolu: 1-metylopirol (9,30 min), 2-metylopirol (12,02 min) oraz pirydyny: 4-metylopirydyna (12,90 min). Dodatkowo stwierdzono obecność 1-metylo-2,5- pirolidynodionu (17,75 min), estru metylowego kwasu pirydynokarboksylowego (18,32 min) oraz estru dimetylowego kwasu pirydynokarboksylowego (25,22 min), których nie wykryto podczas pirolizy tej melaniny. W pirogramie Tyr-melaniny poddanej termochemolizie pojawiło się więcej produktów niezidentyfikowanych (11,13; 16,55; 30,02 min), pochodzących prawdopodobnie z termicznej degradacji TMAH. Na ryc. 2A przedstawiono chromatogram produktów termicznej degradacji naturalnego wzorca eumelaniny-sepiomelaniny. W obrazie chromatograficznym sepiomelaniny wśród produktów pirolizy dominują związki o czasach retencji 9.40 i 9,71 min, zidentyfikowane jako pirydyna oraz pirol. Dodatkowo pod względem ilościowym wyróżniają się: toluen (10,10 min), 3 (2)-metylopirole (12,05 min, 12,31 min), fenol (15,37 min) oraz indol (21,56 min). W mniejszych ilościach wykryto: kwas octowy (5,19 min), benzen (7,06 min), styren (13,49 min), 4-metylofenol (17,32 min), benzylonitryl (18,78 min) oraz 3-metyloindol (23,06 min). Zaobserwowano także nieznaczny udział produktów o czasach retencji 8,96 i 11,13 min, których nie udało się zidentyfikować. Zastosowanie termochemolizy (ryc. 2B), podobnie jak w przypadku Tyr-melaniny, pozwoliło na uzyskanie większej liczby produktów w formie metylowych pochodnych. Dodatkowo w końcowym odcinku tego pirogramu (25-35 min) pojawiły się związki, które prawdopodobnie mogą pochodzić z rozpadu lipidów. Są to estry metylowe kwasów tłuszczowych: tetradekanowego (27,18 min), heksadekanowego (30,08 min), oktadekanowego (33,97 min) oraz n-alkeny: 1-heksadeken (25,80 min) i 1-oktadeken (30,48 min). Z przedstawionego na ryc. 3 zestawienia produktów pirolizy i termochemolizy Tyr-melaniny i sepiomelaniny wynika, że zawartość procentowa produktów badanych melanin zależy od źródła pochodzenia barwnika oraz warunków syntezy. Wśród składników pirolizatu i termochemolizatu otrzymanego z Tyr-melaniny dominują pochodne pirydyny, natomiast w profilu pirolitycznym melaniny wyizolowanej z Sepia officinalis dominują pochodne pirolu. Dodatkowo w profilu badanych melanin stwierdzono obecność pochodnych benzenu i fenolu. Natomiast wśród produktów pirolizy i termochemolizy Tyr-melaniny nie wykryto indolu i jego pochodnych. Poza tym tylko w wyniku termochemolizy sepiomelaniny otrzymano produkty pochodzenia lipidowego, tj.: estry metylowe kwasów tłuszczowych. Przedstawione zestawienie relacji ilościowych między grupami głównych produktów pirolizy i termochemolizy prowadzonej w obecności TMAH badanych melanin dowodzi o znacznym zróżnicowaniu ich profili pirolitycznych. Różnice pomiędzy syntetyczną Tyr-melaniną a naturalną sepiomelaniną zaobserwowano również podczas analizy obrazów uzyskanych za pomocą mikroskopii sił atomowych (AFM). Obrazy AFM Deflection i Height 2D dostępnego handlowo wzorca syntetycznej eumelaniny uzyskane przez skanowanie powierzchni o wielkości 3 μm x 3 μm ujawniają granulkowatą strukturę tego biopolimeru. Obrazy pokazują Ryc. 3. Analiza porównawcza produktów pirolizy i termochemolizy Tyrmelaniny i sepiomelaniny (nz - związki niezidentyfikowane).

