FITOESTROGENY. II. WEWN TRZKOMÓRKOWY MECHANIZM DZIA ANIA W UK ADZIE ROZRODCZYM SAMICY*

Transkrypt

1 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 207 POSTÊPY BIOLOGII KOMÓRKI TOM NR 1 ( ) FITOESTROGENY. II. WEWN TRZKOMÓRKOWY MECHANIZM DZIA ANIA W UK ADZIE ROZRODCZYM SAMICY* PHYTOESTROGENS. II. MOLECULAR MECHANISM OF ACTION IN FEMALE REPRODUCTIVE TRACT Anna NYNCA 1, Olga KRASZEWSKA 1, Maria S OMCZYÑSKA 2, Renata CIERESZKO 1 1 Katedra Fizjologii Zwierz¹t, Uniwersytet Warmiñsko-Mazurski, Olsztyn; 2 Pracownia Endokrynologii i Hodowli Tkanek Zak³adu Fizjologii Zwierz¹t, Instytut Zoologii, Uniwersytet Jagielloñski, Kraków Streszczenie: Fitoestrogeny to wystêpuj¹ce w wielu roœlinach zwi¹zki chemiczne, które m.in. mog¹ wp³ywaæ na procesy rozrodcze ludzi i zwierz¹t. W komórkach docelowych mog¹ naœladowaæ dzia³anie estrogenów endogennych (dzia³anie estrogenne), jak równie dzia³aæ w stosunku do nich antagonistycznie (dzia³anie antyestrogenne). W prezentowanej pracy przedstawiono wspó³czesne pogl¹dy na wewn¹trzkomórkowy mechanizm dzia³ania fitoestrogenów w komórkach jajnika, macicy i gruczo³u mlekowego. S³owa kluczowe: fitoestrogeny, genisteina, daidzeina, wewn¹trzkomórkowa transdukcja sygna³u, receptory estrogenowe, dzia³anie estrogenne, dzia³anie antyestrogenne, samica. Summary: Phytoestrogens are plant-derived chemical compounds which may affect reproductive processes in humans and animals. In their target cells, phytoestrogens may mimic (estrogenic effects) or antagonize (antiestrogenic effects) action of endogenous estrogens. In the current paper, contemporary views are presented on intracellular mechanism of phytoestrogen action in ovarian, uterine, and mammary gland cells. Key words: phytoestrogens, genistein, daidzein, signal transduction, estrogen receptors, estrogenic effect, antiestrogenic effect, female. *Praca by³a finansowana przez granty: PBZ-KBN-084/P06/2002 i UWM oraz ze œrodków Europejskiego Funduszu Spo³ecznego w ramach ZPORR (dla AN).

2 208 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO WPROWADZENIE Fitoestrogeny to substancje pochodzenia roœlinnego, strukturalnie przypominaj¹ce estrogeny hormony wytwarzane przez steroidogenne komórki organizmów zwierzêcych (estrogeny endogenne). Zawarte w diecie ludzi i zwierz¹t fitoestrogeny oddzia³uj¹ na ró ne komórki i narz¹dy, w tym te docelowe (jajnik, macica) dla estrogenów endogennych (17β-estradiol, estron). W komórkach docelowych, fitoestrogeny mog¹ naœladowaæ dzia³anie estrogenów endogennych (dzia³anie estrogenne), jak równie dzia³aæ w stosunku do nich antagonistycznie (dzia³anie antyestrogenne). Wyniki badañ z ostatnich kilku lat wskazuj¹, e fitoestrogeny wp³ywaj¹ na komórkow¹ ekspresjê receptorów estrogenowych (ER). Aktywacja ER, z kolei, mo e prowadziæ do ekspresji genów zale nych od estrogenów. Wewn¹trzkomórkowy mechanizm dzia³ania fitoestrogenów, poza oddzia- ³ywaniem z ER, mo e obejmowaæ wp³yw na aktywnoœæ enzymów odpowiedzialnych za syntezê i metabolizm samych estrogenów [15]. Fitoestrogeny oddzia³uj¹ tak e na funkcje niektórych komórek za poœrednictwem mechanizmów niezwi¹zanych z estrogenami; mog¹ na przyk³ad modulowaæ aktywnoœæ bia³ek zaanga owanych w wewn¹trzkomórkowe przekaÿnictwo sygna³u [27] lub wp³ywaæ na ekspresjê ró nych estrogenoniezale nych genów [36]. WEWN TRZKOMÓRKOWY MECHANIZM DZIA ANIA ESTROGENÓW Estrogeny wp³ywaj¹ na prawid³owy wzrost, rozwój i funkcje szeregu struktur uk³adu rozrodczego, takich jak: jajniki, macica i pochwa [60]. Swoje efekty biologiczne indukuj¹ w komórkach docelowych zarówno za pomoc¹ mechanizmów genomowych, jak i niegenomowych (ryc. 1). Genomowe dzia³anie estrogenów i receptory estrogenowe Najczêœciej badanym sposobem dzia³ania estrogenów endogennych, a tak e œrodowiskowych jest droga genomowa, obejmuj¹ca aktywacjê swoistych ER (ryc. 1a) [18, 25]. Wyró nia siê dwa podstawowe typy receptorów estrogenowych: ERα i ERβ, które s¹ kodowane przez dwa odrêbne geny zlokalizowane na ró nych chromosomach [40]. Nale ¹ one do rodziny receptorów wewn¹trzkomórkowych i pe³ni¹ funkcjê czynników transkrypcyjnych. Zbudowane s¹ z szeœciu domen oznaczonych literami od A do F (ryc. 2). Domeny A i B, zlokalizowane na koñcu aminowym bia³ka, odpowiadaj¹ za aktywacjê transkrypcji niezale n¹ od liganda. Domena C jest zaanga owana w dimeryzacjê receptora oraz w przy³¹czanie kompleksu ligand-receptor do specyficznej sekwencji DNA. Domena ta, we wszystkich typach receptorów wewn¹trzkomórkowych, ma budowê tzw. palców cynkowych. W zjawisku dimeryzacji receptora bierze tak e udzia³ domena E, a jej fragment po³o ony na koñcu karboksylowym jest odpowiedzialny za aktywacjê transkrypcji zale n¹ od przy³¹czenia liganda [74]. Domena E zawiera

3 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 209 RYCINA 1. Wewn¹trzkomórkowy mechanizm dzia³ania estrogenów: a klasyczna droga genomowa ERE-zale na; b droga genomowa ERE-niezale na, c droga niegenomowa, d droga niegenomowogenomowa, ER receptor estrogenowy, E estradiol, TF czynnik transkrypcyjny, P reszta 2 fosforanowa (zmodyfikowany wg [3] za zgod¹ The Endocrine Society) strukturê hydrofobowej kieszeni przy³¹czaj¹cej specyficzny ligand. Najwiêksz¹ homologiê receptory wykazuj¹ w obrêbie domeny C [32]. Do naturalnych ligandów ER zaliczamy endogenne estrogeny (np. 17β-estradiol, estron) oraz fitoestrogeny (np. genisteina, daidzeina). Po przy³¹czeniu siê liganda, receptor jest uwalniany z nieaktywnego kompleksu z bia³kami opiekuñczymi (hsp 90, 70 i 56), a w obrêbie domeny E dochodzi do konformacyjnych zmian struktury receptora i powstania specyficznego miejsca wi¹zania dla koaktywatorów j¹drowych [62]. Nastêpnie ER dimeryzuje i wi¹ e siê do specyficznego miejsca na DNA, zwanego miejscem odpowiedzi na estrogeny (ERE, ryc. 1a), stymuluj¹c lub hamuj¹c ekspresjê odpowiednich genów [26, 66]. Z drugiej strony przybywa dowodów na to, e ER indukuj¹ ekspresjê genów niezawieraj¹cych ERE. U podstaw tego zjawiska le y modulacja przez kompleks ligand-er czynników transkrypcyjnych innych ni ER (interakcja bia³ko-bia³ko). Jest to tzw. genomowa, ERE-niezale na droga dzia³ania receptorów estrogenowych (ryc. 1b) [3, 19]. U ludzi, oko³o jedna trzecia genów, które s¹ regulowane przez ER nie zawiera w swoim promotorze sekwencji ERE [55]. Niegenomowe dzia³anie estrogenów Niektóre efekty wywo³ywane przez estrogeny zachodz¹ zbyt szybko, by mog³y zale eæ od transkrypcji i translacji [3]. Te szybkie odpowiedzi biologiczne s¹ indukowane drog¹ tzw. mechanizmów niegenomowych (ryc. 1c). Nale ¹ tu m.in.: wp³yw na

