Wstęp PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS

Transkrypt

1 93 Ekspresja koreceptorów CD80 i CD86 na limfocytach B w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego CD80 and CD86 coreceptors expression on lymphocytes B in hypertrophied adenoids in children with otitis media with effusion Karol Ratomski 1, Beata Żelazowska-Rutkowska 1, Jolanta Wysocka 1, Bożena Skotnicka 2, Edwina Kasprzycka 1, Bauer Ilona 2 SUMMARY Aim: The aim of this study was evaluation of the percentage and mean fluorescence intensity of lymphocytes B with expression CD80 and CD86 in hypertrophied adenoids in children with otitis media with effusion. Material and methods: Expression coreceptors CD80 and CD86 on lymphocytes B in adenoid tissue were estimated by flow cytometry method. 15 children with otitis media with effusion and 15 children with hypertrophied adenoid were tested. Results: This study showed significantly higher percentage of lymphocytes CD19+CD80+ in children with otitis media with effusion (OME 1,42% ± 0,91) than in comparative group with hypertrophied adenoids (AH 0,63% ± 0,21). The receptor CD86 didn t show differences in expression on lymphocytes B between both examinated groups. Conclusion: Low expression of CD80 and CD86 indicates that local immunity response in hypertrophied adenods in children with otitis media with effusion is weakened. It can contribute to the otitis media with effusion. Hasła indeksowe: CD80, CD86, limfocyty, przerost migdałka gardłowego, wysiękowe zapalenie ucha środkowego. Key words: CD80, CD86, lymphocytes, hypertrophied adenoid, otitis media with effusion. by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: Zaakceptowano do druku/accepted: Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. J. Wysocka 2 Klinika Otolaryngologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. E. Hassmann-Poznańska Wkład pracy autorów/authors contribution: Karol Ratomski główny badacz oraz przewodniczący zespołu autorów, Beata Żelazowska-Rutkowska, Jolanta Wysocka, Bożena Skotnicka, Ilona Baure udział w kierowaniu badaniem i interpretacja danych, Edwina Kasprzycka odpowiedzialna za analizę statystyczną i przygotowanie wyników badań do analizy. Konflikt interesu/conflicts of interest: Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: Karol Ratomski adres pocztowy: Zakład Laboratoryjnej Diagnostyki Pediatrycznej UMwB ul. J. Waszyngtona Białystok tel. 085/ karol.cam@interia.pl Otolaryngol Pol 2010; 64 (2): Wstęp Często powtarzające się lub długotrwałe stany zapalne w okolicach pierścienia Waldeyera mogą doprowadzić do powstania przerostu migdałka gardłowego. Paradoksalnie może stać się on nie tylko źródłem swoistej odpowiedzi immunologicznej, ale i źródłem flory patogennej. Co więcej, zaburzona jest sama funkcja odpornościowa migdałka gardłowego. Sprzyja to powstawaniu stanów zapalnych w obrębie ucha środkowego. Przerosły migdałek gardłowy sąsiadując z gardłowym ujściem trąbki Eustachiusza, powoduje jego ucisk i upośledza wentylację ucha środkowego [1, 2, 3]. Efektywna odpowiedź immunologiczna limfocytów T występuje po połączeniu receptorów komórek T z cząsteczką MHC (major histocompatibility complex) komórek prezentujących antygen (APC), receptorem TCR i pojedynczym antygenem. Połączenie takie stanowi pierwszy sygnał aktywacji komórki. Do pełnej aktywacji dochodzi dopiero po połączeniu cząsteczek kostymulujących; jest to drugi sygnał pobudzenia. Sygnał przekazywany jest od komórki prezentującej antygen z udziałem jej powierzchniowych receptorów B.7 (CD80 i CD86) do limfocytu T, na którym są obecne ligandy tych receptorów CD28 i CTLA-4 (CD152) [4, 5]. Rozpoznanie i związanie przez cząsteczkę adhezyjną CD28 komórki T molekuł z rodziny B7 powoduje aktywację komórki i produkcję prozapalnej IL-2 oraz białek antyapoptotycznych (głównie z rodziny Bcl). Ponadto obserwuje się zwiększone wydzielanie IL-4, IL-5, IL-8, IL-13 oraz INF-α i TNF [5, 12, 14]. Następnie przetworzony sygnał aktywacji przez limfocyt T jest przekazywany z udziałem koreceptorów powierzchniowych (CD80 i CD86) i receptorem BCR na limfocyt B [6, 7]. Receptory powierzchniowe CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2) należą do nadrodziny białek immunoglobulinopodobnych i są obecne na wielu komórkach: makrofagach, spoczynkowych komórkach dendrytycznych i limfocytach B. Cząsteczki B7 występują jako monomery w błonie komórkowej, posiadają część pozakomórkową złożoną z domen podobnych do IgV i IgC2 oraz krótki łańcuch cytoplazmatyczny. Część wewnątrzkomórkowa receptora CD86 zawiera trzy miejsca potencjalnej fosforylacji kinazy proteinowej C i jest dłuższa niż cząsteczce CD80 [8].

