(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/40 EP B1 (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 15/00 ( ) A61K 38/00 ( ) A61P 35/00 ( ) A61P 37/04 ( ) C07K 7/06 ( ) C07K 16/18 ( ) (54) Tytuł wynalazku: Peptyd antygenowy do odrzucania raka pochodzący z glipikan-3 (GPC3) do zastosowania u HLA-A2-pozytywnego pacjenta i środek farmaceutyczny zawierający antygen (30) Pierwszeństwo: JP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2008/21 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/02 (73) Uprawniony z patentu: Oncotherapy Science, Inc., Kawasaki, JP (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 YASUHARU NISHIMURA, Kumamoto, JP TETSUYA NAKATSURA, Chiba, JP HIROYUKI KOMORI, Kumamoto, JP (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Janina Kossowska PRZEDSIĘBIORSTWO RZECZNIKÓW PATENTOWYCH PATPOL SP. Z O.O. SKR. POCZT Warszawa 130 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis Dziedzina techniki [0001] Wynalazek obecny dotyczy nowych peptydów, które są skuteczne jako szczepionka na raka w wysokim stopniu wyrażającego glipikan-3 (GPC3), takiego jak rak wątrobowokomórkowy lub czerniak złośliwy (czerniak) oraz leku zawierającego te peptydy stosowanego do leczenia i zapobiegania nowotworom. Podstawa techniki [0002] Pierwotny rak wątrobowokomórkowy jest złośliwą chorobą, która z wysoką częstotliwością występuje w różnych krajach na świecie. W związku z dużym wybuchem zapalenia wątroby typu B i C na świecie, w krajach azjatyckich i europejskich gwałtownie wzrosła częstość występowania raka wątrobowokomórkowego. Biorąc pod uwagę długi okres inkubacji od zakażenia wirusem zapalenia wątroby do początku choroby, przewiduje się, że taka tendencja będzie utrzymywała się przez następne pięćdziesiąt lat. Rak wątrobowokomórkowy, którego stan pogarsza się, ma złe rokowania. A zatem, pożądane jest szybkie opracowanie nowej strategii leczenia. [0003] Z drugiej strony, w ostatnich latach, wraz z rozwojem biologii molekularnej i immunologii nowotworów, ujawniono że cytotoksyczne limfocyty T (zabójcy) oraz pomocnicze limfocyty T rozpoznają peptydy wytworzone w wyniku rozkładu białek wyrażanych w wysokim stopniu specyficznie w komórkach rakowych, które to peptydy są obecne na powierzchni komórek rakowych lub komórek prezentujących antygen przez cząsteczki HLA, i że wykazują one reakcję odpornościową w kierunku niszczenia takich komórek rakowych. Ponadto, zidentyfikowano dużą liczbę białek i peptydów, które są antygenami nowotworowymi, stymulujących reakcję odpornościową w celu zaatakowania raka i opracowano specyficzną wobec antygenu immunoterapię nowotworów. [0004] Cząsteczki HLA klasy I są wyrażane na powierzchni wszystkich komórek jądrzastych w organizmie. Peptydy pochodzące z rozłożonych cytoplazmatycznych jądrowych białek wiążą się z cząsteczkami HLA klasy I i są wyrażane na powierzchniach takich komórek. Na powierzchni komórek prawidłowych, z cząsteczkami HLA klasy I wiążą się peptydy pochodzące od prawidłowych autologicznych białek, a limfocyty T układu odpornościowego nie rozpoznają i nie reagują na takie peptydy związane z cząsteczkami HLA klasy I. Z drugiej strony, w procesie, w którym prawidłowe komórki ulegają przekształceniu w raka, takie komórki rakowe mogą wyrażać duże ilości białek, które w komórkach prawidłowych są prawie niewyrażane lub są wyrażane jedynie w małych ilościach. Gdy peptyd wytworzony przez rozkład w cytoplazmie takiego białka, które jest wysoce i specyficznie wyrażane w komórce rakowej, zwiąże się z cząsteczką HLA klasy I i będzie wyrażany na powierzchni takiej komórki rakowej, wówczas limfocyt T zabójca rozpozna taki peptyd i zniszczy jedynie komórkę rakową. Ponadto, przez podawanie do danego organizmu takiego antygenu lub peptydu specyficznego wobec raka można zniszczyć komórki rakowe i zahamować wzrost raka, bez uszkadzania prawidłowych komórek. Określa się to jako immunoterapię raka z zastosowaniem antygenu specyficznego dla raka. Ponadto, cząsteczka HLA klasy II jest wyrażana głównie na powierzchni komórki prezentującej antygen. Taka cząsteczka HLA klasy II wiąże się z peptydem pochodzącym od specyficznego wobec raka antygenu, wytworzonego przez wprowadzenie specyficznego wobec raka antygenu z zewnątrz komórki i 1

