(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2010/22 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61K39/39 A61K39/395 C07H21/02 C07K14/52 ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Immunostymulująca kombinacja do profilaktyki i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu c (30) Pierwszeństwo: ES ES (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2008/31 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 10/2010 (73) Uprawniony z patentu: Proyecto de Biomedicina Cima, S.L., Zizur Mayor, ES (72) Twórca (y) wynalazku: PL/EP T3 ZABALETA AZPIROZ Aintzane, Pamplona, ES BORRAS CUESTA Francisco, Pamplona, ES PRIETO VALTUEÑA Jesús, Pamplona, ES SAROBE UGARRIZA Pablo, Pamplona, ES LASARTE SAGASTIBELZA Juan José, Pamplona, ES (74) Pełnomocnik: Przedsiębiorstwo Rzeczników Patentowych Patpol Sp. z o.o rzecz. pat. Żebrowska-Kucharzyk Agnieszka Warszawa 130 skr. pocz. 37 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy immunostymulującej kombinacji do profilaktyki i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C, która zawiera białko NS3 wirusa HCV wraz z adiuwantami wybranymi pod kątem ich zdolności do wywoływania specyficznych, skutecznych i trwałych odpowiedzi typu CD8+ i CD4+ skierowanych przeciwko wirusowi HCV. STAN TECHNIKI [0002] Zakażenie wirusem wątroby typu C (HCV), przy szacowanej liczbie przypadków wynoszącej ponad 170 mln zakażonych ludzi, stanowi obecnie istotne obciążenie dla zdrowia publicznego. A wydaje się, że w nadchodzących latach prewalencja ta nie będzie się zmieniać. [0003] Zakażenie wirusem HCV charakteryzuje wysoka tendencja do przewlekłego przebiegu. Wirus HCV przeżywa u 70% zakażonych osobników, z których u 20% prowadzi do rozwoju marskości wątroby, a u 2.5% dochodzi do rozwoju raka wątroby. [0004] Aktualnie rekomendowanym narzędziem terapeutycznym, do którego można się odnieść, są protokoły terapeutyczne oparte na zastosowaniu interferonu. Niemniej jednak takie terapie antywirusowe są ekonomicznie kosztowne, stosunkowo toksyczne i skuteczne jedynie w przypadku 50-60% leczonych pacjentów. Dlatego też niezbędnym i pożądanym jest opracowanie nowych terapeutycznych strategii, które będą skuteczniejsze i będą lepiej tolerowane u pacjentów. [0005] Zaktualizowaną pracę przeglądową na temat wirusa HCV można znaleźć w Nature ("Insights: Hepatitis C". Nature 2005, Supplements; Vol. 436, Nr. 7053, pp ). [0006] Mimo, że choć nie dysponujemy jeszcze skuteczną szczepionką przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu C, dostępne dane eksperymentalne pozwalają sądzić, że wynalezienie skutecznej szczepionki jest możliwe. Mimo iż w odpowiedzi na zakażenie produkowane są przeciwciała antywirusowe, przewlekły stan cechuje brak immunologicznej odpowiedzi typu komórkowego ze strony cytotoksycznych komórek T (CD8+) i pomocniczych komórek T (CD4+). Dlatego też zakłada się, że wirus HCV rozwinął strategie pozwalające mu w sposób specyficzny unikać przeciwwirusowych odpowiedzi immunologicznych, gdzie siła i jakość takiej odpowiedzi, opartej o cytotoksyczne i pomocnicze komórki T, determinuje wyleczenie pacjentów (zarówno w przypadku samoistnego wyleczenia lub wyleczenia w odpowiedzi na leczenie) lub to czy dojdzie u nich do rozwoju przewlekłego zakażenia. [0007] Głównym zadaniem każdej szczepionki jest stymulacja specyficznej względem antygenu nabytej odporności oraz mediatorów, jakimi są limfocyty B i T. W związku z tym, komórki prezentujące antygen (APC) odgrywają ważną rolę w zapoczątkowaniu specyficznej odpowiedzi immunologicznej, a w szczególności w aktywacji limfocytów T. Komórki APC, a przede wszystkim komórki dendrytyczne, wychwytują antygeny w narządach obwodowych, a następnie, po otrzymaniu czynnika stymulującego, migrują do narządów limfatycznych. Tam komórki dendrytyczne prezentują na swojej powierzchni peptydowe produkty związane do właściwych cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej MHC, powstałe w wyniku degradacji antygenów (epitopy) oraz wytwarzają w sposób ciągły chemokiny i cytokiny w celu zwabienia i aktywacji komórek T. Ten proces aktywacji komórek dendrytycznych nazywany również dojrzewaniem charakteryzuje wysoki poziom wyrażanych cząsteczek MHC (sygnał 1), cząsteczek kostymulujących (sygnał 2) i cytokin regulacyjnych, takich jak interleukina-12 (IL-12) 1

3 (sygnał 3). Dojrzewanie to indukowane jest przez czynniki takie jak składniki patogenów lub cząsteczki gospodarza, które spotykane są często w zapaleniu lub procesach niszczenia komórek. Czynniki te oddziałują na komórki dendrytyczne poprzez specyficzne receptory dla produktów pochodzących z mikroorganizmów, takie jak receptory typu TLR (receptory Toll-podobne), receptory dla cytokin (TNFα, IL-1, IFN-α) lub receptory dla ligandów na powierzchni komórek (np.: CD40). [0008] Stymulacja i aktywacja przez komórki APC różnych populacji komórek T z jednej strony ograniczona jest przez typ cząsteczek MHC, a z drugiej strony przez właściwości epitopów, które tworzą kompleksy z tymi cząsteczkami MHC. Tak więc przykładowo, identyfikowane były określone fragmenty białek wirusowych specyficznie indukujących aktywację cytotoksycznych limfocytów T CD8+ (CTL), nazywane epitopami limfocytów lub epitopami komórek T CD8+ lub epitopami CD8+; lub epitopy, które specyficznie indukują aktywację pomocniczych limfocytów T CD4+ (HTL), tzw. epitopy CD4+. Baza danych "HCV Immunology Database" ( obejmuje zestawienie epitopów dla limfocytów T, zarówno CTL CD8+ jak i HTL CD4+, zidentyfikowanych w oparciu o białka wirusowe różnych szczepów i izolatów wirusa zapalenia wątroby typu C. [0009] W związku z powyższym opracowanie protokołów immunizacyjnych opartych na zastosowaniu epitopów w formie peptydów wymaga wcześniejszej selekcji odpowiednich dla każdego osobnika peptydów, pod kątem typu prezentowanych przez niego cząsteczek MHC. Oznacza to, że w zależności od obecnych u danego osobnika cząsteczek MHC, określona kombinacja peptydów musiałaby być wybrana tak, aby była zdolna do zachowywania się jak epitopy w powyżej opisanym kontekście. Zastosowanie dużych antygenów pozwala obejść ten problem, ponieważ są one zazwyczaj antygenami zawierającymi wiele epitopów i prezentują w swojej sekwencji różne epitopy, zarówno te dla CTL CD8+, jak i te dla HTL CD4+, które mogą być prezentowane przez cząsteczki MHC obecne u różnych osobników. W ten sposób pojedynczy antygen może być użyty jako szczepionka u osobników z różnymi cząsteczkami MHC. [0010] Spośród różnych białek wirusa HCV, rdzeń i białko NS3 wykazują dużą immunogenność, a w przypadku osobników, którzy przezwyciężyli zakażenie, wykrywano silną odpowiedź CTL CD8+ i HTL CD4+ przeciwko tym antygenom. Mimo to, istnieją dane pokazujące, że rdzeń w chwili, gdy znajduje się w kontakcie z komórkami układu odpornościowego, może również wykazywać szkodliwe efekty względem tych komórek, co czyni go niewskazanym antygenem z punktu widzenia strategii szczepionkowych. Z drugiej strony NS3 jest białkiem, które prawie nie wykazuje opisanego efektu i mogłoby być dobrym kandydatem na antygen indukujący odpowiedzi CTL CD8+ i HTL CD4+. [0011] Na tle przytoczonych informacji, opis patentowy WO 2002/ A2 ujawnia zastosowanie białka NS3 pochodzącego z wirusa HCV jako antygenu do wytwarzania szczepionek przeznaczonych do profilaktyki i leczenia zakażeń wirusem HCV. Białku NS3 może towarzyszyć adiuwant- rybawiryna, który można spotkać w opisanej lub w innej kompozycji farmaceutycznej. Dodatkowo adiuwant ten może być podawany jednocześnie z antygenem lub jego podanie może następować w innym momencie niż podanie antygenu. Dokument ten nie pokazuje jednak, że rybawiryna podwyższa odpowiedź immunologiczną typu CD8 przeciwko białku NS3. 2

