Key words: melanin, EPR spectroscopy, paramagnetic centers, free radicals

Transkrypt

1 Streszczenie Melaniny charakteryzuje trwały paramagnetyzm, zależny od obecności jonów metali w strukturze polimeru, substancji leczniczych oraz od obecności tlenu w środowisku próbki. Celem niniejszej pracy jest zaprezentowanie znanych z literatury naukowej publikacji dotyczących zastosowań spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) do badania centrów paramagnetycznych melanin ze szczególnym uwzględnieniem kompleksów melanina-jony metali oraz melanina-substancja lecznicza. Metodą EPR można określić rodzaj badanej melaniny. Odmienny kształt widm EPR obserwujemy dla eu- i feomelaniny. Centra paramagnetyczne melanin to głównie o-semichinonowe wolne rodniki. Analizy temperaturowe widm EPR melanin wykazały występowanie w polimerach melaninowych również birodników. Intensywności integralne linii EPR wolnych rodników o spinie S = 1/2 zmieniają się wraz ze wzrostem temperatury zgodnie z prawem Curie, podczas gdy birodniki o spinie S = 1 nie podlegają prawu Curie. Dotychczasowe badania EPR udowodniły rolę wolnych rodników w wiązaniu substancji leczniczych do melaniny. Wykazano, że diamagnetyczne jony metali zwiększają ilość wolnych rodników w melaninie oraz w jej kompleksach z lekami. Stwierdzono zmniejszenie amplitudy linii EPR melanin naturalnych i syntetycznych po kompleksowaniu polimeru paramagnetycznymi jonami metali. W pracy przedstawiono szerokie możliwości wykorzystania metody EPR do oceny właściwości układu centrów paramagnetycznych melanin oraz ich kompleksów z jonami metali i substancjami leczniczymi. Abstract Stable paramagnetism dependent on metal ions and drugs in polymer structure, and presence of oxygen in the sample environment characteizes melanins. The aim of this work is to present the known scientific papers about applications of electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy to examination of paramagnetic centers in melanins, as well as in melanin-metal ions and melanin-drug complexes. EPR method may be used to determine the type of melanin. Different lineshapes are observed for eu- and pheomelanins. o-semiquinone free radicals are the main type of paramagnetic centers existing in melanins. Temperature analysis of EPR spectra revealed that biradicals also exist in melanins. Integral intensities of EPR spectra of free radicals with spin S = 1/2 change with temperature according to the Curie law, whereas biradicals with spin S = 1 do not fulfill the Curie law. EPR studies have demonstrated that free radicals play an important role in drugs binding to melanin. It has been shown that diamagnetic metal ions increase free radicals content in melanin and its complexes with drugs. Lower amplitudes of EPR lines of natural and synthetic melanins after complexing of these polymers by paramagnetic metal ions were observed. In this work applications of EPR method to examination of paramagnetic centers system in melanin and melanin complexes with metal ions and drugs are presented. Key words: melanin, EPR spectroscopy, paramagnetic centers, free radicals Słowa kluczowe: melanina, spektroskopia EPR, centra paramagnetyczne, wolne rodniki

