KIERUNKI PRAC BADAWCZYCH ZESPOŁU

Transkrypt

1 W y d z i a ł C h e m i c z n y P o l i t e c h n i k a R z e s z o w s k a i m. I g n a c e g o Ł u k a s i e w i c z a Dorota Antos, Wojciech Piątkowski KIERUNKI PRAC BADAWCZYCH ZESPOŁU Katedra Inżynierii Chemicznej i Procesowej Wydział Chemiczny, Politechnika Rzeszowska

2 Adsorpcja i chromatografia teoria oraz zastosowania

3 CYTOWANIA - MONOGRAFIE 1. N. Kielcew Podstawy techniki adsorpcyjnej 2. Praca zbiorowa pod red. Z. Ziółkowskiego Procesy dyfuzyjne i termodynamiczne skrypt Pol. Wrocławskiej część;3; 3. Z. Witkiewicz Podstawy chromatografii 4. R. Petrus; G. Aksielrud; J. Gumnicki; W. Piątkowski Wymiana masy w układzie ciało stałe ciecz, Of.Wyd. PRz Dorota Antos, Krzysztof Kaczmarski, Wojciech Piątkowski Chromatografia preparatywna jako proces rozdzielania mieszanin, WNT W-wa 2014 Chromatografia cieczowa kolumnowa LC Chromatografia w układzie ciecz-ciało stałe LSC Chromatografia nadkrytyczna SFC podziałowa adsorpcyjna podziałowa hydrofobowa a) adsorpcyjna powinowactwa wykluczania jonowymienna Schemat klasyfikacji technik chromatograficznych LSC w chromatografii preparatywnej Techniki chromatograficzne okresowa cykliczna ciągła b) elucja izokratyczna elucja gradientowa rugowanie Dorota Antos, Krzysztof Kaczmarski, Wojciech Piątkowski Chromatografia preparatywna jako proces rozdzielania mieszanin rozdz.1.

4 Chromatografia Różnice między chromatografią analityczną a preparatywną stężenie czas [s] Kształt pików chromatograficznych: - w chromatografii analitycznej. - W chromatografii preparatywnej: c F c F V F c m szok fala prosta c m ogon piku t r b) t r Przeładowanie stężeniowe Przeładowanie objętościowe Dorota Antos, Krzysztof Kaczmarski, Wojciech Piątkowski Chromatografia preparatywna jako proces rozdzielania mieszanin rozdz.1.

5 SMB chromatografia ciągła, układy kolumn Klasyczny proces SMB (TMB) zone IV solid zone III zone II Q R Q F ; c salt,f Q E R (1) E (2) F (1, 2) liquid System kolumn równoległych CMS Schemat karuzeli 4-kolumnowej Feed + Eluent I Eluent II Eluent III Eluent IV zone I Column I Column II Column III Column IV Q D Effluent I Effluent II Effluent III Effluent IV

6 Kolumny HPLC Ciśnienie do 1000 bar Kolumny HPLC Ciśnienie do 200 bar

7 Kolumna preparatywna Hipersep, Prochrom DAC, NOVASEP. Za zgodą NOVASEP,

8 80 cm SMB system Produktywność 1 10 kg czystej subst./dzień.

9 2 m średnicy 0.5 m wysokości złoża 1,570 L objetości 12,000 kg wagi (Amersham Biosciences)