3 przez jego rozkład w komórce, i jest wyrażana na powierzchni komórki. Limfocyt T pomocniczy, który rozpoznał peptyd związany przez cząsteczkę HLA klasy II, aktywuje się i wytwarza różne cytokiny, które aktywują inne komórki immunokompetentne, wywołując lub nasilając reakcję odpornościową przeciwko nowotworowi. [0005] A zatem, gdyby opracowano immunoterapię skierowaną na antygen, który jest wysoce i specyficznie wyrażany w raku, terapia taka mogłaby stać się metodą skutecznego zwalczania samego raka, bez uszkadzania prawidłowych narządów autologicznych. Ponadto, przewiduje się, że taką immunoterapię można będzie stosować u pacjentów cierpiących na terminalne stadium raka, u których nie można stosować żadnej innej terapii. Ponadto, gdy specyficzny wobec raka antygen i peptyd podaje się w postaci szczepionki człowiekowi z wysokim ryzykiem rozwoju raka, istnieje możliwość zapobieżenia wystąpieniu tego raka. [0006] Zgodnie z doniesieniami, w prawidłowych tkankach α-fetoproteina (AFP) jest wyrażana jedynie w okresie prenatalnym i z tego względu jest nazywana białkiem rakowo-płodowym, którego wyrażanie aktywuje się ponownie w wielu rakach wątrobowokomórkowych. Ponadto, kilka typów mysich i ludzkich limfocytów T rozpoznaje epitop peptydu pochodzący od AFP i prezentowany przez cząsteczkę MHC klasy I. W czasie stadium rozwoju płód jest eksponowany na AFP występującą w dużej ilości w osoczu. Jednakże, dojrzałe limfocyty T nie nabywają całkowitej tolerancji na AFP i we krwi obwodowej wykrywa się specyficzne wobec AFP limfocyty T. Można stwierdzić, że takie rakowopłodowe białko może być celem immunoterapii. [0007] Istnieją różne sposoby leczenia raka wątrobowokomórkowego. Jednakże, w takim raku wątrobowokomórkowym rokowania są gorsze niż w innych typach raka, a zatem rak ten jest uważany za oporny na leczenie. Przyczyną może być fakt, że rak wątrobowokomórkowy rozwija się jako następstwo marskości wątroby i pacjenci z takim rakiem mają upośledzone funkcje wątroby. Przyczyną może być również to, że chociaż większą część raka wyleczono, w innych miejscach rozwija się inny rak. A zatem, stało się konieczne szybkie opracowanie nowej strategii leczenia. Gdyby można było opracować immunoterapię skierowaną na antygen, który jest wysoce i specyficznie wyrażany w raku wątrobowokomórkowym, uzyskano by możliwość, że immunoterapia taka będzie skuteczną metodą terapeutyczną do zwalczania samego raka bez uszkadzania prawidłowych narządów autologicznych. Ponadto, przewiduje się, że wspomniana immunoterapia może być sposobem leczenia, który będzie dostępny dla pacjentów w terminalnym stadium raka, jak również dla pacjentów, u których funkcje wątroby są na tyle złe, że uniemożliwiają prowadzenie innego leczenia. W chwili obecnej podaje się, że w Japonii wirusowym zapaleniem wątroby typu C zakażonych jest ponad ludzi i ludzie tacy są potencjalnymi pacjentami z rakiem wątrobowokomórkowym. Istnieje możliwość, że wspomniana wyżej immunoterapia będzie także stosowana do zapobiegania wystąpieniu raka wątrobowokomórkowego u takich zakażonych pacjentów. [0008] Czerniak jest typem raka skóry, który często określa się jako czerniak złośliwy. Jest kilka typów raka skóry. Wśród tych typów czerniak klasyfikuje się jako typ o najwyższym stopniu złośliwości, a zatem budzi on największe obawy. Kilka spośród komórek, które tworzą skórę, wytwarza pigment melaninowy. Komórki takie są nazywane melonocytami. Gdy malanocyty rakowacieją, pojawia się czerniak. [0009] W Japonii częstość występowania czerniaka mieści się w zakresie od 1,5 do 2 osób na ogółu populacji. A zatem, szacuje się, że w ciągu roku czerniak rozwinie się u około 1500 do 2000 osób. Z drugiej strony, w krajach zachodnich czerniak rozwija się u ponad tuzina osób na ogółu populacji. Zwłaszcza w Australii czerniak taki rozwija się u 20 lub więcej osób na ogółu populacji, a zatem uważa się, że w Australii częstość występowania czerniaka jest najwyższa na świecie. W tych okoliczno- 2

4 ściach ludzie, którzy mieszkają w Europie, Stanach Zjednoczonych i Australii są zainteresowani czerniakiem i uważnie śledzą częstość jego występowania. Ponadto, częstość przypadków czerniaka wzrosła, zwłaszcza wśród rasy białej, co jest wynikiem zwiększonej ekspozycji na promienie ultrafioletowe na skutek zmniejszenia warstwy ozonowej spowodowanego zniszczeniem środowiska. Ponadto, również w Japonii częstość występowania czerniaka z roku na rok ma tendencję wzrostową. Zgodnie z ostatnimi badaniami roczna liczba śmiertelnych ofiar na skutek czerniaka wzrosła w Japonii do około 450. Czerniak rozwija się niezależnie od wieku. Jednakże przypadki tej choroby wzrosły u ludzi powyżej 40 roku życia, a największą ich ilość obserwuje się u 60- i 70-latków. Przypadki choroby u dzieci są niezwykle rzadkie, co nie oznacza, że choroba ta nie rozwija się nigdy w wieku dziecięcym. Ostatnio, częstość występowania czerniaka wykazuje tendencję wzrostową u pacjentów młodych w 20 i 30 roku życia. Czerniak rozwija się niezależnie od płci i na chorobę tę cierpią zarówno mężczyźni, jak i kobiety. U pacjentów w Japonii miejscem, w którym najczęściej rozwija się czerniak, jest podeszwa (podeszwa stopy) i czerniak taki stanowi 30% wszystkich przypadków. Cechą charakterystyczną czerniaka u pacjentów w Japonii jest to, że rozwija się on na stopach i paznokciowych częściach palców. Ponadto, u pacjentów w krajach zachodnich, jak również u pacjentów w Japonii, czerniak rozwija się na wszystkich częściach skóry, takich jak korpus, ręce, stopy, twarz i głowa. [0010] Twórcy obecnego wynalazku najpierw prowadzili analizę ekspresji genu w skali genomu, obejmującą rodzajów genów ludzkich, z zastosowaniem analizy mikromacierzy cdna. Twórcy analizowali profile ekspresji tych genów w 20 przypadkach pierwotnego raka wątrobowokomórkowego oraz w różnych typach prawidłowych narządów obejmujących narządy występujące w okresie prenatalnym. W wyniku tych badań, twórcy wynalazku stwierdzili, że glipikan-3 (GPC3) jest wyrażany w wątrobie, nerkach i płucach podczas okresu prenatalnego, jak również jest wysoce wyrażany w wielu rakach wątrobowokomórkowych, aczkolwiek prawie nigdy nie jest wyrażany w prawidłowych narządach u dorosłych, chociaż jest wyrażany w łożysku. Twórcy donoszą ponadto, że taki GPC3 jest białkiem wydzielniczym, które można wykryć metodą ELISA w surowicy u 40% pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym, a zatem jest on użyteczny jako nowy marker nowotworowy raka wątrobowokomórkowego (Nakatsura, T. i in., Biochem. Biophys. Res. Commun. 306, (2003)). Ponadto, twórcy donoszą również, że GPC3 jest wykrywany w surowicy u pacjentów z czerniakiem, a zatem jest także użyteczny jako nowotworowy marker czerniaka (Nakatsura, T. i in., Clin. Cancer Res. 10: (2004)). [0011] Twórcy obecnego wynalazku zidentyfikowali już peptyd GPC3, który wiąże się z HLA-A24 i jest prezentowany ludzkim limfocytom T zabójcom i jest przydatny do immunoterapii przeznaczonej dla pacjentów z HLA-A24-pozytywnym rakiem wątrobowokomórkowym lub czerniakiem. Twórcy wynalazku prowadzili badania na zwierzętach z zastosowaniem myszy BALB/C wyrażających mysie cząsteczki K d, z którymi wiąże się peptyd o strukturze tej samej, co peptyd wiążący się z HLA-A24. W wyniku tych badań wykazano skuteczność immunoterapii z zastosowaniem powyższego peptydu i odnotowano już ich wyniki (Zgłoszenie międzynarodowe PCT/JP2004/016374; Data zgłoszenia międzynarodowego: 28 października 2004). Ponieważ GPC jest wyrażany jedynie w łożysku i w wątrobie w okresie prenatalnym, w prawidłowych narządach, nawet gdy w celu zahamowania nowotworu prowadzi się immunoterapię skierowaną na GPC3, nie występują skutki uboczne, takie jak choroba autoimmunizacyjna. Potwierdzono to w eksperymentach z zastosowaniem myszy. [0012] Do chwili obecnej, w odniesieniu do glipikanu-3 (GPC3) jako antygenu odrzucenia nowotworu, twórcy obecnego wynalazku zidentyfikowali peptyd, który jest prezentowany limfocytowi T zabójcy głównie przez 3

