(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/50 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. C07K16/18 ( ) G01N33/574 ( ) A61P35/00 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Przeciwciała modyfikujące przebieg choroby nowotworowej (30) Pierwszeństwo: US (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2006/02 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 04/2007 (73) Uprawniony z patentu: Arius Research, Inc., Toronto, CA PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: YOUNG David S. F., Toronto, CA HAHN Susan E., Toronto, CA (74) Pełnomocnik: Kancelaria Patentowa rzecz. pat. Zbigniew Kamiński Warszawa Al. Jerozolimskie 101/18 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis PRZEDMIOT WYNALAZKU Przedmiotem wynalazku jest wyodrębnianie i wytwarzanie przeciwciał modyfikujących przebieg choroby nowotworowej (CDMAB) i zastosowanie CDMAB w procesach terapeutycznych i diagnostycznych, ewentualnie w połączeniu z przynajmniej jednym środkiem chemoterapeutycznym. Ponadto przedmiotem wynalazku są oznaczenia wiązania w których stosuje się CDMAB-y według wynalazku. STAN TECHNIKI WYNALAZKU Każdy pacjent, który poddawany jest leczeniu w chorobie nowotworowej jest wyjątkowy i, podobnie jak dowody tożsamości tych pacjentów, każdy nowotwór jest inny niż nowotwory innych pacjentów. Jednakże obecnie w stosowanych terapiach wszyscy pacjenci z tym samym typem nowotworu, na tym samym etapie rozwoju choroby, są leczeni w ten sam sposób. Wiadomo, że przynajmniej u 30% tych pacjentów pierwszy zastosowany sposób leczenia nie będzie skuteczny. W wyniku tego stosowane są kolejne sposoby leczenia i zwiększa się prawdopodobieństwo iż kolejna terapia zawiedzie, nastąpią przerzuty, a ostatecznie śmierć pacjenta. Lepszym podejściem do leczenia choroby nowotworowej mogłoby być dostosowanie leczenia do konkretnego pacjenta tzw. terapia celowana. Jedyną stosowaną obecnie terapią, która może być dostosowana do konkretnego pacjenta, jest zabieg chirurgiczny. Chemoterapia i leczenie napromieniowaniem nie należą do terapii celowanych, dostosowanych do pacjenta, a sam zabieg chirurgiczny, w większości przypadków jest niewystarczający lub nieodpowiedni dla pacjenta. Wraz z rozpoczęciem prac nad przeciwciałami monoklonalnymi, możliwość opracowywania nowych sposobów leczenia dostosowanych do konkretnego pacjenta staje się coraz bardziej realistyczna, gdyż każde przeciwciało może być skierowane przeciwko tylko jednemu epitopowi. Ponadto możliwe jest wytworzenie kombinacji przeciwciał, które są skierowane 2

3 przeciwko układowi epitopów, które wybiórczo definiują określony nowotwór u leczonego pacjenta. Gdy naukowcy odkryli, że znacząca różnica pomiędzy komórkami nowotworowymi a zdrowymi, polega na tym, że komórki nowotworowe zawierają antygeny, które są specyficzne dla zmienionych nowotworowo komórek, długo utrzymywali, że przeciwciała monoklonalne mogą być tak zaprojektowane aby specyficznie oddziaływały ze zmienionymi nowotworowo komórkami przez wiązanie specyficznie z tymi antygenami nowotworowymi; co dało podstawy do przekonania, że przeciwciała monoklonalne mogą służyć jako "magiczne pociski " do eliminacji komórek nowotworowych. Wykazano, że przeciwciała monoklonalne wyodrębnione zgodnie ze wskazówkami ujawnionego tutaj wynalazku modyfikują proces choroby nowotworowej w sposób, który jest korzystny dla pacjenta, na przykład obniżając obciążenie guzem, a zatem różnie odmiany tych przeciwciał będą opisywane tutaj spójnie jako przeciwciała modyfikujące przebieg choroby nowotworowej (CDMAB) lub przeciwciała "przeciwnowotworowe". Obecnie, pacjent cierpiący na nowotwór zwykle ma kilka opcji leczenia. Ściśle kontrolowane podejście do leczenia terapeutycznego odprowadziło do uzyskania poprawy w globalnym współczynniku przeżywalności i obniżenie współczynnika śmiertelności. Jednakże w odniesieniu do poszczególnych pacjentów, te poprawione statystyki nie zawsze korelują się z poprawą w ich własnej sytuacji. Zatem, jeśli metodyka według wynalazku zostałaby wprowadzona umożliwiłaby ona lekarzom leczenie każdego guza niezależnie u każdego z pacjentów cierpiących na ten sam typ guza, a zatem zapewniłaby terapię celowaną, dostosowaną do określonej osoby. Taki tryb leczenia mógłby, w rozwiązaniu idealnym, zwiększyć ilość osób wyleczonych i prowadzić do lepszych wyników, zaspakajając występującą już od dłuższego czasu potrzebę opracowania skutecznej terapii celowanej. Z historycznego punktu widzenia, zastosowanie poliklonalnych przeciwciał zostało zwieńczone jedynie ograniczonym sukcesem w leczeniu nowotworów u ludzi. Chłoniaki i białaczki leczono z użyciem ludzkiego osocza, lecz wystąpiło jedynie kilka opóźnionych remisji lub odpowiedzi. Ponadto brak było powtarzalności wyników i brak dodatkowych korzyści w porównaniu do 3

