PL B1. Płyn celomatyczny dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: (51) Int.Cl. A61K 35/56 ( ) A61P 35/00 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (54) Płyn celomatyczny dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 18/16 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/18 (73) Uprawniony z patentu: UNIWERSYTET MARII CURIE- -SKŁODOWSKIEJ, Lublin, PL UNIWERSYTET MEDYCZNY W LUBLINIE, Lublin, PL (72) Twórca(y) wynalazku: MARTA FIOŁKA, Lublin, PL JOLANTA RZYMOWSKA, Lublin, PL PRZEMYSŁAW KOŁODZIEJ, Radymno, PL (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Maria Brodzicka PL B1

2 2 PL B1 Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest nowe, medyczne zastosowanie płynu celomatycznego wyizolowanego z dżdżownicy Dendrobaena veneta w leczeniu raka płuc. Znana jest z publikacji jak np., Yanqin i wsp., European Journal of Soil Biology t.43, 2007; Dinesh i wsp. Bioscience Biotechnology Research Asia, t.10, 2013; Kauschke i Mohrig, Journal Comparative Physiology, B t. 157, 1987 czy też Yamaji i wsp. Journal of Biological Chemistry, t.273, 1998, przeciwnowotworowa aktywność białek z płynu celomatycznego wyizolowanego z dżdżownic Eisenia fetida i Eudrilus eugeniae na komórki raka szyjki macicy, raka mózgu, raka okrężnicy oraz złośliwą postać białaczki. Z kolei z publikacji Kobayashi i wsp., Comparative Biochemistry and Physiology część C, 1.128, wiadomo, że prowadzono badania na rybach, kijankach i myszach, jedynie w kierunku cytotoksyczności płynu celomatycznego z dżdżownic należących do gatunku Eisenia fetida po podgrzaniu w 60 C przez 20 minut. Z prac autorstwa S. Matejko pt. Dżdżownice jako źródło aktywnie biologicznych cząstek badania przeciwnowotworowych właściwości płynu celomatycznego oraz Przeciwnowotworowe właściwości białek dżdżownic, zamieszczonych w archiwum prac dyplomowych Uniwersytetu Jagiellońskiego dostępnych na stronach internetowych z dnia , znany jest również wpływ płynu celomatycznego dwóch innych gatunków dżdżownic Eisenia Andrei i Aporrectodea caliginosa, na żywotność i aktywność proapoptotyczną komórek nowotworowych wątroby, raka szyki macicy oraz czerniaka złośliwego skóry i błony naczyniowej gałki ocznej. W wymienionych publikacjach wskazano jednocześnie na toksyczne działanie białek z płynu celomatycznego badanych gatunków dżdżownic na przykładzie fibroblastów kurcząt i leukocytów świnki morskiej oraz na lizę fibroblastów i erytrocytów kręgowców. W znanym stanie techniki nie zostały ujawnione wyniki badań płynu celomatycznego uzyskanego z gatunku dżdżownic Dendrobaena veneta, będącego źródłem aktywnie biologicznych cząstek o działaniu przeciw nowotworom. Dotychczasowe publikacje takie jak np., M. Fiołka i wsp., Journal of Invertebrate Pathology t.105, 2010, czy opisy patentowe PL , PL oraz P ujawniają aktywność przeciwdrobnoustrojową i przeciwnowotworową metabolitów szczepów bakterii z rodzaju Raoulteila ornithinolytica i Bacillus pumilus wyizolowanych z jelita dżdżownicy Dendrobaena veneta. Przedstawione wyżej publikacje, potwierdzają ogromny immunologiczny potencjał dżdżownic, stąd podjęto dalsze badania w kierunku wyizolowania samego płynu celomatycznego Dendrobaena veneta w warunkach obiecujących zachowanie największej liczby jego składników białkowych i zbadania wpływu tego płynu na szczególnie agresywne i trudne w leczeniu komórki nowotworowe. Nieoczekiwanie, w badaniach z wykorzystaniem różnych linii komórek nowotworowych, okazało się, że płyn celomatyczny w określonej postaci uzyskany z dżdżownicy Dendrobaena veneta, wykazuje bardzo efektywne działanie w znacznym stopniu uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów - prawidłowych komórek skóry mysiej oraz komórek krwi człowieka zarówno erytrocytów, jak i leukocytów. Istotą wynalazku jest płyn celomatyczny z dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc, po oddzieleniu celomocytów i koagulacji toksycznych białek w temperaturze C. Wynalazek został przedstawiony w poniższych przykładach wykonania. P r z y k ł a d 1. Pozyskiwanie płynu celomatycznego z dżdżownic Dendrobaena veneta do dalszych badań. Hodowlę dżdżownic Denrobaena veneta prowadzono w ziemi ogrodowej o wilgotności ok. 80% i temperaturze C, karmiąc je rozdrobnioną gotowaną marchewką. Do badań wybrano kilkadziesiąt dojrzałych osobników i po opłukaniu w wodzie destylowanej i osuszeniu, polewano niewielką ilością jałowego płynu fizjologicznego. Następnie w okolicę ciała każdej dżdżownicy przykładano na 30 sekund prąd z 2 ogniw baterii o mocy 4.5 V. W tym czasie dżdżownice wyrzucały przez otwory układu wydalniczego płyn z jamy ciała wraz komórkami krwi celomocytami. Zebrane wydaliny odwirowywano w ciągu kilkunastu minut przy obrotach 3000 na minutę, przez co oddzielono skutecznie osadzone na dnie probówki celomocyty. Supernatant przesączono przez sączek Millipore o średnicy porów 0,22 m dla otrzymania sterylnego płynu, po czym metodą Bradford, spektrofotometrycznie

