CYTOKINY. Maja Machcińska

Transkrypt

1 CYTOKINY Maja Machcińska

2 Cytokiny hormony układu odpornościowego białkowe przekaźniki rozpuszczalni pośrednicy komunikowania się międzykomórkowego. działają w złożonej sieci, w której produkcja jednej cytokiny będzie wpływać na produkcję kilku cytokin lub odpowiadać na nie. ponad 100 opisanych cytokin i wciąż odkrywane nowe

3 Sieć cytokin

4 Cechy cytokin: Proteiny lub glikoproteiny Niskocząsteczkowe (przeważnie <30kDa) Wysoka aktywność biologiczna, działają w stężeniach pikomolarnych Brak właściwości enzymatycznych Produkowane przez wszystkie tkanki, ale głównie przez komórki układu immunologicznego (najwięcej DC, Makrofagi i limfocyty Th) Produkcja nie jest konstytutywna, a wynika ze stymulacji (zaburzenie homeostazy) Działają głównie lokalnie Produkcja cytokin jest ściśle kontrolowana na wielu poziomach

5 Właściwości cytokin: Plejotropowość zdolność do wielokierunkowego działania Redundancja różne cytokiny wpływają jednakowo na daną populację komórek Synergizm dodatni wpływ obu cytokin na dane zjawisko Antagonizm przeciwstawne działanie dwóch (lub więcej) cytokin

6 Właściwości cytokin: Pętle sprzężeń Th1 zwrotnych (+) IL-12 IFNγ (-) IL-10 Makrofag (+) IFNγ IL-12 (+) (+) TNF Th1

7

8

9 Wielopoziomowa rola cytokin: Indukują w komórkach: proliferację różnicowanie chemotaksję (przemieszczania się) cytotoksyczność produkcję przeciwciał przeżycie/apoptozę Regulują: interakcje międzykomórkowe intensywność i czas trwania odpowiedzi immunologicznej Kontrolują: działanie i dojrzewanie komórek ukł. odpornościowego procesy zapalne Kluczowa rola podczas odpowiedzi immunologicznej oraz podczas naprawy tkanek

10 Kontrola produkcji cytokin: Regulacja przez czynniki transkrypcyjne (np. NFκB) wewnątrzkomórkowa regulacja produkcji cytokin występowanie sekwencji destabilizującej na 3 końcu mrna cytokin, powodują, że to mrna jest niestabilne Specyfikacja komórkowa (niektóre cytokiny produkowane są tylko przez określony rodzaj komórek) Produkcja cytokin zależy nie tylko od rodzaju komórki, ale i od stopnia jej zróżnicowania, dojrzałości

11 Kontrola produkcji cytokin: Regulacja ekspresji receptorów dla cytokin na powierzchni komórek docelowych Konieczność kontaktu między komórkami - powstawanie synapsy immunologicznej zapewniającej odpowiednie stężenie cytokin Okres półtrwania cytokin w krążeniu oraz zewnątrzkomórkowych płynach jest zazwyczaj bardzo krótki Antagoniści cytokin szereg białek blokujących biologiczną aktywność cytokin. Białka te mogą wiązać się z: receptorem dla cytokin np. antagonista dla IL-1: IL-1Ra (antagoniści nie są w stanie aktywować komórek, tylko blokują receptor) bezpośrednio z cytokiną hamując jej aktywność i uniemożliwiają jej połączenie z receptorem na powierzchni komórki

12 Działanie cytokin:

13 Receptory dla cytokin:

14 Przekazywanie sygnału udział receptorów wykorzystujących kinazy tyrozynowe i białka STAT To, że różne cytokiny wywołują ten sam efekt w danej komórce jest związane z podobieństwem w domenach receptorów

15 Podział cytokin Chemokiny Interleukiny CYTOKINY TNF Cytokiny krwiotwórcze Interferony i inne np. TGF-β, MIF

16 Interleukiny Umożliwiają komunikację leukocytów między sobą i pozwalają na wpływ jednych populacji leukocytów na inne. Duża grupa cytokin, produkowane głównie przez komórki T Różnorakie funkcje, większość zaangażowana w kierowanie innych komórek do podziału i różnicowania IL-2 IL-4 IL

17 Czynniki krwiotwórcze G-CSF (czynnik stymulujący powstawanie kolonii granulocytów) - pobudza tworzenie granulocytów w szpiku M-CSF (czynnik stymulujący powstawanie kolonii makrofagów) - pobudza szlak tworzenia monocytów i wpływa na dojrzałe monocyty i makrofagi GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie kolonii granulocytów i makrofagów) - pobudza powstawanie granulocytów i makrofagów oraz wpływa na limfocyty erytropoetyna - pobudza rozwój erytrocytów SCF (czynnik komórek macierzystych) - wpływa na młode, multipotencjalne komórki macierzyste krwiotworzenia Ligand Flt3 działa na bardzo wczesne komórki krwiotwórcze, czynnik dojrzewania komórek dendrytycznych

18

19 Chemokiny chemoattractant cytokines Ponad 50 zidentyfikowanych chemokin Działanie chemotaktyczne - tworzą one gradient chemotaktyczny, śladem którego wędrują komórki. Udział w aktywacji, proliferacji i różnicowaniu różnych leukocytów Regulacja angiogenezy, tworzenie przerzutów nowotworowych Określane dwiema nazwami: 1. Budowa 2. Właściwości fizjologiczne

20 Chemokiny Podział ze względu na budowę

21 Chemokiny Podział ze względu na właściwości fizjologiczne 1. Chemokiny prozapalne (indukowane) Reakcja zapalna Przyciąganie do miejsc objętych procesem zapalnym komórek efektorowych odpowiedzi immunologicznej: 2. Chemokiny limfoidalne (konstytutywne lub homeostatyczne) Wytwarzane stale Regulują krążenie różnych populacji limfocytów, sterują migracją komórek dendrytycznych, uczestniczą w przemieszczaniu się dojrzewających tymocytów do odpowiednich rejonów grasicy

22 Interferony Grupa cytokin wytwarzana i uwalniana przez komórki w odpowiedzi na zakażenie wirusowe Wiodąca rola w odpowiedzi przeciwwirusowej brak bezpośredniego działania przeciwirusowego oddziałują na komórki indukując w nich powstanie czynników przeciwirusowych Mogą pobudzić komórki ukł. odpornościowego do zabicia komórek zakażonych przez wirusy Hamują proliferację i indukują różnicowanie wielu komórek

23 Interferony Trzy typy: - TYP I Interferon α, β, ε, ω, κ - TYP II Interferon γ - TYP III Interferony λ (IL-28A, IL-28B, IL-29)

24 Nadrodzina cząsteczek TNF Ponad 20 cząsteczek białkowych o podobnej budowie. Nie wszystkie są cytokinami (mogą to być też białka błonowe). TNF (Tumor Necrosis Factor) - czynnik martwicy nowotworu FasL TRAIL (TNF-related apoptosis inducing ligand)

25 Nadrodzina cząsteczek TNF TNF-α cytotoksyczny względem wielu linii komórek nowotworowych (stąd nazwa) cytokina prozapalna produkowana głównie przez makrofagi i monocyty poprzez swoje receptory (o ile są one obecne na komórce nowotworowej) uruchamia kaskadę prowadzącego do apoptozy (kwas arachidonowy; wolne rodniki) analogicznie wobec komórek zakażonych patogenami pobudza wątrobę do produkcji białek ostrej fazy w tym CRP przyciąga neutrofile

26 TNF Niskie stężenie wynaczynienie leukocytów Średnie stężenie produkcja białek ostrej fazy przez hepatocyty; gorączka, zwiększona produkcja leukocytów w szpiku Wysokie stężenie szok septyczny (serce, układ krwionośny, hiperglikemia, śmierć)

27

28 Inne cytokiny TGF-β transformujący czynnik wzrostu - występuje w trzech odmianach: β1, β2, β3 - wytwarzamy m.in. przez makrofagi, neutrofile, płytki krwi i limfocyty - działa hamująco na proliferację limfocytów T i B oraz komórek NK - zmniejsza wydzielanie wielu cytokin - hamuje ekspresję MHC II i powstawanie limfocytów Tc - bierze udział w gojeniu się ran i stymuluje powstawanie naczyń MIF czynnik zahamowania migracji makrofagów - Wytwarzany głównie przez monocyty i makrofagi np. pod wpływem endotoksyny i niektórych cytokin - Pobudza makrofagi do zabijania mikroorganizmów i komórek nowotworowych - Bierze istotny udział w rozwoju nadwrażliwości typu drugiego