5 HLA-A24 (Zgłoszenie międzynarodowe PCT/JP03/10459 WO2004/018667; Data zgłoszenia międzynarodowego: 19 sierpnia 2003). Jednakże, jedynie z takimi peptydami prezentowanymi przez HLA-A24 limfocytom T zabójcom, szczepionki peptydowe można podawać tylko 60% Japończyków z HLA-A24. Gdyby można było zidentyfikować peptyd prezentowany limfocytom T zabójcom przez HLA-A2, w stosunku do którego 40% Japończyków ma pozytywny wynik testu, u około 85% Japończyków można by było stosować dwa rodzaje szczepionek peptydowych. Ponadto, ponieważ u rasy białej w krajach zachodnich częstotliwość występowania HLA-A2 jest stosunkowo wysoka, taki prezentowany przez HLA-A2 peptyd można byłoby stosować u wielu ludzi na zachodzie. A zatem, ważnym celem jest zidentyfikowanie wspomnianego wyżej peptydu prezentowanego limfocytom T zabójcom przez HLA-A2. W szczególności, ponieważ czerniak jest rakiem, który rozwija się coraz częściej u rasy białej w krajach zachodnich i który skutecznie poddaje się immunoterapii, a ponadto z uwagi na fakt, że występowanie raka wątrobowokomórkowego w krajach zachodnich gwałtownie wzrasta, przyjmuje się, że będzie znaczna liczba pacjentów, u których będzie można stosować immunoterapię z zastosowaniem peptydu GPC3 wiążącego się z HLA-A2. [0013] W WO 2004/ A1 ujawniono sekwencję o pełnej długości ludzkiego glipikanu-3 (SEKW. NR ID.: 3). [0014] W dokumencie WO01/47944 A2 ujawniono peptyd FFQRLQPGLWVPE (SEKW. NR ID.: 8700; strona 2451 dokumentu). Ujawnienie wynalazku Problemy do rozwiązania przez wynalazek [0015] Celem obecnego wynalazku jest zidentyfikowanie peptydów prezentowanych przez HLA-A2 limfocytowi T zabójcy i w ten sposób dostarczenie środka do prowadzenia immunoterapii, którą będzie można skierować na około 40% pacjentów w Japonii, cierpiących na kilka typów raka, który wyraża [0016] wysokie poziomy GPC3. Środki do rozwiązania problemów [0017] W oparciu o analizę mikromacierzy cdna, twórcy obecnego wynalazku zidentyfikowali uprzednio glipikan-3 (GPC3) jako nowe białko rakowo-płodowe, które jest specyficznie i nadmiernie wyrażane w ludzkim raku wątrobowokomórkowym. Twórcy wyjaśnili ponadto, że rozpuszczalne białko GPC3 jest wykrywane w surowicy u pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym, a zatem może być nowym markerem nowotworowym raka wątrobowokomórkowego. Twórcy obecnego wynalazku stwierdzili, że GPC3 jest wyrażany w linii komórek mysiego czerniaka B16 i jest w wysokim stopniu wyrażany w czerniaku, jak również w raku wątrobowokomórkowym. A zatem, twórcy stwierdzili, że GPC3 może być również przydatnym markerem nowotworowym czerniaka. W wyniku badań potwierdzających, twórcy stwierdzili, że GPC3 działa jako marker nowotworowy czerniaka, umożliwiając wczesną diagnozę, czego do tej pory nie zrealizowano. Obecnie, twórcy obecnego wynalazku stymulowali ludzkie CD8-pozytywne limfocyty T zabójców przez ko-hodowlę ich in vitro razem z ludzkimi komórkami dendrytycznymi pochodzącymi z monocytów krwi obwodowej, do której dodawano w sposób pulsacyjny ludzki peptyd GPC3 wykazujący motyw wiązania HLA-A2, indukując w ten 4

6 sposób specyficzne wobec peptydu GPC3 limfocyty T zabójców. Obecność lub brak indukcji limfocytów T zabójców specyficznych wobec każdego peptydu GPC3 wykrywano metodą ELISPOT wykrywającą γ- interferon (IFN-γ) wytworzony przez aktywowane limfocyty T zabójców, rozpoznające peptydy prezentowane przez HLA-A2 i w ten sposób zidentyfikowano nowy peptyd GPC3, który mógłby być kandydatem na docelowy antygen odpowiedni do immunoterapii. [0018] A zatem, niniejszy wynalazek dostarcza następujących cech wynalazku: (1) Peptydu składającego się z sekwencji aminokwasowej jak przedstawiona w dowolnej spośród SEKW NR ID.: 1 do 3; (2) Immunologicznie indukowanej kompozycji stosowanej do leczenia raka, która obejmuje co najmniej jeden typ peptydu z powyższego punktu (1). (3) Kompozycji farmaceutycznej do stosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu nowotworom, która obejmuje co najmniej jeden typ peptydu z powyższego punktu (1). (4) Kompozycji środka do indukowania komórek prezentujących antygen, o wysokiej zdolności do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T, która obejmuje peptyd z powyższego punktu (1). (5) Kompozycji środka do indukowania komórek prezentujących antygen, o wysokiej zdolności do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T do stosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu nowotworom, która obejmuje gen kodujący peptyd według jednego z następujących punktów (A) lub (B): (A) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej, jak przedstawiono w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3; albo (B) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie lub addycję jednego lub dwóch aminokwasów w sekwencji aminokwasowej jak przedstawiona w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3, i który ma zdolność do indukowania limfocytów T zabójców. (6) Kompozycji środka do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T, która obejmuje peptyd z powyższego punktu (1). (7) Przeciwciała przeciwko peptydowi z powyższego punktu (1). (8) Limfocytu T pomocniczego, limfocytu T zabójcy, lub obejmującej takie komórki populacji immunocytów, która jest indukowana z zastosowaniem peptydu z powyższego punktu (1). (9) Komórki prezentującej antygen, która prezentuje kompleks składający się z cząsteczki HLA i peptydu z powyższego punktu (1). (10) Komórki prezentującej antygen według powyższego punktu (9), która jest indukowana z zastosowaniem kompozycji środka według powyższego punktu (4) lub (5). (11) Sposobu in vitro indukowania komórek prezentujących antygen o wysokiej zdolności do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T, który obejmuje gen kodujący peptyd według jednego z następujących punktów (A) lub (B): 5