10 Wybrany dorobek zespołu w zakresie podstaw teoretycznych adsorpcji i chromatografii 1. Antos D., Piątkowski W., Kaczmarski K., Determination of mobile phase effect on single-component adsorption isotherm by use of numerical estimation, J. Chromatogr. 874 (2000) Gritti, F.; Piątkowski, W.; Guiochon, G., Comparison of the adsorption equilibrium of a few low-molecular mass compounds on a monolithic and a packed column in reversed-phase liquid chromatography, J. Chromatogr. 978 (2002) Gritti, F., Piątkowski, W., Guiochon, G., Study of the mass transfer kinetics in a monolithic column, J. Chromatogr. 983 (2003) Piątkowski, W., Antos D., Kaczmarski, K., Modeling of preparative chromatography processes with slow intraparticle mass transport kinetics, J. Chromatogr. 988 (2003) Piątkowski, W. Gritti, F., Kaczmarski, K., Guiochon, G., Influence of the particle porosity on chromatographic band profiles, J. Chromatogr. 989 (2003) Piątkowski, W., Antos D., Gritti, F., Guiochon, G., Study of the competitive isotherm model and the mass transfer kinetics for a BET binary system, J. Chromatogr. 1003, (2003) Antos D., Kaczmarski K., Seidel-Morgenstern A., Piątkowski W., Concentration dependence of lumped mass transfer coefficients. Linear versus non-linear chromatography and isocratic versus gradient operation, J. Chromatogr (2003) Piątkowski W., Petrushka I., Antos D., Adsorbed solution model for prediction of normal-phase chromatography process with varying composition of the mobile phase, J. Chromatogr (2005) Poplewska I., Piątkowski W., Antos D., Effect of temperature on competitive adsorption of the solute and the modifier in reversed-phase liquid chromatography, J. Chromatogr (2006) Piątkowski W., Kramarz R., Poplewska I., Antos D., Deformation of gradient shape as a result of preferential adsorption of solvents in mixed mobile phases, J. Chromatogr (2006) Nowak J., Gedicke K., Antos D., Piatkowski W., Seidel-Morgenstern A., "Synergistic effects in competitive adsorption of carbohydrates on an ionexchange resin", J. Chromatogr (2007) R. Bochenek, W. Marek, W. Piątkowski, D. Antos, Evaluating the performance of different multicolumn setups for chromatographic separation of proteins on HIC media, J. Chromatogr. A 1301 (2013) Marek W., Muca R., Woś S., Piątkowski W., Antos D., Isolation of monoclonal antibody from a CHO supernatant.i. Assessment of different separation concepts, J. Chromatogr. A 1305 (2013) Poplewska I., Muca R., Strachota A., Piatkowski W., Antos D., Adsorption behavior of proteins on temperature-responsive resins, J. Chromatogr. A, 1324 (2014) Poplewska I., Piątkowski W., Antos D., Overcoming solubility limits in overloaded gradient hydrophobic interaction chromatography, J. Chromatogr. A, 1386 (2015) Antos D., Piątkowski W., Band deformation in non-isocratic liquid Chromatography, Trends Anal. Chem., 81 (2016), Gorczyca R., Marek W., Bochenek R., Piątkowski W., Antos D., Protein separation in carousel multicolumn setup. Performance analysis and experimental validation, J. Chromatogr. A, Antos D., Piątkowski W., Thermodynamics of Multicomponent Liquid Chromatography, Chem. Ing. Tech. 88, (11), (2016) Muca R., Marek W., Żurawski M., Piątkowski W., Antos D., Effect of mass overloading on binding and elution of unstable proteins inhydrophobicinteraction Chromatography, 1492 (2017) W., Sauer D., Dürauer A., Jungbauer A., Piatkowski W., Antos D., Prediction tool for loading, isocratic elution, gradient elution and scaling up of ion exchange chromatography of proteins, J. Chromatogr. A, 1566 (2018),

11 Adsorpcja i chromatografia białek

12 Motywacja: Produkcja czystych substancji czynnych farmakologicznie Zapotrzebowanie na produkty farmaceutyczne, biofarmaceutyczne, (takie jak przeciwciała monoklonalne, koniugaty białkowe, cząsteczek VLP (virus like particles) itp.), ma we współczesnym przemyśle farmaceutycznym i biotechnologicznym stałą tendencję wzrostową. Na przykładzie białek: Wytwarzanie aktywnych biologicznie białek do zastosowania terapeutycznego zazwyczaj rozpoczyna się w zbiorniku do hodowli komórek - ten proces jest etapem upstream (USP), całej technologii hodowli oraz otrzymywania pożądanego białka. Bardzo często do produkcji białek stosuje się hodowle komórkowe z jajnika chomika chińskiego (CHO) oraz Escherichia coli. Produkt kluczowy, którym jest wytworzone przez komórki białko, musi być izolowany z pożywki fermentacyjnej. Izolacja i oczyszczenie produktu głównego, tzw. downstream processing (DSP), całej technologii. Ze względu na złożoność mieszanin pofermentacyjnych izolacja pożądanego białka wymaga wydajnych, przewidywalnych technik separacyjnych. DSP obejmuje zazwyczaj kilka etapów oczyszczania, w tym wychwytywanie białka z wieloskładnikowej mieszaniny, separację pośrednią oraz doczyszczenie produktu do czystości farmaceutycznej. We wszystkich etapach oczyszczania wykorzystywana jest kolumnowa chromatografia cieczowa jako jedna z najważniejszych technik separacyjnych, w tym przede wszystkim jest zasadniczą techniką w etapie doczyszczania produktu. Ze względu na zapotrzebowanie na duże dawki terapeutycznych biofarmaceutyków, a z drugiej strony ze względu na wysoki koszt faz stacjonarnych używanych w procesie chromatografii, procesy chromatograficzne stanowią coraz większą część całkowitych kosztów produkcji białek, a także istotnym, krytycznym etapem na drodze do szybkiego opracowania i wprowadzenia na rynek nowych leków.