4 Ryc. 4. Granulkowata nanostruktura melaniny syntetycznej otrzymanej z tyrozyny. Obrazy uzyskane za pomoca AFM: A - obraz Deflection, B obraz Height 2D, C obraz Height 3D. Obszar skanowanej powierzchni próbki (3 μm x 3 μm). Ryc. 5. Granulki melaniny syntetycznej otrzymanej tyrozyny. Obrazy uzyskane za pomocą AFM: A obraz Deflection, B obraz Height 2D, C obraz Height 3D. Obszar skanowanej powierzchni próbki (1 μm x 1 μm). Ryc. 6. Obrazy uzyskane za pomocą AFM melaniny otrzymanej z Sepia officinalis: A obraz Deflection, B obraz Height 2D, C obraz Height 3D. Obszar skanowanej powierzchni próbki (3 μm x 3 μm). Ryc. 7. Filamenty melaniny otrzymanej z Sepia officinalis. Obrazy uzyskane za pomocą AFM: A obraz Deflection, B obraz Height 2D, C obraz Height 3D. Obszar skanowanej powierzchni próbki (1 μm x 1 μm). granulki różnej wielkości, pojedyncze, dobrze wyodrębnione. Natomiast nie obserwowano agregacji granulek w bardziej złożone elementy (ryc. 4A i 4B). Wykonanie skanowania powierzchni o wymiarze 1 μm x 1 μm pozwoliło na uzyskanie większego powiększenia badanego polimeru. Obrazy AFM Deflection i Height 2D (ryc. 5A i 5B) ujawniają małe zróżnicowanie morfologiczne melaniny. Poszczególne granulki mimo różnych rozmiarów posiadają podobny kształt i wszystkie są jednostronnie zwężone. Scharakteryzowane obrazy D2 (ryc. 4A, 4B, 5A i 5B) w pełni korespondują z trójwymiarowymi obrazami (ryc. 4C i 5C). Trójwymiarowe obrazy badanej melaniny ukazują ponadto różnice wielkości pomiędzy granulkami. W szczególności zjawisko to jest widoczne w przypadku obserwacji prowadzonych przy obrazie o mniejszym powiększeniu (ryc. 4C) uzyskanym przez skanowanie powierzchni o wielkości (3 μm x 3 μm). Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że większość granulek jest podobnej wysokości, tylko pojedyncze grudki są większe od pozostałych. Uzyskany stożkowaty kształt na obrazach Height 3D (ryc. 4C i 5C) dla poszczególnych granulek jest wynikiem skanowania powierzchni polimeru. Zaobserwowano istotne różnice w obrazie AFM melaniny naturalnej uzyskanej z Sepia officinalis (ryc. 6 i 7) w porównaniu z obrazami uzyskanymi dla melaniny syntetycznej (ryc. 4 i 5). Struktura melaniny uzyskanej z Sepia officinalis ujawnia dwie różne formy morfologiczne. Pierwszą stanowi bryła nieforemna. Jest to pojedynczy element o wyraźnym zarysie i stosunkowo gładkiej powierzchni (ryc. 6A-B). Jest on wyraźnie wyodrębniony z badanej powierzchni (6C). Skanowanie obszaru o wielkości 1.0 μm x 1.0 μm pozwoliło na obserwację bardziej złożonej nanostruktury. Obserwuje się podłużne dobrze wyodrębnione filamenty tworzące bardziej złożone elementy. Uzyskane obrazy Deflecton

5 i Height 2D (ryc. 7A i 7B) ukazują wyraźne trzy filamety o porównywalnej długości, ułożone równolegle do siebie i powiązane ze sobą. Trójwymiarowa struktura przedstawiona na obrazie Height D3 (ryc. 7C) przedstawia trzy filamenty położone w dwóch płaszczyznach. Są one wyraźnie wyodrębnione z powierzchni. Dwa większe filamenty położone są bezpośrednio na badanej powierzchni. Na największym filamencie położony jest trzeci najmniejszy wykazujący kontury odrębności. Dyskusja Do niedawna wnioskowanie o strukturze melanin opierało się głównie o metody chemicznej degradacji [21]. Niestety metody te mają kilka ograniczeń, takich jak: słaba powtarzalność, niedostateczna wydajność produktów degradacji oraz możliwość powstawania artefaktów podczas reakcji degradacyjnych [22]. Metodą z powodzeniem wykorzystywaną do badania struktury zarówno syntetycznych jak i naturalnych melanin jest piroliza połączona