29 Cytokiny produkowane przez limfocyty Th: Limfocyty Th CD4+ można podzielić na subpopulacje w oparciu o produkowane cytokiny: limfocyty Th1 indukcja odpowiedzi komórkowej: obrona organizmu przed wirusami i patogenami wewnątrzkomórkowymi, eliminacja komórek nowotworowych, rekrutacja komórek fagocytujących w miejsce infekcji limfocyty Th2 indukcja odpowiedzi humoralnej: eliminacji patogenów zewnątrzkomórkowych i zwiększenie produkcji przeciwciał (gł. IgE) limfocyty Th3 cytokiny o właściwościach supresorowych TGF-β

30 Polaryzacja immunologiczna

31 Polaryzacja immunologiczna IL-12, INF-γ Th1 IFN-γ IL-2 Odpowiedź komórkowa Th0 IL-4 Th2 IL-4 IL-5 IL-10 IL-13 Odpowiedź humoralna

32

33 Metody wykrywania cytokin

34 Wykrywanie cytokin Poziom cytokin ulega gwałtownym i znaczącym zmianom w wielu chorobach (głównie podczas infekcji i stanów zapalnych). Cytokiny są bezpośrednio zaangażowane w proces rozwoju wielu patofizjologicznych procesów u ludzi Stosowanie cytokin oraz inhibitorów cytokin w próbach klinicznych i w leczeniu wymuszają powstawanie coraz dokładniejszych metod pomiaru cytokin.

35 Metody wykrywania cytokin na różnych poziomach 1. mrna dla cytokin PCR FISH Northern-blot RPA 2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny Metoda wewnątrzkomórkowego barwienia + FACS 3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki ELISA ELISPOT RIA 4. Cytokiny w homogenatach tkankowych, płynach surowiczych, supernatantach zebranych znad hodowli Western blot Testy immunologiczne Testy biologiczne

36 Metody wykrywania cytokin 1. Ocena ekspresji cytokinowego mrna Obecne komórki odpornościowe wykazują słabą ekspresję cytokinowego mrna lub nawet jej całkowity brak Po stymulacji komórek obserwuje się zauważalny wzrost poziomu mrna wykrywany metodami biologii molekularnej Wykrycie mrna typowych cytokin zapalnych (TNF-α, IL-6, IL-8)

37 Metody wykrywania cytokin 1. Ocena ekspresji cytokinowego mrna PCR FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) Northern-blot RPA (RNA-se protection assay)

38 Metody wykrywania cytokin 1. Ocena ekspresji cytokinowego mrna PCR - Metoda jakościowa i ilościowa ekspresji genu - Ograniczenia: musimy znać sekwencję badanego genu (projektowanie starterów) zmiany posttranslacyjne, którym podlegają transkrypty niektórych cytokin

39 Metody wykrywania cytokin 1. Ocena ekspresji cytokinowego mrna PCR zastosowania w praktyce klinicznej szacowanie ekspresji cytokinowego mrna w węzłach chłonnych oraz w komórkach osób cierpiących na chłoniaka Hodgkina (Metoda umożliwia detekcję zmian wywołanych uszkodzeniem prawidłowego genu) diagnostyka molekularna przy wykrywaniu licznych patogenów: grzybów, wirusów i bakterii w tkankach onkologia kliniczna określanie kinetyki ekspresji genów docelowych w odpowiedzi na enzymy, warunkujące dystrybucję i funkcjonowanie leku

40 Metody wykrywania cytokin 1. Ocena ekspresji cytokinowego mrna FISH (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ) skrawki tkankowe, zawiesiny komórek identyfikacja komórek bezpośrednio odpowiedzialnych za syntezę cytokiny w heterogennej populacji komórkowej metoda czuła, czasochłonna, droga wymaga prowadzenia ścisłej kontroli wewnętrznej van de Corput MP i wsp. Sensitive mrna detection by fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification.j Histochem Cytochem Nov;46(11):

41 Metody wykrywania cytokin 1. Ocena ekspresji cytokinowego mrna RPA (RNA-se protection assay) i Northern-blot Metody ilościowe RPA czuła metoda wykorzystywana do detekcji i ilościowej oceny swoistych transkryptów mrna w mieszaninie całkowitego RNA. Pozwala na wykrycie wielu transkryptów w pojedynczej próbce RNA. Metoda Northern-blot - detekcja kilku transkrytpów, jednak działanie takie wymaga przeprowadzenia przynajmniej kilku cykli reakcji. Metoda około 10- krotnie mniej swoista od RPA.