7 (A) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej, jak przedstawiono w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3; albo (B) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie lub addycję jednego lub dwóch aminokwasów w sekwencji aminokwasowej jak przedstawiona w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3 i który jest zdolny do indukowania limfocytów T zabójców. Najlepszy sposób prowadzenia wynalazku (1) Peptyd według obecnego wynalazku oraz kompozycja induktora immunologicznego zawierająca ten peptyd stosowana do leczenia raka [0019] Peptydem według obecnego wynalazku jest peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej, jak przedstawiona w dowolnej spośród sekwencji SEKW. NR ID.: 1 do 3. [0020] Stosowane w obecnym opisie określenie "peptyd o zdolności do indukowania limfocytów T zabójćow" oznacza peptyd o indukującej limfocyty T aktywności stymulującej limfocyty T zabójców (cytotoksyczne limfocyty T/CTL). [0021] Sposób otrzymywania/wytwarzania peptydu według obecnego wynalazku nie jest konkretnie ograniczony. Można stosować białko syntetyzowane chemiczne lub białko rekombinantowe wytworzone metodą rekombinacji genetycznej. [0022] Gdy stosuje się peptyd syntetyzowany chemicznie, peptyd według obecnego wynalazku można syntetyzować sposobami takimi jak, na przykład, metoda Fmoc (z grupą fluorenylometyloksykarbonylową) lub metoda tboc (z grupą t-butyloksykarbonylową). Ponadto, peptyd według obecnego wynalazku można również zsyntetyzować stosując różnego typu syntezatory peptydów dostępne w handlu. [0024] Gdy peptyd według obecnego wynalazku został wytworzony w formie białka rekombinantowego, wówczas wywarza się DNA zawierający sekwencję nukleotydową kodującą ten peptyd, jego mutant lub homolog, a następnie wprowadza się do odpowiedniego układu ekspresyjnego i uzyskuje się peptyd według obecnego wynalazku. [0025] Jako wektor ekspresyjny korzystnie można stosować wektor zdolny do autonomicznej replikacji w komórce gospodarza lub wektor, który można wprowadzić do chromosomu komórki gospodarza. Stosuje się wektor ekspresyjny obejmujący promotor w pozycji zdolnej do ekspresji genu kodującego peptyd. Ponadto, przez wprowadzenie do gospodarza wspomnianego wektora ekspresyjnego można wytworzyć transformant zawierający gen kodujący peptyd według obecnego wynalazku. Jako gospodarza można stosować komórkę bakteryjną, komórkę drożdżową, komórkę zwierzęcą lub komórkę owadzią. Wektor ekspresyjny można wprowadzić do gospodarza znaną metodą, w zależności od typu takiego gospodarza. [0026] W obecnym wynalazku wytworzony jak powyżej transformant hoduje się, a następnie wytwarza się peptyd według obecnego wynalazku i gromadzi się w hodowli. Następnie, peptyd według obecnego wynalazku zbiera się z hodowli i wyizolowuje się peptyd rekombinantowy. [0027] Gdy transformantem takim jest prokariota, taki jak Escherichia coli lub eukariota, taki jak drożdże, jako pożywkę do hodowli takich mikroorganizmów można stosować pożywkę naturalną lub pożywkę syntetyczną, pod warunkiem, że zawiera ona źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne, itp., które mogą być asymilowane przez ten mikroorganizm, i że jest to pożywka, w której skutecznie można prowadzić hodowlę 6

8 transformanta. Ponadto, hodowlę taką można prowadzić w warunkach, które powszechnie stosuje się do hodowli takich mikroorganizmów. Po zakończeniu hodowli, peptyd według obecnego wynalazku można wyizolować z hodowli transformanta i oczyścić, typowymi metodami izolowania i oczyszczania peptydów. [0028] Peptyd złożony z sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie lub addycję jednego lub dwóch aminokwasów w aminokwasowej sekwencji, jak przedstawiona w dowolnej spośród sekwencji SEKW. NR ID.: 1 do 3, może być odpowiednio wytworzony lub uzyskany przez specjalistę w tej dziedzinie techniki na podstawie informacji dotyczących sekwencji nukleotydowej DNA kodującego sekwencję aminokwasową, jak przedstawiona w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3. Oznacza to, że gen kodujący peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie lub addycję jednego lub dwóch aminokwasów w sekwencji aminokwasowej, jak przedstawiona w dowolnej spośród sekwencji SEKW. NR ID.: 1 do 3 i który ma zdolność do indukowania limfocytów T zabójców, można wytworzyć dowolną metodą znaną specjalistom w tej dziedzinie techniki, taką jak synteza chemiczna, metody inżynierii genetycznej lub mutageneza. Przykładowo, do wprowadzenia konkretnej mutacji w konkretnej pozycji jako metoda inżynierii genetycznej przydatna jest mutageneza ukierunkowana. Taką ukierunkowaną mutagenezę można prowadzić sposobem opisanym w Molecular Cloning: A laboratory Manual, wydanie 2, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (określanym dalej skrótem Molecular Cloning. wyd. 2), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1 to 38, John Wiley & Sons ( ) (określanym dalej skrótem Current Protocols in Molecular Biology), itd. [0029] Jak opisano w poniższych przykładach, wspomniany peptyd według obecnego wynalazku jest zdolny do indukowania odporności przeciwko rakowi. A zatem, wynalazek obecny dostarcza induktora odporności stosowanego w przypadku raka, który obejmuje peptyd według obecnego wynalazku. [0030] Stosowany w przypadku raka induktor odporności według obecnego wynalazku stosuje się in vitro lub in vivo, a korzystnie in vitro, tak, aby mógł on indukować limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójcę lub zawierającą takie komórki populację immunocytów, i w ten sposób nadać im odporność na raka. (2) Przeciwciało według obecnego wynalazku [0031] Wynalazek obecny dotyczy również przeciwciała, które rozpoznaje jako epitop (antygen) część lub całość wspomnianego wyżej peptydu według obecnego wynalazku, oraz limfocytu T zabójcy indukowanego przez stymulację in vitro z zastosowaniem tego białka lub peptydu. Na ogół, taki limfocyt T zabójca wykazuje aktywność przeciwnowotworową, która jest silniejsza niż aktywność przeciwciała. [0032] Przeciwciałem według obecnego wynalazku może być przeciwciało poliklonalne lub przeciwciało monoklonalne. Przeciwciało takie można wytworzyć typowym sposobem. [0033] Przykładowo, przeciwciało poliklonalne można wytworzyć przez immunizowanie ssaka lub małp peptydem według obecnego wynalazku stosowanym jako antygen, a następnie przez pobranie krwi od ssaka lub małpy i wyodrębnienie i oczyszczenie przeciwciała z pobranej krwi. Przykładowo, można immunizować małpy lub ssaki, takie jak mysz, chomik, świnka morska, kura, szczur, królik, pies, koza, owca, lub wół. Takie metody immunizacji są znane specjalistom w tej dziedzinie techniki. Przykładowo, antygen można podawać 2 lub 3 razy w odstępie od 7 do 30 dni. Jako dawkę jednorazowo można podać, na przykład, około 0,05 do 2 mg antygenu. Droga podawania nie jest konkretnie ograniczona i można ją odpowiednio wybrać spośród podawania podskórnego, śródskórnego, śródotrzewnowego, dożylnego, domięśniowego, itd. Ponadto, anty- 7

