Ekspresja antygenu Fas i FasL na limfocytach T i B w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha

Transkrypt

1 Ekspresja antygenu Fas i FasL na limfocytach T i B w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha Expression Fas and FasL antigen protein of lymphocytes T and B in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion Beata Żelazowska-Rutkowska 1, Jolanta Wysocka 1, Karol Ratomski 1, Bożena Skotnicka 2, Janusz Żak 1, Małgorzata Mrugacz 3 1Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. J. Wysocka 2Klinika Otolaryngologii ęcej AM w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. E. Hassmann-Poznańska 3Klinika Okulistyki ęcej AM w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. A. Bakunowicz-Łazarczyk Summary Introduction. Apoptosis of lymphocytes can be induced by different factors mainly however the activation of antigen Fas (CD95) and his ligand FasL (CD95L) route. Apoptosis induced by Fas-FasL has large significance in elimination of lymphocytes T in final phase immune response designate AICD (activation induced cell death). Lymphocytes B undergo apoptosis induced by Fas-FasL in germinal center, which has special meaning in elimination of cells about low specificity and weak affinity of receptor BCR ( B-cell antigen receptor). Aim of study. The aim of this study was evaluation of percentage of apoptotic lymphocytes and expression of Fas and FasL in CD4 +, CD8 +, CD19 + lymphocytes in hypertrophied adenoid and hypertrophied adenoid and otitis media with effusion. Methods. CD4 + Fas +, CD8 + Fas +, CD19 + Fas + CD4 + FasL +, CD8 + FasL +, CD19 + FasL + cells subpopulation were identified using monoclonal antibodies and flow cytometry method. Results. The percentage of lymphocytes CD4 + Fas +, CD8 + Fas +, CD19 + Fas + was higher in hypertrophied adenoid and otitis media with effusion compored to the control group. Their was no significant difference the percentage CD4 + Fas +, CD8 + Fas +, CD19 + Fas + CD4 + FasL +, CD8 + FasL +, CD19 + FasL + in hypertrophied adenoid and otitis media with effusion then the control group. The percentage of apoptotic lymphocytes was higher in hypertrophied adenoid and otitis media with effusion compored to the control group. Conclusions. The susceptibility the individual subpopulation of lymphocytes in hypertrophied adenoid seems to influence on change of relations of quantitative lymphocytes and upset the immunological function of tonsils which can influence on course otitis media with effusion at children. Hasła indeksowe: apoptoza, wysiękowe zapalenie ucha, cytometria przepływowa Key words: apoptosis, otitis media with effusion, flow cytometry Otolaryngol Pol 2008; LXII (1): by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi WSTĘP Podczas odpowiedzi immunologicznej antygenowo-specyficzne limfocyty T i B ulegają intensywnej proliferacji rozwijając swoje funkcje efektorowi, jak wydzielanie przeciwciał, cytotoksyczność lub wytwarzanie cytokin. Aby ochronić własne tkanki przed uszkodzeniem przez te mechanizmy, po zakończeniu odpowiedzi immunologicznej efektorowe aktywowane limfocyty są Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów. Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1 59