13 Chromatografia powinowactwa (np. Proteina A) Biospecyficzność Chromatografia jonowa (IEC) Chromatografia jonowa (jonowymienna), w której faza stacjonarna zawiera obdarzone ładunkiem elektrycznym grupy funkcyjne, oddziałujące z przeciwnie naładowanymi grupami związków, które mają zostać zatrzymane przez nośnik. Tego rodzaju chromatografii używa się na skalę przemysłową do oddzielania między innymi takich związków, jak aminokwasy, peptydy czy białka. Chromatografia oddziaływań hydrofobowych (HIC) Jest szeroko wykorzystywana do separacji i oczyszczania makrocząsteczek białkowych. Białka adsorbowane są na złożu dzięki występowaniu oddziaływań hydrofobowych fragmentów białka z silnie hydrofobowymi grupami ligandów, trwale umocowanych na powierzchni nośnika pozbawionego ładunku elektrycznego. Chromatografia wykluczania (SEC) (filtracja żelowa, sączenie molekularne), w której fazę stacjonarną stanowi porowate wypełnienie o określonym zakresie wielkości porów. Substancje rozdzielane są na bazie ich wielkości i kształtu. Najczęściej rozdzielanymi związkami są polimery oraz białka. 1) Petrus R., Aksielrud G., Gumnicki J., Piątkowski W., Wymiana masy w układzie ciecz-ciało stałe, monografia, Oficyna Wyd. PRz., Rzeszów ) Antos D., Kaczmarski K., Piątkowski W., Chromatografia preparatywna jako proces rozdzielania mieszanin, monografia, Oficyna WNT, Warszawa 2011

14 Żele NIPA Żele NIPA - hydrożele podlegające przejściom fazowym związanym z dużą zmianą objętości złoża. Zmiany zachodzące pod wpływem temperatury w obrębie fazy polimerowej mogą być wykorzystane w wielu dziedzinach współczesnej chemii i technologii, czego przykładem są zastosowania takich polimerów w medycynie, np. w kontrolowanym uwalnianiu leków czy jako nośników białek i peptydów. W większości przypadków są to termoczułe lub ph-czułe hydrożele usieciowane głównie N N -metylenobisakryloamidem, a także dihydroksyetylenobisakryloamidem i dimetakrylanem glikolu etylenowego lub liniowe polimery tzw. poli(nipaam). Innym przykładem jest szczepienie liniowego poli(nipaam) na powierzchni kapsułek i sterowanie uwalnianiem leku za pomocą otwierania/zamykania porów membrany kapsułki dzięki rozkłębieniu/skłębieniu liniowego poli(nipaam) ze zmianami temperatury. Inteligentne polimery są wykorzystywane w procesach separacyjnych, np.: wymianie rozpuszczalników odwadnianiu roztworów białek i innych wielkocząsteczkowych substancji biologicznie czynnych.