4 [0012] HTL CD4+ mają znaczenie w odporności nabytej, razem z innymi mechanizmami uruchamianymi poprzez aktywację APC, aktywację CTL i indukcję pamięci immunologicznej. W szczególności opisano, że specyficzne dla wirusa HCV komórki CD4+ są niezbędne do utrzymania antywirusowych CTL (Grakoui A. i współp., "HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T-cell help"; Science, 2003; 302: ). Dlatego też skuteczna szczepionka przeciwko wirusowemu zapaleniu wątroby typu C musi zapewnić maksymalną siłę w indukowaniu nie tylko odpowiedzi CTL CD8+, ale również odpowiedzi HTL CD4+. W związku z tym taka szczepionka będzie wymagała selekcji specyficznych antygenów, które zapewnią takie odpowiedzi. [0013] Nie oznacza to jednak, że taka kombinacja antygenów może sama sobie stanowić skuteczną szczepionkę przeciwko HCV. Biorąc pod uwagę fakt, że dojrzewanie komórek dendrytycznych jest warunkiem skutecznej inicjacji i aktywacji limfocytów T, korzystnym dla takiej szczepionki będzie włączenie do immunostymulującej kombinacji pewnych adiuwantów, które stymulowałyby dojrzewanie komórek dendrytycznych. Jako adiuwanty mogłyby zostać użyte ligandy receptorów TLR, receptorów cytokin lub ligandy receptorów dla wymienionych wcześniej ligandów wewnątrzkomórkowych, a jeszcze lepiej działająca w sposób synergistyczny kombinacja takich adiuwantów. [0014] Tak więc przykładowo, Rouas i współp. (International Immunology, May 2004, 16(5): ) ujawniają zastosowanie in vitro CD40L, IFN-γ oraz poli(i:c), syntetycznego ligandu dla TLR3, w kompozycji farmaceutycznej indukującej wytwarzanie dojrzałych komórek dendrytycznych. To pokazuje, że komórki dendrytyczne, które dojrzały w wyniku działania poli(i:c), są jedynymi komórkami, wydzielającymi IL-12p70 po stymulacji CD40L, do czego nie dochodzi w przypadku dojrzewania indukowanego IFN-γ. Publikacja ta ujawnia również dojrzewanie komórek dendrytycznych w wyniku ich inkubacji zarówno z CD40L, jak i z poli(i:c). Dojrzałe komórki dendrytyczne są bardzo ważne dla odpowiedzi immunologicznej, ponieważ wydzielana przez nie IL-12 aktywuje zarówno limfocyty Th1 oraz cytotoksyczne limfocyty T. [0015] Dalej, opis patentowy US2004/ opisuje immunostymulujące kombinacje, które zawierają antagonistę receptorów TLR lub antagonistę cząsteczek z super-rodziny czynnika nekrozy nowotworu (TNF) lub antagonistę receptorów TNF (TNFR), oraz które mogą również zawierać antygen. Pośród wielu możliwych kombinacji, patent ten prezentuje kombinację złożoną z ligandu dla CD40 (przeciwciało anty-cd40) i poli(i:c), w przypadku której wykazano synergistyczny efekt działania na wzrost limfocytów T CD8+. Podobnie, Ahonen i współp. (J. Exp. Med. 2004; 199: ) przedstawiają dane dotyczące synergistycznego działania agonistów TLR/CD40, w sposób niezależny od limfocytów T CD4+, na indukcję wzrostu i różnicowania się specyficznych względem antygenu CTL CD8+. Mimo iż prace te opisują zdolność TLR/CD40 do aktywacji limfocytów T CD8+, charakterystycznych dla specyficznej względem antygenu pamięci immunologicznej, nie jest możliwe ustalenie na ich podstawie czy opisana kombinacja agonistów może również wzmocnić odpowiedź HTL CD4+. [0016] W przypadku zakażenia wirusem HCV, zidentyfikowano wyraźną różnicę w odpowiedzi HTL CD4+ między pacjentami zakażonymi oraz tymi, którzy byli zdolni wyeliminować zakażenie. Niemniej jednak, mimo iż u pacjentów zakażonych, w porównaniu z pacjentami wyleczonymi, tego typu odpowiedź była gorsza, wciąż wykrywalna była u nich odpowiedź typu CTL CD8+. Dlatego mimo iż 3