4 210 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO RYCINA 2. Struktura receptorów estrogenowych α i β (ERα i β). ERα zbudowany jest z 595, a ERβ z 485 aminokwasów. W procentach przedstawiono stopieñ podobieñstwa miêdzy homologicznymi domenami obydwu typów ER syntezê i aktywnoœæ cyklicznego AMP [64], aktywacja ró nych kinaz bia³kowych, np. kinaz tyrozynowych i kinaz MAP [44], czy te mobilizacja wewn¹trzkomórkowych jonów wapnia [29]. Niektórzy autorzy sugeruj¹, e niegenomowe dzia³anie estrogenów mo e zachodziæ za pomoc¹ aktywacji tej subpopulacji ER, która jest zlokalizowana w b³onie komórkowej [59, 64]. Obecny stan wiedzy wskazuje, e ka dy z podtypów receptora estrogenowego mo e poœredniczyæ zarówno w niegenomowym, jak i genomowym szlaku odpowiedzi na estrogeny. GENOMOWE DZIA ANIE FITOESTROGENÓW Znaczenie receptorów estrogenowych w mechanizmie dzia³ania fitoestrogenów Stwierdzono, e fitoestrogeny mog¹ wi¹zaæ siê z ER i indukowaæ sygna³ podobny do sygna³u estrogenowego. Mechanizm estrogennego dzia³ania fitoestrogenów mo e wiêc obejmowaæ: a) aktywacjê ER, b) zwiêkszanie si³y wi¹zania kompleksu ER-ligand do ERE i/lub c) ekspresjê genów indukowanych estrogenami. Ponadto, w obecnoœci estrogenów, fitoestrogeny mog¹ konkurowaæ z estrogenami o miejsce wi¹ ¹ce w ER. Efekt antyestrogenny mo e zostaæ wywo³any przez fitoestrogeny wówczas, gdy: a) blokuj¹ w ER miejsce wi¹ ¹ce ligand, b) hamuj¹ wi¹zanie ER do DNA i/lub c) wp³ywaj¹ na ekspresjê ER w sposób antagonistyczny do endogennych estrogenów, uniemo liwiaj¹c tym ostatnim wywo³ywanie specyficznej odpowiedzi biologicznej. Rozmieszczenie receptorów estrogenowych w organizmie zwierzêcym Obecny stan wiedzy wskazuje na to, e estrogenny lub antyestrogenny charakter odpowiedzi indukowanej przez fitoestrogeny zale y m.in. od typu receptora i jego wystêpowania w ró nych tkankach. Dystrybucja obu typów ER w organizmie

5 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 211 zwierzêcym jest zró nicowana [33]. ERα wykryto w macicy, jajniku, gruczole sutkowym, naj¹drzu, j¹drze, sercu, aorcie, w¹trobie, nerce, nadnerczu, przysadce i podwzgórzu. Najwy szy poziom ekspresji ERβ zlokalizowano w jajniku (komórki ziarniste pêcherzyków przedowulacyjnych) i komórkach œródb³onka prostaty, a tak e w wielu innych tkankach, np. oœrodkowym uk³adzie nerwowym, uk³adzie krwionoœnym, odpornoœciowym, moczowo-p³ciowym, pokarmowym i oddechowym [32]. Obie formy receptora wspó³wystêpuj¹ w gruczole sutkowym, macicy, jajniku oraz w naczyniach krwionoœnych, przy czym przewaga jednego z nich zale y zwykle od tkanki i jej stanu fizjologicznego. Powinowactwo fitoestrogenów do receptorów estrogenowych Powinowactwo fitoestrogenów do ER zale y od rodzaju fitoestrogenu, typu receptora oraz gatunku zwierzêcia [52]. Przyk³adem mo e byæ genisteina (4,5,7-trihydroksyizoflawon), która wi¹ e siê do ERb z silnym powinowactwem, ale brak jednej (daidzeina, biochanina A) lub dwóch (formononetyna) grup hydroksylowych prowadzi do mniejszej lub wiêkszej utraty zdolnoœci wi¹zania. Wykazano, e fitoestrogeny ³atwiej wi¹ ¹ siê do receptorów ERb ni do ERa, jak równie silniej, w porównaniu z ERa, aktywuj¹ wi¹zanie ERb do ERE [37]. Istnieje kilka powszechnie stosowanych metod umo liwiaj¹cych badanie aktywnoœci estrogennej fitoestrogenów. Oceniana jest w nich zdolnoœæ fitoestrogenów do wi¹zania siê z ER (ang. ligand binding) oraz si³a wi¹zania kompleksu ligand-er do miejsca ERE (ang. ER-binding to ERE). Ponadto, aby oceniæ estrogenn¹ lub antyestrogenn¹ aktywnoœæ fitoestrogenów czêsto stosuje siê wyposa one w gen reporterowy (zawieraj¹cy ERE) komórki transfekowane cdna dla ERa lub ERb [67, 70]. Gen reporterowy charakteryzuje siê nastêpuj¹co: 1) nie wystêpuje w badanych komórkach w warunkach naturalnych, 2) ekspresjê tego genu ³atwo jest zmierzyæ (np. gen lucyferazy lub zielonego bia³ka fluorescencyjnego), 3) zawiera w swojej sekwencji ERE. Transfekowane komórki traktuje siê fitoestrogenami, których aktywnoœæ wyra a siê, w zale noœci od rodzaju genu reporterowego, np. intensywnoœci¹ œwiecenia komórki. Badania aktywnoœci fitoestrogenów, przeprowadzane na modelach komórkowych, pozwalaj¹ na przybli on¹ ocenê mo liwoœci oddzia³ywania tych roœlinnych estrogenów na organizmy zwierzêce in vivo. Zdolnoœæ wi¹zania fitoestrogenów i 17β-estradiolu (E 2 ) do ERα przedstawia siê nastêpuj¹co: E 2 >>> kumestrol > genisteina > daidzeina > biochanina A > formononetyna, natomiast w przypadku ERβ: E 2 >> genisteina = kumestrol > daidzeina > biochanina A > formononetyna. Porównanie powinowactwa fitoestrogenów i E 2 do ER wskazuje na znacznie mniejsz¹ aktywnoœæ biologiczn¹ fitoestrogenów. Z drugiej strony, iloœci spo ywanych przez ludzi i zwierzêta fitoestrogenów mog¹ kompensowaæ tê ró nicê. Wiadomo równie, e fitoestrogeny w koncentracji zaledwie 1 10 nm stymuluj¹ aktywnoœæ transkrypcyjn¹ obydwu typów ER [40]. Ponadto, wy sze dawki fitoestrogenów (100 nm) mog¹ wywo³ywaæ odpowiedÿ komórkow¹ porównywaln¹ do odpowiedzi indukowanej przez hormony endogenne [2].

6 212 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO Wp³yw fitoestrogenów na receptory estrogenowe Estrogenne dzia³anie fitoestrogenów. Znaczenie ER w transdukcji sygna³u indukowanego przez fitoestrogeny podkreœlaj¹ liczne badania przeprowadzone na komórkach uk³adu rozrodczego ró nych gatunków zwierz¹t oraz liniach komórkowych raka gruczo³u mlekowego. Wydaje siê, e aktywacja ER jest dominuj¹cym mechanizmem wywo³ywanym przez fitoestrogeny (podobnie jak estrogeny) w komórkach docelowych. Badania na izolowanych bydlêcych komórkach endometrium i cia³ka ó³tego wykaza³y, e fitoestrogeny stymuluj¹ syntezê prostaglandyn przez te komórki oraz e wp³yw ten zachodzi tylko poprzez aktywacjê ER [81, 82]. Fitoestrogeny mog¹ naœladowaæ dzia³anie estrogenów poprzez wp³yw na ekspresjê zarówno mrna, jak i bia³ka receptorowego ERα i ERβ. Podawanie estrogenów lub fitoestrogenów (genisteina, daidzeina) szczurzycom obni a³o poziom mrna receptorów estrogenowych α i β w macicy tych zwierz¹t [9, 12, 14]. Przeciwnie, w komórkach ziarnistych jajnika myszy, genisteina stymulowa³a ekspresjê ERα oraz ERβ [30], dzia³aj¹c jednak tak e w sposób podobny do estrogenów [84]. Zatem, estrogenny charakter fitoestrogenów przejawiaæ siê mo e zarówno poprzez obni anie (macica), jak i stymulacjê (jajnik) ekspresji mrna dla ERα i ERβ, a efekt tego oddzia³ywania zale y od rodzaju tkanki. W doœwiadczeniach in vivo istotn¹ rolê wydaje siê odgrywaæ sposób podawania fitoestrogenów. Genisteina podawana podskórnie wywo³ywa³a spadek iloœci bia³ka ERα w tkankach macicy szczurów [8, 9]. Przeciwnie, genisteina dostarczana zwierzêtom w paszy nie mia³a wp³ywu na ekspresjê bia³ek ERα i ERβ [8, 9, 12, 28]. Wyniki te sugeruj¹, e efekty biologiczne wywo³ywane przez fitoestrogeny spo ywane przez zwierzêta wraz z pokarmem s¹ mniej wyraÿne od efektów powodowanych przez fitoestrogeny podawane w formie iniekcji. Estrogenny efekt dzia³ania fitoestrogenów obserwowano tak e w licznych badaniach in vitro przeprowadzanych na liniach komórkowych ludzkich komórek nowotworowych. Genisteina dodana do hodowli komórek raka gruczo³u mlekowego powodowa³a spadek poziomu mrna i bia³ka dla ERα [13, 47, 68, 75], naœladuj¹c dzia³anie estradiolu. Podobne do estradiolu dzia³anie genisteiny zaobserwowano tak e w odniesieniu do ekspresji ERβ, gdzie poziom mrna dla ERβ wzrasta³ po dodaniu do hodowli zarówno E 2, jak i genisteiny [5]. Analiza wp³ywu genisteiny i biochaniny A oraz E 2 na ekspresjê bia³ka ERβ w izolowanych komórkach ziarnistych jajnika œwini tak e wykaza³a wzrost poziomu tego bia³ka zarówno po dodaniu do hodowli E 2, jak i badanych fitoestrogenów [53]. Ponadto, w doœwiadczeniu wykonanym na osteoblastach œwini zarówno E 2, jak i daidzeina dzia³a³y w ten sam sposób, podnosz¹c poziom ekspresji bia³ka ERβ [11]. Analogiczne do estradiolu dzia³anie fitoestrogenów w licznych tkankach uk³adu rozrodczego oraz w komórkach nowotworowych uzasadnia celowoœæ badañ, jakie podejmuj¹ naukowcy, aby poznaæ mechanizm dzia³ania tych zwi¹zków, szczególnie jeœli chodzi o potencjalne anty- lub pronowotworowe w³aœciwoœci fitoestrogenów. Antyestrogenne dzia³anie fitoestrogenów. Estrogeny œrodowiskowe mog¹ dzia³aæ przeciwstawnie do estrogenów endogennych. Istniej¹ doniesienia, e fitoestrogeny

7 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 213 (genisteina, kumestrol, ekwol, daidzeina) hamuj¹ specyficzne wi¹zanie E 2 do ER w macicy i gruczole mlekowym ludzi oraz w macicy szczurów [2]. Antyestrogenne dzia³anie estrogenów œrodowiskowych polegaæ mo e na modulowaniu ekspresji receptorów estrogenowych w komórkach docelowych. Dzia³anie to widaæ szczególnie wyraÿnie w strukturach mózgowych zwi¹zanych z osi¹ podwzgórze przysadka gonady. Podawanie szczurzycom po ywienia bogatego w fitoestrogeny powodowa³o podwy szenie poziomu mrna dla ERβ w podwzgórzu, bez wzglêdu na to, czy w diecie by³a mieszanka fitoestrogenów [56, 80] czy dominowa³a genisteina [57] lub kumestrol [58, 80]. W tych samych uk³adach doœwiadczalnych E 2 powodowa³ efekt przeciwny obni a³ poziom mrna dla ERβ. Wzrost iloœci bia³ka ERα zaobserwo-wano równie w komórkach przysadki owiec, którym genisteinê podano do trzeciej komory mózgu [63]. Jednak w tym doœwiadczeniu, podobnie jak w ni ej cytowanym eksperymencie, nie badano wp³ywu estradiolu. Przeciwnie do szczurów i owiec, w podwzgórzu u œwini daidzeina hamowa³a ekspresjê mrna dla ERβ [65]. Fitoestrogeny mog¹ zaburzaæ funkcjonowanie organizmu ludzi i zwierz¹t dzia³aj¹c przeciwstawnie do estrogenów endogennych i zmieniaj¹c odpowiedzi wywo³ywane przez te hormony. Od czego zale y wp³yw fitoestrogenów na ekspresjê receptorów estrogenowych? Opisane powy ej dzia³ania fitoestrogenów wydaj¹ siê zale eæ przede wszystkim od gatunku zwierzêcia, badanej tkanki, typu ER oraz sposobu podania fitoestrogenów. Poza tym, czynnikiem wp³ywaj¹cym na ekspresjê ER jest równie stê enie stosowanych fitoestrogenów [30, 54], które mo e tak e decydowaæ o estrogennym lub antyestrogennym dzia³aniu badanego zwi¹zku. Genisteina podawana podskórnie kilkudniowym myszom, w dawce 1 µg na dobê podwy sza³a, a w dawce 100 µg obni a³a poziom mrna i bia³ka receptorowego ERα i ERβ w jajnikach [30]. Podobnie, niskie stê enia genisteiny stymulowa³y ekspresjê mrna dla ERα w ludzkich komórkach endometrium in vitro, a wysokie ekspresjê tê obni a³y [83]. Genisteina nie wykazywa³a jednak dwufazowej aktywnoœci w badaniach na komórkach ludzkiej linii komórek raka piersi (MCF-7), gdy podawana do medium hodowlanego zarówno w ni szej (10 µm), jak i wy szej (100 µm) koncentracji zmniejsza³a poziom bia³ka ERα [47]. Byæ mo e, w tym przypadku, nie badano dawki genisteiny dostatecznie niskiej dla tego uk³adu doœwiadczalnego. Dyskutowane zwi¹zki miêdzy fitoestrogenami obecnymi w diecie a chorobami nowotworowymi czy naczyniowymi [39] uzasadniaj¹ potrzebê podejmowania badañ dotycz¹cych zale nego od dawki wp³ywu fitoestrogenów na komórki docelowe. Wra liwoœæ komórek uk³adu rozrodczego na dzia³anie fitoestrogenów wydaje siê tak e zale eæ od czasu ekspozycji na te zwi¹zki oraz od œrodowiska hormonalnego, w jakim badane komórki siê znajduj¹. W komórkach macicy szczurów iniekcje genisteiny wywo³ywa³y zró nicowane efekty w zale noœci od czasu ekspozycji oraz od tego, który typ ER badano i czy czynnikiem badanym by³ poziom mrna czy bia³ka ER. Zaobserwowano znaczne obni enie poziomu mrna dla ERβ po 7 godzinach od iniekcji, natomiast po jednej lub trzech dobach efekt ten nie by³ ju tak widoczny [12]. W tym samym doœwiadczeniu, genisteina hamowa³a tak e ekspresjê mrna dla ERα, jednak efekt ten nie zmienia³ siê w czasie. Natomiast badania Lee i wsp. [42], w których analizowano ekspresjê bia³ka receptorowego

8 214 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO ERα i ERβ w macicy szczurzyc, wykaza³y wzrost poziomu ERα po 3 i 6 godzinach po iniekcji genisteiny, podczas gdy po 12 i 24 godzinach iloœæ ERα nie ró ni³a siê od grupy kontrolnej. Nie zaobserwowano natomiast zmian w poziomie bia³ka ERβ bez wzglêdu na czas, jaki up³yn¹³ od iniekcji genisteiny [42]. Ciekawe jest, e wiêkszoœæ badañ dotycz¹cych wp³ywu genisteiny na ekspresjê ERα w komórkach MCF-7 wykazuje brak wp³ywu czasu ekspozycji na fitoestrogen. Zarówno krótsze (24 godz.), jak i d³ugotrwa³e (6 dni) traktowanie komórek genistein¹ hamowa³o ekspresjê mrna ERα [47, 68, 75]. Czas ekspozycji komórek na fitoestrogeny mo e byæ czynnikiem, od którego zale y wp³yw tych zwi¹zków m.in. na ekspresjê ER. Wydaje siê jednak, e zarówno typ receptora, jak i rodzaj tkanki odgrywa wa niejsz¹ ni czas rolê w tych oddzia³ywaniach. Wp³yw fitoestrogenów na si³ê wi¹zania aktywnych ER do ERE/transaktywacjê ER Fitoestrogeny, oprócz wp³ywu na ekspresjê ER, mog¹ zaburzaæ funkcjonowanie ER-pozytywnych komórek poprzez modulowanie si³y wi¹zania ERα i/lub ERβ do specyficznego miejsca na DNA. Najczêœciej zwi¹zki te dzia³aj¹ jak agoniœci ER, wspó³zawodnicz¹c z endogennymi estrogenami w stymulowaniu wi¹zania ER do ERE. Kumestrol, ekwol, genisteina i daidzeina indukowa³y wi¹zanie ERα i ERβ do ERE [37]. Podobnie, Harris i wsp. [23] wykazali, e zarówno w obecnoœci, jak i przy braku E 2 genisteina i daidzeina zwiêksza³y si³ê wi¹zania ERβ do ERE w komórkach MCF-7. Badania na transfekowanych komórkach (sztucznie zaopatrzonych w ER i ERE) równie wykaza³y, e fitoestrogeny (genisteina, daidzeina, kumestrol, biochanina A, apigenina), dzia³aj¹c analogicznie do E 2, stymulowa³y transaktywacjê ER [1, 67]. Si³a transaktywacji ER zale a³a od rodzaju stosowanego fitoestrogenu i jego dawki. Przyk³adowo, koncentracja fitoestrogenu niezbêdna do wywo³ania 50% maksymalnej indukcji transaktywacji wynosi³a w przypadku genisteiny 55 nm, daidzeiny 1,2 µm, a biochaniny A 50 µm [1]. Natomiast wy sze stê enia (> 50 µm) niektórych fitoestrogenów (kumestrol, kempferol, kwercetyna) hamowa³y proces wi¹zania receptorów estrogenowych do DNA blokuj¹c efekty biologiczne wywo³ywane przez endogenne estrogeny [23, 37]. Wiêkszoœæ badañ dotycz¹cych mechanizmu dzia³ania fitoestrogenów wskazuje na bardzo wa n¹ rolê, jak¹ pe³ni¹ receptory estrogenowe. Wp³yw fitoestrogenów na ekspresjê ER, si³ê wi¹zania aktywnych ER do ERE oraz na transaktywacjê ER wydaje siê byæ kluczowym mechanizmem oddzia³ywania tych zwi¹zków w komórkach uk³adu rozrodczego samicy. Znaczenie innych receptorów w mechanizmie dzia³ania fitoestrogenów Mechanizm dzia³ania fitoestrogenów mo e równie obejmowaæ aktywacjê receptorów wewn¹trzkomórkowych innych ni ER. Niestety niewiele jest publikacji poœwiêconych temu problemowi u samic. Dlatego te w tym rozdziale uwzglêdnimy równie informacje uzyskane w doœwiadczeniach przeprowadzonych na samcach i liniach komórkowych. Podanie szczurom genisteiny w po ywieniu powodowa³o indukcjê ekspresji mrna dla receptora progesteronowego (PR) oraz spadek poziomu

9 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 215 bia³ka PR w macicy [12]. Natomiast, iniekcje genisteiny nie wp³ywa³y na poziom mrna dla PR, ale powodowa³y wzrost bia³ka PR w macicy szczurzyc [9]. U samców szczura, spo ywanie genisteiny wywo³ywa³o spadek ekspresji zarówno mrna, jak i bia³ka dla receptora androgenowego (AR) w prostacie [17, 45]. Podobnie w j¹drach u myszy zaobserwowano spadek poziomu mrna dla AR po podaniu genisteiny [73]. W badaniach na transfekowanych komórkach Hepa-1 (mysia linia komórkowa komórek raka w¹troby) wykazano, e fitoestrogeny mog¹ równie aktywowaæ receptor wêglowodorów aromatycznych (AhR), który uwa any jest powszechnie za receptor dioksyn [72, 85]. Inni autorzy wykazali, e biochanina A indukowa³a zdolnoœæ wi¹zania siê AhR do odpowiedniego miejsca na DNA w komórkach MCF-7 [22]. Ponadto, zaobserwowano aktywacjê receptorów aktywowanych proliferatorami peroksysomów (PPAR) przez daidzeinê, biochaninê A i formononetynê w ludzkich komórkach nowotworu macicy HeLa [71]. Mo liwoœæ oddzia³ywania fitoestrogenów poprzez kilka ró nych receptorów czyni mechanizm ich dzia³ania bardziej z³o onym. Mog¹ one zaburzaæ funkcjonowanie komórek, które maj¹ receptory inne ni estrogenowe i uruchamiaæ szlaki wewn¹trzkomórkowej transdukcji sygna³u niezwi¹zane z ER. NIEGENOMOWE DZIA ANIE FITOESTROGENÓW Wiele efektów, które fitoestrogeny wywo³uj¹ w komórkach uk³adu rozrodczego samicy, zachodzi zbyt szybko, by mog³y one byæ zwi¹zane z ekspresj¹ specyficznych genów i biosyntez¹ bia³ek. To niegenomowe dzia³anie fitoestrogenów mo e obejmowaæ wiele ró nych procesów wewn¹trzkomórkowych dotycz¹cych m.in. cyklu komórkowego i proliferacji komórek, biosyntezy i metabolizmu hormonów steroidowych i kwasów t³uszczowych czy wewn¹trzkomórkowych szlaków transdukcji sygna³u. Wp³yw fitoestrogenów na aktywnoœæ enzymów steroidogenezy oraz enzymów metabolizuj¹cych estrogeny Fitoestrogeny mog¹ wp³ywaæ na dostêpnoœæ estrogenów endogennych poprzez wp³yw na enzymy bior¹ce udzia³ w syntezie, a tak e metabolizmie estrogenów. Badania na ludzkich luteinizuj¹cych komórkach ziarnistych wykaza³y, e genisteina, daidzeina i biochanina A hamuj¹ aktywnoœæ dehydrogenazy 3β-hydroksysteroidowej (3β-HSD) oraz dehydrogenazy 17β-hydroksysteroidowej (17β-HSD) enzymów odpowiedzialnych za przekszta³canie odpowiednio pregnenolonu w progesteron (P 4 ) i estronu w E 2 [41, 79]. Fitoestrogeny wi¹za³y siê do tych enzymów, redukuj¹c ich dostêpnoœæ i skutecznoœæ w przekszta³caniu prekursorów steroidowych [10, 41, 78]. Ponadto, stwierdzono, e mikromolowe dawki genisteiny, biochaniny A, daidzeiny i apigeniny obni a³y aktywnoœæ aromatazy (enzym konwertuj¹cy testosteron do E 2 ) w ludzkich luteinizuj¹cych komórkach ziarnistych [41]. Z drugiej strony, dodanie genisteiny do hodowli ludzkich komórek endometrium powodowa³o wzrost poziomu bia³ka aromatazy, a tak e aktywnoœci tego enzymu [16].