2 94 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela I. Odsetek limfocytów B (CD19+) z ekspresją koreceptorów: CD80 i CD86 w tkance przerosłych migdałków gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () i w grupie porównawczej z przerostem migdałka gardłowego (). Table I. Mean percentage of B lymphocytes (CD19+) with expression of coreceptors: CD80 and CD86 in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion (OME) and in children Grupa + A znamienność statystyczna p<0,05 Odsetek limfocytów B z ekspresją CD80 (% ± SD) Obydwie cząsteczki różnią się kinetyką ekspresji. W warunkach in vitro wzrost ekspresji CD86 jest widoczny w ciągu 4 6 godzin, podczas gdy szczyt ekspresji CD80 wykrywalny jest dopiero po 24 godzinach i utrzymuje się godziny [9, 10]. Cel badań Odsetek limfocytów B z ekspresją CD86 (% ± SD) 0,63 ± 0,21A 7,59 ± 1,60 1,42 ± 0,91A 7,54 ± 2,93 Tabela II. Średnia intensywność fluorescencji B (CD19+) z ekspresją koreceptorów: CD80 i CD86 w tkance przerosłych migdałków gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () i w grupie porównawczej z przerostem migdałka gardłowego (). Table II. Mean fluorescence intensity (MFI) of B lymphocytes (CD19+) with expression of coreceptors: CD80 and CD86 in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion (OME) and in children with hypertrophied adenoid (HA). Grupa + Średnia intensywność fluorescencji limfocytów B z ekspresją CD80 (MFI ± SD) Średnia intensywność fluorescencji limfocytów B z ekspresją CD86 (MFI ± SD) 6,27 ± 1,19 15,30 ± 2,06 7,12 ± 1,33 17,77 ± 1,93 Celem badań była ocena odsetka limfocytów B z ekspresją cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86 w tkance przerosłych migdałków gardłowych dzieci z wysiękowym zapaleniem ucha środkowego trwającym powyżej trzech miesięcy. W przeprowadzonych badaniach wykorzystano tkankę przerosłych migdałków gardłowych usuniętych w ramach zabiegów adenoidektomii wykonywanych ze wskazań lekarskich w Klinice Otolaryngologii Dziecięcej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Grupa badana () z przerostem migdałka gardłowego i wysiękowym zapaleniem ucha środkowego trwającym powyżej 3 miesięcy liczyła 15 pacjentów w wieku od 2. do 17. roku życia. Grupa porównawcza () liczyła 15 dzieci w podobnym wieku, jedynie z przerostem migdałków gardłowych. Na przeprowadzenie tematu badawczego otrzymano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Usunięte w czasie zabiegu migdałki były niezwłocznie umieszczone w podłożu RPMI 1640 z dodatkiem 10% surowicy cielęcej i transportowane do pracowni w temperaturze 4 C. Bioptat tkanki został pocięty i mechanicznie rozdrobniony poprzez wyczesywanie igłą, delikatny nacisk, potrząsanie w celu otrzymania jednorodnej zawiesiny komórkowej. Gęstość komórek została oceniona za pomocą analizatora hematologicznego Sysmex XT-2000i. W analizatorze tym każdy leukocyt jest niezależnie mierzony przy użyciu trzech detektorów: objętości, konduktancji i światła laserowego. Żywotność komórek została ustalona za pomocą błękitu trypanu. Do badań cytometrycznych wykorzystano próbki, w których żywotność komórek wyniosła co najmniej 95%. W celu przeprowadzenia analizy limfocytów zawiesiny komórkowe były inkubowane z odpowiednimi przeciwciałami monoklonalnymi sprzężonymi z fluorochromami (BectonDickinson i R&D Systems). Następnie zawiesiny były lizowane za pomocą EPICS IMMUNOLOGY WORK STATION (automatycznej stacji lizowania). Przeciwciała monoklonalne użyte w badaniach skierowane były przeciw powierzchniowym markerom: CD45, CD19, CD80 i CD86. W badaniach użyto kontroli