4 chemoterapii. Guzy lite takie jak nowotwory sutka, czerniaki i nowotwory komórek nerkowych również leczono z użyciem ludzkiej krwi, surowicy szympansiej, ludzkiego osocza i surowicy końskiej z równie nieprzewidywalnym wynikiem i brakiem skuteczności. Przeprowadzono wiele prób klinicznych na przeciwciałach monoklonalnych stosowanych do leczenia guzów litych. W latach 80. XX wieku przeprowadzono przynajmniej cztery próby kliniczne leczenia ludzkiego nowotworu sutka, w których stwierdzono odpowiedź na leczenie tylko u jednej osoby w porównaniu do przynajmniej 47 pacjentów stosujących przeciwciała skierowane przeciwko specyficznym antygenom lub oparte na selektywności względem tkanki. Dopiero w 1998 osiągnięto sukces w badaniach klinicznych leczenia raka z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał anty-her 2 w połączeniu z cisplatyną. W tej próbie klinicznej brało udział 37 pacjentów, u których zaobserwowano odpowiedź, przy czym u jednej czwartej z nich stwierdzono odpowiedź częściową, a u połowy obserwowano niewielki lub stały postęp choroby. Próby kliniczne, w których badano raka jelita grubego, obejmowały przeciwciała skierowane przeciwko zarówno docelowym glikoproteinom jaki glikolipidom. Przeciwciała takie jak 17-1A, które wykazują pewną specyficzność względem komórek raka gruczołowego, przeszły fazę drugą prób klinicznych u ponad 60 pacjentów, przy tylko jednym pacjencie wykazującym częściową odpowiedź. W innych próbach, zastosowanie 17-1A prowadziło tylko do jednej pełnej odpowiedzi i dwóch pomniejszych, spośród 52 pacjentów poddanych protokołom, w których dodatkowo stosowano cyklofosfamid. Inne próby związane z podawaniem 17-1A prowadziły do podobnych wyników. Zastosowanie humanizowanego mysiego monoklonalnego przeciwciała wstępnie zatwierdzonego do obrazowania, również nie powodowało cofania się nowotworu. Do dziś nie opracowano żadnego przeciwciała, które byłoby skuteczne w leczeniu raka jelita grubego. Podobnie równie słabe wyniki osiągano w przypadku raka płuc, raka mózgu, raka jajników, raka trzustki, raka prostaty i raka żołądka. Pewien, ograniczony sukces zanotowano przy zastosowaniu monoklonalnego przeciwciała anty-gd3 stosowanego w leczeniu czerniaka. Zatem, widoczne jest, że pomimo pomyślnych wyników w przypadku badań na małych zwierzętach, które to wyniki są warunkiem wstępnym do 4

5 przeprowadzenia prób klinicznych na ludziach, badane przeciwciała w większości były nieskuteczne. Opublikowane patenty W patencie US Nr 5,750,102 ujawniono sposób, w którym komórki pobrane z guza pacjenta transfekuje się genami MHC, które mogą być sklonowane z komórek lub tkanki tego pacjenta. Transfekowane komórki następnie stosuje się u tego pacjenta jako szczepionkę. W patencie US Nr 4,861,581 ujawniono sposób obejmujący etapy otrzymywania przeciwciał monoklonalnych, które są specyficzne względem wewnątrzkomórkowego składnika komórek nowotworowych i zdrowych ssaka, lecz nie względem składników zewnętrznych, znakowania monoklonalnego przeciwciała, kontaktowania znakowanego przeciwciała z tkanką ssaka, który został poddany terapii, aby zniszczyć komórki nowotworowych i wyznaczania skuteczności leczenia przez pomiar wiązania znakowanego przeciwciała ze składnikiem wewnątrzkomórkowym zdegenerowanych komórek nowotworowych. Twórcy patentu stwierdzili, że komórki złośliwe stanowią dogodne źródło takich antygenów do otrzymywania przeciwciał skierowanych przeciwko ludzkim antygenom wewnątrzkomórkowym. W patencie US Nr 5,171,665 przedstawiono nowe przeciwciało i sposób jego wytwarzania. Bardziej szczegółowo, w patencie tym przedstawiono wytwarzanie monoklonalnych przeciwciał, które charakteryzują się silnym wiązaniem z białkowym antygenem związanym z guzami u ludzi, np. guzami okrężnicy i płuc, podczas gdy wiązanie z komórkami zdrowymi zachodziło w znacznie mniejszym stopniu. W patencie US Nr 5,484,596 dostarczono sposób leczenia nowotworów obejmujący chirurgiczne usuwanie tkanki guza z organizmu pacjenta cierpiącego na nowotwór, traktowanie tkanki guza, aby otrzymać komórki nowotworowe, naświetlanie komórek nowotworowych, aby były zdolne do życia, ale nie powodujące rozwoju nowotworu i stosowanie tych komórek do wytwarzania szczepionki dla pacjenta, która będzie zdolna do hamowania ponownego wystąpienia pierwotnego guza i jednocześnie hamująca przerzuty nowotworu. W patencie tym przedstawiono otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych, które reagują z antygenami powierzchniowymi komórek nowotworowych. Jak przedstawiono w kolumnie 4, wersy 45 i następne, twórcy 5

6 wynalazku wykorzystali autochtoniczne komórki nowotworowe do uzyskiwania przeciwciał monoklonalnych umożliwiających specyficzną immunoterapię w przypadku powstawania nowotworu u ludzi. W patencie US Nr 5,693,763 przedstawiono glikoproteinowy antygen charakterystyczny dla ludzkich nowotworów i nie zależny od miejsca pochodzenia z tkanki nabłonokowej. W patencie US Nr 5,783,186 przedstawiono przeciwciała Anty-Her2, które indukują apoptozę w komórkach, w których następuje ekspresja Her2, linie komórkowe hybrydomy produkujące przeciwciała, sposoby leczenia nowotworu z wykorzystaniem przeciwciał i kompozycje farmaceutyczne obejmujące te przeciwciała. W patencie US Nr 5,849,876 opisano nowe linie komórkowe hybrydomy do produkcji przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciwko antygenom mucynowym oczyszczonym z tkanki guza i z innych tkanek. W patencie US Nr 5,869,268 przedstawiono sposób wytwarzania ludzkich limfocytów produkujących przeciwciało specyficzne względem określonego antygenu, sposób wytwarzania monoklonalnego przeciwciała, jak i przeciwciała monoklonalne wytworzone tym sposobem. Patent zwłaszcza dotyczy produkcji ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty-hd stosowanego do diagnozy i leczenia nowotworów. Patent US Nr 5,869,045 dotyczy przeciwciał, fragmentów przeciwciał, koniugatów przeciwciał i jednołańcuchowych immunotoksyn reagujących z ludzkimi komórkami nowotworowymi. Mechanizm, według którego te przeciwciała funkcjonują jest dwojaki i polega po pierwsze na tym, że cząsteczki reagują z antygenami błony komórkowej obecnymi na powierzchni ludzkich komórek nowotworowych, a po drugie przeciwciała mają zdolność do przenikania po związaniu do środka komórki rakowej. Te mechanizmy powodują, że przeciwciała przedstawiony w tym patencie są szczególnie użyteczne do tworzenia koniugatów przeciwciało-lek i przeciwciało-toksyna. W swojej niezmodyfikowanej postaci, przy określonych stężeniach, przeciwciała te wykazują również właściwości cytotoksyczne. W patencie US Nr 5,780,033 ujawniono zastosowanie autoprzeciwciał do leczenia i profilaktyki nowotworów. Jednakże, opisane przeciwciało jest autoprzeciwciałem przeciwjądrowym od ssaka w starszym wieku. W tym 6

7 przypadku, stwierdza się, że autoprzeciwciało jest tego samego typu co naturalne przeciwciało znalezione w układzie immunologicznym. Ponieważ autoprzeciwciało to pochodzi od "ssaka w starszym wieku", nie ma konieczności, aby to autoprzeciwciało faktycznie pochodziło od leczonego pacjenta. Ponadto, w patencie ujawniono naturalne i monoklonalne autoprzeciwciała przeciwjądrowe od ssaka w starszym wieku i linię komórkową hybrydoma wytwarzającą monoklonalne autoprzeciwciało przeciwjądrowe. OPIS WYNALAZKU Twórcy niniejszego wynalazku otrzymali już patent US Nr 6,180,357, zatytułowany "Individualized Patient Specific Anti-Cancer Antibodies", którego przedmiotem jest sposób selekcji przeciwciał przeciwnowotworowych do terapii celowanej, które są stosowane w leczeniu choroby nowotworowej. Rozwiązanie to wykorzystuje sposób wytwarzania przeciwciał przeciwnowotworowych specyficznych dla pacjenta, jak opisano w patencie nr '357, do wyodrębnienia linii komórkowych hybrydom, które kodują przeciwciała monoklonalne modyfikujące nowotworowy proces chorobowy. Przeciwciała te mogą być wytworzone, tak aby były specyficznie dla jednego, określonego guza i dzięki temu możliwe jest dostosowanie sposobu leczenia nowotworów do danego pacjenta. W zakresie tego rozwiązania przeciwciała przeciwnowotworowe mają właściwości takie jak zdolność do uśmiercania komórek (właściwości cytotoksyczne) lub do hamowania wzrostu komórek (właściwości cytostatyczne), które poniżej będą określane łącznie jako właściwości cytotoksyczne. Przeciwciała według wynalazku mogą być stosowane jako środki pomocnicze do klasyfikacji według stadiów zaawansowania i do diagnozy nowotworów, jak również mogą być stosowane do leczenia przerzutów nowotworowych. Oczekuje się, że terapia celowana w leczeniu nowotworów przyniesie zmianę w sposobie traktowania pacjenta. Najbardziej prawdopodobny scenariusz kliniczny obejmuje pozyskania próbki tkanki guza w momencie zapoznania się lekarza z chorobą i umieszczenia tej próbki w banku tkanek. Na podstawie tej tkanki, można przeprowadzić identyfikację typu guza, korzystając z panelu wcześniej zgromadzonych przeciwciał modyfikujących choroby nowotworowe. U pacjenta tradycyjnie zostanie określone stadium rozwoju 7

8 nowotworu, lecz dostępne przeciwciała będą mogły być użyte w dalszych stadiach choroby pacjenta. Pacjent może być leczony natychmiast z wykorzystaniem istniejących przeciwciał, a panel przeciwciał specyficznych względem przedmiotowego guza może być wytworzony zarówno stosując sposoby przedstawione tutaj lub przez zastosowanie bibliotek fagowych w połączeniu z metodami przesiewowymi ujawnionymi w tym patencie. Wszystkie wytworzone przeciwciała będą dodane do biblioteki przeciwciał przeciwnowotworowych, gdyż istnieje prawdopodobieństwo, że inne guzy mogą nieść część takich samych epitopów jak te, które właśnie wykorzystano. Przeciwciała wytworzone według sposobu według wynalazku mogą być użyteczne do leczenia choroby nowotworowej u dowolnej liczby pacjentów, którzy cierpią na nowotwory niosące epitopy, które wiążą się z tymi przeciwciałami. Oprócz przeciwciał przeciwnowotworowych, pacjent może zdecydować się na otrzymywanie obecnie zalecanych terapii, będących częścią zróżnicowanego trybu leczenia. Fakt że przeciwciała wyodrębnione z wykorzystaniem opisanej tutaj metodyki są stosunkowo nietoksyczne dla komórek nie będących komórkami nowotworowymi, umożliwia zastosowanie kombinacji tych przeciwciał w bardzo wysokich dawkach, zarówno samych, jak i w połączeniu z tradycyjnymi sposobami leczenia. Wysoki współczynnik terapeutyczny również umożliwi zastosowanie ponownego leczenia w ciągu krótkiego czasu, co powinno obniżyć prawdopodobieństwo wystąpienia komórek odpornych na leczenie. Ponadto, również w zakresie niniejszego wynalazku jest sprzęganie standardowych środków chemoterapeutycznych, np. radionuklidów z CDMABami według wynalazku, dzięki czemu skupia się działanie tych środków chemoterapeutycznych na komórkach nowotworowych. Jeśli stan pacjenta nie polepsza się po wstępnych trybach leczenia lub występują przerzuty, proces wytwarzania specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko nowotworowi może być powtórzony w celu powtórzenia terapii. Ponadto, przeciwciała przeciwnowotworowe mogą być sprzężone z czerwonymi krwinkami otrzymanymi od pacjenta i ponownie wprowadzone do leczenia przerzutów. Istnieje niewiele skutecznych sposobów leczenia przerzutów nowotworowych i przerzuty zwykle zapowiadają 8