10 216 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO Wykazano, e genisteina zmniejsza produkcjê E 2 i estronu poprzez inhibicjê aktywnoœci 17β-HSD i aromatazy w komórkach nowotworowych MCF-7, przyczyniaj¹c siê w ten sposób do hamowania proliferacji tych komórek [4]. W komórkach raka prostaty genisteina hamowa³a aktywnoœæ 5α-reduktazy, co mo e byæ jednym z czynników obni aj¹cych ryzyko wyst¹pienia tej choroby [20]. W przeciwieñstwie do efektów powodowanych przez fitoestrogeny w badaniach in vitro, fitoestrogeny obecne w diecie nie wp³ywa³y na aktywnoœæ enzymów szlaku steroidogenezy [43, 76]. Ponadto, fitoestrogeny mog¹ hamowaæ aktywnoœæ enzymów odpowiedzialnych za przekszta³canie aktywnych biologicznie estrogenów w nieaktywne formy, np. siarczany. Genisteina i metabolit daidzeiny ekwol hamowa³y estrogenow¹ sulfotransferazê w preparatach cytozolowych pochodz¹cych z ludzkiej w¹troby [24]. Podobnie Kirk i wsp. [35] wykazali w p³ytkach krwi u ludzi hamuj¹cy wp³yw flawonoidów (m.in. genisteiny, daidzeiny, apigeniny) na aktywnoœæ sulfotransferazy. Interesuj¹ce, e dawki flawonoidów zdolne do obni ania aktywnoœci sulfotransferaz s¹ porównywalne ze stê eniami obecnymi we krwi osobników spo ywaj¹cych dietê bogat¹ w fitoestrogeny. Wydaje siê, e wp³yw fitoestrogenów na dostêpnoœæ estrogenów w komórce poprzez modulowanie steroidogenezy oraz metabolizmu estrogenów mo e byæ istotnym czynnikiem reguluj¹cym ró ne procesy komórkowe. Wp³yw fitoestrogenów na bia³ka wi¹ ¹ce hormony p³ciowe Wiêkszoœæ estrogenów kr¹ ¹cych we krwi zwi¹zanych jest z bia³kami wi¹ ¹cymi SBP (ang. sex steroid binding protein). Wykazano, e genisteina stymuluje syntezê SBP w hodowlach ludzkich hepatocytów [2]. Takie dzia³anie fitoestrogenów mo e redukowaæ poziom wolnych (niezwi¹zanych) estrogenów we krwi, co zmniejsza ich dostêpnoœæ dla komórek [66]. Z drugiej strony, fitoestrogeny mog¹ hamowaæ wi¹zanie hormonów steroidowych do SBP [50]. Jury i wsp. [31] wykazali, e estrogeny œrodowiskowe konkuruj¹ z endogennymi steroidami o miejsca wi¹ ¹ce w SBP i w przypadku du ej iloœci fitoestrogenów we krwi mog¹ one wypieraæ z tego wi¹zania estrogeny endogenne. Fitoestrogeny poprzez wp³yw na syntezê SBP i si³ê wi¹zania estrogenów do SBP mog¹ regulowaæ poziom wolnych estrogenów, czyni¹c je z jednej strony dostêpnymi dla komórek docelowych, a z drugiej bardziej podatnymi na przemiany metaboliczne. Wp³yw fitoestrogenów na wewn¹trzkomórkowe enzymy i przekaÿniki transdukcji sygna³ów Genisteina jest uwa ana za inhibitor kinaz tyrozynowych (PTK), enzymów pe³ni¹cych wa n¹ rolê w transdukcji sygna³ów komórkowych i regulacji cyklu komórkowego [6]. Jako inhibitor PTK, mo e regulowaæ uwalnianie przez komórki jajnika substancji biologicznie czynnych, wywieraj¹cych stymuluj¹cy efekt na procesy rozrodcze, np. insulinopodobnego czynnika wzrostu (IGF-1), P 4, E 2 i camp [48, 77]. Stwierdzono, e genisteina, poprzez hamowanie aktywnoœci PTK, zwiêksza³a syntezê camp przez komórki ziarniste jajnika ludzi [79], byd³a i królika [48]. Genisteina

11 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 217 wykazywa³a te hamuj¹cy wp³yw na produkcjê P 4 przez luteinizuj¹ce komórki ziarniste szczura [77] oraz P 4 i E 2 przez luteinizuj¹ce komórki ziarniste ludzi [79]. Obni anie aktywnoœci PTK przez genisteinê mo e stanowiæ jeden z mechanizmów hamuj¹cych rozwój nowotworów. Genisteina, obni aj¹c aktywnoœæ tych kinaz, przyczynia siê do spadku iloœci ufosforylowanej tyrozyny w komórce. Sugeruje siê, e procesy fosforylacji tyrozyny s¹ skorelowane z rozwojem raka, gdy oko³o 50% onkogenów koduje receptory maj¹ce aktywnoœæ kinazy tyrozynowej lub inne wewn¹trzkomórkowe bia³ka katalizuj¹ce fosforylacjê tyrozyny [46]. Fitoestrogeny hamuj¹ tak e aktywnoœæ kinazy bia³kowej C [27] oraz kinaz MAP [10]. Niestety, w doœwiadczeniach, w których przedmiotem badañ by³y w³aœciwoœci fitoestrogenów odpowiedzialne za hamowanie aktywnoœci enzymów komórkowych, stosowano tylko wysokie ( µm), niespotykane w warunkach in vivo stê enia fitoestrogenów [61]. Wp³yw fitoestrogenów na stymulatory i inhibitory angiogenezy oraz topoizomerazy Liczne doœwiadczenia z udzia³em fitoestrogenów dotycz¹ zjawiska angiogenezy, towarzysz¹cej np. nowotworzeniu. Tworzenie siê nowych naczyñ krwionoœnych jest uwarunkowane dzia³aniem substancji stymuluj¹cych angiogenezê, tj. naczyniowoœródb³onkowego czynnika wzrostu (VEGF) i metaloproteinaz (MMP). VEGF jest czynnikiem mitogennym dla komórek œródb³onka naczyñ. Metaloproteinazy natomiast degraduj¹ macierz zewn¹trzkomórkow¹, u³atwiaj¹c rozwój nowotworu. Za inhibitory angiogenezy uwa a siê cytokiny (np. interleukina 12 i 18), angiopoetynê oraz tkankowe inhibitory metaloproteinaz (TIMP). Proces tworzenia siê naczyñ krwionoœnych hamuj¹ tak e fitoestrogeny. Dodanie genisteiny do hodowli ró nych typów nowotworowych linii komórkowych spowodowa³o obni enie poziomu mrna dla MMP [38]. Podobnie, genisteina hamowa³a MMP i stymulowa³a ekspresjê TIMP w ludzkich komórkach raka piersi [69]. W tym samym doœwiadczeniu wykazano tak e hamuj¹cy wp³yw genisteiny na angiogenezê in vivo. U myszy z wszczepionymi ludzkimi komórkami nowotworowymi po podaniu genisteiny zauwa ono zmniejszenie poziomu VEGF oraz zahamowanie rozwoju nowych naczyñ krwionoœnych i wzrostu nowotworu. Zjawisko hamowania angiogenezy przez fitoestrogeny mo e w przysz³oœci zostaæ wykorzystane do walki z chorobami nowotworowymi. Obni anie aktywnoœci topoizomeraz typu I i II jest kolejnym przyk³adem potencjalnych, antynowotworowych w³aœciwoœci genisteiny. Topoizomerazy to enzymy odpowiedzialne za katalizowanie reakcji przecinania i ³¹czenia ³añcuchów DNA, bior¹ce czynny udzia³ w licznych procesach komórkowych: replikacji DNA, rekombinacji, transkrypcji. Genisteina, hamuj¹c aktywnoœæ topoizomerazy II, mo e doprowadziæ do zahamowania wzrostu komórkowego, a nawet do apoptozy komórek [7, 49]. Istniej¹ przypuszczenia, e niskie dawki genisteiny mog¹ indukowaæ niewykrywalne uszkodzenia DNA w miejscach koduj¹cych specyficzne geny odpowiedzialne za wzrost komórkowy [61]. Takie dzia³anie fitoestrogenu w tkance rakowej przyczynia³oby siê do obni enia zdolnoœci zmienionej tkanki do niekontrolowanego rozrostu.