z chromatografią gazową i spektrometrią mas (Py-GC/MS) [23, 24] oraz termochemoliza [25, 26]. Technika pirolizy polega na wykorzystaniu wysokiej temperatury z zakresu C w celu termicznego rozkładu badanej próbki, a następnie rozdziale powstałych produktów za pomocą chromatografii gazowej i ich identyfikacji na podstawie widm masowych techniką spektrometrii mas. Produkty termicznej degradacji odzwierciedlają w dużym stopniu strukturę analizowanego biopolimeru, ponieważ jak wykazano, ryzyko pojawienia się artefaktów w trakcie pirolizy jest względnie niskie [27]. Natomiast modyfikacją pirolizy jest technika termochemolizy polegająca na dodaniu do badanej próby odczynnika derywatyzującego, a następnie umieszczeniu analizowanej próby w komorze pirolizera i analizie metodą GC/MS. Z danych literaturowych wynika, że powszechnie stosowanymi odczynnikami derywatyzującymi są: wodorotlenek tetrametyloamoniowy, wodorotlenek tetrabutyloamoniowy, wodorotlenek fenylotrimetyloamoniowy, wodorotlenek (m-trifluorometylofenylo)-trimetyloamoniowy [27]. W niniejszej pracy badano strukturę syntetycznych oraz naturalnych melanin metodą pirolizy i termochemolizy. Analizie poddano wzorzec syntetycznej eumelaniny otrzymanej z tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru oraz wzorzec naturalnej melaniny z Sepia officinalis. Doniesienia literaturowe wskazują, że sposób polimeryzacji, a tym samym ostateczna struktura melanin, zależy od warunków syntezy [24, 28]. Badania techniką Py-GC/MS i Py-GC/MS w obecności TMAH wykazały, że Tyr-melanina otrzymana w wyniku utlenienia tyrozyny nadtlenkiem wodoru różni się strukturalnie od DOPA-melaniny otrzymanej w wyniku autooksydacyjnej polimeryzacji 3,4-dihydroksyfenyloalaniny [24]. W pirolizatach Tyr-melaniny dominującym produktem była pirydyna i jej alkilowe pochodne. Fakt, że wśród produktów pirolizy i termochemolizy Tyr-melaniny stwierdzono niższą sumaryczną zawartość piroli oraz że nie wykryto indolu i jego pochodnych w porównaniu z DOPA-melaniną, może świadczyć o dużym udziale niezcyklizowanych jednostek tyrozynowych w strukturze analizowanego polimeru. Badania oparte na metodach chemicznej degradacji wykazały, że melaniny naturalne są wysoce heterogennymi polimerami złożonymi z różnych jednostek monomerycznych, w tym głównie z jednostek DHI i DHICA oraz z jednostek pirolowych [29]. Hydroliza zasadowa poprzedzona utlenianiem sepiomelaniny nadtlenkiem wodoru, pozwoliła na uzyskanie kwasów pirolowych: głównie: kwasu pirolo-2,3,5-trikarboksylowego oraz w mniejszych ilościach kwasu pirolo-2,3-dikarboksylowego i kwasu pirolo-2,3,4,5-tetrakarboksylowego [9, 30]. Sugeruje się jednak, że kwas pirolotetrakarboksylowy jest sztucznie wytwarzany w środowisku zasadowym podczas chemicznej degradacji melaniny z Sepia officinalis. Natomiast alkaliczne stapianie sepiomelaniny pozwoliło na identyfikację wśród produktów degradacji DHI jak i DHICA, jednak w niewielkich ilościach i dlatego próby wykorzystania tej reakcji do ilościowego oznaczenia eumelanin w tkankach pigmentowanych zakończyły się niepowodzeniem [21]. W prezentowanej pracy dokonano analizy sepiomelaniny techniką pirolizy i termochemolizy. Dominującym produktem termolizy tego wzorca eumelaninowego był pirol, co jest zgodne z wynikami chemicznej analizy sepiomelaniny [9]. W melaninie tej wykazano obecność markerowych produktów pochodzenia eumelaninowego (benzenu, pirolu, pirydyny, fenolu, indolu i ich alkilowych pochodnych). Ponadto w profilu pirolitycznym melaniny z Sepia officinalis poddanej termochemolizie, stwierdzono obecność