5 CTL wydają się być populacją komórek efektorowych odgrywającą ważną rolę w usuwaniu zakażenia wirusem HCV, w zwalczaniu choroby znaczącą rolę odgrywają również komórki CD4+. Opisano ponadto, że indukcja limfocytów T CD4+ jest ważna dla utrzymania przeciwwirusowych odpowiedzi CTL (Grakoui A. i współp., "HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T-cell help"; Science, 2003; 302: ). Wyniki te sugerują, że w przypadku szczepień i terapii chorób wirusowych spowodowanych HCV, ważną rolę odgrywa indukcja silnej i trwałej odpowiedzi antywirusowej typu CD8+ i CD4+. [0017] W związku z tym celem niniejszego wynalazku jest selekcja immunostymulujących kombinacji antygenów i adiuwantów odpowiednich do profilaktyki i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C, które zapewnią stymulację obu typów odpowiedzi: CD8+ i CD4+ - silniejszych, pełniejszych i trwalszych. SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU [0018] Pierwszym przedmiotem niniejszego wynalazku jest immunostymulująca kombinacja przeznaczona do profilaktyki i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C, określana w dalszej części niniejszego dokumentu jako immunostymulująca kombinacja będąca przedmiotem wynalazku, która zawiera agonistę TLR3, agonistę CD40 lub sekwencję DNA, która je koduje oraz polipeptyd zawierający białko NS3 wirusa zapalenia wątroby typu C lub fragment wspomnianego białka NS3, oraz która wykazuje zdolność do indukcji odpowiedzi typu CD8+ i CD4+. [0019] Termin agonista TLR3 odnosi się do ligandu, który może występować w kombinacji lub być związany do receptorów TLR3 (receptor Toll-podobny 3) i indukuje odpowiedź komórkową. TLR3 jest receptorem dla dwuniciowego RNA, przekazuje sygnały aktywujące NF-κB i wytwarzanie interferonów typu I (IFN-α i IFN-β) oraz stymuluje dojrzewanie komórek dendrytycznych. Myszy, które nie wyrażały TLR3, wykazywały obniżony poziom odpowiedzi na poli(i:c) podobny do dwuniciowego RNA ligand dla TLR3 powstający podczas replikacji wirusa HCV, stawały się odporne na letalny efekt poli(i:c) w warunkach uwrażliwienia myszy D-galaktozaminą oraz obserwowano u nich obniżenie poziomu zapalnych cytokin (Alexopoulou i współp. Nature, 2001, Vol. 413, pp ). W szczególnym wykonaniu niniejszego wynalazku, wspomniany ligand dla TLR3 może być wirusowym dwuniciowym RNA lub podwójnym łańcuchem kwasu poliinozyno-policytydylowego - poli(i:c). [0020] Wyrażenie agonista CD40 odnosi się do ligandu, który może występować w kombinacji lub być związany z receptorami CD40 indukując również odpowiedź komórkową. CD40 jest cząsteczką wyrażaną w błonie różnych typów komórek, takich jak limfocyty E lub komórki prezentujące antygen (makrofagi, komórki dendrytyczne itp.). Naturalny ligand dla CD40 (CD40L lub CD154) wyrażany jest głównie przez limfocyty zaktywowane w wyniku rozpoznania antygenu. Oddziaływanie CD40L z CD40, do którego dochodzi w komórkach prezentujących antygen, indukuje dojrzewanie tych kmórek. Zjawisko to w sposób podobny do stymulacji wywołanej przez patogeny powoduje, że komórki prezentujące antygen nabywają większą zdolność do indukowania odpowiedzi immunologicznej. Stąd agonista CD40 w immunostymulującej kombinacji będącej przedmiotem niniejszego wynalazku odnosi się z jednej strony do ligandu CD40L lub do fragmentu CD40L, który zachowuje zdolność do wiązania się z CD40 (anty-cd40) oraz indukcji komórkowej lub immunologicznej odpowiedzi. W szczególnym wykonaniu, ligand ten może być specyficznym przeciwciałem skierowanym przeciwko CD40 (anty- 4

6 CD40) lub fragmentem tego przeciwciała, który zachowuje zdolność do wiązania się z CD40. Ponadto, ligand dla CD40 lub jego fragment mogą być obecne w immunostymulującej kombinacji zarówno w formie białka, jak również w formie rekombinowanego kwasu nukleinowego (DNA) kodującego ten ligand, przykładowo w formie wektora wirusowego przeznaczonego do transfekcji lub terapii genowej. [0021] Określenie antygen odnosi się do każdej substancji, która zdolna jest do indukcji w organizmie osobnika (człowieka lub zwierzęcia) odpowiedzi immunologicznej, zarówno typu humoralnego jak i typu komórkowego, lub która może indukować odpowiedź immunologiczną typu komórkowego (rozrost, aktywację i/lub dojrzewanie komórek układu odpornościowego, wytwarzanie cytokin lub przeciwciał) w wyniku kontaktu z komórkami układu odpornościowego. W szczególności, antygenem tym może być białko wirusowe, peptyd lub fragment wspomnianego białka wirusowego, rekombinowane formy takich wirusowych białek lub nawet syntetyczny peptyd zdolny do indukcji odpowiedzi uruchamianej na drodze aktywacji szlaków sygnałowych. [0022] Termin epitop indukujący CD8+ odnosi się do fragmentu lub części polipeptydowego łańcucha antygenu, które zdolne są do specyficznej indukcji aktywacji cytotoksycznych limfocytów T CD8+ (CTL). Określenie epitop indukujący CD4+ odnosi się do fragmentu lub części polipeptydowego łańcucha antygenu, które zdolne są do specyficznej indukcji aktywacji pomocniczych limfocytów T CD4+ (HTL). [0023] Określenie białko NS3 odnosi się do niestrukturalnego białka NS3 pochodzącego z wirusa zapalenia wątroby typu C - białka o masie 67 kda zawierającego 2 domeny: domenę o aktywności proteinazy serynowej obejmującą 189 aminokwasów z N-końca i domenę o aktywności helikazytrójfosfatazy nukleozydów obejmującej końcowe 442 aminokwasy z C-końca. Sekwencja białka NS3 zawarta w polipeptydzie z immunostymulującej kombinacji będącej przedmiotem niniejszego wynalazku może odpowiadać sekwencji z jakiegokolwiek szczepu lub izolatu wirusa zapalenia wątroby typu C. W szczególnym wykonaniu ten polipeptyd, zawierający białko NS3, otrzymywany jest przy zastosowaniu technologii rekombinacji. W szczególnym, lecz nie ograniczonym do niżej podanego wykonania niniejszego wynalazku, stosowane jest rekombinowane białko NS3 o sekwencji SEKW. Nr: 1 (odpowiadającej numerom dostępowym Genebank DQ i AAY , VRL 28-NOV-2005). Zastosowaliśmy również inną sekwencję białka rekombinowanego SEKW. Nr: 2 (odpowiadającą numerowi dostępowemu Genebank D90208). [0024] W innym alternatywnym wykonaniu niniejszego wynalazku, możliwe jest również zastosowanie polipeptydu zawierającego fragment białka NS3, w sposób taki, że wspomniany fragment zdolny jest do indukcji odpowiedzi CD8+ i CD4+. Zatem wspomniany fragment będzie zawierał co najmniej jeden epitop indukujący CD8+ i jeden epitop indukujący CD4+. [0025] W szczególnym wykonaniu, immunostymulująca kombinacja będąca przedmiotem wynalazku zawiera poli(i:c), przeciwciało anty-cd40 oraz polipeptyd zawierający białko NS3. [0026] W korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, ta immunostymulująca kombinacja zawiera wszystkie składniki tworzące część tej samej farmaceutycznej kompozycji, gdzie każdy ze składników obecny jest w ilościach akceptowalnych farmaceutycznie. Ponadto wynalazek odnosi się również do wspomnianej farmaceutycznej kompozycji. 5