15 Kompilacja dwóch rodzajów chromatografii

16 Ekstrakcja białek

17 Ekstrakcja w wodnych układach dwufazowych (dwuwodnych)

18 Ekstrakcja w wodnych układach dwufazowych Stężenie PEG [% w/w] Skład fazy górnej Obszar I-fazowy Skład układu Skład fazy dolnej binoda PEG/SA/NaCl konoda dla układu 15/5/15 konoda dla układu 15/4/15 binoda PEG/SA konoda dla układu 20/8 Obszar II-fazowy Skład fazy dolnej Stężenie SA [% w/w] Binoda oraz konody dla układów ATPE zawierających PEG i siarczan amonu (SA) oraz dla układów z PEG, SA oraz NaCl. Wojciech Marek, praca doktorska pt. Rozdział białek za pomocą łączonych technik chromatograficznych, promotor Wojciech Piątkowski, Rzeszów (2014).

19 Chromatografia ekstrakcyjna Wirnik i grawerowany dysk znajdujący się w aparacie wyprodukowanym przez Sanki (obecna nazwa CPC240). Porównanie składu kolumn w chromatografii CPC na górze, oraz HPLC na dole Schemat działania trybu wstępującego ASC po lewej, oraz trybu zstępującego DSC po prawej

20 Krystalizacja białek

21 Krystallizacja białek przez wysalanie Proces krystalizacji jest bardzo często używany do oczyszczania oraz rozdzielania białek. W większości przypadków krystalizacja jest realizowana jako proces wysalania. Przesycenie w roztworze białka uzyskuje się przez dodanie soli kosmotropowych. 3

22 Wyniki dla Owalbuminy - przykład Zmiany profilu stężenia podczas krystalizacji były przewidziane przez opracowany model. first stage second stage Comparison of experimental and simulated data for both stages of the ovalbumin crystallization. Dwustopniowa krystalizacja C p,0 [g L -1 ] C p,eq [g L -1 ] Y [%] Y wydajność krystalizacji definiowana jako: Y = m 0 m eq m 0 m 0 masa początkowa owalbuminy; m eq masa owalbuminy w roztworze nasyconym (r-rze macierzystym) 1 2

23 Dorobek zespołu w zakresie chromatografii oraz innych procesów rozdzielania białek 1. Muca R., Piątkowski W., Antos D., Effects of thermal heterogeneity in hydrophobic interaction chromatography, J. Chromatogr (2009) Muca R., Piątkowski W., Antos D., Altering efficiency of hydrophobic interaction chromatography by combined salt and temperature effects, J. Chromatogr (2009) Muca R., Marek W., Piątkowski W., Antos D., Influence of the sample-solvent on protein retention, mass transfer and unfolding kinetics in hydrophobic interaction chromatography, J. Chromatogr (2010) Marek W., Piątkowski W., Antos D., Multiple-injection technique for isolating a target protein from multicomponent mixtures, J. Chromatogr (2011) Marek W., Muca R., Woś S., Piątkowski W., Antos D., Isolation of monoclonal antibody from a CHO supernatant.i. Assessment of different separation concepts, J. Chromatogr. A 1305 (2013) Marek W., Muca R., Woś S., Piątkowski W., Antos D., Isolation of monoclonal antibody from a CHO supernatant.ii. Dynamics of the integrated separation on IEC and HIC column, J. Chromatogr. A 1305 (2013) Poplewska I., Muca R., Strachota A., Piatkowski W., Antos D., Adsorption behavior of proteins on temperature-responsive resins, J. Chromatogr. A, 1324 (2014) Poplewska I., Piątkowski W., Antos D., Overcoming solubility limits in overloaded gradient hydrophobic interaction chromatography, J. Chromatogr. A, 1386 (2015) Ryś S., Piątkowski W., Antos D., Predictions of matrix-assisted refolding of α-lactalbumin: Process efficiency versus batch dilution method, Eng. Life Sci., 15 (2015) Ryś S., Muca R., Kołodziej M., Piątkowski W., Dürauer A., Jungbauer A., Antos D., Design and optimization of protein refolding with crossflow ultrafiltration, Chem. Eng. Sc., 130 (2015), Muca R., Piątkowski W., Antos D., A short-cut method for evaluation of yield reduction due to protein deposition onto the membrane surface in crossflow ultrafiltration, Eng. Life Sci. 17 (2017), ; DOI: /elsc Muca R., Marek W., Żurawski M., Piątkowski W., Antos D., Effect of mass overloading on binding and elution of unstable proteins in Hydrophobic Interaction Chromatography, J. Chromatogr. A, 1492 (2017) , 13.Kołodziej M., Poplewska I., Piątkowski W., Antos D., Design of bulk protein crystallization based on phase diagrams accounting for the presence of interfacial water, Cryst. Growth & Des. 18 (1) (2018), , DOI: /acs.cgd.7b01398; 14.Marek W., Sauer D., Dürauer A., Jungbauer A., Piatkowski W., Antos D., Prediction tool for loading, isocratic elution, gradient elution and scaling up of ion exchange chromatography of proteins, J. Chromatogr. A, 1566 (2018), , 15.Kołodziej M., Olbrycht M., Poplewska I., Piątkowski W., Antos D., Forced Convection Evaporation for Bulk Protein Crystallization, Cryst. Growth & Des. 18 (9) (2018), DOI: /acs.cgd.8b00638;