estrów metylowych kwasów tłuszczowych, które prawdopodobnie pochodzą z degradacji lipidów. Liczne badania wskazują, że melaniny pochodzenia naturalnego są silnie związane z białkami i lipidami komórkowymi [23, 25]. Sugeruje to, iż zastosowana procedura izolacji melaniny z Sepia officinalis nie prowadzi do całkowitego oczyszczenia pigmentu z komponenty lipidowej. Obecnie coraz częściej do badania struktury makromolekuł (białek, peptydów, kwasów nukleinowych, polimerów oraz biopolimerów) wykorzystuje się nowoczesną metodę mikroskopii sił atomowych (AFM) umożliwiającą zarówno analizę topografii powierzchni, jak i badanie właściwości tych związków. Do zalet metody AFM należą: wysoka rozdzielczość obrazu badanego materiału, zdolność do generowania trójwymiarowego obrazu oraz minimalizacja pracoi czasochłonności przygotowania biomateriału do analizy. Technika AFM umożliwia obrazowanie badanego materiału zarówno w warunkach in situ jak i w środowisku wodnym [31]. Clancy i Simon [32] metodą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) wykazali, że dominującą strukturą sepiomelaniny są agregaty złożone z pojedynczych cząstek o średnicy nm. Natomiast metoda AFM uwidoczniła, że cząstki tworzące agregaty nie stanowią podstawowej jednostki strukturalnej melaniny z Sepia officinalis, ale są zbudowane z wielu mniejszych elementów [33]. Potwierdzają to również wyniki prezentowanej pracy, w której podczas analizy nanostruktury naturalnej sepiomealniny wykazano złożoność struktury analizowanego filamentu.

6 Nosfinger i wsp., [34] wykazali brak podobieństwa strukturalnego pomiędzy eumelaniną z Sepia officinalis oraz syntetyczną eumelaniną. Wyniki niniejszej pracy również wskazują na różnice strukturalne pomiędzy Tyr-melaniną a melaniną z Sepia officinalis. Wydaje się, że te różnice mogą wynikać z odmiennego sposobu powstawania analizowanych polimerów. Syntetyczną Tyr-melaninę otrzymano w wyniku chemicznego utleniania tyrozyny w obecności nadtlenku wodoru, a więc w warunkach, które mogą prowadzić do oksydacyjnej degradacji powstającego pigmentu. Natomiast melanogeneza zachodząca w woreczku atramentowym mątwy jest złożonym procesem enzymatycznym, którego ostateczny efekt zależy od różnych czynników zarówno zewnątrz- jak i wewnątrzkomórkowych [35]. Badania finansowane przez Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach (grant nr KNW-2-128/09). Piśmiennictwo 1. Riley P. Melanogenesis and melanoma. Pigment Cell Res 2003; 16: Liu Y, Simon JD. Metal ion interactions and the structural organization of Sepia eumelanin. Pigment Cell Res 2005; 18: Tran L, Powell B, Meredith P. Chemical and structural disorder in eumelanins: a possible explanation for broadband absorbance. Biophys J 2006; 90: Cano M i wsp. Magnetic properties of synthetic eumelanin-preliminary results. Photochem Photobiol 2008; 84: Ito S, Wakamatsu K. Quantitative analysis of eumelanin and pheomelanin in humans, mice, and other animals: a comparative review. Pigment Cell Res 2003; 16: Bennett DC. Ultraviolet wave bands and melanoma initiation. Pigment Cell Res 2008; 21: Wakamatsu K i wsp. Characterization of melanin in human iridal and choroidal melanocytes from eyes with various colored irides. Pigment Cell Res 2008; 21: Ito S. A chemist s view of melanogenesis. Pigment Cell Res 2003; 16: Ward W i wsp. Quantification of naturally occurring pyrrole acids in melanosomes. Photochem Photobiol 2008; 84: Bush WD i wsp. Neuromelanins isolated from different regions of the human brain exhibit a common surface photoionization threshold. Photochem Photobiol 