zgodnej izotypowo z klasą użytych przeciwciał. Analiza cytometryczna wykonywana była na cytometrze przepływowym firmy Beckman Coulter PC 500. Cytometria przepływowa umożliwia analizę dużej liczby komórek danej populacji, stwarza możliwość standaryzacji wyników. Cytometr rejestruje światło rozproszone na komórce oraz światło wysyłane przez wzbudzony fluorochrom. Analizuje także komórki w przestrzeni dwuwymiarowej i różnicuje je ze względu na wielkość i kształt oraz wewnętrzną ziarnistość. Analizę statystyczną uzyskanych wyników przeprowadzono testem nieparametrycznym U Manna- -Whitney a przy użyciu programu STATISTICA 5.0. Wyniki podawano w wartościach odsetkowych. Za istotną statystycznie przyjęto wartość przy p<0,05. Materiał i metody Wyniki Średni odsetek limfocytów B (CD19+) w przerosłym migdałku gardłowym z ekspresją cząsteczki kostymulującej CD80 w grupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () wyniósł 1,42 ± 0,91%.

3 95 3,2 Odsetek limfocytów B CD80 13 Odsetek limfocytów B CD86 2,8 2,4 11 CD80% 2,0 1,6 1,2 CD86% 9 7 0,8 0,4 0,0 5 3 Ryc. 1. Średni odsetek limfocytów B (CD19+) z ekspresją koreceptora CD80 w tkance przerosłego migdałka gardłowego u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () i w grupie z przerosłym migdałkiem gardłowym (). Fig. 1. Mean percentage of B lymphocytes (CD19+) with expression of coreceptor CD80 in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion (OME) and in children Ryc. 3. Średni odsetek limfocytów B (CD19+) z ekspresją koreceptora CD86 w tkance przerosłego migdałka gardłowego u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () i w grupie z przerosłym migdałkiem gardłowym (). Fig. 3. Mean percentage of B lymphocytes (CD19+) with expression of coreceptor CD86 in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion (OME) and in children Średnia intensywność fluorescencji limfocytów B MIF80 21 Średnia intensywność fluorescencji limfocytów B CD CD80 MFI 8 CD86 MFI Ryc. 2. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) limfocytów B (CD19+) z ekspresją koreceptora CD80 w tkance przerosłego migdałka gardłowego u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () i w grupie z przerosłym migdałkiem gardłowym (). Fig. 2. Mean fluorescence intensity of B lymphocytes (CD19+) with expression of coreceptor CD80 in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion (OME) and in children Ryc. 4. Średnia intensywność fluorescencji (MFI) limfocytów B (CD19+) z ekspresją koreceptora CD86 w tkance przerosłego migdałka gardłowego u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha środkowego () i w grupie z przerosłym migdałkiem gardłowym (). Fig. 4. Mean fluorescence intensity of B lymphocytes (CD19+) with expression of coreceptor CD86 in hypertrophied adenoid in children with otitis media with effusion (OME) and in children Był on statystycznie znamiennie wyższy (p<0,05) niż w grupie odniesienia (), z przerosłym migdałkiem gardłowym (0,63 ± 0,21%) (Tab. I., Ryc. 1.). Średnia intensywność fluorescencji (MFI), pośrednio odpowiadającą gęstości receptora w grupie badanej miała wartość 7,12 ± 1,33, a w grupie bez stanu zapalnego ucha środkowego wynosiła 6,27 ± 1,19. Nie wykazano różnicy istotnej statystycznie (Tab. II., Ryc. 2.). W grupie badanej średni odsetek limfocytów B w tkance przerosłego migdałka gardłowego z ekspresją CD86 wyniósł 7,54 ± 2,93%, natomiast w grupie z stanowił 7,59 ± 1,60% (Tab. I., Ryc. 3.). Wskaźnik średniej intensywności fluorescencji receptora CD86 w grupie ze stanem zapalnym ucha środkowego był nieznacznie wyższy niż w grupie odniesienia i stanowił odpowiednio w 17,77 ± 1,93, a w 15,30 ± 2,06 (Tab. II., Ryc. 4.). Omówienie W tkance migdałka gardłowego dominującą subpopulacją są limfocyty B, stanowiące ok. 60% wszystkich komórek jednojądrzastych [11]. Do rozwinięcia pełnej odpowiedzi immunologicznej z wytworzeniem swoistych przeciwciał niezbędna jest kaskada reakcji międzykomórkowych pomiędzy komórkami prezentującymi antygen, limfocytami T i B oraz cytokinami. Na powierzchni limfocytów są zlokalizowane cząsteczki,