2 B. Żelazowska-Rutkowska i inni usuwane między innymi w procesie apoptozy [21, 27]. Apoptoza limfocytów może być indukowana przez wiele czynników, jednak główną rolę w tej indukcji pełni aktywacja receptora śmierci Fas (CD95) przez jego ligand (CD95L). Proces apoptozy zależny od CD95 zachodzi przy udziale dwóch różnych mechanizmów. W typie I droga aktywacji omija mitochondria, a w typie II kontrolowanym przez antyapoptotyczne białka należące do rodziny Bcl-2 dochodzi do aktywacji mitochondriów [1, 19]. Fas jest transmembranową glikoproteiną typu I (50kDa) występującą konstytutywnie na powierzchni limfocytów, należącą do rodziny receptorów TNF (tumor necrosis factor)/ngt (nerve growth factor). FasL typ II transmembranowego białka (40kDa) nie występuje na limfocytach spoczynkowych, ulega on ekspresji podczas aktywacji limfocytów T i B i komórek NK [6, 10]. Aktywowanie receptora Fas przez komplementarną cząsteczkę Fas ligand rozpoczyna wewnątrzkomórkowy szlak przemian. Po związaniu z ligandem dochodzi do oligomeryzacji cząsteczek receptora, a następnie sygnał przekazywany jest przez ich wewnątrzcytoplazmatyczną część zwaną domeną śmierci DD (death domain). Powoduje to aktywację wielu białek adapterowych i powstania wielkocząsteczkowego kompleksu określanego mianem DISC (death-inducing signaling complex). Służy on jako platforma inicjacji enzymatycznego mechanizmu apoptozy. Następnie dochodzi do wzajemnej proteolitycznej aktywacji cząsteczkowej kaspazy 8, która uruchamia kolejne cząsteczki innych kaspaz inicjując całą kaskadę kaspaz aż do aktywacji efektorowej kaspazy 3 [4, 11]. Apoptoza indukowana przez wiązanie Fas-FasL ma największe znaczenie w eliminacji limfocytów T w końcowej fazie odpowiedzi immunologicznej nazywanej śmiercią komórki indukowaną aktywacją (AICD activation induced cell death [1, 10, 12]. Limfocyty B ulegają apoptozie indukowanej przez wiązanie Fas-FasL w ośrodkach rozmnażania, co ma szczególne znaczenie w eliminacji komórek o niskiej swoistości i słabym powinowactwie receptora BCR [3, 8, 18, 25]. Celem pracy była ocena nasilenia apoptozy limfocytów w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha trwające ponad trzy miesiące przez ocenę odsetka limfocytów apoptotycznych i limfocytów T (CD4 + i CD8 + ) i B(CD19 + ) z ekspresją antygenu Fas i FasL. MATERIAŁ I METODY Grupę badaną stanowiło 42 dzieci w wieku od 1 do 17 r.ż. z przerostem migdałka gardłowego chorych na wysiękowe zapalenie ucha trwające ponad 3 miesiące. Z powodu braku postępów w leczeniu dzieci te zakwalifikowano do zabiegu adenoidektomii. Grupę porównawczą stanowiło 40 dzieci obojga płci w wieku od 1 do 17 r.ż. z przerostem migdałka gardłowego, u których nie stwierdzono stanu zapalnego uszu. Kwalifikację chorych oraz adenoidektomię przeprowadzono w Klinice Otolaryngologii ęcej Akademii Medycznej w Białymstoku. Migdałki gardłowe natychmiast po adenoidektomii poddano mechanicznemu rozdrobnieniu w celu uzyskania zawiesiny komórek, której gęstość oceniano w analizatorze hematologicznym Sysmex XT 2000i. Do analizy użyto zawiesiny komórek o gęstości 4-10 x10 3 / µl. Wyizolowane komórki jednojądrzaste w formie zawiesiny w PBS poddano znakowaniu przeciwciałami monoklonalnymi. Przeprowadzono znakowanie antygenów na powierzchni komórki, dodając do 100 µl zawiesiny 10 µl przeciwciał monoklonalnych (anty-cd4-fitc, anty-cd8-fitc, anty-cd19-fitc, anty-cd95-pe, anty-cd95l-pe). Następnie przeprowadzono 15 min. inkubację w temp. pokojowej. Po inkubacji dodawano odczynniki lizujące erytrocyty i ponownie przeprowadzono inkubacje. Komórki płukano PBS zawierającym 0,1% azydku sodu i 1 % albuminy wołowej wirując przez 5 min. przy 2000 obr./min., a następnie poddawano analizie cytometrycznej. Po dokładnym wymieszaniu, próbki oceniano na cytometrze przepływowym EPICS XL Coulter, wyposażonym w laser argonowy emitujący promieniowanie o długości fali 488 nm. Oceniano również odsetek komórek apoptotycznych zestawem Apoptest. Badane komórki płukano w PBS i