12 218 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO Wp³yw fitoestrogenów na procesy antyoksydacyjne Wolne rodniki uwa a siê za jeden z kancerogennych czynników, przyczyniaj¹cych siê do powstawania nowotworów u ludzi i zwierz¹t. Ju w latach siedemdziesi¹tych znana by³a rola genisteiny jako przeciwutleniacza wykorzystywanego w przemyœle spo ywczym [21]. Antyoksydacyjne w³aœciwoœci fitoestrogenów (genisteina, daidzeina, kempferol, kumestrol) stwierdzono zarówno w badaniach in vitro, jak i in vivo [51]. Sugeruje to, e fitoestrogeny mog¹ przyczyniaæ siê do obni ania zachorowalnoœci na raka, ochraniaj¹c komórki przed peroksydacj¹ lipidów oraz moduluj¹c syntezê, uczestnicz¹cych w procesie kancerogenezy, prostaglandyn i leukotrienów [34]. Genisteina mo e tak e obni aæ produkcjê reaktywnych form tlenu przez komórki nowotworowe i komórki uk³adu immunologicznego [61]. W badaniach in vivo u myszy, genisteina podwy sza³a aktywnoœæ enzymów antyoksydacyjnych: katalazy, dysmutazy ponadtlenkowej, peroksydazy glutationowej i reduktazy glutationowej [51]. Antyoksydacyjne w³aœciwoœci fitoestrogenów, podobnie jak ich rola w hamowaniu aktywnoœci topoizomeraz i angiogenezy, wydaj¹ siê stanowiæ wa ne mechanizmy, dziêki którym zwi¹zki te mog¹ zostaæ wykorzystane do walki z chorobami nowotworowymi. PODSUMOWANIE Analizuj¹c mechanizm dzia³ania fitoestrogenów nie mo na automatycznie przek³adaæ wyników eksperymentów prowadzonych w okreœlonych warunkach doœwiadczalnych (gatunek, p³eæ, tkanka, czas i sposób ekspozycji, stê enie i rodzaj fitoestrogenu, typ receptora) na inne warunki. Szczególn¹ ostro noœæ nale y zachowaæ przy porównywaniu wyników uzyskanych w warunkach in vitro z zachodz¹cymi in vivo. Ze wzglêdu na iloœæ i ró norodnoœæ procesów, w regulacjê których zaanga owane s¹ fitoestrogeny oraz ze wzglêdu na istniej¹ce ró nice gatunkowe, osobnicze i tkankowe wiele pytañ dotycz¹cych funkcji i mechanizmu dzia³ania fitoestrogenów pozostaje na razie bez odpowiedzi. Spoœród poznanych dot¹d sposobów wewn¹trzkomórkowego dzia³ania fitoestrogenów najwiêkszym zainteresowaniem cieszy siê aktywacja receptorów estrogenowych. Mimo wysi³ku licznych grup badawczych, nawet ten, tak intensywnie badany problem zawiera jeszcze wiele niewiadomych. PODZIÊKOWANIA Autorki pragn¹ podziêkowaæ Pani Prof. Luizie Duszy za cenne uwagi dotycz¹ce przygotowywanego do druku manuskryptu. PIŒMIENNICTWO [1] AN J, TZAGARAKIS-FOSTER C, SCHARSCHMIDT TC, LOMRI N, LEITMAN DC. Estrogen receptor β-selective transcriptional activity and recruitment of coregulators by phytoestrogens. J Biol Chem 2001; 276(21):

13 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 219 [2] BENASSAYAG C, PERROT-APPLANAT M, FERRE F. Phytoestrogens as modulators of steroid action in target cells. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2002; 777(1 2): [3] BJÖRNSTRÖM L, SJÖBERG M. Mechanisms of estrogen receptor signaling: convergence of genomic and nongenomic actions on target genes. Mol Endocrinol 2005; 19(4): [4] BROOKS JD, THOMPSON LU. Mammalian lignans and genistein decrease the activities of aromatase and 17β-hydroxysteroid oxidoreductase in MCF-7 cells. J Steroid Biochem Mol Biol 2005; 94: [5] CAPPELLETTI V, MIODINI P, DI FRONZO G, DAIDONE MG. Modulation of estrogen receptor-beta isoforms by phytoestrogens in breast cancer cells. Int J Oncol 2006; 28(5): [6] CHU L, ZHANG J-X, NOROTA I, ENDOH M. Differential action of a protein tyrosine kinase inhibitor, genistein, on the positive inotropic effect of endothelin-1 and norepinephrine in canine ventricular myocardium. Br J Pharmacol 2005; 144(3): [7] CONSTANTINOU A, KIGUCHI K, HUBERMAN E. Induction of differentiation and DNA strand breakage in human HL-60 and K-562 leukemia cells by genistein. Cancer Res 1990; 50(9): [8] COTRONEO MS, FRITZ A, LAMARTINIERE CA. Dynamic profiling of estrogen receptor and epidermal growth factor signaling in the uteri of genistein- and estrogen-treated rats. Food Chem Toxicol 2005; 43: [9] COTRONEO MS, LAMARTINIERE CA. Pharmacologic, but not dietary, genistein supports endometriosis in a rat model. Toxicol Sci 2001; 61: [10] DELUCA D, KRAZEINSEN A, BREITLING R, PREHN C, MÖLLER G, ADAMSKI J. Inhibition of 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase by phytoestrogens: comparison with other steroid metabolizing enzymes. J Steroid Biochem Mol Biol 2005; 93: [11] DE WILDE A, LIEBERHERR M, COLIN C, POINTILLART A. A low dose of daidzein acts as an ERbetaselective agonist in trabecular osteoblasts of young female piglets. J Cell Physiol 2004; 200(2): [12] DIEL P, GEIS RB, CALDARELLI A, SCHMIDT S, LESCHOWSKY UL, VOSS A, VOLLMER G. The differential ability of the phytoestrogen genistein and of estradiol to induce uterine weight and proliferation in the rat is associated with a substance specific modulation of uterine gene expression. Mol Cell Endocrinol 2004; 221: [13] DIEL P, OLFF S, SCHMIDT S, MICHNA H. Molecular identification of potential selective estrogen receptor modulator (SERM) like properties of Phytoestrogens in the human breast cancer cell line MCF-7. Planta Med 2001; 67(6): [14] DIEL P, SCHULZ T, SMOLNIKAR K, STRUNCK E, VOLLMER G, MICHNA H. Ability of xeno- and phytoestrogens to modulate expression of estrogen-sensitive genes in rat uterus: estrogenicity profiles and uterotropic activity. J Steroid Biochem Mol Biol 2000; 73: [15] DUSZA L, CIERESZKO R, SKAR YÑSKI DJ, NOGOWSKI L, OPA KA M, KAMIÑSKA B, NYNCA A, KRASZEWSKA O, S OMCZYÑSKA M, WOC AWEK-POTOCKA I, KORZEKWA A, PRUSZYÑSKA- OSZMA EK E, SZKUDELSKA K. Mechanism of phytoestrogen action in reproductive processes of mammals and birds. Reprod Biol 2006; 6(Suppl 1): [[16] EDMUNDS KM, HOLLOWAY AC, CRANKSHAW DJ, AGARWAL SK, FOSTER WG. The effects of dietary phytoestrogens on aromatase activity in human endometrial stromal cells. Reprod Nutr Dev 2005; 45: [17] FRITZ WA, WANG J, ELTOUM I-E, LAMARTINIERE CA. Dietary genistein down-regulates androgen and estrogen receptor expression in the rat prostate. Mol Cell Endocrinol 2002; 186: [18] GALABOVA-KOVACS G, WALTER I, AURICH C, AURICH J. Steroid receptors in canine endometrial cells can be regulated by estrogen and progesterone under in vitro conditions. Theriogenology 2004; 61: [19] GOTTLICHER M, HECK S, HERRLICH P. Transcriptional cross-talk, the second mode of steroid hormone receptor action. J Mol Med 1998; 76: [20] HADDAD NG, FUGUA JS. Phytoestrogens: Effects on the Reproductive System. The Endocrinologist 2001; 11: [21] HAMMERSCHMIDT PA, PRAT DE. Phenolic antioxidants of dried soybeans. J Food Sci 1978; 43: [22] HAN EH, KIM JY, JEONG HG. Effect of biochanin A on the aryl hydrocarbon receptor and cytochrome P450 1A1 in MCF-7 human breast carcinoma cells. Arch Pharm Res 2006; 29(7): [23] HARRIS DM, BESSELINK E, HENNING SM, GO VL, HEBER D. Phytoestrogens induce differential estrogen receptor alpha- or beta-mediated responses in transfected breast cancer cells. Exp Biol Med (Maywood) 2005; 230(8):

14 220 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO [24] HARRIS RM, WOOD DM, BOTTOMLEY L, BLAGG S, OWEN K, HUGHES PJ, WARING RH, KIRK CJ. Phytoestrogens are potent inhibitors of estrogen sulfation: implications for breast cancer risk and treatment. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: [25] HATSUMI T, YAMAMURO Y. Downregulation of estrogen receptor gene expression by exogenous 17 beta-estradiol in the mammary glands of lactating mice. Exp Biol Med (Maywood) 2006; 231(3): [26] HEWITT SC, KORACH KS. Oestrogen receptor knockout mice: roles for oestrogen receptors α and β in reproductive tissues. Reproduction 2003; 125: [27] HUANG RQ, FANG MJ, DILLON GH. The tyrosine kinase inhibitor genistein directly inhibits GABA A receptors. Brain Res Mol Brain Res 1999; 67: [28] HUGHES CL, LIU G, BEALL S, FOSTER WG, DAVIS V. Effects of genistein or soy milk during late gestation and lactation on adult uterine organization in the rat. Exp Biol Med 2004; 229: [29] IMPROTA-BREARS T, WHORTON AR, CODAZZI F, YORK JD, MEYER T, MCDONNELL DP. Estrogen-induced activation of mitogen-activated protein kinase requires mobilization of intracellular calcium. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: [30] JEFFERSON WN, COUSE JF, PADILLA-BANKS E, KORACH KS, NEWBOLD RR. Neonatal exposure to genistein induces estrogen receptor (ER) α expression and multioocyte follicles in the maturing mouse ovary: evidence for ER β-mediated and nonestrogenic actions. Biol Reprod 2002; 67: [31] JURY HH, ZACHAREWSKI TR, HAMMOND GL. Interactions between human plasma sex hormonebinding globulin and xenobiotic ligands. J Steroid Biochem Mol Biol 2000; 75: [32] KALITA K, LEWANDOWSKI S, SKRZYPCZAK M, SZYMCZAK S, TKACZYK M, KACZMAREK L. Receptory estrogenowe. W: Receptory i mechanizmy przekazywania sygna³u. pod red. J. Nowaka i J.B. Zawilskiej, PWN, Warszawa [33] KIM H, PETERSON TG, BARNES S. Mechanism of action of the soy isoflavone genistein: emerging role for its effects via transforming growth factor β signaling pathways. Am J Clin Nutr 1998; 68: [34] KING MM, MCCAY PB. Modulation of tumor incidence and possible mechanisms of inhibition of mammary carcinogenesis by dietary antioxidants. Cancer Res 1983; 43(5 Suppl): 2485s 2490s. [35] KIRK CJ, HARRIS RM, WOOD DM, WARING RH, HUGHES PJ. Do dietary phytoestrogens influence susceptibility to hormone-dependent cancer by disrupting the metabolism of endogenous oestrogens? Biochem Soc Trans 2001; 29: [36] KONSTANTAKOPOULOS N, MONTGOMERY KG, CHAMBERLAIN N, QUINN MA, BAKER MS, RICE GE, GEORGIOU HM, CAMPBELL IG. Changes in gene expressions elicited by physiological concentrations of genistein on human endometrial cancer cells. Mol Carcinog 2006; 45(10): [37] KOSTELAC D, RECHKEMMER G, BRIVIBA K. Phytoestrogens modulate binding estrogen receptors α and β to the estrogen response element. J Agric Food Chem 2003; 51: [38] KOUSIDOU OC, MITROPOULOU TN, ROUSSIDIS AE, KLETSAS D, THEOCHARIS AD, KARAMA- NOS NK. Genistein suppresses the invasive potential of human breast cancer cells through transcriptional regulation of metalloproteinases and their tissue inhibitors. Int J Oncol 2005; 26(4): [39] KRASZEWSKA O, NYNCA A, KAMIÑSKA B, CIERESZKO R. Fitoestrogeny. I. Wystêpowanie, metabolizm i znaczenie biologiczne u samic. Post Biol Kom 2007; 34(1): [40] KUIPER GGJM, LEMMEN JG, CARLSSON B, CORTON JC, SAFE SH, VAN DER SAAG PT, VAN DER BURG B, GUSTAFSSON J-A. Interaction of estrogenic chemicals and phytoestrogens with estrogen receptor β. Endocrinology 1998; 139: [41] LACEY M, BOHDAY J, FONSEKA SMR, ULLAH AI, WHITHEAD SA. Dose-response effects of phytoestrogens on the activity and expression of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase and aromatase in human granulose-lutein cells. J Steroid Biochem Mol Biol 2005; 96: [42] LEE G-S, CHOI K-CH, KIM H-J, JEUNG E-B. Effect of genistein as a selective estrogen receptor beta agonist on the expression of calbindin-d 9k in uterus of immature rats. Toxicol Sci 2004; 82: [43] LEPHART ED, THOMPSON JM, SETCHELL KD, ADLERCREUTZ H, WEBER KS. Phytoestrogens decrease brain calcium-binding proteins but do not alter hypothalamic androgen metabolizing enzymes in adult male rats. Brain Res 2000; 859: [44] LOSEL R, WEHLING M. Nongenomic actions of steroid hormones. Nat Rev Mol Cell Biol 2003; 4: [45] LUND TD, MUNSON DJ, ADLERCREUTZ H, HANDA RJ, LEPHART ED. Androgen receptor expression in the rat prostate is down-regulated by dietary phytoestrogens. Reprod Biol Endocrinol 2004; 16: 2 5. [46] MAGEE PJ, ROWLAND IR. Phyto-oestrogens, their mechanism of action: current evidence for role in breast and prostate cancer. Br J Nutr 2004; 91(4):