2009; 85: Wilczek A, Kondoh H, Mishima Y. Composition of mammalian eumelanins: analyses of DHICA-derived units in pigments from hair and melanoma cells. Pigment Cell Res 1996; 9: Lamoreux L, Wakamatsu K, Ito S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res 2001; 14: Nighswander-Rempel S i wsp. Time-resolved and steadystate fluorescence spectroscopy of eumelanin and indolic polymers. Photochem Photobiol 2007; 83: Ito S, Wakamatsu K, Ozeki H. Chemical analysis of melanins and its application to the study of the regulation of melanogenesis. Pigment Cell Res 2000; 13: Ito S, Wakamatsu K. Chemistry of mixed melanogenesis-pivotal roles of dopaquinon. Photochem Photobiol 2008; 84: Liu Y i wsp. Ion-exchange and adsorption of Fe(III) by Sepia melanin. Pigment Cell Res 2004; 17: Seagle B i wsp. Photoprotection of human retinal pigment epithelium cells against blue light-induced apoptosis by melanin free radicals from Sepia officinalis. Proc Natl Acad Sci 2006; 103: Lawrie K, Meredith P, McGeary R. Synthesis and polymerization studies of organic-soluble eumelanins. Photochem Photobiol 2008; 84: Nighswander-Rempel S i wsp. Solvochromic effects in model eumelanin compounds. Photochem Photobiol 2008; 84: Horcas I i wsp. WSXM: a software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. Rev Sci Instrum 2007; Wakamatsu K, Ito I. Advanced chemical methods in melanin determination. Pigment Cell Res 2002; 15: Ito S. Advances in chemical analysis of melanins. W: The pigmentary system: physiology and pathophysiology. Red. Nordlund JJ i wsp. Oxford University Press. New York 1998, Dzierżęga-Lęcznar A i wsp. Structural investigations of neuromelanin by pyrolysis-gas chromatography/mass spectrometry. J Neural Transm 2006; 113: Chodurek E i wsp. Różnicowanie profili pirolitycznych DOPA-melanin metodą GC/MS. Ann Acad Med Siles 2007; 61: Chodurek E i wsp. Termochemolysis as the useful metod to assess the purity of melanin isolated from the human melanoma malignum. Acta Pol Pharm 2008; 65: Stepień K i wsp. Melanin from epidermal human melanocytes: study by pyrolytic GC/MS. J Am Soc Mass Spectrom 2009; 20: Moldoveanu S. Pyrolysis GC/MS, present and future (recent past and present needs). J Microcolumn Separ 2000; 13: Bertazzo A i wsp. Application of matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry to the detection of melanins formed from Dopa and dopamine. J Mass Spectrom 1999; 34: Prota G. Melanins and melanogenesis. Academic Press. San Diego Ito S, Fujita K. Microanalysis of eumelanin and pheomelanin in hair and melanomas by chemical degradation and liquid chromatography. Anal Biochem 1985; 144: Ikai A i wsp. The world of nanobiomechanics: Mechanical imaging and measurement by atomic force microscopy. Elsevier Science 2008;

7 32. Clancy C, Simon J. Ultrastructural organization of eumelanin from Sepia officinalis measurmed by atomic force microscopy. Biochemistry 2001; 40: Liu Y, Simon DJ. Isolation and biophysical studies of natural eumelanins: applications of imaging technologies and ultrafast spectroscopy. Pigment Cell Res 2003; 16: Nofsinger J, Forest S, Eibest L, Gold K, Simon J. Probing the building blocks of eumelanins using scanning electron microscopy. Pigment Cell Res 2000; 13: Palumbo A. Melanogenesis in the Ink Gland of Sepia officinalis. Pigment Cell Res 2003; 16: data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: dr Ewa Chodurek Katedra i Zakład Biofarmacji Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląski Uniwersytet Medyczny Sosnowiec, ul. Narcyzów 1 echodurek@sum.edu.pl