4 96 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS receptory kostymulujące wspomagające prezentację i rozpoznawanie antygenów. Wytworzenie optymalnej odpowiedzi humoralnej wymaga pełnej aktywacji limfocytów T. Rozpoznawanie antygenów przez limfocyty T odbywa się z udziałem kompleksu receptorów CD3-TCR w obecności odpowiedniej cząsteczki MHC. Dopiero po przetworzeniu sygnału przez komórki T jest on prezentowany limfocytom B. Do całkowitej aktywacji limfocytów B potrzebne są co najmniej 2 sygnały pobudzenia. Pierwszy sygnał jest zależny od antygenów kostmulujących CD40-CD40L. Drugi zaś może być dostarczony przez ligandy receptorów CD28 i CD152 oraz cząsteczki CD80 i CD86 [6, 12, 13]. W pełni aktywowany limfocyt pomocniczy T (CD3+CD4+) jest kompetentny do dostarczenia sygnału pobudzenia limfocytom B poprzez wydzielenie IL-4 lub zwiększoną ekspresję CD40L. W zależności od tego, czy sygnał pobudzenia jest przekazywany jednocześnie z udziałem receptorów CD3-TCR i CD40-CD40L oraz drugim sygnałem kostymulującym, limfocyt B może ulegać apoptozie lub proliferacji i różnicowaniu. Te interakcje międzykomórkowe mają głównie miejsce w drugorzędowych ośrodkach rozmnażania, a zachodzą po antygenowo specyficznej stymulacji w płaszczu grudki limfatycznej, w następstwie czego dochodzi do dojrzewania i przełączenia klas przeciwciał [14, 15]. W przeprowadzonych badaniach wykazano wyższy odsetek limfocytów B z ekspresją CD80 w grupie dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha z przerostem migdałka gardłowego niż w grupie jedynie z samym przerostem migdałka gardłowego. Natomiast nie wykazano różnicy odsetka limfocytów B CD86 pomiędzy ocenianymi grupami. Nie zaobserwowano również różnicy średniej intensywności fluorescencji komórek B z ekspresją CD80 i CD86, która pośrednio odpowiada gęstości tych receptorów na limfocytach. Dziewicze spoczynkowe limfocyty B wykazują niską ekspresję cząsteczki sygnalizującej CD86 (B7.2). Na komórkach tych cząsteczka CD80 (B7.1) nie występuje lub wykazuje swoją ekspresję na bardzo niskim poziomie [16]. Wzrost ekspresji CD86 może zachodzić poprzez aktywację receptora BCR (B-cell receptors) limfocytów B oraz CD40-CD40L oraz pod wpływem działania lipopolisacharydu LPS. Wzrost ekspresji CD86 obserwowany jest już po 4-6 godzinach od stymulacji z udziałem BCR, podczas gdy CD80 po 24 godzinach. Ich ekspresja zmniejsza się w 2-3 dobie. Ponadto stymulacja komórek B wykazujących ekspresję CD86 przeciwciałem anty-cd86 może powodować wzrost ekspresji CD80 [17]. W badaniach immunohistochemicznych migdałków wykazano, że w strefie międzygrudkowej ekspresję CD80 i CD86 wykazują makrofagi i komórki dendrytyczne. Natomiast w ośrodku rozmnażania obecne w strefie ciemnej centroblasty są B7.2+. Centrocyty występujące w strefie jasnej są głównie B7.1+. W strefie płaszczowej grudki limfatycznej na limfocytach nie stwierdzono występowania cząsteczek z grupy B7 [18]. Cząsteczki B7.1 i B7.2 obecne na limfocytach B mają odmienną rolę w regulacji odpowiedzi immunologicznej. Wynika to z możliwości łączenia się CD80 i CD86 z różnymi