9 niekorzystne wyniki leczenia, prowadzące do śmierci. Jednakże, przerzuty nowotworowe zwykle są dobrze unaczynione i dostarczanie przeciwciał przeciwnowotworowych za pośrednictwem czerwonych krwinek może prowadzić do zatężenia przeciwciał w miejscu występowania guza. Nawet przed wystąpieniem przerzutów, w przypadku większości komórek nowotworowych, ich przeżycie zależy od dopływu krwi od gospodarza i przeciwciało przeciwnowotworowe sprzężone z czerwonymi krwinkami może być również skutecznie skierowane przeciwko guzowi in situ. W innym rozwiązaniu, przeciwciała mogą być sprzężone z innymi komórkami związanymi z układem krwionośnym, np. limfocytami, makrofagami, monocytami, naturalnie występującymi krwinkami białymi o działaniu cytotoksycznym, itp. Występuje pięć klas przeciwciał i każda z klas jest związana z funkcją przeciwciała, która jest nadawana przez jego ciężki łańcuch. Ogólnie uważa się, że w niszczeniu komórek rakowych przez nagie przeciwciała uczestniczy bądź komórkowa cytotoksyczność zależna od przeciwciała bądź cytotoksyczność zależna od układu dopełniacza. Na przykład mysie przeciwciała IgM i IgG2a mogą aktywować ludzki układ dopełniacza przez wiązanie składnika C-1 układu dopełniacza, aktywując klasyczną drogę aktywacji układu dopełniacza, co może prowadzić do lizy guza. W przypadku ludzkich przeciwciał najbardziej skuteczne przeciwciała aktywujące układ dopełniacza obejmują zasadniczo IgM i IgG1. Mysie przeciwciała izotypu IgG2a i IgG3 są skuteczne w nabywaniu cytotoksyczności komórkek, które mają receptory Fc, co będzie prowadzić do niszczenia komórek przez monocyty, makrofagi, granulocyty i pewne limfocyty. Ludzkie przeciwciała obu izotypów IgG1 i IgG3 pośredniczą w komórkowej cytotoksyczności zależnej od przeciwciała. Innym możliwym mechanizmem niszczenia komórek rakowych przez przeciwciało może być zastosowanie przeciwciał, których funkcja polega na katalizie hydrolizy różnych wiązań chemicznych w błonie komórkowej i związanych z nią glikoprotein lub glikolipidów, są to tak zwane przeciwciała katalityczne. Istnieją jeszcze dwa kolejne, ogólnie akceptowane, mechanizmy niszczenia komórek rakowych przez przeciwciało. Pierwszy mechanizm polega na zastosowaniu przeciwciał jako szczepionki, która indukuje organizm do wytworzenia odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko 9

10 przypuszczalnemu antygenowi nowotworowemu, który znajduje się na komórce nowotworowej. Drugi mechanizm obejmuje zastosowanie przeciwciał skierowanych przeciwko receptorom wzrostu i oddziałujących z ich funkcją lub regulujących aktywność receptora, tak aby jego skuteczne funkcjonowanie było zniesione. Zgodnie z powyższym, przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania, z komórek pochodzących od określonego pacjenta, przeciwciał modyfikujących przebieg choroby nowotworowej, które są cytotoksyczne w odniesieniu do komórek nowotworowych i jednocześnie są stosunkowo nietoksyczne dla komórek nie będących komórkami rakowymi, przy czym sposób ten prowadzi do wyodrębnienia linii komórkowych hybrydom i odpowiednich wyodrębnionych przeciwciał monoklonalnych i ich fragmentów wiążących antygen, które są kodowane przez te linie komórkowe hybrydom. Kolejnym przedmiotem wynalazku są przeciwciała modyfikujące przebieg choroby nowotworowej i fragmenty tych przeciwciał wiążące antygen. Kolejnym przedmiotem wynalazku są wytworzenie przeciwciała modyfikujące przebieg choroby nowotworowej, w których cytotoksyczności uczestniczy komórkowa toksyczność zależna od przeciwciała. Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest wytworzenie przeciwciał modyfikujących przebieg choroby nowotworowej, w których cytotoksyczności uczestniczy toksyczność zależna od układu dopełniacza. Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wytworzenie przeciwciał modyfikujących przebieg choroby nowotworowej, których cytotoksyczność jest oparta na zdolności tych przeciwciał do katalizowania hydrolizy wiązań chemicznych w komórce. Jeszcze innym przedmiotem wynalazku jest wytworzenie przeciwciał modyfikujących przebieg choroby nowotworowej, które są stosowane w oznaczaniu wiązania do celów diagnostycznych, prognostycznych i do monitorowania nowotworów. Inne odmiany i korzyści wynikające z niniejszego wynalazku staną się jasne na podstawie poniższego opisu, w którym przedstawiono pewne realizacje wynalazku w celu jego zilustrowania i jako przykład. Krótki opis rysunku 10