7 [0027] W innym szczególnym wykonaniu niniejszego wynalazku, składniki tej immunostymulującej kombinacji stanowią część co najmniej dwóch farmaceutycznych kompozycji. Wynalazek ten odnosi się ponadto do zastosowania wspomnianej immunostymulującej kombinacji, charakteryzującej się tym, że wspomniane kompozycje farmaceutyczne podawane są jednocześnie. Inne wykonanie niniejszego wynalazku odnosi się do zastosowania wspomnianej immunostymulującej kombinacji, charakteryzującego się tym, że wspomniane kompozycje farmaceutyczne podawane są w innych momentach tą samą drogą lub z użyciem innych dróg podawania. W ten sposób, jedno szczególne wykonanie niniejszego wynalazku odnosi się do zestawu do podawania opisanej powyżej immunostymulującej kombinacji, charakteryzującej się tym, że zawiera co najmniej dwie różne kompozycje farmaceutyczne. [0028] W innym aspekcie, niniejszy wynalazek odnosi się do sposobu wywoływania odpowiedzi immunologicznej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C charakteryzującego się tym, że obejmuje on podawanie zdefiniowanej powyżej stymulującej kombinacji w ilościach skutecznych do wywołania odpowiedzi immunologicznej. W korzystnym wykonaniu, sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku obejmuje działanie profilaktyczne. W bardziej korzystnym wykonaniu, sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku działanie lecznicze. [0029] Ostatecznie, niniejszy wynalazek odnosi się także do szczepionki przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C, charakteryzującej się tym, że zawiera ona zdefiniowaną powyżej immunostymulującą kombinację i tworzy przedmiot niniejszego wynalazku. KRÓTKI OPIS FIGUR [0030] Figura 1. Jednoczesna immunizacja anty-cd40 i poli(i:c) razem z białkiem NS3 indukuje skierowane przeciwko wielu epitopom odpowiedzi limfocytów T CD4+ i CD8+. Myszom HHD (dwie w każdej grupie) wstrzykiwano 50 g anty-cd40 (i.p.). Cztery godziny później, myszom wstrzykiwano 50 g poli(i:c) (i.v.) i 500 g rekombinowanego białka NS3 (i.p.) (SEKW. Nr: 1). Po upływie sześciu dni zwierzęta uśmiercano, a splenocyty izolowano w celu przeprowadzenia stymulacji in vitro przy użyciu różnych antygenów oraz analizy wyindukowanej odpowiedzi immunologicznej. (A) Komórki stymulowano przez pięć dni epitopami CD8+: 1073, 1406 lub 1038 (10 µm) w obecności IL-2. Po czym dla każdej z grupy splenocytów mierzono odpowiedź lityczną względem komórek docelowych, które zawierały (peptyd, czarne słupki) lub były pozbawione (kontrola, białe słupki) odpowiedniego peptydu. Uzyskane wyniki przedstawiono dla stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych wynoszącego 100:1. B) W ten sam sposób hodowano splenocyty w obecności różnych stężeń ( µm) peptydów 1073 (czarne koła), 1406 (białe trójkąty) lub 1038 (czarne trójkąty), a po upływie 48 godz. od stymulacji mierzono poziom IFN-γ w supernatantach znad hodowli przy użyciu testu ELISA. (C) W celu zmierzenia odpowiedzi typu CD4+, splenocyty stymulowano także przez 48 godz. stosowanym do immunizacji białkiem NS3 (SEKW. Nr: 1) w ilości 5 lub 1 µg/ml, białkiem NS3 wytworzonym w bakteriach (SEKW. Nr: 3) w ilości 1 µg/ml lub podłożem hodowlanym (kontrola). Po tym okresie czasu supernatanty zbierano, a ilość wytworzonego IFN-γ mierzono przy użyciu testu ELISA. 6

8 Figura 2. Pomiar ilości białka NS3 potrzebnego do wyindukowania odpowiedzi limfocytów T CD4+ i CD8+ będącej wynikiem immunizacji z zastosowaniem poli(i:c) i anty-cd40. Myszy HHD (dwie w każdej grupie) immunizowano białkiem NS3 (SEKW. Nr: 1) (500, 250, 125 lub 25 µg/mysz) razem z poli(i:c) i anty-cd40, postępując zgodnie z protokołem opisanym dla Fig. 1. Do eksperymentu włączono również grupę kontrolną immunizowaną w ten sam sposób, z zastosowaniem jako antygenów 5 µg NS3 (SEKW. Nr: 1) i 50 µg peptydów 1073 i 1038, razem z poli(i:c) i anty-cd40. Po sześciu dniach zwierzęta uśmiercano, a splenocyty izolowano i stymulowano różnymi antygenami (A). W celu pomiaru wyindukowanej odpowiedzi litycznej, komórki stymulowano przez pięć dni epitopem CD (10 µm) oraz IL-2. Następnie mierzono odpowiedź porównując działanie różnych ilości komórek efektorowych względem stałej liczby komórek docelowych prezentujących peptydy. Ponadto, wyindukowana odpowiedź typu CD8+ była analizowana w oparciu o pomiar poziomu wytwarzanego IFN-γ. W tym celu komórki stymulowano różnymi stężeniami peptydów 1073 (B) i 1038 (C). W celu pomiaru odpowiedzi CD4+, komórki stymulowano także białkiem NS3 (SEKW. Nr: 1). Po upływie 48 godz. mierzono ilość IFN-γ obecnego w supernatantach. Figura 3. Immunizacja przy użyciu poli(i:c) i CD40 w połączeniu z białkiem NS3 indukuje odpowiedź typu CD4+ i CD8+ u innych szczepów myszy posiadających różne cząsteczki MHC. Myszy C57BL6 (posiadające cząsteczki MHC typu H2-b) (dwie w każdej grupie) poddano jednej (białe kwadraty) lub dwóm (czarne kwadraty) immunizacjom z użyciem 100 µg białka NS3 (SEKW. Nr: 1) w połączeniu z poli(i:c) i anty-cd40, postępując zgodnie z protokołem opisanym dla Fig. 1. Sześć dni później zwierzęta uśmiercano, a splenocyty hodowano w obecności różnych antygenów w celu pomiaru wyindukowanej odpowiedzi typu CD8+ i CD4+. Do stymulacji splenocytów i pomiaru odpowiedzi typu CD8+ użyto epitopu restrykcyjnego H-2 Db (GAVQNEVTL) (SEKW. NR: 7) (A). W celu określenia odpowiedzi CD4+ użyto białka NS3 (SEKW. NR: 1) (B). Po upływie dwóch dni hodowli zbierano supernatanty i mierzono poziom wytworzonego IFN-γ. Figura 4. Immunizacja przy użyciu białka NS3 razem z poli(i:c) i CD40 indukuje odpowiedź typu CD8+ pozwalającą na rozpoznanie komórek wyrażających białka wirusa HCV. (A) Myszom HHD (dwie w każdej grupie) wstrzykiwano 100 µg białka NS3 (SEKW. NR: 2) razem z poli(i:c) i anty-cd40, jak to opisano dla Fig. 1. Sześć dni później zwierzęta uśmiercano, a ich splenocyty stymulowano, w obecności IL-2, traktowanymi mitomycyną komórkami T1/HCVcon (komórki T1 transfekowane plazmidem wyrażającym białka wirusa HCV). Po upływie pięciu dni od stymulacji, mierzono zdolność splenocytów do rozpoznawania komórek T1/HCVcon przy pomocy testów na aktywność lityczną. W tym celu różne ilości splenocytów inkubowano ze stałą liczbą komórek T1/HCVcon (czarne koła) lub ze stałą liczbą komórek kontrolnych T1, które nie były transfekowane (białe koła) Figura 5. Immunizacja przy użyciu poli(i:c) i anty-cd40 w połączeniu z białkiem NS3 indukuje trwałą odpowiedź limfocytów T CD4+ i CD8+. Myszom HHD (dwie w każdej grupie) wstrzykiwano 100 µg białka NS3 (SEKW. NR: 2) razem z poli(i:c), jak to opisano dla Fig. 1. Dwa tygodnie później zwierzęta poddano drugiej immunizacji, prowadzonej w tych samych warunkach. Po sześćdziesięciu dniach od drugiej immunizacji zwierzęta uśmiercano, a ich splenocyty izolowano w celu zbadania trwałej odpowiedzi limfocytów T typu CD8+ i CD4+. (A) Splenocyty stymulowano epitopem CD (10 µm) lub hodowano bez obecności antygenu, a po upływie 48 godz. supernatanty znad hodowli 7