15 FITOESTROGENY. II. MECHANIZM DZIA ANIA 221 [47] MAGGIOLINI M, BONOFIGLIO D, MARSICO S, PANNO ML, CENNI B, PICARD D, ANDO S. Estrogen receptor alpha mediates the proliferative but not the cytotoxic dose-dependent effects of two major phytoestrogens on human breast cancer cells. Mol Pharmacol 2001; 60: [48] MAKAREVICH A, SIROTKIN A, TARADAJNIK T, CHRENEK P. Effects of genistein and lavendustin on reproductive processes in domestic animals in vitro. J Steroid Biochem Mol Biol 1997; 63: [49] MARKOVITS J, LINASSIER C, FOSSE P, COUPRIE J, PIERRE J, JACQUEMIN-SABLON A, SAUCIER JM, LE PECQ JB, LARSEN AK. Inhibitory effects of the tyrosine kinase inhibitor genistein on mammalian DNA topoisomerase II. Cancer Res 1989; 49: [50] MARTIN ME, HAOURIGUI M, PELISSERO C, BENASSAYAG C, NUNEZ EA. Interactions between phytoestrogens and human sex steroid binding protein. Life Sci 1996; 58: [51] MITCHELL JH, GARDNER PT, MCPHAIL DB, MORRICE PC, COLLINS AR, DUTHIE GG. Antioxidant efficacy of phytoestrogens in chemical and biological model systems. Arch Biochem Biophys 1998; 360(1): [52] MORITO K, HIROSE T, KINJO J, HIRAKAWA T, OKAWA M, NOHARA T, OGAWA S, INOUE S, MURAMATSU M, MASAMUNE Y. Interaction of phytoestrogens with estrogen receptors α and β. Biol Pharm Bull 2001; 24: [53] NYNCA A, S OMCZYÑSKA M, CIERESZKO R. The effect of genistein and biochanin A on porcine granulosa cell function. 7 th International Conference on Pig Reproduction, June 2005, Rolduc, The Netherlands, abstr., p [54] OH SM, KIM YP, CHUNG KH. Biphasic effects of kaempferol on the estrogenicity in human breast cancer cells. Arch Pharm Res 2006; 29(5): [55] O LONE R, FRITH MC, KARLSSON EK, HANSEN U. Genomic targets of nuclear estrogen receptors. Mol Endocrinol 2004; 18: [56] PATISAUL HB, DINDO M, WHITTEN PL, YOUNG LJ. Soy isoflavone supplements antagonize reproductive behavior and estrogen receptor alpha- and beta dependent gene expression in the brain. Endocrinology 2001; 142: [57] PATISAUL HB, MELBY M, WHITTEN PL, YOUNG LJ. Genistein affects ERβ- but not ERα-dependent gene expression in the hypothalamus. Endocrinology 2002; 143(6): [58] PATISAUL HB, WHITTEN PL, YOUNG LJ. Regulation of estrogen receptor beta mrna in the brain: opposite effects of 17beta-estradiol and the phytoestrogen, coumestrol. Brain Res 1999; 67: [59] PEDRAM A, RAZANDI M, LEVIN ER. Nature of functional estrogen receptors at the plasma membrane. Mol Endocrinol 2006; 20(9): [60] PELLETIER G, EL-ALFY M. Immunoctochemical localization of estrogen receptors α and β in the human reproductive organs. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: [61] PETERSON TG. Evaluation of the biochemical targets of genistein in tumor cells. J Nutr 1995; 125(3): [62] PIKE ACW, BRZOZOWSKI AM, HUBBARD RE. A structural biologist s view of the oestrogen receptor. J Steroid Biochem Mol Biol 2000; 74: [63] POLKOWSKA J, RIDDERSTRALE Y, WAÑKOWSKA M, ROMANOWICZ K, MISZTAL T, MADEJ A. Effects of intracerebroventricular infusion of genistein on gonadotrophin subunit mrna and immunoreactivity of gonadotrophins and oestrogen receptor-α in the pituitary cells of the anoestrous ewe. J Chem Neuroanat 2004; 28(4): [64] RAZANDI M, PEDRAM A, GREENE GL, LEVIN ER. Cell membrane and nuclear estrogen receptors (ERs) originated from a single transcript: studies of ERα and ERβ expressed in Chinese hamster ovary cells. Mol Endocrinol 1999; 13: [65] REN MQ, KUHN G, WEGNER J, NÜRNBERG G, CHEN J, ENDER K. Feeding daidzein to late pregnant sows influences the estrogen receptor beta and type 1 insulin-like growth factor receptor mrna expression in newborn piglets. J Endocrinol 2001; 170: [66] ROSSELLI M, REINHART K, IMTHURN B, KELLER PJ, DUBEY RK. Cellular and biochemical mechanisms by which environmental oestrogens influence reproductive function. Hum Reprod Update 2000; 6(5): [67] SCHREIHOFER DA. Transcriptional regulation by phytoestrogens in neuronal cell lines. Mol Cell Endocrinol 2005; 231: [68] SEO H-S, DENARDO D, JACQUOT Y, LAÏOS I, VIDAL DS, ZAMBRANA CR, LECLERCQ G, BROWN PH. Stimulatory effect of genistein and apigenin on the growth of breast cancer cells correlates with their ability to activate ER alpha. Breast Cancer Res Treat 2006; 99(2):

16 222 A. NYNCA, O. KRASZEWSKA, M. S OMCZYÑSKA, R. CIERESZKO [69] SHAO ZM, WU J, SHEN ZZ, BARSKY SH. Genistein exerts multiple suppressive effects on human breast carcinoma cells. Cancer Res 1998; 58(21): [70] SHARMA SC, CLEMENS JW, PISARSKA MD, RICHARDS JS. Expression and function of estrogen receptor subtypes in granulosa cells: regulation by estradiol and forskolin. Endocrinology 1999; 140: [71] SHEN P, LINT MH, NG TY, CHAN YH, YONG EL. Differential effects of isoflavones, from Astragalus membranaceus and Pueraria thomsonii, on the activation of PPARalpha, PPARgamma, and adipocyte differentiation in vitro. J Nutr 2006; 136: [72] SHERTZER HG, PUGA A, CHANG C, SMITH P, NEBERT DW, SETCHELL KD, DALTON TP. Inhibition of CYP1A1 enzyme activity in mouse hepatoma cell culture by soybean isoflavones. Chem Biol Interact 1999; 123: [73] SHIBAYAMA T, FUKATA H, SAKURAI K, ADACHI T, KOMIYAMA M, IGUCHI T, MORI C. Neonatal exposure to genistein reduces expression of estrogen receptor alpha and androgen receptor in testes of adult mouse. Endocr J 2001; 48(6): [74] TKACZYK M, KALITA K. Receptor estrogenowy β budowa, regulacja i funkcja. Post Biochem 2001; 47(1): [75] WANG TTY, SATHYAMOORTHY N, PHANG JM. Molecular effects of genistein on estrogen receptor mediated pathways. Carcinogenesis 1996; 17: [76] WEBER KS, SETCHELL KDR, STOCCO DM, LEPHART ED. Dietary soy phytoestrogens decrease testosterone levels and prostate weight without altering LH, prostate 5α-reductase or testicular steroidogenic acute regulatory peptide levels in adult male Sprague-Dawley rats. J Endocrinol 2001; 170: [77] WHITEHEAD SA, LACEY M. Protein tyrosine kinase activity of lavendustin A and the phytoestrogen genistein on progesterone synthesis in cultured rat ovarian cells. Fertil Steril 2000; 73(3): [78] WHITEHEAD SA, LACEY M. Phytoestrogens inhibit aromatase but not 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD) type 1 in human granulosa-luteal cells: evidence for FSH induction of 17β-HSD. Hum Reprod 2003; 18: [79] WHITEHEAD SA, CROSS JE, BURDEN C, LACEY M. Acute and chronic effects of genistein, tyrphostin and lavendustin A on steroid synthesis in luteinized human granulosa cells. Hum Reprod 2002; 17: [80] WHITTEN PL, PATISAUL HB, YOUNG LJ. Neurobehavioral actions of coumestrol and related isoflavonoids in rodents. Neurotoxicol Teratol 2002; 24(1): [81] WOCLAWEK-POTOCKA I, ACOSTA TJ, KORZEKWA A, MAMADOU MB, SHIBAYA M, OKUDA K, SKARZYNSKI DJ. Phytoestrogens modulate prostaglandin production in bovine endometrium: cell type specificity and intracellular mechanisms. Exp Biol Med 2005; 230(5): [82] WOCLAWEK-POTOCKA I, BOBER A, KORZEKWA A, OKUDA K, SKARZYNSKI D. Equol and paraethyl-phenol stimulate prostaglandin F 2α secretion in bovine corpus luteum: intracellular mechanisms of action. Prostag Oth Lipid M 2006; 79(3 4): [83] XUE XO, WEI LH. Regulation of genistein on the levels of ERalpha, ERbeta mrna in uterine endometrial cancer cells. Beijing Da Xue Xue Bao 2005; 37(3): [84] YANG P, KRIATCHKO A, ROY SK. Expression of ERα and ERβ in the hamster ovary: differential regulation by gonadotropins and ovarian steroid hormones. Endocrinology 2002; 143: [85] ZHANG S, QIN C, SAFE SH. Flavonoids as aryl hydrocarbon receptor agonists/antagonists: effects of structure and cell context. Environ Health Perspect 2003; 111: Redaktor prowadz¹cy Maciej Zabel Otrzymano: r. Przyjêto: r Olsztyn, ul. Oczapowskiego 1A; reniac@uwm.edu.pl