9 gen można rozpuścić w odpowiednim buforze, na przykład można stosować bufor, który zawiera kompletny adiuwant Freunda, lub powszechnie stosowany adiuwant, taki jak tlenek glinu. [0034] Tak immunizowanego ssaka lub małpę hoduje się przez pewien czas. Następnie, gdy miano przeciwciała wzrasta, można zastosować dawkę wspomagającą, na przykład 100 do 1000 µg antygenu. Po miesiącu lub dwóch od ostatniej immunizacji od ssaka lub małpy pobiera się krew. Tak pobraną krew następnie oddziela się i oczyszcza zwykłymi metodami, obejmującymi odwirowanie, wytrącanie siarczanem amonu lub glikolem polietylenowym, chromatografię, taką jak chromatografia żelowa, chromatografia jonowymienna lub chromatografia powinowactwa, itd. i otrzymuje się przeciwciało poliklonalne rozpoznające peptyd według obecnego wynalazku w postaci poliklonalnej antysurowicy. [0035] Z drugiej strony, przeciwciało monoklonalne można otrzymać przez wytworzenie hybrydomy. Przykładowo, hybrydomę taką można otrzymać przez fuzję komórkową komórki wytwarzającej przeciwciało i komórki szpiczaka. Hybrydomę, która wytwarza przeciwciało monoklonalne według obecnego wynalazku, można otrzymać następującą metodą fuzji komórkowej. [0036] Jako komórkę wytwarzającą przeciwciało stosuje się komórkę śledziony, komórkę węzła chłonnego, limfocyt B, lub podobną komórkę uzyskaną od immunizowanego zwierzęcia. Jako antygen stosuje się peptyd według obecnego wynalazku. Jako zwierzę do immunizacji można stosować mysz, szczura, itp. Antygen podaje się takiemu zwierzęciu typowym sposobem. Przykładowo, zawiesinę lub zemulgowaną ciecz zawierająca adiuwant, taki jak kompletny adiuwant Freunda lub niekomplektny adiuwant Freunda, oraz stosowany jako antygen peptyd według obecnego wynalazku podaje się zwierzęciu przez podawanie dożylne, podawanie podskórne, podawanie śródskórne, podawanie śródotrzewnowe, itd., kilka razy, aż do uzyskania immunizacji. Następnie, od immunizowanego zwierzęcia pobiera się komórkę wytwarzającą antygen, taką jak komórka śledziony, i tak otrzymaną komórkę śledziony znaną metodą poddaje się fuzji z komórką szpiczaka (G Kohler et al., Nature, (1975)), uzyskując w ten sposób hybrydomę. [0037] Przykłady szczepów komórek szpiczaka, stosowanych w fuzji komórkowej, obejmują szczep P3X63Ag8, szczep P3UI oraz szczep Sp2/0 w przypadku myszy. Do przeprowadzenia takiej fuzji komórkowej stosuje się promotor fuzji, taki jak glikol polietylenowy lub wirus Sendai. Do selekcji hybrydomy po zakończeniu fuzji komórkowej stosuje się pożywkę zawierająca hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę (HAT), zgodnie z typową metodą. Hybrydomę otrzymaną w wyniku fuzji komórkowej klonuje się metodą ograniczonych rozcieńczeń. Ponadto, w razie potrzeby, prowadzi się skrining metodą immunologicznego testu enzymatycznego z zastosowaniem peptydu według obecnego wynalazku i otrzymuje się szczep komórkowy, który wytwarza przeciwciało monoklonalne specyficznie rozpoznające peptyd według obecnego wynalazku. [0038] W celu uzyskania z tak otrzymanej hybrydomy odpowiedniego przeciwciała monoklonalnego, hybrydomę tę można hodować typowa metodą hodowli komórkowej lub metodą wytwarzania w płynie otrzewnowym, a następnie przeciwciało monoklonalne można oczyścić z supernatant z hodowli lub z płynu otrzewnowego. Przeciwciało monoklonalne można oczyścić z supernatantu lub z płynu otrzewnowego typowym sposobem. Przykładowo, można stosować frakcjonowanie siarczanem amonu, filtrację żelową, chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa, lub w razie potrzeby, można też łączyć inne metody. [0039] Ponadto, w zakres wynalazku wchodzą również fragmenty opisanego wyżej przeciwciała. Przykłady takich fragmentów przeciwciała obejmują fragment F(ab')2 i fragment Fab'. (3) Limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójca lub populacja immunocytów zawierająca takie komórki 8

10 [0040] Wynalazek obecny dotyczy również limfocytu T pomocniczego, limfocytu T zabójcy lub populacji immunocytów zawierającej takie komórki, które indukuje się przez stymulację in vitro z zastosowaniem peptydu według obecnego wynalazku. Przykładowo, gdy in vitro z zastosowaniem peptydu według obecnego wynalazku stymuluje się limfocyty krwi obwodowej lub limfocyty infiltrujące nowotwór, indukowane są reaktywne wobec nowotworu aktywowane limfocyty T. Tak aktywowane limfocyty T można skutecznie stosować do adoptywnej immunoterapii. Ponadto, komórkom dendrytycznym, które są silnymi komórkami prezentującymi antygen, umożliwia się wyrażanie peptydu według obecnego wynalazku in vivo lub in vitro i następnie wyrażające antygen komórki dendrytyczne stosuje się do prowadzenia indukcji immunologicznej. [0041] Korzystnie, limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójcę, lub populację immunocytów zawierającą takie komórki, można indukować przez stymulację in vitro, stosując peptyd według obecnego wynalazku i immunostymulator. Przykłady takiego stosowanego tu immunostymulatora obejmują komórkowy czynnik wzrostu i cytokinę. [0042] Tak otrzymany limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójcę, lub populację immunocytów zawierającą takie komórki przenosi się do organizmu i w ten sposób można zahamować rozwój guza i zapobiec i/lub leczyć raka. [0043] Ponadto, stosując peptyd według obecnego wynalazku, można uzyskać limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójcę lub zawierającą takie komórki populację immunocytów, które są zdolne do zahamowania nowotworu, jak opisano powyżej. Tak więc, wynalazek obecny dostarcza roztworu hodowli komórkowej zawierającego peptyd według obecnego wynalazku. Stosując taki roztwór hodowli komórkowej można uzyskać limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójcę lub zawierającą takie komórki populację immunocytów, które są zdolne do zahamowania nowotworu. Ponadto, wynalazek obecny dostarcza również zestawu do hodowli komórkowej do wytwarzania pomocniczego limfocytu T, limfocytu T zabójcy lub zawierającej takie komórki populacji immunocytów, który obejmuje opisany wyżej roztwór do hodowli komórkowej oraz naczynie do hodowli komórkowej. (4) Środek farmaceutyczny według obecnego wynalazku do leczenia i/lub zapobiegania nowotworowi (szczepionka na raka) [0044] Ponieważ peptyd według obecnego wynalazku jest zdolny do indukowania specyficznych wobec komórek rakowych limfocytów T zabójców, można oczekiwać, że będzie on środkiem do leczenia i/lub zapobiegania rakowi. Przykładowo, jako szczepionkę do leczenia i/lub zapobiegania rakom u ludzi można skutecznie stosować bakterię, taką jak BCG (Bacillus Calmette-GuErin) stransformowaną rekombinantowym DNA wytworzonym przez wprowadzenie do odpowiedniego wektora genu kodującego peptyd według obecnego wynalazku, lub wirusy, takie jak wirus krowianki, do których genomu wprowadzono DNA kodujący peptyd według obecnego wynalazku. Należy zauważyć, że dawkowanie oraz sposób podawania takiej szczepionki na raka są takie same jak w przypadku typowego szczepienia na ospę lub szczepienia BCG. [0045] Innymi słowy, DNA kodujący peptyd według obecnego wynalazku (który stosuje się jako taki lub w formie 9