11 Figura 1 przedstawia reprezentatywne histogramy FACS przeciwciała 10A304.7, przeciwciała kontrolnego izotypu, przeciwciała anty-egfr skierowane przeciwko kilku liniom komórek nowotworowych i komórek nienowotworowych. PRZYKŁAD 1 Wytwarzanie hybrydom - Linia komórkowa hybrydomy 10A304.7 Linię komórkową hybrydomy 10A304.7 złożono, zgodnie z Układem Budapesztańskim, 26 listopada 2002, w American Type Culture Collection, University Blvd., Manassas, Va , USA, za numerem dostępu PTA Zgodnie z 37 CFR 1.808, zgłaszający zapewniają, że wszystkie ograniczenia nałożone na dostępność dla społeczeństwa złożonego materiału będą nieodwołalnie usunięte w wyniku przyznania patentu. W celu wytworzenia komórek hybrydomy, wytwarzających przeciwciało przeciwnowotworowe, w zimnym PBS przygotowano zawiesinę pojedynczych komórek z guza okrężnicy hodowanego u myszy SCID z linii komórek nowotworowych okrężnicy HT-29. Następnie przygotowano do użycia adiuwant IMMUNEASY (Qiagen, Venlo, Holandia) łagodnie mieszając na mieszadle Vortex. Do 10 milionów komórek HT-29 w probówce do wirowania dodano 100 mikrolitrów mysiego adiuwanta IMMUNEASY i zamieszano, po czym pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 15 min. Myszy BALB/c w wieku ośmiu do dziewięciu tygodni immunizowano przez iniekcję domięśniową 100 mikrolitrami antygenu-adiuwanta zawierającego 2,5 milionów komórek. Dwa tygodnie po wstępnej immunizacji stosowano świeżo przygotowany antygenadiuwant jako dawkę wspomagającą u immunizowanej mszy, wstrzykując wewnątrzotrzewnowo 2,5 milionów komórek w 250 mikrolitrach. Śledzionę wykorzystano do fuzji dwa dni po immunizacji. Hybrydomy przygotowano przez fuzję wyodrębnionych limfocytów śledzionowych z odpowiednikami komórkami szpiczaka NSO-1. Supernatanty po fuzji badano pod kątem klonowania hybrydom. Aby wyznaczyć czy przeciwciała wydzielane przez komórki hybrydomy mają izotyp IgG lub IgM, zastosowano test ELISA. 100 mikrolitrów/studzienkę koziego przeciwciała skierowanego przeciwko mysim IgG + IgM (H+L) przy stężeniach 2,4 mikrogramów/ml w buforze do nakładania (0,1M bufor 11

12 węglan/wodorowęglan, ph 9,2-9,6) w temperaturze 4 C dodawano do szalek ELISA przez noc. Szalki przemyto trzykrotnie buforem do przemywania (PBS+0,05% Tween). Do szalki dodano w temperaturze pokojowej 100 mikrolitrów/studzienkę buforu blokującego (5% mleko w buforze do przemywania) przez godzinę, a następnie przemyto trzykrotnie buforem do przemywania. Dodano 100 mikrolitrów/studzienkę supernatantu hybridomy i szalkę inkubowano przez godzinę w temperaturze pokojowej. Szalki przemyto trzykrotnie buforem do przemywania i dodawano rozcieńczenie 1/5000 bądź koziego przeciwciała przeciwko mysiej IgG lub IgM sprzężonego z peroksydazą z chrzanu (rozcieńczenie w PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej), 100 mikrolitrów/studzienkę. Po inkubacji szalki przez godzinę w temperaturze pokojowej, szalkę przemyto trzykrotnie buforem do przemywania. Dodano 100 mikrolitrów/studzienkę roztworu TMB i inkubowano przez 1-3 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję barwną stopowano dodając 100 mikrolitrów/studzienkę 2M H 2 SO 4 i dokonywano odczytu szalki przy 450 nm stosując czytnik szalek Perkin-Elmer HTS7000. Jak przedstawiono w tabeli 1 komórki hybridom 10A304.7 wydzielały pierwotnie przeciwciała o izotypie IgG. Tabela 1 Izotyp ELISA Cytotoksyczność (%) Wiązanie (powyżej tła) Krotność HT-29 SW1116 SW620 HT-29 SW1116 SW620 (powyżej tła) Klon IgG IgM Średnia CV Średnia CV Średnia CV Krotność Krotność Krotność 10A ,0 0, ,8 13,1 23,9 38D NaN Cykloheksimid Anty- EGFR(C225) Po jednym przebiegu granicznego rozcieńczenia supenatanty hybrydomy badano pod kątem przeciwciał, które wiążą się z docelowymi komórkami w teście komórkowym ELISA. Badano trzy linie komórkowe nowotworu okrężnicy: HT-29, SW1116 i SW620. Naniesione komórki utrwalono przed użyciem. Szalki przemyto trzykrotnie w temperaturze pokojowej PBS 12