zawieszano w buforze w stężeniu komórek/ml. Następnie do 96 µl zawiesiny komórek dodawano 1 µl Anneksyny- V sprzężonej z fluoresceiną oraz 2,5 µl jodku propidyny (PI) i inkubowano przez 10 min w ciemności. Po inkubacji do próby dodawano 250 µl buforu i bezpośrednio mierzono fluorescencję komórek wykorzystując metodę cytometrii przepływowej. We wczesnej fazie apoptozy na powierzchni komórki dochodzi do utraty asymetrii fosfolipidów błony komórkowej spowodowanej translokacją fosfatydyloseryny z wewnętrznej na zewnętrzną stronę błony komórkowej. Zjawisko to jest charakterystyczne 60 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1

3 Ekspresja antygenu Fas i FasL dla procesu apoptozy, ale zachodzi również podczas nekrozy komórki. Różnicując dwie formy śmierci komórki można wykorzystać właściwości Anneksyny V, białka, które w obecności jonów Ca 2+ i Mg 2+ wiąże się z fofadyloseryną i jednocześnie stosując jodek propidyny, który wnika do wnętrza komórki, weryfikując integralność błony komórkowej [5, 15]. Jednoczesne dodanie Anneksyny V oraz jodku propidyny pozwala różnicować populację komórek żywych (nie barwiącym się żadnym flurochromem) od komórek w początkowym stadium apoptozy (barwiących się jedynie Anneksyny V) oraz komórek chłonących jodek propidyny i wiążących się z Anneksyny V, czyli komórek martwiczych [2, 15]. Wyniki przeprowadzonych badań podano jako procent pozytywnych komórek w poszczególnej próbie badanej. Różnice dla p<0,05 uznano za znamienne statystycznie. WYNIKI Odsetek limfocytów apoptotycznych w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 3,60 ± 1,13% i był istotnie statystycznie wyższy, p < 0,001 niż w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego (PMG), który wynosił średnio 2,55 ± 0,72%. W podgrupie dzieci młodszych grupy badanej (WZU1) odsetek limfocytów apoptotycznych stanowił 3,35 ± 1,20% i był znamiennie statystycznie wyższy niż w analogicznej podgrupie dzieci grupy porównawczej (PMG1 2,48 ± 0,71%), p<0,04. Wykazano różnice znamiennie statystyczną, p < 0,004 między grupą WZU2 (3,85 ± 0,73%) a podgrupą PMG 2 (2,63 ± 0,74%). Odsetek limfocytów CD4 + CD95 + u grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 68,01 ± 8,13% i był nieznacznie wyższy w porównaniu z grupą dzieci z przerostem migdałka gardłowego (PMG), gdzie wynosił 65,00 ± 4,31%. W grupie badanej dzieci młodszych WZU 1 stwierdzono statystycznie znamiennie wyższy, p < 0,05 odsetek limfocytów CD4 + CD95 +, którego wartość wynosiła 69,22 ± 6,71% w porównaniu z podgrupą dzieci młodszych grupy porównawczej (PMG 1-64,71 ± 5,05%). Nieznacznie wyższe wartości odsetka limfocytów CD4 + CD95 + obserwowano w podgrupie dzieci starszych grupy badanej (WZU 2-66,20 ± 10,15%), w porównaniu z podgrupą dzieci starszych grupy porównawczej (PMG 2-65,47 ± 6,28%). Odsetek limfocytów CD8 + CD95 + w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 33,24 ± 9,50%. Był on znamiennie statystycznie wyższy, p < 0,05 względem grupy porównawczej (PMG- 28,01 ± 8,61%). W podgrupach dzieci młodszych i dzieci starszych grupy badanej odsetek limfocytów CD8 + CD95 + był nieznacznie wyższy (WZU 1-32,77 ± 9,14%, WZU 2-33,93 ± 10,67%) niż w analogicznych podgrupach grypy odniesienia (PMG 1-29,27 ± 7,74%, PMG 2-26,34 ± 9,87%), chociaż różnice te nie były znamienne statystyczne. Analiza statystyczna wykazała statystycznie znamiennie wyższy odsetek limfocytów CD19 + CD95 +, p<0,02 w grupie badanej (WZU-24,98 ± 5,35%) w porównaniu z grupą odniesienia (PMG-21,10 ± 4,25%). W podgrupie dzieci młodszych grupy badanej (WZU1) wartość ta wynosiła 23,73 ± 5,46% i była wyższa niż w podgrupie