ligandami: CD28 lub CTLA-4 (citotoxic T lymphocyte associated antigen) na komórce T. Powinowactwo pomiędzy B7.1-CTLA-4 jest wyższe niż interakcja pomiędzy B7.2-CTLA-4. CD28 łączy się częściej z B7.2 niż z B7.1. Interakcja pomiędzy CD80 i CD86 a CD28 powoduje aktywację i różnicowanie limfocytów T oraz zabezpiecza je przed apoptozą [19]. CD28 odgrywa znaczącą rolę w różnicowaniu i produkcji przeciwciał przez komórki B oraz formowaniu ośrodków rozmnażania w grudkach limfatycznych w odpowiedzi zależnej od limfocytów T pomocniczych [5]. Dlatego zwiększony odsetek limfocytów T pomocniczych z ekspresją CD28+ w przerosłych migdałkach gardłowych u dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha wydaje się być zjawiskiem korzystnym. Wskazuje to na wzmożoną odpowiedź immunologiczną w migdałku gardłowym [12]. Kostymulacja CD28 z udziałem komórek B (poprzez CD80 i CD86) prowadzi również do wzrostu ekspresji CTLA-4 na komórkach T. Aktywacja CTLA-4 powoduje efekt antagonistyczny dla większości reakcji immunologicznych wyzwalanych na skutek przekazania sygnału pobudzenia komórkom T z udziałem CD28, w tym proliferacji komórek T i produkcji IL-2 [5]. Zablokowanie sygnału pobudzenia przekazywanego poprzez układ cząsteczek CD28-CD80 i CD86 powoduje zahamowanie proliferacji komórek T równie efektywnie jak zmniejszenie liczby limfocytów T. Może powodować także antygenowo specyficzną niewrażliwość tych komórek, stan anergii [20]. Fujihara i wsp. [21] uważają, że zmiany ekspresji tych cząsteczek kostymulujących korelują z częstością występowania ostrych nawracających stanów zapalnych migdałków. Limfocyty B pamięci (sigd-sigm+) wykazujące silną ekspresję receptorów B7 występują w pobliżu nabłonka krypt, gdzie pełnią funkcję komórek prezentujących antygen limfocytom T [22]. Limfonabłonek pełni kluczową rolę w kształtowaniu odpowiedzi immunologicznej. Antygeny rozpuszczalne stosunkowo łatwo przechodzą przez nabłonek migdałków i reagują z wewnątrzbłonowymi i podnabłonkowymi leukocytami i komórkami dendrytycznymi [23]. Blisko 50% śródnabłonkowych limfocytów B jest zdolnych do produkcji immunoglobulin [24]. Wysoka ekspresja cząsteczek B7 na limfocytach B pamięci w tym miejscu wskazuje, że mogą one być odpowiedzialne za szybką aktywację wtórnej odpowiedzi immunologicznej. Ponadto Mattila i wsp. [25] wskazują, że migdałki mogą być miejscem różnicowania

5 97 limfocytów zasiedlających błonę śluzową ucha środkowego i biorących udział w reakcji zapalnej. Możliwość migracji limfocytów z migdałków do błony śluzowej ucha środkowego potwierdziły badania Rayan a i wsp. [26] przeprowadzone na modelach zwierzęcych. Wnioski Limfocyty B obecne w migdałku gardłowym w następstwie stymulacji antygenowej mogą stanowić grupę komórek immunologicznie zaangażowanych w odniesieniu do tkanek otaczających, w tym i ucha środkowego. Z drugiej jednak strony wykazana w badaniach zbyt niska ekspresja cząsteczek kostymulujących CD80 i CD86 wskazuje na osłabienie lokalnej odpowiedzi immunologicznej, która może przyczyniać się nie tylko do przewlekłego stanu zapalnego migdałków, ale i powstania wysiękowego zapalenia ucha środkowego. PIŚMIENNICTWO 1. Bernstein JM. Role of allergy in eustachian tube blockade and otitis media with effusion. Otolaryngol Head Neak Surg. 1996; 114: Fujihara K, Goto H, Hiraoka M, Hayashi M, Hotomi M, Tamura S i wsp. Tonsillitis index: an objective tool for quantifing the indications for tonsillectomy for recurrent acute tonsillitis. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 2005; 69: Paulussen C, Claes J, Claes G, Jorissen M. Adenoids and tonsils, indications for surgery and immunological consequences of surgery. Acta Otorhinolaryngol Belg 2000; 54: Collins M, Ling V, Carreno BM. The B7 family of immuneregulatory ligands. Genome Biology. 2005; 6: Bour-Jordan H, Bluestone JA CD28 function: a balance of costimulatory and regulatory signals. J Clin Immunol. 2002; 22: Weinstein E, Peeva E, Putterman Ch, Diamond. B-cell biology. Rheum Dis Clin N Am. 2004; 30: Sahoo NC, Rao KVS, Natarajan K. CD80 expression in induced on activated B cell following stimulation by CD86. Scand J Immunol. 2002; 55: Hathcock KS, Laszlo G, Pucillo C i wsp. Comparative analysis of B7-1 nad B7-2 costimulatory ligands, expression and function. J Exp Med. 1994; 180: Lenschow DL, Sperling AI, Cooke MP i wsp. Differential up-regulation of the B7-1 and B7-2 costimulatory molecules after Ig receptor engagement by antigen. J Immunol. 1994; 153: Coyle AJ, Gutierrez-Ramos J-C. The expanding B7 superfamily: increasing comlexity in co-stimulatory signals regulating T cell function. Nat Immunol. 2001; 2: Wysocka J, Hassmann-Poznańska E, Kasprzycka E, Musiatowicz M. Ocena subpopulacji limfocytów w przerosłych migdałkach gardłowych metodą cytometrii przepływowej. Wiad Lek 2001; 54: Ratomski K, Żelazowska-Rutkowska B, Wysocka J, Skotnicka B. Ekspresja cząsteczki adhezyjnej CD28 na subpopulacjach limfocytów przerpsłych migdałków gardłowych dzieci chorych na wysiękowe zapalenie ucha. Otolaryngol Pol. 2006; 60: Harris NL, Ronchese F. The role of B7 costimulation in T- cell immunity. Immunol Cell Biology. 1999; 77: Vallejo AN, Davila E, Weyand CM, Goronzy JJ. Biology of T-cell lymphocytes. Rheum. Dis Clin N Am. 2004; 30: Peggs KS, Allison JP. Co-stimulation pathways in lymphocyte regulation: the immunoglobulin superfamily. Brit J Haematol. 2005; 130: Lenschow DJ, Su G-H, Zuckerman T i wsp. Expression nad functional significance of an additonal ligand for CTLA-4. Proc Nat Acad Sci USA. 1993; 90: Sahoo NC, Rao KVS, Natarjan K. CD80 expression is induced on activated B cells following stimulation by CD80. Scand J Immunol. 2002; 55: Vyth-Dreese FA, Dellemijn TAM, Majoor D, de Jong D. Localization in situ of the co-stimulatory molecules B7.1, B7.2, CD40 and their ligands in normal human lymphoid tissue. Eur J Immunol. 1995; 25: Collins A, Brodie D, Gilbert R, Iaboni A, Manso-Sancho R, Walse B I wsp. The imteraction properties of costimulatory molecules revised. Immunity. 2002; 17: Jenkins MK, Taylor PS, Norton SD, Urdahl KB. CD28 delivers a co-stimulation signal involved in antigen-specific IL-2 production by human T cells. J Immunol. 1991; 147: Fujihara K, Goto H, Hiraoka M, Hayashi M, Hotomi M, Tamura Sh I wsp. Tonsillitis index: An objective tool for quantifying the indications for tonsillectomy for recurrent acute tonsillitis. Int J Ped Otorhinolaryngol. 2005; 69: Brandtzaeg P. Immunology of tonsils and adenoids: everything the ENT surgeon needs to now. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2003; 67: Perry M, White A. Immunology of the tonsils. Immunol. Today. 1998; 19: Tang X, Hori S, Osamura RY, Tsutsumi Y. Reticular crypt epithelium and intra-epithelial cells in the hyperplastic human palatine tonsil: An immunohistochemical analysis. Pathol Int. 1995; 45: Mattila PS, Nykanen A, Eloranta M, Tarkkanen J. Adenoids provide a microenvironment for the generation CD4+, CD45RO+, L-selectine, CXCR4+, CCR5+ T lymphocytes, a lymphocyte phenotype found uin the middle ear effusion. Int Immunol. 2000; 12; Rayan AF, Sharp PA, Harris. Lymphocyte circulation to the middle ear. Acta Ptolaryngol. 1990; 109: