Do moich badań wybrałam przede wszystkim linię kostniakomięsaka 143B ze względu na jej wysoki potencjał przerzutowania. Do wykonania pracy

Transkrypt

1 Streszczenie Choroby nowotworowe stanowią bardzo ważny problem zdrowotny na świecie. Dlatego, medycyna dąży do znalezienia nowych skutecznych leków, ale również rozwiązań do walki z nowotworami. Głównym elementem poszukiwań jest poznanie mechanizmów powstawania nowotworów, a także mechanizm działania potencjalnych leków przeciwnowotworowych oraz leków już istniejących. Obecnie wiele badań skupionych jest na mechanizmach nowotworzenia. Kostniakomięsak, złośliwy nowotwór kości, dotyka głównie młodzież a także dzieci. Pomimo rozwiniętej medycyny powstawanie tego nowotworu nie jest znane, również leczenie nie zawsze przynosi zamierzone skutki. Głównym problemem klinicznym kostniakomięsaka jest jego duży stopień złośliwości a także oporność na chemioterapię. Śmiertelność z powodu tego nowotworu nie zmniejszyła się od lat 80-tych XX wieku. Dlatego też poszukiwanie związków o właściwościach przeciwnowotworowych należy do kluczowych elementów w walce z chorobami nowotworowymi. Ważną rolę w regulacji śmierci komórek nowotworowych odgrywa stres nitrooksydacyjny. Reaktywne formy tlenu i azotu, mają dwoistą naturę, mogą wywierać korzystne, lub szkodliwe efekty w układach biologicznych. Są cząsteczkami sygnałowymi, pełniącymi rolę aktywacyjną i regulacyjną wielu znaczących procesów komórkowych m.in. metabolizm, proliferacja, apoptoza. Do reaktywnych form tlenu zalicza się wolne rodniki takie jak anionorodnik ponadtlenkowy (O2 ), rodnik hydroksylowy (OH ), natomiast do reaktywnych form azotu, głównie tlenek azotu (NO ). Do reaktywnych form tlenu i azotu o charakterze nierodnikowym zaliczyć można: nadtlenek wodoru (H2O2), czy nadtlenoazotyn (ONOO ). Poziom reaktywnych form tlenu i azotu ze względu na bardzo reaktywny charakter, jest stale kontrolowany poprzez system obrony antyoksydacyjnej, w celu utrzymania komórki w stanie równowagi redoks. Stres nitro-oksydacyjny występuje w wyniku zaburzenia równowagi prooksydacyjno-antyoksydacyjnej, prowadząc do nadmiernej kumulacji reaktywnych form tlenu i azotu. Komórki nowotworowe wykorzystują podwyższony poziom reaktywnych form tlenu i azotu w procesie kancerogenzy, a także do aktywacji szlaków biorących udział

2 w metabolizmie, proliferacji czy anigogenezie. Równocześnie podniesiony stres nitrooksydacyjny w komórkach nowotworowych przyczynia się do ich większej wrażliwości na reaktywne formy tlenu i azotu, co za tym idzie komórki mogą ulegać oksydacji białek, lipidów czy DNA. Wszystko to może przyczynić się do kancerogenezy, spowodować powstanie niestabilności genomowej a nawet doprowadzić do śmierci komórki nowotworowej. Przeżywalność komórek nowotworowych jest związana m.in. z ich możliwościami regulacji ekspresji genów czy poziomu białek odpowiedzialnych za obronę przeciwutleniającą. Wykorzystując wiedzę o reaktywnych formach tlenu i azotu, a także możliwościach wywołania uszkodzeń w komórkach, możliwe jest konstruowanie metod i strategii leczenia nowotworów. Jedną taką metodą jest wykorzystanie czynników generujących reaktywne formy tlenu i azotu. Natomiast, inna metoda opiera się na obniżaniu ochrony, poprzez hamowanie enzymów przeciwutleniających. Związkiem, znajdującym się w zaawansowanych fazach badań klinicznych, który może znaleźć zastosowanie w leczeniu kostniakomięsaka jest 2-metoksyestradiol (2-ME). 2-ME jest naturalnym metabolitem 17β-estradiolu. Z doniesień literaturowych wynika, iż 2-ME odpowiedzialny jest za apoptozę zależną od mitochondrium związaną z akumulacją reaktywnych form tlenu w komórkach. Jak wykazał nasz zespół we wcześniejszych pracach, 2-ME wywiera cytotoksyczny efekt na komórki kostniakomięsaka 143B w zakresie stężeń fizjologicznych i farmakologicznych, co związane jest ściśle z selektywną indukcją neuronalnej syntazy tlenku azotu. Ponadto, wykazaliśmy, iż 2-ME powoduje translokację neuronalnej syntazy tlenku azotu z cytoplazmy do jądra komórkowego w zakresie stężeń odpowiadającym fizjologicznym i farmakologicznym. Cytotoksyczny efekt działania 2-ME polegał na oksydacyjnych uszkodzeniach DNA w wyniku miejscowej generacji tlenku azotu w jądrach komórkowych komórek kostniakomięsaka 143B. Głównym celem mojej pracy doktorskiej była ocena roli stresu nitro-oksydacyjnego w cytotoksycznym mechanizmie działania 2-ME używając komórkowego modelu komórek kostniakomięsaka 143B o wysokim potencjale przerzutowania. Ponadto, celem mojej pracy doktorskiej była ocena modulacyjnego wpływu witaminy D3 na mechanizm cytotoksyczności 2-ME używając komórkowego modelu komórek kostniakomięsaka 143B o wysokim potencjale przerzutowania.