13 zawierającym MgCl 2 i CaCl 2. Do każdej studzienki dodawano 100 mikrolitrów 2% paraformaldehydu rozcieńczonego PBS przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie roztwór usunięto. Szalki ponownie przemyto trzy razy w temperaturze pokojowej PBS zawierającym MgCl 2 i CaCl 2. Blokowanie przeprowadzono stosując 100 mikrolitrów/studzienkę 5% mleka w buforze do przemywania (PBS+0,05% Tween) przez godzinę w temperaturze pokojowej. Szalki przemyto trzykrotnie buforem do przemywania i dodano supernatant hybrydomy w ilości 100 mikrolitrów/studzienkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Szalki przemyto trzy razy buforem do przemywania i dodano 100 mikrolitrów/studzienkę 1/5000 rozcieńczenia koziego przeciwciała przeciwko mysiej IgG lub IgM sprzężonego z peroksydazą z chrzanu (rozcieńczonego w PBS zawierającym 1% albuminę z surowicy bydlęcej). Po inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej szalki przemyto trzy razy buforem do przemywania i inkubowano z 100 mikrolitrami/studzienkę substratu TMB przez 1-3 minut w temperaturze pokojowej. Reakcję stopowano dodając 100 mikrolitrów/studzienkę 2M H 2 SO 4 i szalki poddano odczytowi przy 450 nm stosując czytnik do szalek Perkin-Elmer HTS7000. Wyniki zestawione w tabeli 1 przedstawiono jako krotność powyżej wartości tła w porównaniu do kontrolnego izotypu IgG (3BD-27). Przeciwciała z hybrydomy 10A304.7 wykazały 22,8- krotnie, 13,1-krotnie, i 23,9-krotnie wyższe wiązanie niż wiązanie tła dla komórek odpowiednio HT-29, SW1116, i SW620. Wskazuje to na fakt, że przeciwciało wiąże się z antygenem, który występuje w większej ilości na powierzchni niektórych komórek nowotworowych w porównaniu do innych. Łącznie z badaniem wiązania przeciwciała, testowano działanie cytotoksyczne supernatantów hybrydomy na tych samych liniach komórek nowotworu okrężnicy: HT-29, SW11116 i SW620. Test cytotoksyczności żywe/martwe otrzymano z Molecular Probes (Eu, OR). Testy wykonywano zgodnie z instrukcją producenta ze zmianami przedstawionymi poniżej. Komórki wysiano przed wykonaniem testu zgodnie ze wcześniej określonymi odpowiednimi gęstościami. Po dwóch dniach, 100 mikrolitrów supernatantu z szalek mikrotitracyjnych zawierających hybrydomy przenoszono do szalek do hodowli komórek i inkubowano w cieplarce w atmosferze 5% CO 2 przez 5 dni. Studzienki, które służyły jako kontrole pozytywne, zasysano do uzyskania pustych studzienek i dodawano 100 mikrolitrów azydku sodu i/lub 13

14 cykloheksimidu. Monoklonalne przeciwciało 3BD-27 również dodano jako kontrolę izotypową, gdyż wiadomo że nie wiąże się ono z komórkami nowotworu okrężnicy HT-29. Ponadto w celach porównawczych również zastosowano w teście przeciwciało anty-egfr (C225). Po 5 dniach testu, szalki następnie opróżniono przez odwrócenie do góry dnem i wysuszono bibułą. DPBS o temperaturze pokojowej, zawierający MgCl 2 i CaCl 2, dozowano do każdej studzienki z wielokanałowej butli wyciskanej, postukano trzy razy, opróżniono przez odwrócenie do góry dnem, a następnie wysuszono bibułą. 50 mikrolitrów barwnika fluorescencyjnego do testu żywy/martwy rozcieńczono w DPBS, zawierającym MgCl 2 i CaCl 2, dodano do każdej studzienki i inkubowano w temperaturze 37 C w cieplarce w atmosferze 5% CO 2 przez 30 minut. Szalki odczytywano w czytniku do szalek Perkin-Elmer HTS7000 i dane analizowano komputerowo używając Microsoft Excel. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Hybridoma 10A304.7 wytworzyła specyficzną cytotoksyczność wynoszącą 11% w przypadku komórek SW1116, podobną do otrzymanej dla przeciwciał C225 anty-egfr. Silne wiązanie 10A304.7 z komórkami SW1116 wskazało, że ten poziom wiązania przeciwciał był wystarczający do pośredniczenia w cytotoksyczności skierowanej przeciwko komórkom nowotworowym. Pomimo, że występowało silne wiązanie przeciwciał 10A304.7 z komórkami nowotworowymi HT-29 i SW620, jak oznaczono testem komórkowym ELISA, nie obserwowano występowania cytotoksyczności. Wynik ten sugeruje, że samo wiązanie z przeciwciałem nie było wystarczające do uzyskania cytotoksyczności przez 10A304.7 skierowane przeciwko komórkom HT-29 i SW620. Jak zestawiono w tabeli 1, przeciwciało 3BD-27, o tym samym izotypie co przeciwciało 10A304.7, ponadto jak wiadomo ze stanu techniki, nie wiążące się z komórkami nowotworu okrężnicy HT-29, nie powodowało cytotoksyczności w tej linii komórek nowotworowych. Jak należało się spodziewać uzyskano cytotoksyczność dla znanych, niespecyficznych środków cytotoksycznych, takich jak azydek sodu i cykloheksimid. W porównaniu, dobrze zdefiniowane przeciwnowotworowe przeciwciało C225 wytwarzało 13% cytotoksyczność w komórkach nowotworowych SW1116. Wyniki przedstawione w tabeli 1 wskazują, że wiązanie 10A304.7 z komórkami nowotworowymi może być ważnym etapem w uzyskiwaniu cytotoksyczności, lecz uzyskana tak cytotoksyczność nie jest dostateczna aby stanowić o istocie tego zjawiska. 14