dzieci młodszych grupy porównawczej PMG 1-21,19 ± 3,98%. W podgrupie dzieci starszych grupy badanej WZU 2 odsetek limfocytów CD19 + CD95 + wynosił średnio 27,88 ± 4,83% i był wyższy niż w podgrupie dzieci starszych grupy porównawczej PMG 2-22,44 ± 6,03%. Wykazano różnicę istotną statystycznie, p < 0,05 pomiędzy grupą WZU 2 a grupą PMG 2. Odsetek limfocytów CD4 + CD95L + w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) wynosił średnio 2,85 ± 0,72% i był nieznacznie wyższy niż w grupie dzieci z przerostem migdałka gardłowego (PMG), który wynosił średnio 2,70 ± 0,67%.W podgrupie dzieci młodszych i dzieci starszych grupy badanej odsetek limfocytów CD4 + CD95L + wynosił średnio (WZU 1-3,03 ± 0,71%, WZU 2-2,60 ± 0,71%) i był wyższy niż w analogicznych podgrupach wiekowych dzieci grupy odniesienia (PMG 1-2,99 ± 0,62%, PMG 2-2,32 ± 0,55%). Wykazano różnice znamiennie statystyczną, p < 0,02 między grupą PMG1 a PMG 2. Odsetek limfocytów CD8 + CD95L + w grupie badanej wynosił średnio (WZU 2,89 ± 0,92%) i był zbliżony do grupy porównawczej (PMG-2,90 ± 0,32%). W podgrupie dzieci młodszych grupy badanej WZU 1 odsetek limfocytów CD8 + CD95L + wynosił 3,00 ± 0,98% i był nieco wyższy niż w grupie porównawczej dzieci młodszych PMG 1-2,70 ± 0,95%. W podgrupie dzieci starszych grupy badanej WZU 2 odsetek limfocytów CD8 + CD95L + wynosił 2,72 ± 0,85% i był nieco niższy niż w podgrupie dzieci starszych grupy porównawczej PMG 2 (3,19 ± 0,55%). Wartość odsetka subpopulacji limfocytów CD19 + CD95L + w grupie dzieci z przerostem mig- Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1 61

4 B. Żelazowska-Rutkowska i inni Tabela I. Odsetek limfocytów CD4 + CD95 +, CD8 + CD95 +, CD19 + CD95 +, CD4 + CD95L +, CD8 + CD95L +, CD19 + CD95L + oraz limfocytów apoptotycznych w badanych migdałkach gardłowych dzieci z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) oraz z przerostem migdałka gardłowego (PMG). Subpopulacja limfocytów X±SD Grupa badana (WZU) młodsze (WZU1) starsze (WZU2) Grupa porównawcza PMG młodsze (PMG1) starsze (PMG2) CD4 + CD95 + CD8 + CD95 + CD19 + CD95 + CD4 + CD95L + CD8 + CD95L + CD19 + CD95 + AnnV 68,01±8,13 33,24±9,50 (2) 24,98±5,35 (3) 2,85±0,72 2,89±0,92 5,53±0,91 3,60±1,13 (6) 69,22±6,71 (1) 32,77±9,14 23,73±5,46 3,03±0,71 3,00±0,98 5,46±1,05 3,35±1,20 (7) 66,20±10,15 33,93±10,67 27,88±4,83 (4) 2,60±0,71 2,72±0,85 5,62±0,75 3,58±0,73 (8) 65,00±4,31 28,01±8,61 (2) 21,10±4,25 (3) 2,70±0,67 2,90±0,32 5,08±1,04 2,55±0,72 (6) 64,71±5,05 (1) 29,27±7,74 21,19±3,98 2,99±0,62 (5) 2,70±0,95 5,19±0,78 2,48±0,71 (7) 65,47±6,28 26,34±9,87 22,44±6,03 (4) 2,32±0,55 (5) 3,19±0,55 4,94±1,36 2,63±0,74 (8) Analiza statystyczna: CD4 + CD95 + 1) WZU 1 wzg. PMG 1 p < 0,05 CD8 + CD95 + 2) WZU wzg. PMG p < 0,05 CD19 + CD95 + 3) WZU wzg. PMG p < 0,02 CD19 + CD95 + 4) WZU 2 wzg. PMG 2 p < 0,05 CD4 + CD95L + 5) PMG 1 wzg. PMG 2 p < 0,02 AnnV 6) WZU wzg. PMG p < 0,001 AnnV 7) WZU 1 wzg. PMG 1 p < 0,04 AnnV 8) WZU 2 wzg. PMG 2 p < 0,004 dałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha (WZU) wynosiła 5,53 ± 0,91% i była nieznacznie wyższa w porównaniu do grupy dzieci z przerostem migdałka gardłowego (PMG-5,08 ± 1,04%). Różnica ta nie były istotna statystycznie. Nieco wyższe wartości odsetka limfocytów CD19 + CD95L + stwierdzono w podgrupie dzieci młodszych grupy badanej (WZU 1-5,46 ± 1,05%) w porównaniu z podgrupą dzieci młodszych grupy odniesienia (PMG 1-5,19 ± 0,78%). W podgrupie dzieci starszych (WZU 2 ) średnia wartość limfocytów wynosiła 5,62 ± 0,75% i była wyższa niż w podgrupie dzieci starszych PMG 2-4,94 ± 1,36% (tab. I). DYSKUSJA Apoptotycznej śmierci komórki