3 Do moich badań wybrałam przede wszystkim linię kostniakomięsaka 143B ze względu na jej wysoki potencjał przerzutowania. Do wykonania pracy doktorskiej wykorzystałam metody: do analizy cytotoksyczności związków test MTT, do określenia poziomu białek - Western blot, do analizy wewnątrzkomórkowego poziomu dwutlenku azotu metodę zatrzymanego przepływu, do analizy lokalizacji białek, wewnątrzkomórkowego poziomu anionorodnika ponadtlenkowego, oceny zahamowania faz cyklu komórkowego, oraz określenia zmian w całkowitym obszarze jąder komórkowych metodę cytometrii przepływowej. Wyniki zanalizowałam za pomocą odpowiedniego testu statystycznego z wykorzystaniem programu GraphPad Prism. W przeprowadzonych badaniach wykazałam obniżanie poziomu mitochondrialnej dysmutazy ponadtlenkowej, MnSOD, pod wpływem 2-ME. Co ciekawe, obserwowałam jednak brak korelacji z poziomem anionorodnika ponadtlenkowego. Może to sugerować zużycie anionorodnika ponadtlenkowego podczas bezpośredniej reakcji z tlenkiem azotu, przy jednoczesnym wytworzeniu bardziej reaktywnych pochodnych tlenku azotu. Najbardziej prawdopodobne, że to nadtlenoazotyn oraz dwutlenek azotu są odpowiedzialne za cytotoksyczność 2-ME. Związki te są bardzo szkodliwe, mogą powodować liczne uszkodzenia komórkowe i prowadzić do śmierci komórkowej. Jednocześnie, w przeprowadzonych badaniach wykazałam wzrost generacji dwutlenku azotu pod wpływem 2-ME w stężeniach odpowiadających fizjologicznemu, jak i farmakologicznemu zakresowi stężeń. W mojej pracy doktorskiej podjęłam również próbę wyjaśnienia mechanizmu działania przeciwnowotworowego 2-ME. Sprawdziłam wpływ 2-ME na 3- nitrotyrozynę, jeden z najważniejszych markerów stresu nitro-oksydacyjnego, stanowiący tak zwany odcisk palca reaktywnych form azotu. W pracy wykazałam wzrost poziomu nitrowanych białek, pod wpływem działania 2-ME zarówno w zakresie stężeń odpowiadającym fizjologicznym, jak i farmakologicznym, ściśle skorelowany z wewnątrzkomórkową generacją dwutlenku azotu. Wykazałam, również iż 2-ME w stężeniach odpowiadających fizjologicznym oraz farmakologicznym podnosił cytozolową frakcję oraz indukował jądrową translokację czynnika NF-ĸB. Biorąc pod uwagę, że neuronalna syntaza tlenku azotu bierze udział w komórkowym szlaku sygnalizacyjnym stanowiąc cel dla NF-ĸB, określenie cytotoksyczności 2-ME poprzez regulację poziomu i lokalizacji tego czynnika jest bardzo interesujące.