2 Melanina jest ciemnym pigmentem powszechnie występującym u roślin i zwierząt. W organizmie człowieka występuje w skórze, włosach, oczach, uchu wewnętrznym, ośrodkowym układzie nerwowym, miocytach serca, komórkach Kupfera wątroby [1, 2]. Obecność biopolimerów melaninowych stwierdzono również w eozynofilach krwi ludzkiej [1], co sugeruje, że związki te docierając do prawie wszystkich części organizmu mogą brać udział w regulacji ogólnoustrojowej. Według klasyfikacji Nicolausa [3], uwzględniającej barwę oraz skład chemiczny pigmentu, biopolimery melaninowe dzielimy na trzy główne grupy: eumelaniny - grupa melanin o zabarwieniu brązowoczarnym, zawierająca w strukturze węgiel, wodór, tlen i azot [3, 4]. Występują głównie w skórze, we włosach, w siatkówce i naczyniówce oka oraz w uchu wewnętrznym. Powstają podczas utleniania tyrozyny oraz amin katecholowych: dopaminy, adrenaliny lub noradrenaliny [1, 5, 6]. feomelaniny - pigmenty o barwie od żółtej do czerwonej [3, 4, 6]. Oprócz węgla, wodoru, tlenu i azotu zawierają siarkę - obecność, której wynika z włączenia cysteiny do szlaku biosyntezy tych barwników. Występują w skórze ludzkiej, włosach blond i rudych [4, 6]. allomelaniny - grupa naturalnych barwników koloru czarnego, powszechnie występująca w świecie roślin i mikroorganizmów [1, 3]. Cechą charakterystyczną jest brak azotu w ich cząsteczce. Kolejną grupę naturalnych pigmentów, umiejscowionych w ośrodkowym układzie nerwowym, m.in. w pniu mózgu, oponach miękkich, neuronach substancji czarnej, miejsca sinawego i tworu siatkowatego mózgu, stanowią neuromelaniny [4, 5]. Biopolimery te, zawierają siarkę, co może sugerować, że są mieszaniną zarówno eumelaniny, jak i feomelaniny [2-4]. Melanina jest polimerem trójwymiarowym o niejednorodnej i nieregularnej strukturze amorficznej, w którym różne podjednostki (prawdopodobnie wszystkie pośrednie produkty melanogenezy) połączone są różnymi, trudno hydrolizującymi wiązaniami, głównie typu węgiel-węgiel [1]. W strukturze swej zawierają układy skondensowanych pierścieni aromatycznych, głównie indolo-5,6-chinonu oraz 1,4-benzotiazyny [4]. Badania natury i własności melanin naturalnych oraz syntetycznych wykazały, że polimery te charakteryzują się następującymi cechami: zdolnościami do przewodnictwa i fotoprzewodnictwa elektrycznego, związanego z półprzewodnikową strukturą polimeru [1, 2]; zdolnościami pochłaniania promieniowania z zakresu ultrafioletu, światła widzialnego i bliskiej podczerwieni, a tym samym zdolnościami do osłabiania szkodliwego wpływu tego promieniowania na tkanki [1, 7]. Absorpcja i częściowe rozproszenie promieni ultrafioletowych przez cząsteczki melaniny powoduje, że jest ona naturalnym filtrem UV, podnoszącym odporność na poparzenia słoneczne skóry oraz chroniącym szlaki metaboliczne przed destrukcyjnym działaniem promieniowania UV; zdolnościami do tworzenia wolnych rodników w wyniku przyłączenia niesparowanych elektronów podczas reakcji z produktami radiolizy środowiska i zapobieganie w ten sposób niekorzystnym skutkom procesów oksydoredukcyjnych przebiegających w komórce [1-3]. Gdy ilość pochłoniętej energii przekracza możliwości detoksykacyjne pigmentów, może dojść do uszkodzenia błony komórkowej i helisy DNA, a w konsekwencji do nekrozy komórki; własnościami paramagnetycznymi wynikającymi z obecności niesparowanych elektronów na o-semichinonowych grupach indolowych podjednostek polimeru [1, 6, 8-15]; własnościami jonowymiennymi przejawiającymi się zdolnościami w oddziaływaniu z jonami metali i ich kumulacją w tkankach zawierających melaninę, przez co wpływają na skład jonowy środowiska wewnątrz- i zewnątrzkomórkowego [1, 8-11]; powinowactwem do substancji leczniczych, prowadzącym często do stanów patologicznych w upigmentowanych tkankach organizmu [12, 13, 16-19]. Specyficzne właściwości biopolimeru melaninowego, takie jak: słaba rozpuszczalność w większości rozpuszczalników, niedokładnie określona masa cząsteczkowa, amorficzna postać [1, 4] spowodowały, iż wiedza o strukturze melanin, właściwościach fizykochemicznych była przez wiele lat bardzo fragmentaryczna. Obecnie badania melanin prowadzone