9 pobierano w celu pomiaru ilości wytworzonego IFN-γ. (B) Splenocyty hodowano przez 5 dni w obecności peptydu 1073 (10 µm) i IL-2, a następnie badano ich zdolność do lizy komórek docelowych zawierających peptyd W tym celu różne ilości komórek efektorowych inkubowano ze stałą liczbą komórek docelowych z peptydem 1073 (czarne koła) lub przy braku peptydu (białe koła). (C) Odpowiedź typu CD4+ badano przeprowadzając stymulację splenocytów białkiem NS3 (1 µg/ml) (SEKW. NR: 2) lub przy braku antygenu. Supernatanty zbierano po 48 godz. i mierzono ilość wytworzonego IFN-γ. SPOSÓB WYKONANIA WYNALAZKU [0031] Zamieszczone poniżej przykłady mają na celu nieograniczającą jego zakresu ilustrację korzystnych wykonań wynalazku będącego przedmiotem niniejszego zgłoszenia patentowego. MATERIAŁ I METODY UŻYTECZNE W PRAKTYCZNEJ REALIZACJI WYNALAZKU Epitopy, antygeny i odczynniki [0032] Stosowane peptydy i epitopy syntezowano ręcznie przy pomocy syntezatora peptydów, wykorzystując reakcje chemiczną bazującą na grupach Fmoc (Wellings DA. i Atherton E. Methods Enzymol 1997; 289: 44-67). Do monitorowania każdego z etapów stosowano ninhydrynowy test Kaiser a. Pod koniec syntezy peptydy zostały połączone, grupy ochronne usunięto przy pomocy kwasu trójfluorooctowego, a następnie peptydy przemyto eterem dietylowym. Czystość peptydów za każdym razem wynosiła więcej niż 90%, co określano przy pomocy HPLC. Tabela 1. Peptydy i epitopy syntezowane i wykorzystywane w przykładach. Peptyd lub epitop Sekwencja GLLGCIITSL; SEKW. NR: CVNGVCWTV; SEKW. NR: KLVALGINAV; SEKW. NR: GAVQNEVTL; SEKW. NR: 7 [0033] Numeracja peptydu lub epitopu odnosi się do jego względnej pozycji HCVH, biorąc jako odniesienie kompletną sekwencję występującą w szczepie H ludzkiego wirusa zapalenia wątroby typu C, która zazwyczaj wykorzystywana jest jako prototyp (numer dostępowy GeneBank M67463). Tak więc przykładowo, baza danych "HCV Immunology Database" ( immuno/immunomain.html) obejmuje epitopy dla limfocytów T, zarówno cytotoksycznych jak i pomocniczych, identyfikowane w białkach wirusowych różnych szczepów i izolatów wirusa zapalenia wątroby typu C, które to wszystkie uporządkowano zgodnie z ich względną pozycją w odniesieniu do szczepu H wirusa, zgodnie z odnośnikiem podanym przez GeneBank. [0034] Jako immunogenu użyto rekombinowanego polipeptydu złożonego z 655 aminokwasów, który zawiera kompletną sekwencję białka NS3 (SEKW. NR: 1; Genebank numer dostępowy AAY , VRL 28-NOV-2005; 631 aminokwasów). Polipeptyd ten, oprócz 631 aminokwasów białka NS3, zawiera również koniec z sekwencją c-myc, pozwalający na detekcję przy użyciu monoklonalnego przeciwciała anty-myc oraz znacznik złożony z reszt histydyny. Białko wytwarzano w Pichia pastoris. Wytwarzanie białka prowadzone jest w zawiesinie w roztworze 22.5 mm Tris / 3.76 M mocznik / 300 mm NaCl. Białko oczyszczano przy użyciu chromatografii na kolumnie wypełnionej nośnikiem Ni. 8

10 [0035] Jako immunogenu użyto również innego rekombinowanego polipeptydu, który zawiera 635 aminokwasów obejmujących kompletną sekwencję białka NS3 (SEKW. NR: 2; Genebank numer dostępowy D90208). Oprócz aminokwasów odpowiadających białku NS3, polipeptyd zawiera również znacznik histydynowy ułatwiający oczyszczanie. Sekwencja DNA odpowiadająca białku NS3 została otrzymana przez trawienie enzymami Sal I i Not I plazmidu gwiz, który zawierał sekwencję NS3 (dostarczony przez dr. G. Inchauspe, Lion, Francja). Produkt trawienia wklonowano w miejsca otrzymane w wyniku trawienia plazmidu pet-45 (+) (Novagen, Madison WI) enzymami restrykcyjnymi BsrG I i Not I, wyrażano w komórkach E. coli i oczyszczano przy użyciu chromatografii powinowactwa na kolumnie wypełnionej nośnikiem Ni, a następnie przy pomocy chromatografii jonowymiennej. [0036] W przypadku testów in vitro również stosowano jako antygen rekombinowany polipeptyd (Mikrogen; numer katalogowy 94302) zawierający ostatnie 20 aminokwasów niestrukturalnego białka NS2 i pierwsze 508 aminokwasów białka NS3 pochodzącego z HVC (SEKW. NR: 3). [0037] Jako antagonistę TLR3 stosowano poli(i:c) uzyskany z firmy Amersham (numer katalogowy ). [0038] Jako antagonistę CD40 stosowano przeciwciała anty-cd40 oczyszczone i pochodzące z hybrydomy FGK-45 (Rolink A. i współp., Immunity : ). [0039] Wszystkie odczynniki zawierały <1 jednostkę endotoksyny na mg produktu, co oznaczano przy pomocy testu QCL-1000 opartego na zastosowaniu lizatu amebocytów Limulus (Bio Whittaker). Myszy [0040] Myszy C57B1/6, w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, pochodziły z Harlan TM. Stosowano również myszy HHD myszy transgeniczne dla ludzkich cząsteczek HLA-A2.1 (Pascolo S. i współp., J. Exp. Med : ). Wszystkie zwierzęta hodowano w sterylnych warunkach i traktowano zgodnie z wytycznymi panującymi w instytucji. Linie komórkowe [0041] Komórki T2, (Salter R. i współp. Immunogenetics, : ) które były używane jako komórki docelowe w teście uwalniania chromu z zastosowaniem cytotoksycznych limfocytów T (CTL), pochodziły od myszy HHD. [0042] W przypadku testów na rozpoznawanie komórek prezentujących białka HCV, stosowano komórki T1 transfekowane nośnikiem plazmidowym regionu kodującego HCV (komórki T1/HCVcon). Komórki te zostały dostarczone przez dr D. Moradpour (Freiburg, Niemcy; Volk B. i współp., J Gen Virol. 2005; 86: ). Stosowano również jako kontrolę nietransfekowane komórki T1 (ATCC, numer katalogowy CRL-1991). [0043] Wszystkie komórki hodowano na pełnym podłożu (RPMI 1640 zawierające 10% płodową surowicę wołową, 100 U/ml penicyliny, 100 µg/ml streptomycyny, 2 mm glutaminy i 50 µm 2- merkaptoetanolu). Hodowla linii komórkowej T1/HCVcon zawierała również 2 mg/ml G418 (Gibco). Immunizacja [0044] Grupy zawierające po 2 myszy immunizowano 50 µg anty-cd40 (i.p). Cztery godziny później, zwierzętom wstrzykiwano 50 µg poli(i:c) (i.v.) oraz różne ilości antygenów: białka NS3 lub mieszaniny NS3 z peptydami (i.p.). 9