42 Metody wykrywania cytokin 2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny Metoda wewnątrzkomórkowego barwienia szybka analiza dużej liczby komórek zastosowanie kilku różnych fluorochromów jednocześnie można ocenić koprodukcję kilku cytokin w obrębie pojedynczej komórki FACS (Fluorescence Activating Cell Sorting) analiza pojedynczej komórki (kilka parametrów jednocześnie) dodatkowo umożliwia sortowanie

43 Barwienie wewnątrzkomórkowe cytokin. Eliza Turlej. Współczesne metody detekcji cytokin real time PCR, ELISPOT oraz technika wewnątrzkomórkowego barwienia cytokin. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2009; 63:

44 Metody wykrywania cytokin 2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny Parametry od których zależy prawidłowe znakowanie cytokin metodą cytometru przepływowego: Rodzaj komórek i sposób ich aktywacji (wybór odpowiedniego stymulatora) Czas w jakim prowadzi się hodowlę komórek po ich aktywacji (cytokiny nie są produkowane konstytutywanie) Blokowanie transportu białek w komórkach (wybór inhibitora transportu białek) Wybór przeciwciała przeciw badanej cytokinie

45 Metody wykrywania cytokin 2. Wewnątrzkomórkowe cytokiny PRZYKŁADY ZASTOSOWANIA BADANIA WEWNĄTRZKOMÓRKOWYCH CYTOKIN W KLINICE Wykrywanie wewnątrzkomórkowych cytokin w zakażeniach bakteryjnych, wirusowych i pasożytniczych. Ekspresja wewnątrzkomórkowych cytokin w chorobach nowotworowych, autoimmunizacyjnych, alergicznych i niedoborach odporności. Analiza ekspresji cytokin w chorobach o podłożu neurologicznym oraz w badaniach oddziaływania hormonów na funkcjonowanie układu immunologicznego. Badanie udziału cytokin w procesie starzenia, w przebiegu ciąży i patologii ciąży. Zaburzenie funkcjonowania sieci cytokinowej przez czynniki zanieczyszczające środowisko.

46 Metody wykrywania cytokin 3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki ELISA - ELISA bezpośrednia - ELISA pośrednia - Sandwich ELISA - ELISA kompetycyjna ELISPOT RIA test radioimmunologiczny

47 Metody wykrywania cytokin 3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) test immunoenzymatyczny oparty o fazę stałą, oznaczanie przeciwciał lub antygenów (hormony, enzymy, cytokiny, antygeny bakteryjne, leki), z wykorzystaniem odczynników znakowanych enzymami, test ilościowy, metoda czuła, prosta, duża ilość oznaczeń w krótkim czasie, jeden z najpowszechniej stosowanych testów w badaniach biomedycznych (naukowych i diagnostycznych).

48 ELISA Antygen związany w fazą stałą Przeciwciało skoniugowane z enzymem

49 ELISA

50 ELISA odczyt wyników Spektrofotometr pomiar absorbancji światła o określonej długości fali

51 Metody wykrywania cytokin Produkcja cytokin na zewnątrz komórki Sandwich ELISA test podwójnego wiązania Przeciwciało wychwytujące i detekcyjne Zwiększona czułość i specyficzność testu Ogranicza wpływ możliwych reakcji krzyżowych z antygenami o podobnej strukturze

52 Sandwich ELISA 5I_Q7YNBfvjreWwGzLo27RLLIkQ=&h=236&w=630&sz=52&hl=pl&start=3&zoom=1&tbnid=52k8gfYZ8ZDdYM:&tbnh=51&tbnw=137&ei=PmSSTeSLA8eg8QOvuPzpAw&prev=/images%3Fq%3Ds andwich%2belisa%26hl%3dpl%26client%3dfirefox-a%26hs%3ddp3%26sa%3dx%26rls%3dorg.mozilla:pl:official%26tbs%3disch:1%26prmd%3divnsb&itbs=1 (1) Płytka jest pokrywana przeciwciałami specyficznymi; (2) Dodawana jest próbka, i jeśli jest obecny antygen, wiąże się on do specyficznych przeciwciał; (3) Dodanie przeciwciała wykrywającego; (4) oraz drugorzędowego przeciwciała wyznakowanego enzymem i wiążącego przeciwciała wykrywające; (5) Dodanie substratu, który jest przekształcany do wykrywalnej formy przez enzym na przeciwciałach drugorzędowych.