są przy wykorzystaniu następujących technik: metody znaczników radioizotopowych, spektroskopii IR, chemicznej degradacji polimeru i analizy produktów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), termicznej degradacji z wykorzystaniem metody pirolizy-chromatografii gazowej/ spektrometrii mas (Py-GC/MS), magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oraz elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) [1, 8, 10, 12, 13-15]. Z dużym powodzeniem w badaniu melanin stosowana jest spektroskopia elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR), z uwagi na obecność niesparowanych elektronów na o-semichinonowych grupach indolowych podjednostek polimeru [1, 4, 6, 10, 20]. Spektroskopia EPR to jedna z najbardziej obiecujących metod służących do wykrywania i charakteryzowania melaniny w materiale biologicznym [1]. Jest to metoda niedestrukcyjna, charakteryzująca się dużą czułością detekcji wolnych rodników w próbce. Pozwala określić rodzaj, właściwości oraz koncentrację centrów paramagnetycznych

3 w melaninach, oddziaływania spin-spin pomiędzy wolnymi rodnikami oraz oddziaływania spin-sieć niesparowanych elektronów z diamagnetycznymi molekułami polimeru [1, 8, 10, 13-15]. Koncentracja wolnych rodników w melaninie zmienia się w zależności od ph środowiska, naświetlania biopolimeru, stopnia uwodnienia, temperatury, zawartości jonów metali, substancji leczniczych oraz obecności tlenu w środowisku próbki [1, 8, 11, 14-22]. I tak na przykład, po naświetlaniu melanin światłem widzialnym i UV następuje odwracalny wzrost koncentracji wolnych rodników. Intensywność linii EPR rośnie wraz ze wzrostem intensywności oświetlenia, natomiast obniżenie temperatury wydłuża czas życia wolnych rodników [1, 7]. Przeprowadzone badania dowiodły również, że intensywność wolnorodnikowego sygnału EPR melaniny zmienia się w obecności związanych jonów metali [1, 11, 13, 15]. Wprowadzenie jonów metali do polimeru melaninowego powoduje zmianę parametrów widm EPR wolnych rodników melaniny. Zaobserwowano wyraźne różnice w oddziaływaniach melanin z paramagnetycznymi i diamagnetycznymi jonami metali. Jony diamagnetyczne np. Zn(II), Cd(II), Sn(II) zwiększają intensywność sygnału EPR poprzez indukcję wolnych rodników w melaninie [1, 10, 11, 15, 18]. Jony paramagnetyczne np. Cu(II), Gd(III), Fe(III), Mn(II), Co(II) zmniejszają intensywność sygnału EPR melaniny, w wyniku oddziaływań magnetycznych pomiędzy spinem rodnika a spinem jonu [1, 11, 15, 18]. Znane są badania, które dowiodły, iż centra wolnorodnikowe melaniny biorą również udział w oddziaływaniu z tlenem [9, 22]. Według Pilawy i wsp. [9] paramagnetyczne molekuły tlenu tworzą kompleksy quasi-chemiczne z wolnymi rodnikami melaniny. Niesparowane elektrony wolnych rodników biorących udział w wiązaniu z tlenem tracą swą efektywność i obecność ich nie jest rejestrowana podczas pomiaru widma EPR [9, 22]. Wskutek usunięcia tlenu ze środowiska, wiązania quasi-chemiczne ulegają zerwaniu, co prowadzi do ponownego wzrostu koncentracji wolnych rodników w próbce [9]. Z uwagi na odmienny kształt widm EPR eumelaniny i feomelaniny, analiza kształtu widm EPR melanin naturalnych może być stosowana w celu określenia typu pigmentu występującego w badanym materiale biologicznym [6, 8, 10, 15, 23-25]. Widmo EPR eumelaniny jest pojedynczą linią, podczas gdy widmo feomelaniny, ze względu na sprzężenie nadsubtelne niesparowanego elektronu z jądrem azotu, posiada kształt bardziej złożony. W sygnale EPR feomelaniny występuje kilka linii składowych wskutek rozszczepienia poziomów energetycznych niesparowanego elektronu przez sprzężone z nim jądro [6, 25]. Na tej podstawie Pilawa i