3 PL B1 3 określono stężenie białka 0,7 mg/ml dla utrzymania porównywalnych warunków w kolejnych eksperymentach. Po 1 ml otrzymanego wyżej płynu celomatycznego przeniesiono do 6 probówek Eppendorfa, po czym wszystkie probówki inkubowano przez 10 minut w termobloku, kolejno w następujących temperaturach: 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100 C, wychładzając próbki do temp. pokojowej po każdorazowym ogrzewaniu. Następnie z próbki płynu celomatycznego po określonej temperaturze inkubacji, pobierano 500 l i dodawano do 1 ml hodowli prawidłowych fibroblastów mysich pochodzenia tłuszczowego ECACC , uzyskując stężenie białka w płynie 250 g/ml. W zależności od temperatury inkubacji, następował różny stopień koagulacji białek toksycznych, wpływający na uszkodzenie fibroblastów tabela 1. Jak wykazują wyniki tego eksperymentu, całkowita koagulacja białek toksycznych 0% martwych komórek następuje po inkubacji tego płynu w temp C. Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną, a także z hodowlami zawierającymi fibroblasty z dodatkiem płynu według wynalazku, tj. po ogrzaniu w 70 C, 90 C i bez ogrzewania, poddano obserwacji pod mikroskopem optycznym z odwróconym polem. Otrzymane obrazy uwidaczniają: fig. 1 fibroblasty kontrolne, fig. 2 fibroblasty po działaniu płynu ogrzanego w 70 C, fig. 3 fibroblasty po działaniu płynu ogrzanego w 90 C i fig. 4 fibroblasty z płynem bez ogrzewania. Dalej wykazano wpływ płynu celomatycznego dżdżownicy Denrobaena veneta na lizę erytrocytów krwi ludzkiej tabela 2. 2,5 ml krwi obwodowej ludzkiej zmieszano z antykoagulantem EDTA i rozdzielono do trzech probówek. Do pierwszej (I) z nich, jako próbki kontrolnej, dodano 250 l 0,9% NaCl, a do pozostałych dwóch dodano również po 250 l płynu celomatycznego dżdżownicy. Próbka II stanowiła tzw. płyn surowy nie poddawany inkubacji, zaś próbkę III inkubowano w ciągu 10 min. w temp. 80 C. Po dokładnym wymieszaniu, próbki poddano analizie w aparacie hematologicznym po 5, 60 i 300 minutach. Wyniki zawarte w tabeli 2 wskazują, iż płyn celomatyczny inkubowany w badanych czasach nie wpływa na zmiany parametrów hematologicznych, w przeciwieństwie do płynu surowego, powodującego prawie natychmiastową lizę erytrocytów, leukocytów i trombocytów. Dodatkowo wykonano analizę mikroskopową rozmazów próbek krwi I, II i III barwionych metodą May-Gϋmwalda-Giemsy. Wszystkie obrazy mikroskopowe krwi z płynem celomatycznym ogrzewanym (próbka III) nie wykazują różnic morfologicznych w porównaniu z kontrolną (próbka I), co dowodzi braku toksycznego działania tego płynu po obróbce termicznej na komórki krwi człowieka. Przedstawione na rysunku obrazy mikroskopowe ilustrują niżej wymienione komórki krwi: neutrofil wraz z erytrocytami - fig. 5 kontrola (próbka I ) oraz fig. 6 próbka III z dodatkiem płynu inkubowanego w 80 C. limfocyt z erytrocytami - fig. 7 kontrola (próbka I ) oraz fig. 8 próbka III z dodatkiem płynu inkubowanego w 80 C. neutrofil i limfocyt bez erytrocytów po działaniu nieogrzewanego płynu (próbka II) fig. 9. P r z y k ł a d 2. Określenie cytotoksyczności płynu celomatycznego względem komórek raka płuc. Badania prowadzono na linii komórek nabłonkowych raka płuc A549. Hodowle wszystkich komórek prowadzono w standardowych warunkach 37 C, 5% CO2, 90% wilgotność powietrza, na pożywce RPMI z dodatkiem 8% płodowej surowicy bydlęcej. Gęstość wyjściowa zawiesiny wynosiła 104 komórek w mililitrze podłoża. Założono 5 hodowli zawierających komórki nabłonkowe raka płuc wraz z płynem celomatycznym o różnej temperaturze inkubacji 70, 80, 90 i 100 C, a także z płynem nieogrzewanym. Do 1 ml każdej hodowli dodawano 0,5 ml płynu celomatycznego, uzyskując stężenie białka 250 g/ml w każdej z nich. Po inkubacji w czasie 24, 48 i 72 godziny, do hodowanych komórek dodawano trypsynę, celem całkowitego oderwania komórek od naczynia hodowlanego, a następnie błękit trypanu dla zabarwienia komórek martwych. Następnie liczono ilość martwych i żywych komórek nowotworowych w komorze Börkera. Badanie powtarzano trzykrotnie. Procent komórek martwych w stosunku do kontroli stanowiącej 100% komórek nowotworowych, przedstawiono jako współczynnik cytotoksyczności w tabeli 3.

