Struktura i właściwości biofizyczne polipeptydów z wydłuŝonym ciągiem glutaminowym. Marta Narczyk

Transkrypt

1 Struktura i właściwości biofizyczne polipeptydów z wydłuŝonym ciągiem glutaminowym Marta Narczyk

2 Choroby konformacyjne ang: protein folding diseases Zmiany struktury przestrzennej białka powodują utratę jego funkcji Degradacja białka mukowiscydoza, fenyloketonuria Agregacja białka mutacje punktowe choroba Alzheimera wydłuŝenia ciągu CAG Priony pląsawica Huntingtona choroba Creutzfeldta-Jakoba -2-

3 Choroby agregacyjne Zmiany struktury przestrzennej białka powodują, Ŝe zyskuje ono nową funkcję tendencję do tworzenia agregatów Agregacja zewnątrzkomórkowa amyloidozy Agregacja wewnątrzkomórkowa w cytoplazmie w ER stwardnienie zanikowe boczne(sla), choroba Parkinsona immunoglobulinopatie w jądrze choroby poliglutaminowe -3-

4 Choroby poliglutaminowe Grupa schorzeń związanych z obecnością mutacji dynamicznych, polegających na zwielokrotnieniu liczby powtórzeń kodonu CAG kodującego glutaminę (Gln, Q) choroba białko opuszkowo-rdzeniowy zanik mięśni (SBMA) zanik jąder zębatych, gałek bladych i ciał podwzgórzowych (DRPLA) receptor androgenu białko DRPLA ataksje rdzeniowo-móŝdŝkowe (SCA1,2,3) ataksyny 1, 2, 3 choroba Huntingtona Huntingtina poliq to jedyna cecha wspólna tych białek przebieg choroby i moment zapadnięcia na nią zaleŝy od długości poliq zatem struktura, zwijanie się, mechanizmy agregacji poliq mogą być kluczowe dla zrozumienia patofizjologii choroby i ewentualnych terapii -4-

5 Choroby poliglutaminowe mikrografia z transmisyjnego mikroskopu elektronowego włókniste agregaty w jądrze neuronu przedniej kory zakrętu obręczy młodej dziewczyny z młodzieńczą postacią HD pacjentka odziedziczyła po ojcu gen Htt zawierający 100 powtórzeń kodonu CAG Max Perutz TIBS 24 (1999)

6 Choroby poliglutaminowe mikrografia agregatów peptydów uzyskanych po enzymatycznym rozcięciu białka fuzyjnego GST-Htt(exon 1) Max Perutz et al. TIBS 24 (1999) nm -6-

7 Długość poliq a ryzyko zachorowania na HD Brinkman et al. Am. J. Hum. Genet. 60 (1997)

8 Mechanizm powstawania powtórzeń CAG w DNA zmiana liczby powtórzeń CAG moŝe zachodzić na skutek przesunięcia ramki odczytu rekombinacji model zaproponowany przez R. Holliday Max Perutz Curr. Opin. Struct. Biol. 6 (1996)

9 Struktura poliq Max Perutz polar zipper 1993r Max Perutz et al. PNAS 91 (1994)

10 Pomiary dichroizmu kołowego (1) badania syntetycznych peptydów Asp 2 - Gln 15 -Lys 2 (poli-l-glutamina nie rozpuszcza się w wodzie) ph 3,0 widma dichroizmu kołowego w nadfiolecie pokazują, Ŝe peptydy mają strukturę β- kartki molar residue elipticity w 197nm niezaleŝny od stęŝenia białka, co oznacza, Ŝe monomery mają strukturę szpilki do włosów (β-hairpin), a agregaty ciasno ułoŝonych β-kartek (tightly linkedβsheets) Max Perutz et al. PNAS 91 (1994)

11 Pomiary dichroizmu kołowego (2) białka fuzyjne: GST-Htt(exon1), ph 6,5 wykres A widma CD GST ( ) GST-Q22 (--) GST-Q41 ( ) wstawka widma róŝnicowe Q22 ( ) Q41 (--) widma typowe dla białek nieustrukturowanych (random coil) Q22 Q41 Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002)

12 NMR (1) widma 1 H NMR ogólny wygląd widm podobny wysokie ostre piki dla widm GST-Q22 i GST-Q41 pochodzą od poliq dla Q41 około 2-krotnie wyŝsze niŝ dla Q22 to sugeruje, Ŝe wszystkie Q znajdują się w podobnym otoczeniu chemicznym Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002)

13 NMR (2) widma 2D NMR 1 H 15 N piki pochodzące od Q wyraźnie dominują uzyskane wartości przesunięć chemicznych są typowe dla peptydów nieustrukturowanych GST GST-Q22 Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002)