11 Stymulacja komórek śledziony do wytwarzania cytokin [0045] Komórki śledziony zawieszano w pełnym podłożu zawierającym lub pozbawionym peptydów lub rekombinowanego białka NS3 wirusa HCV i nanoszono na 96-dołkową płytkę o dołkach w kształcie litery U w ilości 8 x 10 5 komórek/dołek w objętości 0.2 ml. [0046] Dwa dni później zbierano supernatanty w celu pomiaru obecności IFN-γ przy użyciu testu ELISA (BD-Pharmingen), zgodnie z instrukcją producenta. Pomiar litycznej aktywności CTL [0047] Dla zmierzenia odpowiedzi CTL, splenocyty pochodzące od immunizowanych zwierząt inkubowano z peptydami (10 µm) przez 2 godz. w 37 C, przemywano dwukrotnie i hodowano na 24- dołkowej płytce zawierającej zawiesinę komórek w ilości komórek/dołek. W przypadku eksperymentów przeprowadzonych w celu pomiaru zdolności komórek T1/HCVcon do rozpoznawania, spelenocyty od myszy HHD w ilości 7.5 x 10 6 hodowano z traktowanymi wcześniej mitomycyną C (Sigma) komórkami T1/HCVcon w ilości 7.5 x We wszystkich przypadkach do dołków dodawano dwa dni później 2.5 U/ml IL-2 (Boehringer-Mannheim GmbH, Niemcy), a następnie po upływie 5 dni komórki odzyskiwano w celu przeprowadzenia testu uwalniania chromu. [0048] Aktywność lityczną mierzono inkubując przez 4 godz., w obecności oraz przy braku peptydu (celu), różne ilości komórek efektorowych z 3000 komórek docelowych T2 wyznakowanych wcześniej 51 Cr. W przypadku komórek stymulowanych T1/HCVcon, komórki efektorowe poddawano kontaktowi z komórkami T1/HCVcon lub T1, wyznakowanymi wcześniej 51 Cr. [0049] Określony procent lizy obliczano zgodnie ze wzorem: (cpmeksperymentalne cpmspontaniczne) / (cpmmaksymalne cpmspontaniczne) 100, gdzie efekt lizy spontanicznej (mierzony jako cpmspontaniczne) odnosi się do komórek docelowych inkubowanych przy braku komórek efektorowych, natomiast efekt lizy maksymalnej (cpmmaksymalne) uzyskiwano przy inkubacji komórek docelowych z 5% Tritonem X-100. PRZYKŁAD 1 Immunizacja anty-cd40 i poli(i:c) razem z białkiem NS3 indukuje skierowaną przeciwko wielu epitopom odpowiedź limfocytów T typu CD4+ i CD8+. [0050] Immunizacja z zastosowaniem jedynie anty-cd40 i poli(i:c) oraz syntetycznych peptydów jako immunogenów, które stanowią epitopy dla komórek CD8+, skutecznie indukuje odpowiedź typu CD8+. Mimo iż taka strategia pozwala indukować silne odpowiedzi, pokazano, że jednoczesne podanie podczas immunizacji małych ilości białka NS3 (5 µg/mysz), które indukuje odpowiedzi CD4+, zwiększa siłę odpowiedzi CD8+ oraz zwiększa odpowiedź typu CD8+ charakteryzującą się wysokim powinowactwem, innymi słowy taką, która pozwala na rozpoznanie niskich stężeń antygenu. Ponadto immunizacja z użyciem peptydów jest skuteczna jedynie u osobników posiadających cząsteczki o tej samej, jak wybrane epitopy, restrykcji w zakresie HLA. W celu osiągnięcia obu celów, przeprowadzono badania nad tym czy immunizacja większymi ilościami rekombinowanego białka NS3 pozwoliłaby na indukcję nie tylko odpowiedzi typu CD4+, ale również typu CD8+. W tym celu myszy immunizowano białkiem NS3, podając jednocześnie poli(i:c) i anty-cd40, a następnie badano wyindukowane odpowiedzi. W związku z tym myszom HHD (dwie w każdej grupie) wstrzykiwano 50 µg anty-cd40 (i.p.). Po upływie 4 godz. myszom wstrzykiwano 50 µg poli(i:c) (i.v.) i 500 µg 10

12 rekombinowanego białka NS3 (i.p.) (SEKW. Nr: 1). Sześć dni później, zwierzęta uśmiercano, a splenocyty izolowano. W celu analizy immunogenności białka NS3, po wcześniejszym przygotowaniu adiuwantu poli(i: C) + anty-cd40 indukującego odpowiedzi limfocytów T CD8+ i CD4+, splenocyty stymulowano in vitro różnymi antygenami, które aktywują specyficznie te populacje komórek. (A) W celu analizy odpowiedzi typu CD8+, w pierwszym eksperymencie splenocyty przez pięć dni stymulowano w obecności IL-2 epitopami CD8+: 1073, 1406 lub Po czym, w przypadku każdej grupy komórek stymulowanej peptydem, mierzono ich zdolność do lizy komórek docelowych, które prezentowały odpowiedni peptyd (czarne słupki) lub stanowiły grupę komórek kontrolnych pozbawionych peptydu (białe słupki). Figura 1 pokazuje wyniki otrzymane dla stosunku komórek efektorowych do komórek docelowych równego 100:1. (B) Wyindukowaną po immunizacji białkiem NS3 odpowiedź typu CD8+ analizowano również poprzez analizę wytwarzania IFN-γ w odpowiedzi na te same epitopy CD8+. W tym celu splenocyty hodowano z różnymi ilościami 1073 (czarne koła), 1406 (białe trójkąty) lub 1038 (czarne trójkąty). Po upływie 48 godz. hodowli supernatanty zbierano i mierzono zawartość IFN-γ. (C) W celu analizy wyindukowanej odpowiedzi typu CD4+, splenocyty stymulowano stosowanym podczas immunizacji białkiem NS3 (SEKW. NR: 1). Komórki stymulowano także komercyjnie dostępnym białkiem NS3 wytworzonym w bakteriach (SEKW. NR: 3). W sposób podobny do opisanego w poprzednim punkcie, stopień aktywacji mierzono oznaczając wytwarzany IFN-γ. [0051] Przede wszystkim umożliwiło to sprawdzenie, czy ten antygen był zdolny do wyindukowania odpowiedzi typu CD8+, która mogła być wykryta zarówno w teście uwalniania chromu (Figura 1A) oraz poprzez indukcję wytwarzania IFN-γ (Figura 1B). Ponadto odpowiedź ta była skierowana przeciwko wielu epitopom CD8+, które scharakteryzowano w obrębie sekwencji białka NS3 (np.: peptydy 1073, 1406 i 1038). Ostatecznie, potwierdzono również zdolność badanych kombinacji do indukcji odpowiedzi typu CD8+, które pozwalają na rozpoznanie stosowanego do immunizacji białka NS3 oraz komercyjnego białka NS3 wytworzonego w bakteriach (Figura 1C). Odpowiedź przeciwko temu drugiemu białku była niższa, co przypuszczalnie było spowodowane obecnością pewnych różnic w sekwencji obu białek oraz tym, że białko wyrażane w bakteriach było krótsze, przez co mogło utracić pewne epitopy rozpoznawane przez limfocyty T CD4+. PRZYKŁAD 2 Podanie 25 µg rekombinowanego białka NS3 razem z poli(i:c) i anty-cd40 jest wystarczające do indukcji odpowiedzi limfocytów T CD4+ i CD8+. [0052] W oparciu o wcześniejsze doświadczenia wiedzieliśmy, że używając białka NS3 w ilości 5 µg indukowana była odpowiedź typu CD4+, ale nie odpowiedź typu CD8+. W związku z tym chcieliśmy ustalić minimalną ilość NS3, która byłaby wystarczająca do indukcji odpowiedzi typu CD8+. W tym celu, myszy HHD immunizowano 500, 250, 125 i 25 µg białka NS3 (SEKW. NR: 1). Do eksperymentu włączono również jako kontrolę grupę immunizowaną peptydami stanowiącymi epitopy CD8+, które miały indukować odpowiedzi typu CD8+, oraz 5 µg białka NS3 (SEKW. NR: 1), które miało indukować odpowiedzi typu CD4+. W tym celu dla każdej grupy zwierząt immunizowanych dawką NS3 przeprowadzono analizę odpowiedzi CD8+ i CD4+. Odpowiedź typu CD8+ analizowano badając zdolność do lizy komórek docelowych zawierających epitop CD (Ryc. 2A), poddając 11