towarzyszą zmiany strukturalne błony plazmatycznej polegające na ekspozycji na jej powierzchni fosfatydyloseryny (PS phosphatidyloserine). W tym czasie nie dochodzi do utraty integralności błony plazmatycznej [24]. Ekspozycja PS występuje bezpośrednio po rozpoczęciu fazy wykonawczej apoptozy, wobec czego eksternalizacja PS jest uważana za wczesny objaw apoptozy [2, 5]. Ze względu na to, że ekspozycja PS występuje podczas apoptozy różnych rodzajów komórek i że PS wykazuje powinowactwo do Anneksyny V, zjawisko to zostało wykorzystane do wykrywania komórek ulegających apoptozie [2, 24]. Nasilenie apoptozy limfocytów, mierzone odsetkiem komórek barwiących się Anneksyną V, było większe w przerosłych migdałkach gardłowych dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha w porównaniu z grupą bez stanu zapalnego ucha. Podobnie kształtowało się nasilenie apoptozy w podgrupach wiekowych. W dalszych badaniach oceniano odsetek limfocytów T (CD4 + i CD8 + ) oraz limfocytów B (CD19 + ) wykazujących ekspresją receptora śmierci Fas i jego liganda FasL. Odsetek limfocytów T (CD4 + ) wykazujących ekspresję Fas w grupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha był wyższy niż w grupie dzieci bez stanu zapalnego ucha. Szczególnie wysoki odsetek tych limfocytów był w podgrupie dzieci młodszych i różnił się statystycznie znamiennie 62 Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1

5 Ekspresja antygenu Fas i FasL w porównaniu z podgrupą dzieci młodszych bez stanu zapalnego ucha. Również odsetek limfocytów TCD8 + z ekspresją Fas był statystycznie znamiennie wyższy w podgrupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha w porównaniu z grupą odniesienia. Natomiast odsetek limfocytów T (CD4 + i CD8 + ) z ekspresją FasL był zbliżony w obu grupach badanych i podgrupach wiekowych dzieci. Czynniki wpływające na żywotność limfocytów T zmieniają się w zależności od typu i stanu, w jakim znajdują się te komórki. Naiwne limfocyty T nie wykazują ekspresji receptora Fas i umierają zależnie od mechanizmu zależnego od Bcl-2/Bim [12]. Głównym mechanizmem, od którego zależy śmierć aktywowanych limfocytów T, są sygnały docierające do nich przez powierzchniowy receptor Fas [1, 10, 12]. Limfocyty T, wśród których przeważają limfocyty CD4 +, umiejscowione są głównie w przestrzeni międzygrudkowej migdałków. Po kontakcie z komórkami prezentującymi antygen i interakcji różnych cząstek kostymulujących dochodzi do pobudzenia i proliferacji limfocytów T [14]. Pobudzone limfocyty T wykazują ekspresję Fas [1], który po połączeniu z FasL inicjuje proces apoptozy [1, 10, 12]. Proces ten zachodzi w końcowej fazie odpowiedzi immunologicznej. Z badań immunohistochemicznych Stratera i wsp. [20] oraz Zakrzewskiej i wsp. [26] wynika, że w migdałkach większość komórek wykazujących ekspresję mrna CD95L była zlokalizowana pod nabłonkiem krypt, a w nieco mniejszej ilości komórki takie występowały w przestrzeni międzykomórkowej. Tateyama i wsp. [22] uważają, że ważnym czynnikiem regulującym są limfocyty T CD4 + FasL +, gdyż limfocyty CD4 + i CD8 + po kontakcie z nimi ulegały apoptozie. Wyższy odsetek limfocytów T CD4 + i CD8 + wykazujących ekspresję receptora śmierci Fas w przerosłych migdałkach gardłowych dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha może świadczyć o większym nasileniu apoptozy aktywowanych limfocytów, co z kolei może być przyczyną zaburzonej lokalnej odpowiedzi immunologicznej przerosłych migdałków gardłowych obejmującej ucho środkowe. Odsetek limfocytów B z ekspresją Fas w grupie badanej był statystycznie znamiennie wyższy niż w grupie odniesienia. W