14 PoliQ w białkach oligomeryzacja (1) inhibitor chymotrypsyny (chymotrypsin inhibitor 2 CI2) wstawka poliq: G-Q 10 -G dwa mutanty: poliq zamiast nieustrukturowanej pętli poliq wstawiony w nieustrukturowaną pętlę ekspresja w E.Coli mieszanina monomeru, dimeru i trimeru Max Perutz TIBS 24 (1999)

15 PoliQ w białkach oligomeryzacja (2) dysocjacja dimeru i trimeru niemoŝliwa bez całkowitej denaturacji białek oligomery mutantów CI2-Q 10 powstają na skutek wymiany domen (domain swapping), a nie na skutek tworzenia sieci wiązań wodorowych pomiędzy glutaminami model polar zipper Max Perutz TIBS 24 (1999)

16 Krystalizacja CI2-Q 4 i inhibitor chymotrypsyny (CI2) wstawka: G-Q 4 -G-M ekspresja w E.Coli mieszanina monomeru, dimeru i trimeru krystalizacja dimeru temp: 4 ºC bufor: 30% w/v PEG400, 1M Li 2 SO 4, 1mM CaCl 2, 0,1M TrisHCl ph 7,5 kryształy rosły przez 4 tygodnie rozdzielczość 1,8Å grupa przestrzenna P622 Chen et al. PNAS 96 (1999)

17 Krystalizacja CI2-Q 4 i -17-

18 Krystalizacja CI2-Q 4 i ciąg poliq pozostaje nieustrukturowany nawet w krysztale wstawka znajduje się między Met59 i Glu60 Chen et al. PNAS 96 (1999)

19 Struktura agregatów mikroskopia elektronowa mikrografia agregatów peptydów poliq Asp 2 -Gln 15 -Lys 2 agregaty mają kształt robakowaty, grubość Å bardzo róŝne długości Max Perutz et al. PNAS 91 (1994)

20 Struktura agregatów dyfrakcja rentgenowska wiązka promieni X równoległa do płytki z agregatami zdjęcie przedstawia β-krzyŝ refleksy w płaszczyźnie południkowej: 8,4, 4,8, 4,2Å refleksy w płaszczyźnie równikowej: 3,6, 3,2Å obraz taki jest charakterystyczny dla struktury włóknistej równikowy refleks w 3,2 Å odpowiada odległości pomiędzy poszczególnymi residuami β-kartki Max Perutz et al. PNAS 91 (1994)

21 Stabilność i agregacja Białka fuzyjne GST-Q22, GST-Q41, kontrola GST Badania NMR białek w roztworze wykazały, Ŝe oba fragm. poliq mają postać kłębka statystycznego (random coil) Przez 3 miesiące inkubowano białka w 25ºC, monitorawanie: co 7 dni NMR nie zauwaŝono Ŝadnych zmian Badania CD w zakresie temperatur 10 50ºC wykazały wyjątkową stabilność białek co prawdopodobnie wynika z własności GST Dopiero powyŝej temp. 50ºC białka zaczęły się nieodwracalnie wytrącać GST-Q41 zaczynało się wytrącać ok. 0,5h wcześniej niŝ GST-Q22 Inkubacja białek przez 1h w temp 52ºC oraz przez 0,5h w temp. 70ºC GST-Q41 agregaty więcej i większe (ponad 1mm) niŝ w próbce GST-Q22 Masimo et al. FEBS Letters 513 (2002)

22 Podsumowanie krótkie ciągi poliq (<41Q) jako osobne peptydy są nierozpuszczalne w wodzie flankuje się je aminokwasami (Gly, Lys, Asp) bada w niskich ph w takich warunkach powstają struktury β-kartki, szpilki do włosów podobne ciągi poliq wstawiane do białek, lub doczepiane na ich końcu wykazują strukturę kłębka statystycznego (random coil) u Drosophili białka zawierające ciągi ponad 20 Q pełnią funkcje czynników transkrypcyjnych brak dowodów potwierdzających hipotezę struktury polar zipper -22-

23 Bibliografia Daniel Bąk, Michał Milewski Choroby związane z agregacją białek Postępy Biochemii 51 (2005) Max Perutz et. al. Glutamine repeats as polar zipper: Their possible role in inherited neurodegenerative diseases PNAS 91, , 1994 Max Perutz Glutamine repeats and inherited neurodegenerative diseases: molecular aspects Curr. Opin. Struct. Biol. 6 (1996) Max Perutz Glutamine repeats and neurodegenerative diseases: molecular aspects TIBS 24 (1999) Masimo et al. Solution structure of polyglutamine tracts in GSTpolyglutamine fusion proteins FEBS Letters 513 (2002) Brinkman et al. The Likelihood of Being Affected with Huntington Disease by a Particular Age, for a Specific CAG Size Am. J. Hum. Genet. 60 (1997) Chen et al. Crystal structure of a dimeric chymotrypsin inhibitor 2 mutant containing an inserted glutamine repeat PNAS 96 (1999)