13 jednocześnie analizie zdolność do wytwarzania IFN-γ w układzie różnych stężeń epitopów CD (Ryc. 2B) i 1038 (Ryc. 2C). Odpowiedzi CD4+ mierzono określając zdolność do wytwarzania IFN-γ w zależności od różnych stężeń NS3 (SEKW. NR: 1) ( Ryc. 2D). Doświadczenie to pokazało, że wszystkie stężenia testowanego białka NS3 były zdolne do wyindukowania odpowiedzi typu CD8+ w przypadku analizy litycznej odpowiedzi na obecność peptydu 1073 (Ryc. 2A), przy czym dawka 25 µg stanowiła ilość indukującą odpowiedzi o najsłabszej intensywności. Ponadto wszystkie dawki były zdolne do indukowania wytwarzania IFN-γ w odpowiedzi na obecność epitopów 1073 (Ryc. 2B) i 1038 (Ryc. 2C), co pokazało, że utrzymywano zdolność do indukcji odpowiedzi skierowanej przeciwko wielu epitopom nawet przy zredukowanych dawkach. Ostatecznie, i jak oczekiwano, wszystkie z nich indukowały odpowiedzi typu CD4+. Uwzględniając to, że w większości przypadków, gdy używano 25 µg NS3, wyidukowana odpowiedź była mniejsza, w późniejszych doświadczeniach wybrano dawkę 100 µg/mysz, zaczynając od dawki, dla której nie obserwowano wzrostu indukcji odpowiedzi. PRZYKŁAD 3 Immunizacja poli(i:c) i anty-cd40 razem z białkiem NS3 indukuje odpowiedzi typu CD4+ i CD8+ u innych szczepów myszy posiadających różne MHC. [0053] Biorąc pod uwagę fakt, że w tak dużym antygenie jak białko NS3 możliwe jest znalezienie epitopów CD4+ i CD8+, które mogą być prezentowane przez różne cząsteczki MHC, badano zdolność tego protokołu immunizacji do indukcji odpowiedzi typu CD4+ i CD8+ u innego szczepu myszy, posiadającego inne cząsteczki MHC. W tym celu myszy C57/BI6, które posiadają cząsteczki MHC H- 2b, immunizowano 100 µg białka NS3 (SEKW. NR:1). Aby polepszyć odpowiedzi, jedną grupę poddano jednej immunizacji, a drugą grupę dodatkowej drugiej immunizacji wzmacniającej. Przede wszystkim mierzono odpowiedź typu CD8+, określając poziom wytwarzanego IFN-γ w odpowiedzi na obecność peptydu (SEKW. NR: 7) zawierającego epitop CD8+ prezentowany przez cząsteczki MHC klasy I H-2 Db. Jak pokazano na Figurze 3A, w obu grupach myszy indukowana była mierzalna odpowiedź, przy czym poziomy były znacząco większe w przypadku grupy poddanej dwóm immunizacjom (czarne kwadraty), niż w przypadku grupy poddanej jednej immunizacji (białe kwadraty). Odpowiedź typu CD4+, mierzona jako wytwarzanie IFN-γ w odpowiedzi na rekombinowane białko NS3 (SEKW. NR: 1), była również wykrywana w obu grupach (Figura 3B), przy czym znowu wykazano, że dwukrotna immunizacja (czarne kwadraty) indukuje silniejszą odpowiedź niż immunizacja pojedyncza (białe kwadraty). PRZYKŁAD 4 Immunizacja białkiem NS3 razem z poli(i:c) i anty-cd40 indukuje odpowiedzi typu CD8+ zdolne do rozpoznawania komórek wyrażających białka HCV. [0054] W celu zbadania czy immunizacja białkiem NS3 razem z poli(i:c) i anty-cd40 byłaby zdolna do indukowania odpowiedzi, które potencjalnie mogłyby prowadzić do śmierci komórek zakażonych wirusem HCV, zastosowano model in vitro polegający na użyciu docelowych komórek transfekowanych plazmidem wyrażającym białka wirusa HCV (T1/HCVcon). Komórki te wyrażały, poprzez swoje cząsteczki MHC klasy I, te same peptydy, które byłyby wyrażane przez komórki zakażone HCV; Zostało to zatem przyjęte jako odpowiedź przeciwko wirusowi HCV. Białko NS3 (SEKW. NR: 1), użyte w doświadczeniach objętych Figurami od 1 do 3, odpowiadało białku innego 12