53 Metody wykrywania cytokin 3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki ELISPOT (ENZYME-LINKED IMMUNOSPOT ASSAY) Zmodyfikowana ELISA Połączenie techniki immunoenzymatycznej fazy stałej z krótkoterminową hodowlą komórkową trwającą od kilku godzin do kilku dni. Wysoka czułość Można wykryć pojedynczą komórkę wydzielającą dane białko (cytokinę, białko efektorowe, receptor, marker powierzchniowy, przeciwciało) wśród komórek w hodowli.

54 ELISPOT a) Płytka opłaszczona przeciwciałem wiążącym (swoiste dla danej cytokiny). b) Związanie wydzielanej cytokiny z przeciwciałem c) Płukanie d) Dodanie znakowanego biotyną przeciwciała wtórnego e) Dodanie enzymu sprzężonego ze straptawidyną

55 ELISPOT f) Dodanie substratu: w obecności enzymu przekształca się w barwnik g) Zatrzymanie reakcji h) W miejscu reakcji immunoenzymatycznej powstaje plamka barwna i) Liczenie plamek skaner z systemem analizy obrazu

56 Metody wykrywania cytokin 3. Produkcja cytokin na zewnątrz komórki ELISPOT zastosowania w praktyce klinicznej analiza limfocytów T swoistych dla antygenów związanych z komórkami czerniaka w badaniach nad limfocytami T swoistymi dla cytomegalowirusa u pacjentów, u których wykazano reaktywację tego wirusa, detekcja limfocytów B swoistych idiotypowo u osób cierpiących na szpiczaka mnogiego, oznaczanie poziomu INF-γ u osób chorujących na gruźlicę stosowana do monitorowania odpowiedzi immunologicznej u pacjentów - cierpiących na nowotwory, - poddawanych immunoterapii, - podczas infekcji i chorób autoimmunologicznych, monitorowania skuteczności szczepionek przeciwko HIV, wirusowemu zapaleniu wątroby, cholerze, półpaścowi, grypie i malarii niezastąpiona metoda w immunologii onkologicznej, diagnostyce reumatologicznej i diabetologii zastosowanie w alergologii

57 Metody wykrywania cytokin Produkcja cytokin na zewnątrz komórki RIA (Radioimmunoassay) - test radioimmunologiczny Odmiana ELISA Przeciwciała monoklonalne wyznakowane izotopami (np. Cr, I, P, C) Analiza za pomocą licznika promieniowania

58 RIA test radioimmunologiczny Oznaczenia ilościowe hormonów, antygenów nowotworowych, przeciwciał, niektórych leków, witamin Wysoka czułość i specyficzność znaczniki radioizotopowe: 125 I (składniki białkowe), 131 I, 14 C, 3 H (związki drobnocząsteczkowe) Podczas przeprowadzania testu jeden ze składników reakcji jest związany z fazą stałą (nośnikiem), a drugi składnik znajduje się w fazie płynnej, albo oba składniki reakcji (antygen i przeciwciało) znajdują się w fazie płynnej. Metody RIA zostały stworzone przez Rosalyn Sussman Yalow i Solomona Bersona. W 1977 r. Yalow otrzymała za swoje odkrycie Nagrodę Nobla.

59 RIA test radioimmunologiczny 1. Inkubacja wyznakowanego antygenu z surowicą zawierającą przeciwciała. 2. Dodanie niewyznakowanego antygenu (jako standard lub jako próbkę). 3. Wyznakowany i niewyznakowany antygen konkurują o wiązanie się z przeciwciałami. Im więcej nieznakowanego antygenu, tym mniej znakowanego antygenu ma szansę związać się z przeciwciałami. 4. Rozdzielenie niezwiązanego antygenu od kompleksów antygenprzeciwciało i 5. Pomiar radioaktywność wybranej frakcji.

60 Cytokiny w homogenatach tkankowych, płynach surowiczych, supernatantach zebranych znad hodowli Western blot Testy immunologiczne techniki badawcze wykorzystujące przeciwciała monoklonalne Testy biologiczne linie komórkowe będące bioindykatorami obecności cytokin (cytokiny wywołują w nich określony efekt)

61 Testy biologiczne testy proliferacyjne i antyproliferacyjne mierzą wzrost/spadek liczby komórek testy cytotoksyczne gł. w odniesieniu do TNF właściwości przeciwwirusowe- gł. interferony, inhibicja replikacji wirusowej indukcja ekspresji molekuł powierzchniowych właściwości chemotaktyczne inhibicja sekrecji cytokin

62