15 PRZYKŁAD 2 Wytwarzanie przeciwciał Monoklonalne przeciwciało 10A304.7 wytworzono w wyniku hodowli hybrydom w kolbach CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON, USA), zbierając komórki i ponownie je wysiewając w trybie dwa razy na tydzień i stosując standardowy proces oczyszczenia przeciwciał z wykorzystaniem zestawu Protein G Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Biosciences, Baie d'urfé, QC). Zakres niniejszego wynalazku obejmuje wykorzystanie przeciwciał monoklonalnych, które są humanizowane, chimeryzowane lub są przeciwciałami mysimi. Przeciwciała 10A304.7 porównano w testach cytotoksyczności do szeregu zarówno pozytywnych (anty-fas (EOS9.1, IgM, kappa, 20 mg/ml, ebioscience, San Diego, Calif., USA), anty-her2/neu (IgGi, kappa, 10 mg/ml, Inter Medico, Markham, ON, USA), anty-egfr (C225, IgG1, kappa, 5 mg/ml, Cedarlane, Homby, ON, USA), Cykloheksimid (100 mm, Sigma, Oakville, ON, USA) i NaN 3 (0,1%, Sigma, Oakville, ON, USA)), jak i negatywnych kontroli (107,3 (anty-tnp, IgG1, kappa, 20 mg/ml, BD Biosciences, Oakville, ON, USA), MPC-11 (nieznana specyficzność antygenowa, IgG2b, kappa, 20 mg/ml), bufor IgG (2%)) (Tabela 2). Badano następujące linie komórkowe: komórki raka sutka (MB-231, MCF-7), raka okrężnicy (Caco-2, DLD-1, Lovo, HT-29, SW1116, SW620), raka jajnika (OVCAR), raka trzustki (BxPC-3), raka prostaty (PC-3), i komórki nierakowe (CCD 27sk, Hs888 Lu) (wszystkie z ATCC, Manassas, Va., USA). Test cytotoksyczności żywy/martwy otrzymano z Molecular Probes (Eugene, Oreg., USA). Testy wykonywano zgodnie z instrukcją producenta ze zmianami przedstawionymi poniżej. 15

16 Kontrole negatywne Kontrole pozytywne Tabela 2 10A304.7 (20 µg/ml) Anty-Fas (20 µg/ml) Anty-Her2/neu (10 µg/ml) Anty-EGFR (c225, 5µg/ml) Cykloheksimid (100 µm) IgG1 (107,3, 20 µg/ml) IgG2b (MPC- 11, 20 µg/ml) Bufor IgG (2%) Okrężnica Trzustka Sutek Prostata Jajnik Caco-2 DLD-1 Lovo HT-29 SW1116 SW820 BxPC-3 MB-231 MCF-7 PC-3 OVCAR Komórki wysiano przed wykonaniem testu zgodnie ze wcześniej określonymi odpowiednimi gęstościami. Po dwóch dniach, 100 mikrolitrów oczyszczonego przeciwciała rozcieńczono w pożywce, a następnie przenoszono do szalek do hodowli komórek i inkubowano w cieplarce w atmosferze 5% CO 2 przez 5 dni. Szalki następnie opróżniono przez odwrócenie do góry dnem i wysuszono bibułą. DPBS o temperaturze pokojowej, zawierający MgCl 2 i CaCl 2 dozowano do każdej studzienki z wielokanałowej butli wyciskanej, postukano trzy razy, studzienki opróżniono przez odwrócenie do góry dnem, a następnie wysuszono bibułą. Do każdej studzienki dodano 50 mikrolitrów barwnika fluorescencyjnego do testu żywy/martwy rozcieńczonego w DPBS zawierającym MgCl 2 i CaCl 2 i inkubowano w temperaturze 37 C w cieplarce w atmosferze 5% CO 2 przez 30 minut. Szalki odczytywano w czytniku do szalek Perkin-Elmer HTS7000 i dane analizowano komputerowo używając Microsoft Excel. Wyniki przedstawiono w tabeli 2. Dane przedstawiają średnią z czterech osobnych doświadczeń prowadzonych w trzech powtórzeniach i wyniki przedstawiono jakościowo w następujących sposób: 4/4 doświadczeń przy 15% cytotoksyczności powyżej wartości tła (++++), 2/4 doświadczeń przy 15% cytotoksyczności powyżej wartości tła (+++), przynajmniej 2/4 doświadczeń przy 16

17 10-15% cytotoksyczności powyżej wartości tła (++), i przynajmniej 2/4 doświadczeń przy 8-10% cytotoksyczności powyżej wartości tła. Okienka bez oznaczeń w tabeli 2 oznaczają wartości sprzeczne lub działanie cytotoksyczne mniejsze niż wartość progowa. Przeciwciało 10A304.7 wytwarzało 35% działania cytotoksycznego w porównaniu do dobrze opisanego przeciwciała C225 anty-egfr, które indukowało 31% cytotoksyczności względem linii komórek nowotworu okrężnicy SW1116. Wpływ obu przeciwciał na tę linię komórkową był spójny z wynikami przestawionymi w tabeli 1. Ponadto, 10A304.7 indukowało znacząco wyższą cytotoksyczność skierowaną przeciwko innym komórkom nowotworowym, w porównaniu do C225, włącznie z liniami komórek raka sutka MDA MB 231 (111%) i MCF-7 (850%), liniami komórek raka prostaty PC-3 (375%) i liniami komórek raka jajnika OVCAR (667%). Co ważne, 10A304.7 nie wytwarzało cytotoksyczności skierowanej przeciwko wielu komórkom nienowotworowym, takim jak CCD 27sk lub Hs888 Lu, co wskazuje, że przeciwciało wykazuje specyficzność względem różnych komórek nowotworowych. Środki chemiczne wykazujące cytotoksyczność indukowały cytotoksyczność zgodnie z założeniem, podobnie jak w przypadku innych przeciwciał, które włączono do testu w celach porównawczych, uzyskano wyniki również zgodnie z przewidywaniami, biorąc pod uwagę ograniczenia przy testach na komórkach żywych. Komórki przygotowywano do FACS wstępnie przemywając DPBS (bez Ca ++ i Mg ++ ) pojedynczą warstwę komórek. Następnie, aby oddzielić komórki od szalek hodowlanych, zastosowano bufor do dysocjacji komórek (INVITROGEN) w temperaturze 37 C. Po zwirowaniu i zebraniu komórki ponownie zawieszono w buforowanej fosforanem solance Dulbecco zawierającej MgCl 2, CaCl 2 i 25% płodową surowicę bydlęcą w temperaturze 4 C (pożywka do przemywania) i komórki zliczano, po czym rozdzielono na równe części utrzymując odpowiednią gęstość komórek, zwirowano do osadzenie komórek i ponownie zawieszono w pożywce barwiącej (DPBS zawierający MgCl 2, CaCl 2 i 2% płodową surowicę bydlęcą) w temperaturze 4 C, w obecności badanych przeciwciał (10A304.7) lub przeciwciał kontrolnych (kontrola izotypowa, anty- EGF-R, lub anty-fas) w ilości 20 mikrogramów /ml na lodzie przez 30 minut. Przed dodaniem sprzężonego drugorzędowego przeciwciała Alexa Fluor 488 komórki przemyto jeden raz pożywką do przemywania. Następnie dodano 17