24 Rozdzielane związków chiralnych

25 Stereochemia i podział izomerów

26 Enancjomery ich specyfika Enancjomery - cząsteczki, które są wzajemnymi, nienakładalnymi odbiciami lustrzanymi Klasycznym szkodliwego przykładem oddziaływania jest imid kwasu N-ftaliloglutaminowego znany w handlu pod nazwą Thalidomid Działanie enancjomerów Penicylina R: toksyczne S: przeciwbakteryjne Propanolol R: antykoncepcyjne S: β-bloker Etambutol R: uszkadzające wzrok S: antymykobakteryjne 26 Thalidomid R: przeciwbólowe S: silnie embriotoksyczne

27 Motywacja: Produkcja czystych enancjomerów Większość wprowadzanych leków zawiera obecnie centra chiralne, a według Global Industry Analysts (GIA) prawie 95% leków będzie związkami chiralnymi do roku GIA szacuje, że globalny rynek technologii chiralnych, który jest zdominowany przez aplikacje farmaceutyczne (a następnie agrochemikalia i środki smakowo-zapachowe), osiągnie poziom 51 miliardów dolarów do roku Ponieważ FDA wymaga od producentów badania właściwości (fizykochemicznych, farmakokinetycznych itp.) wszystkich enancjomerów / diastereomerów leków chiralnychw celu określenia ich indywidualnego bezpieczeństwa i skuteczności, opracowanie skutecznych technologii syntezy chiralnej pozostaje głównym celem wielu badaczy akademickich i przemysłowych

28 Metody (procesy) rozdzielania enancjomerów 28

29 Chromatografia chiralna Możliwość bezpośredniego rozdzielenia chiralnych izomerów ma niezwykle istotne znaczenie w chemii i to zarówno z analitycznego, jak i preparatywnego punktu widzenia, a w szczególności dla preparatów farmakologicznych oraz w biotechnologii. Według najnowszych danych z ponad 200 najczęściej przepisywanych leków, 114 posiada przynajmniej 1 centrum chiralne, a 25% z nich sprzedawanych jest w postaci racemicznej, mimo, że najczęściej tylko jeden z optycznie czynnych izomerów wykazuje pożądaną czynność farmakologiczną, podczas gdy drugi może być balastem lub działać wręcz szkodliwie. Chromatographic methods Membrane technologies PREPARATIVE SEPARATION METHODS Preferential Crystallization Other e.g., chiral extraction Przemysłowy rozdział mieszanin racemicznych jest bardzo opłacalny z poniższych powodów:: rozdział mieszanin enancjomerów jest bardzo ważnym procesem w przemysłach: farmaceutycznym, biotechnologicznym czy agrochemicznym, ceny chiralnych sustancji czynnych w farmacji rosną w stosunku powyżej 15% rocznie i obecnie osiągają wartość 200 mld $.