11 DNA plazmidowego wprowadzonego do wektora ekspresyjnego), albo rekombinantowy wirus lub rekombinantową bakterię obejmującą wspomniany wyżej DNA, można podawać jako szczepionkę na raka ssakom, łącznie z ludźmi, bezpośrednio lub w postaci zdyspergowanej w adiuwancie. Podobnie, jako szczepionkę na raka można również podawać peptyd według obecnego wynalazku w postaci, w której jest on zdyspergowany w adiuwancie. [0046] Przykłady adiuwantów stosowanych w obecnym wynalazku obejmują niekompletny adiuwant Freunda, BCG, dimykolan trehalozy (TDM), lipopolisacharyd (LPS), adiuwant alum i adiuwant krzemionkowy. Z uwagi na zdolność do indukowania przeciwciała, korzystnie stosuje się niekompletny adiuwant Freunda (IFA). [0047] W obecnym opisie typ raka nie jest konkretnie ograniczony. Konkretne przykłady raka obejmują raka przełyku, raka sutka, raka tarczycy, raka okrężnicy, raka trzustki, czerniaka złośliwego (czerniaka), chłoniaka złośliwego, kostniakomięsaka, barwiaka chromochłonnego, raka głowy i szyi, raka macicy, raka jajnika, raka mózgu, przewłekłą białaczkę mielogenną, ostrą białaczkę mielogenną, raka nerki, raka prostaty, raka płuc, raka żołądka, raka wątroby, raka pęcherza żółciowego, raka jądrek, raka tarczycy, raka pęcharza i mięsaka. [0048] Peptyd według obecnego wynalazku działa jak epitop limfocytu T i indukuje specyficzny wobec komórki rakowej limfocyt T zabójcę. Tak więc, peptyd według obecnego wynalazku jest użyteczny jako środek do zapobiegania i/lub leczenia raka u ludzi. Ponadto, jeśli przeciwciało według obecnego wynalazku jest zdolne do hamowania aktywności GPC3 jak antygen rakowy, jest ono także użyteczne jako środek do zapobiegania i/lub leczenia raka u ludzi. Do faktycznego zastosowania peptyd lub przeciwciało według obecnego wynalazku można podawać jako produkt do wstrzykiwania, bezpośrednio lub razem z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub rozcieńczalnikiem, i w razie potrzeby również z wymienionymi niżej substancjami pomocniczymi. Ponadto, peptyd lub przeciwciało według obecnego wynalazku można rówież podawać sposobem takim jak rozpylanie, przez absorpcję przezskórną przez śluzówkę. Stosowane tu określenie nośnik oznacza, na przykład, albuminę surowicy ludzkiej. Ponadto, jako rozcieńczalnik można stosować PBS, wodę destylowaną, itp. [0049] Peptyd lub przeciwciało według obecnego wynalazku można podawać w dawce w zakresie od 0,01 do 100 mg dla dorosłego pacjenta na dawkę. Jednakże, dawka nie jest ograniczona do wymienionego wyżej zakresu. Również postać użytkowa nie jest konkretnie ograniczona. Można także stosować produkt liofilizowany lub granulat wytworzony przez dodanie substancji pomocniczej, takiej jak cukier. [0050] Przykłady substancji pomocniczych, które można dodawać do środka według obecnego wynalazku w celu zwiększenia aktywności indukującej reaktywne wobec nowotworu limfocyty T, obejmują: muramylodipeptyd (MDP); składniki bakteryjne, takie jak bakterie BCG; ISCOM opisany w Nature, vol. 344, str. 873 (1990); saponinę QS-21 opisaną J. Immunol. vol. 148, str (1992); liposom; oraz tlenek glinu. Ponadto, jako substancje pomocnicze można również stosować immunostymulatory, takie jak lentinan, schizofylan lub Picibanil. Inne przykłady produktów stosowanych tu jako substancje pomocnicze obejmują: cytokiny do zwiększania wzrostu lub różnicowania limfocytów T, takie jak IL-2, IL-4, IL-12, IL-1, IL-6 lub TNF; galaktozyloceramid do aktywowania komórek NKT; CpG, który wiąże się z receptorem Toll-podobnym i aktywuje wrodzony układ odpornościowy; oraz lipopolisaacharyd (LPS). [0051] Ponadto, opisany wyżej peptyd antygenowy dodaje się in vitro do komórek pobranych od pacjenta lub (allogenicznych) komórek z innego źródła, które mają kilka wspólnych alleli HLA, po czym następuje prezentacja antygenu komórkom. Następnie komórki podaje się do naczynia krwionośnego pacjenta w celu 10

12 skutecznego indukowania limfocytów T zabójców w organizmie pacjenta. Ponadto, peptyd według wynalazku dodaje się do limfocytów krwi obwodowej pacjenta i następnie tak otrzymaną mieszaninę hoduje się in vitro. W ten sposób można in vitro indukować limfocyty T zabójców, a następnie z powrotem wprowadzić je do naczynia krwionośnego pacjenta. Taką terapię polegającą na przenoszeniu komórki prowadzono już jako sposób leczenia raka, a zatem sposób ten jest dobrze znany specjalistom w tej dziedzinie techniki. [0052] Przez wprowadzenie peptydu według wynalazku do organizmu limfocyty T zabójcy indukują się i aktywują, w wyniku czego można uzyskać działanie przeciwnowotworowe. Ponadto, gdy limfocyty stymuluje się peptydem według obecnego wynalazku in vitro, indukują się aktywowane limfocyty T. Aktywowane limfocyty T wstrzykuje się do zmienionego chorobowo obszaru. Tę technikę można skutecznie stosować do adoptywnej immunoterapii. [0053] Wynalazek opisano poniżej w następujących przykładach. Przykłady [Przykład 1] (1) Dobór peptydu GPC3 o zdolności do wiązania się z HLA-A2 [0054] Sekwencji aminokwasów ludzkiego GPC3 poszukiwano stosując system BIMAS i wybrano 4 typy sekwencji o ustalonym powinowactwie wobec HLA-A2 wynoszącym 20 lub powyżej. [Tablica 1] Pozycja peptydu Sekwencja aminokwasowa peptydu Wynik dla powinowactwa wiązania GPC RLQPGLKWV 879 GPC FVGEFFTDV 828 GPC YILGSDINV 162 GPC ELFDSLFPV 1055 [Przykład 2] [0055] Indukowanie ludzkich limfocytów T zabójców przez wiążący się z HLA-A2 peptyd GPC3 (1) Pobieranie krwi [0056] Świadomą zgodę uzyskano od poddawanych terapii na oddziale chirurgii gastroenterologicznej, Kumamoto University School of Medicine i w Hospital East, the National Cancer Center, HLA-A2- pozytywnych pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym. Następnie od każdego pacjenta pobrano 30 ml próbkę krwi i wyizolowano monojądrząste komórki krwi obwodowej, stosując metodę Ficoll-Conray wirowa- 11