wsp. [23] wykazali, iż grzybnia Cladosporium cladosporioides oraz melanina wyizolowana z tych grzybów posiadają takie same kształty linii EPR oraz podobne parametry EPR, co syntetyczna eumelanina z domieszką feomelaniny. Może to być dowodem na istnienie biopolimerów eu- i feomelaniny w analizowanych grzybach. Pojedyncze linie EPR eumelaniny zaobserwowano w przypadku naturalnych melanin wyizolowanych z trzech różnych szczepów Drosophila melanogaster [24]. Porównawcze badania EPR melanin z Drosophila melanogaster i DOPA-melaniny wykazały, że o-semichinonowe wolne rodniki występujące w naturalnej i syntetycznej melaninie różnią się odległością pomiędzy niesparowanymi elektronami. W przypadku badanych muszek odległości te są mniejsze niż w DOPA-melaninie, co objawiało się relatywnie szerszymi liniami EPR melaniny naturalnej [24]. Charakterystyczny sygnał EPR melaniny pozwala także na zastosowanie spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego w poszukiwaniach tych polimerów w próbkach biologicznych. I tak na przykład metodę EPR wykorzystano w celu sprawdzenia występowania biopolimeru melaninowego w zarodnikach pleśni Fuligo septica [25]. Fuligo septica wytwarzały ciemne, pomarańczowe i żółte zarodniki. Ciemne zabarwienie zarodników wskazywało na możliwość występowania w nich eumelaniny, a zabarwienie pomarańczowe i żółte mogło świadczyć o obecności feomelaniny. Widma EPR testowanych zarodników Fuligo septica porównano z liniami EPR modelowej syntetycznej eumelaniny DOPA-melaniny oraz feomelaniny. Dla wszystkich badanych zarodników rejestrowano pojedyncze linie EPR charakterystyczne dla eumelaniny [25]. Nie obserwowano złożonych linii EPR feomelaniny. Metoda EPR wykazała więc jednoznacznie, że w zarodnikach Fuligo septica występuje tylko eumelanina [25]. Obecność stabilnych wolnych rodników typu o-semichinonowego, zaobserwowano również w melaninie wyizolowanej z siatkówki oka ludzkiego [26]. Badania EPR wolnych rodników pochodzących z nabłonka barwnikowego siatkówki wykorzystano do wyjaśnieniu roli melaniny w postępującej z wiekiem degeneracji siatkówki. Przypuszcza się, że w warunkach fizjologicznych melanina pełni z jednej strony rolę naturalnego antyoksydanta, z drugiej zaś, w przypadku intensywnego naświetlania, zdolności antyoksydacyjne melaniny mogą się wyczerpać, a pigment może stać się prooksydantem [26, 27, 28]. Znane są z literatury naukowej badania, w których metodę EPR oraz pułapki spinowe (DMPO) zastosowano w celu potwierdzenia ochronnej roli melaniny przed promieniowaniem UVA [29]. Analizowano powstawanie wolnych rodników podczas naświetlania promieniowaniem UVA i promieniowaniem słonecznym skóry ludzi o jasnej i ciemnej karnacji. Stwierdzono spadek zawartości wolnorodnikowych adduktów wraz ze wzrostem pigmentacji [29]. Spektroskopia EPR dostarcza także informacji o wolnorodnikowych właściwościach kompleksów melanina-substancja lecznicza. Melaniny wykazują zdolność wiązania leków, czego następstwem może być ich kumulacja w tkankach upigmentowanych [8, 12, 13, 16, 17]. Substancjami leczniczymi wykazującymi powinowactwo do melaniny są między innymi: β-blokery, neuroleptyki, leki miejscowo znieczulające, leki przeciwnowotworowe, leki przeciwmalaryczne oraz antybiotyki, w szczególności antybiotyki aminoglikozydowe [8, 17]. Melanina chroni tkanki upigmentowane oraz tkanki sąsiadujące z nimi poprzez absorpcję czynników farmakologicznych, które następnie powoli uwalniane są w nietoksycznych stężeniach [17]. Z drugiej zaś strony, długotrwała farmakoterapia może prowadzić do osiągnięcia toksycznego stężenia substancji leczniczych w melaninie, zwiększenia