4 W mojej pracy doktorskiej sprawdziłam również, czy tetrahydrobiopteryna (BH4) może brać udział w regulacji cytotoksycznego efektu działania 2-ME. BH4 jest kofaktorem wielu enzymów, obecność BH4 odpowiada też, za funkcjonowanie natywnej formy neuronalnej syntazy tlenku azotu, czy też czynnika NF-ĸB. Obecność BH4 spowodowała spadek cytotoksyczności 2-ME. Obserwowane przeze mnie zniesienie efektu przeciwnowotworowego może być spowodowane właściwościami przeciwutleniającymi BH4. Z drugiej jednak strony, może także wynikać z działania enzymu w czasie selektywnej indukcji neuronalnej syntazy tlenku azotu pod wpływem 2-ME można zasugerować niedostatek kofaktora BH4 lub substratu, L-argininy. To z kolei może powodować, że enzym ulega rozkojarzeniu. Wpływ obniżania toksyczności 2-ME poprzez BH4 wymaga dalszych badań. W mojej pracy doktorskiej określiłam także wpływ działania 2-ME na zmiany w obszarze jądra komórkowego kostniakomięsaka 143B. Wyniki ukazujące wielkość jądra komórkowego są trudne do analizy, niemniej jednak wielkość jądra komórkowego bierze się pod uwagę podczas diagnozowania nowotworów. W przedstawionej rozprawie doktorskiej przedstawiłam przeciwnowotworowy efekt witaminy D3 (aktywna oraz nieaktywna forma) wobec komórek kostniakomięsaka 143B. Jak wykazałam, efekt ten, przynajmniej częściowo, związany jest z selektywną indukcją oraz jądrową translokacją neuronalnej syntazy tlenku azotu. Jak wspomniałam, neuronalna syntaza tlenku azotu stanowi molekularny przekaźnik przeciwnowotworowego efektu 2-ME. Jednakże, pomimo działania synergistycznego witaminy D i 2-ME na translokacje jądrową enzymu, nie wykazałam korzystnego wpływu przeciwnowotworowego poprzez połączenie obu związków a także nie potwierdziłam efektu addycyjnego. Jak wykazałam, 2-ME przyczynił się do obniżania ekspresji receptora VDR. Receptor odgrywa ważną rolę w chemioterapii. Wiąże się brak ekspresji receptora VDR lub obniżenie jego ekspresji ze stadiami aktywności nowotworów. Moje badania sugerują, że spadek ekspresji receptora VDR w związku z działaniem 2-ME może być odpowiedzialne za brak synergizmu między witaminą D a 2-ME a także być mechanizmem rozwoju chemo-oporności. Podsumowując, w swojej pracy doktorskiej uzupełniłam cytotoksyczny mechanizm działania 2-ME związany z selektywną generacją stresu nitro-oksydacyjnego w komórkach kostniakomięsaka o wysokim potencjale przerzutowania. Wskazałam na rolę czynnika NF-κB w molekularnym mechanizmie przeciwnowotworowego działania 2-ME. Ponadto,

5 zasugerowałam, iż to nie tlenek azotu, a co bardziej prawdopodobne dwutlenek azotu jest odpowiedzialny za genotoksyczne efekty 2-ME. Zasugerowałam potencjalne mechanizmy prowadzące do generacji dwutlenku azotu pod wpływem 2-ME, takie jak: obniżanie poziomu MnSOD oraz deplecja/niedobór BH4. W swojej pracy doktorskiej wykazałam również brak synergizmu 2-ME z witaminą D3, zarówno aktywną, jak i nieaktywną formą. Wykazałam natomiast, iż witamina D3 podobnie do 2-ME powoduje wzrost frakcji cytozolowej oraz jądrową translokację nnos w komórkach kostniakomięsaka 143B. Stąd, stwierdzony przeze mnie przeciwnowotworowy efekt witaminy D3 może wynikać między innymi z indukcji jądrowej translokacji enzymu. Wykazałam również obniżanie ekspresji receptora VDR w wyniku działania 2-ME, co może stanowić mechanizm rozwoju chemo-oporności oraz być przyczyną braku synergizmu pomiędzy witaminą D a 2-ME. Należy podkreślić, iż większość opisywanych efektów 2-ME wobec komórek kostniakomięsaka 143B o wysokim potencjale przerzutowania była obserwowana w zakresie stężeń odpowiadających farmakologicznym, ale również fizjologicznym. Stanowi to kolejny krok w naszych badaniach, czy można nazwać 2-ME hormonem o działaniu przeciwnowotworowym.