13 nia w gradiencie gęstości, zgodnie z opisanym wcześniej sposobem (Nakatsura, T. i in., Eur. J. Immunol. 32, (2002)). (2) Oddzielenie komórek CD8-pozytywnych i CD14-pozytywnych od monojądrzastych komórek krwi obwodowej i indukowanie limfocytów T zabójców [0057] Limfocyty T zabójców z wyizolowanych komórek monojądrzastych krwi obwodowej indukowano opisaną wcześniej metodą (Monji, M i in., Clin Cancer Res 10, , 2004). Najpierw, stosując MACS od monojądrzastych komórek krwi obwodowej oddzielono komórki CD8-pozytywne i CD14-pozytywne. Komórki CD14-pozytywne hodowano w obecności GM-CSF (100 ng/ml) i IL-4 (20 ng/ml) przez 5 dni i w ten sposób zaindukowano różnicowanie komórek dendrytycznych. Następnie, w celu maturacji dodano TNF-α (20 ng/ml). Siódmego dnia dodano każego spośród peptydów GPC3 (10 µm) i prowadzono współhodowlę z komórkami CD8-pozytywnymi. Taką stymulację antygenu autologicznymi CD14-pozytywnymi komórkami pochodzącymi od komórek dendrytycznych powtarzano 3 lub 4 razy w tygodniu i w ten sposób indukowano specyficzne wobec peptydu limfocyty T zabójców. Podczas indukcji co dwa dni połowę pożywki wymieniano na świeżą i dodawano IL-2 w stężeniu 10 U/ml. (3) Analiza aktywności GPC3-specyficznych limfocytów T zabójców metodą ELISPOT [0058] Obecność lub nieobecność limfocytu T zabójcy, który niezawodnie i specyficznie reaguje z GPC3 i wytwarza IFN-γ, indukując w ten sposób limfocyty T zabójców, badano metodą ELISPOT. BPN-γ wykrywano stosując zestaw ELISPOT Human IFN-γ ELISPOT (BD). Gdy limfocyt T zabójca (efektor) reaguje z komórką stymulatorową (cel) i wytwarza IFN-γ, każdy IFN-γ jest wykrywany jako czerwona plamka. Jako komórki docelowe stosowano komórki SK-Hep-1 jako komórki macierzyste, które są HLA-A2-pozytywne i nie wyrażają GPC3, oraz komórki SK-Hep-1/GPC3, w których do komórek SK-Hep-1 wprowadzono gen GPC3 i które wyrażają białko GPC3. Najpierw, płytkę do ELISPOT (BD Bioscience) przez 18 godzin powlekano przeciwludzkim przeciwciałem IFN-γ. Następnie, płytkę przez 2 godziny blokowano 10% FCS/RPMI. Komórki efektorowe (100 µl/studzienkę) zmieszano z komórkami docelowymi (100 µl/studzienkę), po czym mieszaninę hodowano w temperaturze 37 C przez 22 godziny. Eksperyment prowadzono przy stosunku pomiędzy komórkami efektorowymi i docelowymi (stosunek E/T) wynoszącym 5:1. Następnie, płytkę przemyto sterylizowaną wodą i przez 2 godziny poddawano reakcji z biotynylowanym przeciwludzkim przeciwciałem IFN-γ, a potem przez 1 godzinę ze streptawidyną-hrp. Następnie, IFN-γ-pozytywne plamiki wykrywano stosując roztwór substratu. Ilość takich plamek liczono stosując oprogramowanie do automatycznej analizy MINERVA. TECH. W rezultacie, dla limfocytów T zabójców indukowanych przez peptydy GPC , i można było wykryć aktywność GPC3-specyficznego limfocytu T zabójcy. Jednakże, w przypadku limfocytów T zabójców indukowanych przez peptyd GPC (Figury 1 i 2) nie wykryto aktywności specyficznego wobec GPC3 limfocytu T zabójcy. Wyniki analizy dla limfocytów T zabójców indukowanych przez reprezentatywny peptyd GPC przedstawiono na Figurze 1. (4) Analiza aktywności cytotoksycznej limfocytów T zabójców z zastosowaniem testu cytotoksyczności 12

14 [0059] Aktywność cytotoksyczną indukowanych limfocytów T zabójców badano stosując test cytotoksyczności, a jako stymulowane komórki stosowano komórki macierzyste SK-Hep-1, które są HLA-A2-pozytywne i nie wyrażają GPC3, oraz komórki SK-Hep-1/GPC3, w których do komórek SK-Hep-1 wprowadzono gen GPC3, aby wyrażały białko GPC3. Aktywność cytotoksyczną limfocytów T zabójców oceniano w teście cytotoksyczności z zastosowaniem Terascan VP. Najpierw, komórki docelowe znakowano fluorescencyjnie roztworem barwiącym kalceiny AM w temperaturze 37 C przez 30 minut. Komórki takie współhodowano z limfocytami T zabójcami na połowie powierzchni 96-studzienkowej płytki Coster, a następnie fluorescencyjnie znakowane komórki wykrywano w czasie, mierząc w ten sposób stopień cytotoksyczności. Analizę prowadzono stosując test cytotoksyczności z oprogramowaniem komputerowym CalCt-961 z MINERS TECH, które wcześniej stosowano w metodzie fluorescencyjnej. Badanie prowadzono przy stosunku E/T wynoszącym 20:1. W wyniku tego badania potwierdzono GPC3-specyficzną aktywność cytotoksyczną dla limfocytów T zabójców indukowaną przez peptydy GPC , i Jednakże dla limfocytów T zabójców nie obserowano GPC3-specyficznej aktywności cytotoksycznej wywołanej przez peptyd GPC (Figura 2). Zastosowanie w przemyśle [0060] Skuteczność immunoterapii rakowej, która skierowana jest na peptyd prezentowany przez HLA-A24, potwierdzono w badaniach na zwierzętach z zastosowaniem myszy. Jednakże, gdy stosowano takie peptydy, prezentowane przez HLA-A24 limfocytom T zabójcom, szczepionki peptydowe można było podać jedynie 60% Japończyków. Tym razem, w wyniku zidentyfikowania peptydu prezentowanego limfocytom T zabójcom przez HLA-A2, adresatami kombinacji dwóch typów szczepionek peptydowych może stać się około 85% ludzi w Japonii. Wraz z potwierdzeniem skuteczności eksperymentalnych środków terapeutycznych, w których stosuje się peptyd prezentowany limfocytom T zabójcom przez HLA-A2, stanie się wysoce prawdopodobne, że peptyd taki będzie można stosować klinicznie dla pacjentów rasy białej w krajach zachodnich. Ponadto, zidentyfikowanie takiego peptydu, prezentowanego limfocytom T zabójcom przez HLA-A2, umożliwi jego stosowanie nie tylko u 40% pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym i czerniakiem w Japonii, ale również u wielu pacjentów rasy białej, w której częstotliwość występowania HLA-A2 jest wyższa niż u Japończyków. Krótki opis rysunków [0061] Na Figurze 1 przedstawiono reprezentatywne wyniki otrzymane z analizy ELISPOT, dla IFN-γ wytworzonego przez limfocyty T zabójców, które specyficznie rozpoznały peptydy GPC3 i zostały aktywowane. W odniesieniu do limfocytów T zabójców indukowanych przez stymulowanie komórek CD8-pozytywnych z krwi obwodowej pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym przez komórki dendrytyczne pochodzące od CD14-pozytywnych monocytów obciążonych peptydem GPC , gdy jako komórki stymulatorowe (prawa strona na figurze) stosowano komórki SK-Hep-1/GPC3, w których do komórek SK-Hep-1 wprowadzono gen GPC3, aby wyrażały one białko GPC3, liczba plamek oraz całkowita powierzchnia takich plamek była znacznie większa niż w przypadku, gdy jako komórki stymulatorowe (lewa strona na figurze) stosowano 13