podgrupach dzieci młodszych odsetek ten był zbliżony, natomiast w podgrupie dzieci starszych chorych na wysiękowe zapalenie ucha był statystycznie znamiennie wyższy niż w podgrupie dzieci starszych bez stanu zapalnego ucha. Odsetek limfocytów B z ekspresją FasL był zbliżony w obu grupach badanych i podgrupach wiekowych. Nasilenie apoptozy limfocytów B ma znaczenie w odpowiedzi humoralnej [21] migdałków. Decyzja pomiędzy śmiercią komórki a przeżyciem jest podejmowana już we wczesnym okresie rozwoju limfocytów B [7]. W ośrodkach rozmnażania apoptoza limfocytów B dotyczy komórek o niskiej swoistości i brakiem powinowactwa receptora BCR [18]. Limfocyty B w ośrodkach rozmnażania, szczególnie proliferujące centroblasty, wykazują fenotyp charakterystyczny dla komórek wrażliwych na apoptozę, mianowicie niską zawartość antyapoptotycznego Bcl-2 [13] i wysoką ekspresję cząsteczek indukujących śmierć takich jak Fas, Bax, c-myc i p53 [7, 18]. Uważa się, że ponad 90% limfocytów B w ośrodkach rozmnażania umiera w wyniku apoptozy. Przeżywają jedynie te komórki, które syntetyzują przeciwciała o wysokim powinowactwie i mogą się różnicować do komórek pamięci lub komórek plazmatycznych [18]. Znacznie wyższy odsetek limfocytów B z ekspresją Fas w przerosłych migdałkach u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha, zwłaszcza u dzieci po 5 r.ż., wydaje się świadczyć o większym nasileniu apoptozy tych limfocytów. W migdałkach receptor Fas limfocytów B wiąże się z FasL występującym na limfocytach T i B [9] oraz na grudkowych komórkach dendrytycznych [8, 20], głównie w strefie jasnej, gdzie zachodzi selekcja centrocytów [25]. Chociaż komórki te pełnią raczej funkcję antyapoptotyczną wzmagają proliferację i różnicowanie limfocytów B w ośrodkach rozmnażania [16]. Tsunoda i wsp. [23] uważają, że w migdałkowych ośrodkach rozmnażania grudkowe komórki dendrytyczne są zdolne do regulacji podatności limfocytów B na apoptozę. Wydaje się, że odsetek limfocytów B z ekspresją FasL nie wpływa na nasilenie apoptozy limfocytów B u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha, ponieważ jest on zbliżony w obu grupach badanych i podgrupach wiekowych. Prawidłowa funkcja immunologiczna migdałków gardłowych, które są źródłem komórek immunologicznie kompetentnych dla błon śluzowych górnych dróg oddechowych, w tym ucha środkowego [17], zależy od wzajemnych stosunków ilościowych i jakościowych komórek biorących udział w odpowiedzi immunologicznej. Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1 63

6 B. Żelazowska-Rutkowska i inni WNIOSKI Jednym z ważnych procesów regulujących homeostazę migdałka gardłowego jest apoptoza. Podatność poszczególnych subpopulacji limfocytów w przerosłych migdałkach gardłowych wydaje się wpływać na zmianę stosunków ilościowych limfocytów, a tym samym zaburzać funkcję immunologiczną migdałków, co może wpływać na przebieg wysiękowego zapalenia ucha u dzieci. PIŚMIENNICTWO 01. Baumann S, Krueger A, Kirchhoff S, Krammer PH. Regulation of T cell apoptosis during the immune response. Curr Mol Med 2002; 2: Cornelissen M, Philippe J, De Sitter S, De Ridder L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: an electron microscopic evaluation. Apoptosis 2002; 7: Daniel PT, Oettinger U, Mapara YM, Bommert K, Bargou R, Dorken B. Activation and activation-induced death of human tonsillar B cells and Burkitt lymphoma cells: lack of CD95 (Fas/ APO-1) ligand expression and function. Eur J Immunol 1997; 27: Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon wide-ranging implications in human disease. J Intern Med 2005; 258: Gerbaulet A, Hartmann K, Mekori