30 Diastereoizomery DIASTEREOIZOMERY ENANCJOMERY Diastereoizomery- stereoizomery niebędące odbiciami lustrzanymi 30

31 Krystalizacja enancjomerów i diastereomerów Różne typy systemów racemicznych E 1 a) S b) 2 phases (Sol + E 1 (s)) Konglomerat 1 phase - Sol T cryst 3 phases (Sol + E 1 (s) + E 2 (s)) r 2 phases (Sol + E 2 ) (s)) 1 phase - Sol 2 phases (Sol + E 1 (s)) 3 phases (Sol + E 1 (s) + r(s)) 2 phases (Sol + r) T cryst 2 phases (Sol + E 2 (s)) 3 phases (Sol + E 2 (s) r(s)) e e r Mieszanina racemiczna E 2 E 1 E 2 S c) S II III 2 phases (Sol + E 1 (s)) + E 2 (s)) r Pseudoracemat I 1 phase - Sol T cryst E 1 E 2 Wykres fazowy Faza ciekła: S rozpuszczalnik, Sol roztwór, w tym macierzysty, r racemat, e eutektyk

32 Przykład - Krystalizacja konglomeratu S 100% E 1 100% E 2 P 1 ML P T cryst P 2 E 1 E 1 /E 2 r E 2 Konglomerat

33 Wielostopniowa krystalizacja krzyżowa Rys. 6. Schemat technologiczny procesu wielostopniowej krystalizacji współprądowej 33

34 Wielostopniowa krystalizacja przeciwprądowa Rys. 8. Schemat technologiczny procesu wielostopniowej krystalizacji gdzie: F = S 0 masa strumienia surówki (faza krystaliczna) dostarczana do pierwszego stopnia; S k-1 masa strumienia surówki (faza krystaliczna) dostarczana do k-tego stopnia; L k+1 = L k+1 W k+1 masa roztworu macierzystego (faza ciekła), otrzymanego w stopniu k+1, dostarczana do k-tego stopnia; S k, L k masy strumieni: ciała stałego (faza krystaliczna) i roztworu macierzystego (faza ciekła) otrzymanych w k-tym stopniu; Sol masa rozpuszczalnika dostarczana do ostatniego, N-tego, stopnia krystalizacji. 34

35 Dorobek zespołu w zakresie chromatografii chiralnej oraz krystalizacji mieszanin enacjomerów i diastereomerów 1. Poplewska I., Kramarz R., Piatkowski W., Seidel-Morgenstern A., Antos D., " Influence of preferential adsorption of mobile phase on retention behavior of amino acids on the teicoplanin chiral selector ", J. Chromatogr (2007) Poplewska I., Kramarz R., Piatkowski W., Seidel-Morgenstern A., Antos D., " Behavior of adsorbed and fluid phases versus retention properties of amino acids on a chiral selector, J. Chromatogr (2008) Balawejder M., Gałan K., Elsner M.P., Seidel-Morgenstern A., Piątkowski W., Antos D., Multi-stage crystallization for resolution of enantiomeric mixtures in a solid solution forming system, Chem.Eng.Sc. 61 (2011), Balawejder M., Kiwała D., Lorenz H., Seidel-Morgenstern A., Piątkowski W., Antos D., Resolution of a Diasteromeric Salt of Citalopram by Multistage Crystallization, Cryst. Growth & Des. 12, (2012), M. Balawejder, i inni, Modeling and predictions of solid liquid equilibria for citalopram oxalate as a representative of a solid solution forming system, Fluid Phase Eq., 346 (2013), Olbrycht M., Balawejder M., Matuła K., Piatkowski W., Antos D., Multistage cross- and counter-current flow crystallization for separation of racemic 2-methylbutanoic acid, Industrial & Engineering Chemistry Research,) 53, (2014), Kiwala D., Olbrycht M., Balawejder M., Piątkowski W., Seidel-Morgenstern A., Antos D., Separation of Stereoisomeric Mixtures of Nafronyl as a Representative of Compounds Possessing Two Stereogenic Centers, by Coupling Crystallization, Diastereoisomeric Conversion, and Chromatography, Org. Proc. Res. Dev., 20 (3) (2016), , DOI: /acs.oprd.5b00361; 8. Olbrycht M., Kiwala D., Balawejder M., Piątkowski W., Seidel-Morgenstern A., Antos D., Multiplicity of equilibrium states in separating stereoisomeric mixtures of nafronyl oxalate by crystallization, Cryst. Growth & Des. 16 (2016), , DOI: /acs.cgd.6b00624

36 Zespół badawczy: Pracownicy: Izabela Poplewska, Renata Muca, Roman Bochenek, Wojciech Marek, Maksymilian Olbrycht, Wojciech Piątkowski Doktoranci: Michał Kołodziej Krystian Baran Kierownik zespołu: Dorota Antos