15 komórki SK-Hep-1 jako komórki macierzyste, które są HLA-A2-pozytywne i nie wyrażają GPC3. Na podstawie tych wyników można wnosić, że peptyd GPC jest peptydem epitopowym zdolnym do indukowania specyficznych wobec GPC3 limfocytów T zabójców. Na Figurze 2 przedstawiono wyniki analizy ELISPOT oraz testu cytotoksyczności. Jako CD8-pozytywne limfocyty T wybrano komórki krwi obwodowej od HLA-A2-pozytywnego pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym i następnie komórki te stymulowano komórkami dendrytycznymi pochodzącymi z monocytów obciążonych poszczególnymi peptydami GPC3. Obecność specyficznej reakcji tak otrzymanych limfocytów T zabójców z komórkami wyrażającymi GPC3 i wytworzony IFN-γ badano w teście ELISPOT. Ponadto, w teście cytotoksyczności badano, czy powyższe limfocyty T zabójcy specyficznie zabijają komórki wyrażające GPC3. Jak komórki docelowe stosowano komórki SK-Hep-1 jako macierzyste komórki, które są HLA-A2- pozytywne i nie wyrażają GPC3, oraz komórki SK-Hep-1/GPC3, w których do komórek SK-Hep-1 wprowadzono gen GPC3, aby wyrażały białko GPC3. Zgodnie z uzyskanym wynikiem, limfocyty T zabójcy indukowane przez peptydy GPC , oraz specyficznie wobec GPC3 rozpoznają komórki SK- Hep-1/GPC3 i wytwarzają IFN-γ, wykazując również silną aktywność cytotoksyczną. W przeciwieństwie do tego, limfocyty T zabójcy, indukowane przez peptyd GPC , nie wykazują specyficznej wobec GPC3 aktywności limfocytu T zabójcy. Na podstawie tych wyników wykazano, że peptydy GPC , i są peptydami epitopowymi zdolnymi do indukowania specyficznych wobec GPC3-limfocytów T zabójców. LISTA SEKWENCJI [0062] <110> Kumamoto University <120> Pochodzący od glipikanu-3(gpc3) peptydowy antigen odrzucenia nowotworu dla HLA-A2- pozytwnego pacjenta oraz zawierający go lek <130> A61163A <160> 3 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 1 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna 14

16 <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 2 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Opis sekwencji sztucznej: Syntetyczny peptyd <400> 3 Zastrzeżenia patentowe 1. Peptyd złożony z sekwencji aminokwasów jak przedstawiona w dowolnej spośród sekwencji SEKW. NR ID.: 1 Do Kompozycja induktora immunologicznego stosowana w przypadku raka, która obejmuje co najmniej jeden peptyd według zastrz Kompozycja farmaceutyczna do stosowania w leczeniu i/lub zapobieganiu nowotworom, która obejmuje co najmniej jeden typ peptydu według zastrz Kompozycja środka do indukowania komórek prezentujących antygen o wysokiej zdolności do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T, która obejmuje peptyd według zastrz Kompozycja środka do indukowania komórek prezentujących antygen o wysokiej zdolności do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T do stosowania do leczenia i/lub zapobiegania nowotworom, która obejmuje gen kodujący peptyd według dowolnego z następujących punktów (A) lub (B): (A) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej, jak przedstawiono w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3; albo (B) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie lub addycję jednego lub dwóch aminokwasów w sekwencji aminokwasowej jak przedstawiona w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3, i który ma zdolność do indukowania limfocytów T zabójców. 15

17 6. Kompozycja środka do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T, która obejmuje peptyd według zastrz Przeciwciało przeciwko peptydowi według zastrz Limfocyt T pomocniczy, limfocyt T zabójca, lub zawierająca takie komórki populacja immunocytów, która jest indukowana z zastosowaniem peptydu według zastrz Komórka prezentująca antygen, ktora prezentuje kompleks składający się z cząsteczki HLA I peptydu według zastrz Komórka prezentująca antygen według zastrz. 9, która jest indukowana z zastosowaniem kompozycji środka według zastrz. 4 albo Sposób in vitro indukowania komórek prezentujących antygen o wysokiej zdolności do indukowania reaktywnych wobec nowotworu limfocytów T, który obejmuje gen kodujący peptyd według dowolnego z następujących punktów (A) lub (B): (A) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej, jak przedstawiono w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3; albo (B) peptyd, który składa się z sekwencji aminokwasowej obejmującej podstawienie lub addycję jednego lub dwóch aminokwasów w sekwencji aminokwasowej jak przedstawiona w dowolnej spośród SEKW. NR ID.: 1 do 3, i ma zdolność do indukowania limfocytów T zabójców. 16

18 Rysunki [Fig. 1] Komórki do stymulacji Liczba plamek Całkowita powierzchnia 17

19 [Fig. 2] Peptyd GPC3 wiążący się z HLA-A2 Analiza ELISPOT (E/T = 5:1) Test cytotoksyczności (E/T = 20:1) Komórki do stymulacji Liczba plamek Stopień lizy komórek (%) 18

20 ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Cytowaną przez zgłaszającego listę odnośników zamieszczono jedynie dla wygody czytającego. Nie stanowi ona części dokumentu Patentu Europejskiego. Nawet przy dużej staranności w zestawieniu listy odnośników, nie można wykluczyć błędów i pominięć i EPO zrzeka się odpowiedzialności w tym względzie. Cytowane w opisie dokumenty patentowe Cytowana w opisie literatura niepatentowa 19