14 wirusowego szczepu niż ten obecny w komórkach T1/HCVcon. Oba szczepy wykazywały pewne różnice w badanych do tej pory epitopach CD8+. W celu optymalizacji zdolności do rozpoznawania epitopów CD8+ obecnych w komórkach T1/HCVcon, w doświadczeniu tym jako immunogenu użyto białka NS3, którego sekwencja posiada stopień homologii większy niż białko obecne w komórkach T1/HCVcon. Sześć dni po immunizacji myszy HHD białkiem NS3 w ilości 100 µg, splenocyty stymulowano komórkami T1/HCVcon. Zdolność komórek T1/HCVcon do rozpoznawania analizowano w teście na aktywność lityczną. W tym celu stymulowane splenocyty hodowano w obecności komórek T1/HCVcon oraz kontrolnych komórek T. Jak pokazano na Figurze 4, immunizacja NS3 indukowała odpowiedzi charakteryzujące się większą zdolnością do lizy komórek T1, które prezentowały białka HCV (czarne koła) niż do lizy kontrolnych komórek T (białe koła). PRZYKŁAD 5 Immunizacja poli(i:c) i anty-cd40 razem z białkiem NS3 indukuje trwałe odpowiedzi limfocytów T CD4+ i CD8+. [0055] Jedną z głównych cech, które musi posiadać protokół immunizacyjny jest jego zdolność do indukcji trwałej odpowiedzi immunologicznej, to znaczy takiej nabytej w wyniku immunizacji odporności, która może trwać przez długi okres czasu. W celu zbadania tego, czy immunizacja anty- CD40 i poli(i:c) razem z białkiem NS3 byłaby zdolna do indukowania tego typu odpowiedzi, myszy HHD immunizowano 100 µg NS3, zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. W celu wzmocnienia odpowiedzi, po upływie 15 dni, zwierzęta otrzymały dawkę wzmacniającą podaną w tych samych warunkach. Sześćdziesiąt dni po drugiej immunizacji zwierzęta uśmiercano, a ich splenocyty stymulowano różnymi antygenami w celu analizy utrzymującej się w tym momencie odpowiedzi limfocytów T CD8+ i CD4+. Aby zbadać odpowiedź limfocytów T CD8+, komórki stymulowano epitopem 1073 i mierzono wytwarzanie IFN-γ oraz ich aktywność lityczną. Jak pokazano na Figurze 5A, sześćdziesiąt dni po drugiej immunizacji splenocyty myszy immunizowanych anty-cd40 i poli(i:c) razem z białkiem NS3 były zdolne w wyniku stymulacji peptydem 1073 do wytwarzania dużych ilości IFN-γ. Opisanej zdolności nie obserwowano przy braku antygenu. Ponadto, komórki te były zdolne do lizy komórek docelowych prezentujących peptyd 1073 (czarne koła). Do lizy nie dochodziło, gdy komórki docelowe nie prezentowały antygenu (białe koła) (Figura 5B). Ostatecznie badana była również odpowiedź typu CD4+, a jako antygenu użyto tu białka NS3 wykorzystywanego do immunizacji. Figura 5C pokazuje, że ten protokół immunizacyjny indukuje silne i trwałe odpowiedzi typu CD4+, które specyficznie rozpoznają białko NS3. LISTA SEKWENCJI [0056] <110> PROYECTO DE BIOMEDICINA CIMA S.L. <120> IMMUNOSTYMULUJĄCA KOMBINACJA DO PROFILAKTYKI I LECZENIA WIRUSOWEGO ZAPALENIA WĄTROBY TYPU C 13

15 <130> <160> 7 <170> Patentin Version 3.1 <210> SEKW. NR: 1 <211> 631 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu C <220> <221> MISC_FEATURE <223> Niestrukturalne białko NS3 <400> 1 14

16 15

17 <210> SEKW. NR: 2 <211> 635 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu C <220> <221> MISC_PEATURE <223> Niestrukturalne białko NS3 <400> 2 16

18 17

19 18

20 19

21 <210> SEKW. NR: 3 <211> 528 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> <223> Chimeryczne rekombinacyjne białko otrzymane z białek NS2 i NS3 wirusa zapalenia wątroby typu C <400> 3 20

22 21

23 <210> SEKW. NR: 4 <211> 10 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu C <220> <221> misc_feature <223> Epitop pochodzący z wirusowego białka NS3 <400> 4 22

24 <210> SEKW. NR: 5 <211> 9 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu C <220> <221> misc_feature <223> Epitop pochodzący z wirusowego białka NS3 <400> 5 <210> SEKW. NR: 6 <211> 10 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu C <220> <221> misc_feature <223> Epitop pochodzący z wirusowego białka <400> 6 <210> SEKW. NR: 7 <211> 9 <212> PRT <213> Wirus zapalenia wątroby typu C <400> 7 23

25 Zastrzeżenia 1. Immunostymulująca kombinacja do profilaktyki i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C, znamienna tym, że zawiera: a) Poli(I:C) działający jako agonista TLR3, b) agonistę CD40 lub sekwencję DNA, która go koduje, i c) polipeptyd, zawierający białko NS3 wirusa zapalenia wątroby typu C, lub fragment wspomnianego białka NS3 o zdolności do indukowania odpowiedzi typu CD8+ i CD Immunostymulująca kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że agonista CD40 jest wybrany spośród przeciwciała anty-cd40, CD40L i ich fragmentów, które zachowują zdolność do wiązania się z CD Immunostymulująca kombinacja według zastrz. 2, znamienna tym, że agonista CD40 jest przeciwciałem anty-cd Immunostymulująca kombinacja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera: a) poli(i:c), b) przeciwciało anty-cd40, i c) polipeptyd zawierający białko NS3. 5. Immunostymulująca kombinacja według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że polipeptyd zawierający białko NS3 jest polipeptydem o sekwencji SEKW. NR: Immunostymulująca kombinacja według jakiegokolwiek z zastrz. od 1 do 5, znamienna tym, że wszystkie składniki stanowią część pojedynczej farmaceutycznej kompozycji. 7. Immunostymulująca kombinacja według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 5, znamienna tym, że wszystkie składniki stanowią część co najmniej dwóch różnych kompozycji farmaceutycznych. 8. Zastosowanie immunostymulującej kombinacji określonej w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 7 do wytwarzania leku do profilaktyki i leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C. 9. Zastosowanie immunostymulującej kombinacji określonej w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 7 do wytwarzania leku do leczenia wirusowego zapalenia wątroby typu C. 10. Zastosowanie immunostymulującej kombinacji według zastrz. 8 lub 9, znamienne tym, że wspomniany lek zawiera co najmniej dwie kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do jednoczesnego podawania. 11. Zastosowanie immunostymulującej kombinacji według zastrz. 8 lub 9, znamienne tym, że wspomniany lek zawiera co najmniej dwie kompozycje farmaceutyczne odpowiednie do oddzielnego podawania. 12. Zastosowanie immunostymulującej kombinacji według zastrz. 11, znamienne tym, że wspomniane kompozycje farmaceutyczne są odpowiednie do oddzielnego podawania z wykorzystaniem różnych dróg podawania. 13. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca immunostymulującą kombinację określoną w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 5, znamienna tym, że każdy ze składników występuje w farmaceutycznie akceptowalnych ilościach. 14. Zestaw do podawania immunostymulującej kombinacji określonej w zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że zawiera co najmniej dwie różne kompozycje farmaceutyczne, jak zdefiniowano w 24

26 zastrz. 13, a każda z nich zawiera co najmniej jeden ze składników a), b) lub c) wspomnianej immunostymulujacej kombinacji jak zdefiniowano w zastrz Immunostymulująca kombinacja zdefiniowana w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 7, w ilości zdolnej do indukcji odpowiedzi immunologicznej skierowanej przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C. 16. Immunostymulująca kombinacja według zastrz. 15, do stosowania w leczeniu profilaktycznym. 17. Immunostymulująca kombinacja według zastrz. 15, do stosowania w leczeniu terapeutycznym. 18. Szczepionka przeciwko wirusowi zapalenia wątroby typu C, znamienna tym, że zawiera immunostymulującą kombinację określoną w którymkolwiek z zastrz. od 1 do 7. 25

27 Peptyd Kontrola IFN-γ (ng/ml) IFN-γ (ng/ml) % Specyficznej lizy Peptyd Peptyd (µm) Kontrola NS3 (µg/ml) (bakt) FIGURA 1 26

28 Stosunek E/D Peptyd (nm) IFN-γ (ng/ml) IFN-γ (ng/ml) % Specyficznej lizy IFN-γ (ng/ml) Peptyd (nm) NS3 (µg/ml) Mieszanina peptydów i NS3 FIGURA 2 27

29 IFN-γ (ng/ml) Peptyd (µg/ml) IFN-γ (ng/ml) NS3B (µg/ml) FIGURA 3 28

30 % Specyficznej lizy Stosunek E/D FIGURA 4 29

31 % Specyficznej lizy IFN-γ (ng/ml) Brak antygenu Brak antygenu Stosunek E/D IFN-γ (ng/ml) Brak antygenu FIGURA 5 30