4 4 PL B1 Dodatkowo, naczynia z hodowlą kontrolną zawierającą same komórki rakowe oraz hodowle komórek nowotworowych z płynami według wynalazku inkubowanymi w temp. 75 i 90 C, a także z płynem surowym, poddano obserwacji pod mikroskopem optycznym z odwróconym polem. Obrazy mikroskopowe oznaczone na rysunku jako fig. 10 do 13, przedstawiają kolejno: fig. 10 kontrola komórki raka płuc, fig. 11 komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego inkubowanego w temp. 75 C, fig. 12 komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego inkubowanego w temp. 90 C, fig. 13 komórki raka płuc po działaniu płynu celomatycznego surowego, bez ogrzewania. Jak wykazano w powyższych przykładach, płyn celomatyczny z dżdżownicy Dendrobaena veneta, po oddzieleniu celomocytów i inkubacji w temp C, wykazuje bardzo efektywne działanie uszkadzające komórki raka płuc, przy jednoczesnym braku cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów i komórek krwi ludzkiej. Wprawdzie płyn celomatyczny surowy, bez inkubacji, wykazuje dużą aktywność przeciwnowotworową, ale jest jednocześnie toksyczny względem fibroblastów i komórek krwi. Z kolei płyn inkubowany w temperaturach 90 i 100 C, nie wykazuje cytotoksyczności w stosunku do fibroblastów i komórek krwi ludzkiej, ale jednocześnie nie wykazuje działania cytotoksycznego w stosunku do komórek raka płuc. Zastrzeżenie patentowe 1. Płyn celomatyczny dżdżownicy Dendrobaena veneta do zastosowania w leczeniu raka płuc, po oddzieleniu celomocytów i koagulacji toksycznych białek w temperaturze C.

5 PL B1 5 Rysunki

6 6 PL B1

7 PL B1 7

8 8 PL B1

9 PL B1 9

10 10 PL B1

11 PL B1 11

12 12 PL B1 Departament Wydawnictw UPRP Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)