4 ilości wolnych rodników, co w końcowym efekcie może powodować degenerację tkanek [30]. Potwierdzeniem tej tezy są badania, które wykazały, że koncentracja o-semichinonowych wolnych rodników jest większa w kompleksach DOPA-melaniny z antybiotykami aminoglikozydowymi: gentamicyną i kanamycyną, niż w samej DOPA-melaninie i rośnie wraz ze wzrostem stężenia antybiotyku w badanych kompleksach, przy czym aminoglikozydy nie tworzą nowego typu wolnych rodników w DOPA-melaninie [12]. Efekt wzrostu ilości centrów paramagnetycznych w DOPA-melaninie zaobserwowano również dla jej kompleksów z chlorochiną [16]. Rezultaty przeprowadzonych dotychczas badań dowodzą, że łączenie leków z pigmentem to proces odwracalny zależny od typu wiązań, jakie wytworzyły się między biopolimerem a substancją leczniczą [8]. Najczęściej mają one charakter jonowy, a w przypadku wiązania melaniny z antybiotykami aminoglikozydowymi sugerowano tworzenie kompleksów molekularnych z udziałem reakcji typu przeniesienia ładunku [8]. Kolejnym czynnikiem wpływającym na wiązanie substancji leczniczej do melaniny są jony metali, ponieważ te same miejsca w strukturze polimeru mogą być odpowiedzialne za wiązanie substancji leczniczej, jak i metalu. Potwierdzeniem tej tezy są badania, z których wynika, że kolejność kompleksowania w sposób znaczący wpływa na ilość substancji leczniczej przyłączonej do melaniny oraz na koncentrację wolnych rodników w badanych próbkach [13, 18, 22, 31]. Temperaturowe pomiary widm EPR kompleksów DOPA-melaniny z netilmicyną, jonami Zn(II) i Cu(II) [31], kompleksów DOPA-melaniny z kanamycyną i jonami Cu(II) [13] oraz melaniny występującej u Drosophila melanogaster [21] wykazały, iż w badanych próbkach występują zarówno wolne rodniki o spinie S = 1/2, jak i centra paramagnetyczne o spinie S = 1 nie podlegające prawu Curie. Badania EPR centrów paramagnetycznych o spinie S = 1 w melaninach [13, 21, 31] mają charakter nowatorski. Uzasadnia to konieczność prowadzenia dalszych pomiarów, które potwierdzą występowanie w melaninie dwóch typów centrów paramagnetycznych oraz wyjaśnią ich rolę w tworzeniu kompleksów z substancjami leczniczymi. Badania z zastosowaniem spektroskopii elektronowego rezonansu paramagnetycznego poszerzają wiedzę o budowie i właściwościach melanin. Metodą EPR wykazano trwały paramagnetyzm biopolimerów melaninowych [1, 4, 6, 10, 20] oraz udział centrów paramagnetycznych melanin w tworzeniu kompleksów z substancjami leczniczymi oraz jonami metali [12-19, 30, 31]. Poszerzenie wiedzy o zmianach zachodzących w układzie centrów paramagnetycznych melanin, wskutek wiązania leków oraz jonów metali, ma istotne znaczenie z medycznego punktu widzenia, ponieważ wolne rodniki mogą powodować efekty toksyczne w organizmie [30]. Piśmiennictwo [1] Sarna T. Badanie struktury i właściwości centrów aktywnych melanin. Zagad Biof Współ 1981; 6: [2] Tran ML, Powell BJ, Meredith P. Chemical and structural disorder in eumelanins: a possible explanation for broadband absorbance. Biophys J 2006; 90: [3] Nicolaus RA. Melanins. Paris: Hermann 1968, [4] Mårs U, Larsson B. Pheomelanin as a binding site for drugs and chemicals. Pigment Cell Res 1999; 12: [5] Liu Y, Simon JD. Isolation and biophysical studies of natural eumelanins: applications of imaging technologies and ultrafast spectroscopy. Pigment Cell Res 2003; 16: [6] Sealy RC i wsp. Eumelanins and pheomelanins: characterization by electron spin resonance spectroscopy. Science 1982; 217: [7] Ortonne JP. Photoprotective properties of skin melanin. Br J Dermatol 2002; 146: [8] Buszman E. Wiązanie substancji leczniczych do biopolimerów melaninowych w obecności jonów metali. Rozprawa habilitacyjna. Śląska Akademia Medyczna, Katowice, [9] Pilawa