YA. Mast cell apoptosis. Methods Mol Biol 2006; 315: Gupta S, Su H, Bi R, Agrawal S, Gollapudi S. Life and death of lymphocytes: a role in immunesenescence. Immun Ageing 2005; 2: Guzman-Rojas L, Sims-Mourtada J, Rangel R, Martinez-Valdez H. Life and death within germinal centres: a double edged sword. Immunology 2002; 107: Hur DY, Kim DJ, Kim S, Kim YY, Cho D, Lee DS, i wsp. Role of follicular dendritic cells in the apoptosis in germinal center B cells. Immunol Lett 2000; 72: Koopman G, Keehnen R M, Lindhout E, Zhou DF, de Groot C, Pals ST. Germinal center B cells rescued from apoptosis by CD40 ligation or attachment to follicular dendritic cells, but not by engagement of surface immunoglobulin or adhesion receptors, become resistant to CD95-induced apoptosis. Eur J Immunol 1997; 27: Krueger A, Fas SC, Baumann S, Krammer PH. The role of CD95 in the regulation of peripheral T-cell apoptosis. Immunol Rev 2003; 193: Lavrik IN, Golks A, Krammer PH. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J Clin Invest 2005; 115: Marrack P, Kappler J. Control of T cell viability. Ann Rev Immunol 2004, 22: Musiatowicz M, Hassmann-Poznańska E, Musiatowicz B, Baltaziak M. The Bcl-2 protein expression in germinal centers of hypertrophied adenoids in children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2003; 67: Nave H, Gebert A, Pabst R. Morphology and immunology of human paltine tonsil. Anat Embryol 2001; 204: Oancea M, Mazumder S, Crosby ME, Almasan A. Apoptosis assays. Methods Mol Med 2006; 129: Park CS, Choi YS. How do follicular dendritic cells interact intimately with B cells in germinal centre? Immunology 2005; 114: Rynnel-Dag B, gren K. The nasopharynx and the middle ear. Inflammatory reactions in middle ear disease. Vaccine 2001; 19: S26 S Sagaert X, De Wolf-Peeters C. Classification of B-cells according to their differentiation status, their micro-anatomical localisation and their develpmental lineage. Immunol Lett 2003; 90: Scaffidi C, Schmitz I, Zha J, Korsmeyer SJ, Krammer PH, Peter ME. Differential modulation of apoptosis sensitivity in CD95 type I and type II cells. J Biol Chem 1999; 374: Sräter J, Mariani SM, Walczak H, Rücker FG, Leithäuser F, Krammer PH, i wsp. CD95 Ligand (CD95L) in normal human lymphoid tissues. Am J Pathol 1999; 154: Strasser A, Bouilelet P. The control of apoptosis in lymphocyte selection. Immunol Rev 2003; 193: Tateyama M, Oyaizu N, McCloskey TW, Than S, Pahwa S. CD4 lymphocytes are primed to express Fas ligand by CD4 cross-linking and contribute to CD8 T-cell apoptosis via Fas/FasL death pathway. Blood 2000; 96: Tsunoda R, Heinen E, Sugai N, Follicular dendritic cells in vitro modulate the expression of Fas and Bcl-2 on germinal center B cells. Cell Tissue Res 2000, 299: Van Engeland M, Nieland LJW, Ramaekers FCS, Schutte B, Reutelingsperger CPM. AnnexinV-affinity assay: a reviewe on an apoptosis detection system based on phosphatidylserine exposure. Cytometry 1998; 31: Verbeke CS, Wenthe U, Zengraf H. Fas ligand expression in the germinal centre. J Pathol 1999, 189: Zakrzewska A, Kobos J, Gryczyńska D. Evaluation of CD25, CD152, Fas-ligand expression in the adenoids of allergic and non-allergic children: a pilot study. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2003; 67(suppl 1), S Zhang N, Hartig H, Dzhagalov I, Draper D, He YW. The role of apoptosis in the development and function of T lymphocytes. Cell Res 2005; 15: Adres autora: mgr Beata Żelazowska-Rutkowska Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej AM w Białymstoku ul. Waszyngtona Białystok tel: (085) Otolaryngologia Polska 2008, LXII, 1