18 sprzężone drugorzędowe przeciwciało Alexa Fluor 488 w pożywce barwiącej przez 20 minut. Komórki następnie przemywano ostatni raz i ponownie zawieszano w buforze barwiącym zawierającym 1 mikrogram/ml jodku propidyny. Przepływowe cytometryczne zbieranie komórek oznaczano stosując przebieg próbek na FACScan i oprogramowanie CellQuest (BD Biosciences). Rozproszenie przednie (FSC) i rozproszenie boczne (SSC) komórek wyznaczono dostosowując napięcie i amplitudę wzmocnienia na detektorach FSC i SSC. Detektory dla trzech kanałów fluorescencji (FL1, FL2, i FL3) dostosowano stosując przebieg komórek znakowanych oczyszczonym kontrolnym izotypem przeciwciała, po których wprowadzono drugorzędowe przeciwciała sprzężone z Alexa Fluor 488, tak że komórki miały jednolity pik ze średnią intensywnością fluorescencyjną równą około 1-5 jednostek. Żywe komórki zbierano bramkując FSC z wykluczeniem jodkiem propidyny. Dla każdej próbki, do analizy zbierano w przybliżeniu żywych komórek i wynik przedstawiono w tabeli 3. 18

19 Tabela 3 Okrężnica Trzustka Sutek Prostata Jajnik Komórki zdrowe Przeciwciało Caco-2 DLD-1 Lovo HT-29 SW1116 SW620 BxPC-3 MB-231 MCF-7 PC-3 OVCAR COD27sk Hs888Lu 10A (dwumodalny) (dwumodalny) Anty-Fas Anty-EGFR (dwumodalny) (dwumodalny)

20 Tabela 3 podsumowuje krotność wzrostu średnich intensywności fluorescencji powyżej kontroli izotypowej, co przedstawiono jakościowo w tabeli jako: poniżej 3 do 5 (+); 5 do 25 (++); 25 do 50 (+++) i powyżej 50 (++++). Reprezentatywne histogramy przeciwciał 10A304.7 zestawiono na fig. 1 i wykazano eksperymentalną charakterystykę wiązania, włącznie z przedstawionymi dwumodalnymi pikami w pewnych przypadkach. Przeciwciało 10A304.7 wiązało się niespecyficznie ze wszystkimi liniami komórkowymi, włącznie z wiązaniem w bardzo dużym stopniu z komórkami nierakowymi CCD-27sk i Hs888.Lu, lecz stopień związania pomiędzy różnymi liniami komórkowymi był różny. Zatem przeciwciało 10A304.7 selektywnie wiązało się z liniami komórkowymi na różnych poziomach. Wyniki z tabel 2 i 3 wskazują, że wiązanie 10A304.7 z komórkami nowotworowymi jest konieczne do uzyskania cytotoksyczności w której pośredniczy przeciwciało, lecz nie jest to wystarczające do wywołania tego zjawiska. Zastrzeżenia patentowe 1. Wyodrębnione monoklonalne przeciwciało kodowane przez klon złożony w ATCC za numerem dostępu PTA Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem humanizowanym. 3. Przeciwciało według zastrz. 1, znamienne tym, że jest przeciwciałem chimeryzowanym. 4. Wyodrębniony klon złożony w ATCC za numerem dostępu PTA Oznaczenia wiązania wykrywające obecność komórek nowotworowych w próbce tkanki z ludzkich guzów, obejmujące dostarczenie wyodrębnionego przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu wiążącego antygen kodowanego przez klon złożony w ATCC za numerem dostępu PTA-5065; kontaktowanie z próbką tkanki wyodrębnionego przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu wiążącego antygen i wyznaczanie wiązania z próbką tkanki wyodrębnionego przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu wiążącego antygen prowadzące do identyfikacji obecności komórek nowotworowych w próbce tkanki. 6. Oznaczenia wiązania według zastrz. 5, znamienne tym, że próbka pochodzi z ludzkiego guza okrężnicy, jajnika, płuc lub sutka. 20

21 7. Sposób wyodrębnienia komórek rakowych lub przeszukiwania materiału pod kątem obecności komórek rakowych w próbce tkanki pochodzącej z ludzkich guzów, w którym: dostarcza się wyodrębnione przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen kodowane przez klon złożony w ATCC za numerem dostępu PTA- 5065; kontaktuje się z próbką tkanki wyodrębnione przeciwciało monoklonalne lub jego fragment wiążący antygen, i wyznacza się wiązanie z próbką tkanki wyodrębnionego przeciwciała monoklonalnego lub jego fragmentu wiążącego antygen, identyfikując obecność lub brak komórek nowotworowych w próbce tkanki. 8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że próbkę pobiera się z tkanki ludzkiego guza okrężnicy, jajnika, płuc lub sutka. 9. Wiążące antygen fragmenty wyodrębnionego przeciwciała monoklonalnego jak określono w zastrz Wiążące antygen fragmenty humanizowanego przeciwciała jak określono w zastrz Wiążące antygen fragmenty chimeryzowanego przeciwciała jak określono w zastrz Wyodrębnione przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jak określono w zastrz. 1, 2, 3, 9, 10 lub 11, sprzężone z elementem wybranym z grupy obejmującej grupy cytotoksyczne, enzymy, związki radioaktywne i komórki krwiopochodne. 21

22 Kontrola izotypowa Figura 1 22