B, Chodurek E, Wilczok T. Types of paramagnetic centers in Cu complexes with model neuromelanins. Appl Magn Reson 2003; 24: [10] Matuszczyk M i wsp. Cd effect on free radicals in Cladosporium cladosporioides melanin tested by EPR spectroscopy. Chem Phys Letters 2004; 394: [11] Szpoganicz B i wsp. Metal binding by melanins: studies of colloidal dihydroxyindole-melanin, and its complexation by Cu(II) and Zn(II) ions. J Inorg Biochem 2002; 89: [12] Pilawa B i wsp. Application of EPR spectroscopy to examination of gentamicin and kanamycin binding to DOPA-melanin. Appl Magn Reson 2002; 23: [13] Kozdrowska L. Właściwości centrów paramagnetycznych kompleksów DOPA-melaniny z kanamycyną i jonami miedzi(ii). Rozprawa doktorska. Uniwersytet Zielonogórski, Zielona Góra, [14] Sealy RC i wsp. Novel free radicals in synthetic and natural pheomelanins: Distinction between dopa melanins and cysteinyldopa melanins by ESR spectroscopy. Biophys 1982; 79: [15] Buszman E i wsp. EPR examination of Zn and Cu binding by pigmented soil fungi Cladosporium cladosporioides. Sci Total Environ 2006; 363: [16] Buszman E, Kwaśniak B, Wilczok T. The effect of metal ions incorporated into DOPA-melanin on chloroquine binding ability. Curr Top Biophys 1992; 16: [17] Wrześniok D. Oddziaływanie antybiotyków aminoglikozydowych z melaniną. Rozprawa doktorska. Śląska Akademia Medyczna, Katowice, [18] Buszman E i wsp. EPR examination of Zn and Cu effect on free radicals in DOPA-melanin-netilmicin complexes. Chem Phys Letters 2005; 403: [19] Buszman E i wsp. Paramagnetic centers in DOPA-melanin-dihydrostreptomycin complexes. Acta Physica Pol A 2005; 108:

5 [20] Okazaki M i wsp. Electron spin relaxation of synthetic melanin and melanin-containing human tissues as studied by electron spin echo and electron spin resonance. Arch Biochem Biophys 1985; 242: [21] Pilawa B i wsp. Effect of temperature on melanin EPR spectra. Phys Med 2004; 1: [22] Pilawa B i wsp. Effect of oxygen on spin-spin and spinlattice relaxation in DOPA-melanin. Complexes with chloroquine and metal ions. Appl Magn Reson 2003; 25: [23] Pilawa B i wsp. EPR studies of melanin from Cladosporium cladosporioides. Pol J Med Phys Eng 1996; 2: [24] Buszman E i wsp. Free radical properties of melanins from Drosophila melanogaster. Pol J Med Phys Eng 1995; 1: [25] Krzywda A i wsp. Sclerotia of the acellular (true) slime mould Fuligo septica as a model to study melanization and anabiosis. Cell Mol Biol Let 2008; 13: [26] Bilińska B i wsp. Electron spin resonance investigations of human retinal pigment epithelium melanosomes from young and old donors. Spectrochim Acta A 2002; 58: [27] Biesemeier A i wsp. UV-A induced oxidative stress is more prominent in naturally pigmented aged human RPE cells compared to non-pigmented human RPE cells independent of zinc treatment. J Photochem Photobiol B 2008; 90: [28] Sarna T i wsp. Loss of melanin from human RPE with aging: possible role of melanin photooxidation. Exp Eye Res 2003; 76: [29] Haywood R, Rogge F, Lee M. Protein, lipid and DNA radicals to measure skin UVA damage and modulation by melanin. Free Radic Biol Med 2008; 44: [30] Hegedus ZL. The probable involvement of soluble and deposited melanins, their intermediates and the reactive oxygen side-products in human diseases and aging. Toxicology 2000; 145: [31] Zdybel M. Złożony układ centrów paramagnetycznych kompleksów DOPA-melaniny z netilmicyną, jonami cynku(ii) i miedzi(ii). Rozprawa doktorska. Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach, Katowice, Adres do korespondencji: Magdalena Zdybel Katedra i Zakład Biofizyki, ul. Jedności 8, Sosnowiec tel. (032) , mzdybel@sum.edu.pl