(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2009/11 EP B1 (13) T3 (51) Int. Cl. A61K31/496 A61P31/10 A61K39/395 A61K31/506 ( ) ( ) ( ) ( ) (54) Tytuł wynalazku: Leczenie infekcji grzybiczych (30) Pierwszeństwo: GB (43) Zgłoszenie ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2007/01 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 08/2009 (73) Uprawniony z patentu: NeuTec Pharma Limited, Camberley, GB PL/EP T3 (72) Twórca (y) wynalazku: BURNIE James Peter, Alderley Edge, GB MATTHEWS Ruth Christine, Alderley Edge, GB (74) Pełnomocnik: Jan Wierzchoń &Partnerzy Biuro Patentów i Znaków Towarowych rzecz. pat. Górczak Jolanta Warszawa skr. pocz. 709 Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 9511/09/P-RO/JG EP Leczenie infekcji grzybiczych Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy nowych kompozycji i preparatów zawierających skuteczne środki grzybobójcze wraz z przeciwciałami, które można włączać do innych kompozycji i preparatów. [0002] Infekcje grzybicze są poważną przyczyną zgonów pacjentów na oddziałach intensywnej opieki, a bardziej ogólnie pacjentów nieodpornych i osłabionych (Gold, J.W.M., 1984, Am. J. Med. 76: ; Klein, R.S. et al., 1984, N. Engl. J. Med. 311: ; Burnie, J.P., 1997, Current Anaesthesia & Critical Care 8: ). Obecność i uporczywość infekcji grzybiczych można przypisać naciskowi selekcyjnemu środków grzybobójczych o szerokim spektrum, często długim pobytom pacjentów w takich obiektach jak oddział intensywnej opieki, problemom z diagnozowaniem infekcji oraz brakowi skuteczności środków grzybobójczych stosowanych w leczeniu. Choć ścisłe przestrzeganie zasad higieny może w pewnym stopniu zapobiegać infekcjom grzybiczym w szpitalach i innych miejscach, pojawianie się takich infekcji stanowi poważny problem wymagający rozwiązania. [0003] Choć większość klinicznych przypadków grzybic jest powodowana głównie przez Aspergillus fumigatus, inne gatunki z rodzaju Aspergillus, takie jak A. flavus, A. terreus i A. niger również są związane z poważnymi infekcjami nieodpornego gospodarza (Espinel-Ingroff, A., 2003, J. Clin. Microbiol. 41: ). [0004] Wykrycie i zdiagnozowanie grzybiczego patogenu odpowiedzialnego za daną infekcję ma podstawowe znaczenie dla późniejszej terapii, ponieważ określone środki grzybobójcze mogą być bardziej skuteczne przeciwko niektórym szczepom. Patenty GB i EP opisują białko stresowe syntetyzowane w odpowiedzi na infekcje grzybicze i odpowiednie do niego przeciwciało, które można by wykorzystać w czułym i wysoce specyficznym teście wykrywającym patogeny grzybicze. [0005] Infekcje grzybicze spowodowane przez gatunki z rodzajów Aspergillus i Candida tradycyjnie leczy się środkiem grzybobójczym o nazwie amfoterycyna B, uważanym za standard ogólnoustrojowej terapii przeciwgrzybiczej (Burnie, J.P., 1997, jw.). Niestety sama amfoterycyna B jest wysoce toksyczna, a jej stosowanie ograniczają skutki uboczne, takie jak przeziębienia, gorączka, mięśniobóle lub zakrzepowe zapalenie żył. Do innych środków grzybobójczych należą doustne leki azolowe (mikonazol, ketokonazol, itrakonazol, flukonazol, worikonazol) i 5-fluorocytozyna. Jednak wiele gatunków grzybów zyskuje oporność na środki grzybobójcze takie jak flukonazol, a gatunki te występują często u pacjentów, którym podawano ten lek zapobiegawczo. Wobec coraz większej przewagi szczepów opornych na środki grzybobójcze i pomimo ostatnich postępów w dziedzinie leków takich jak flukonazol, itrakonazol i ogólnoustrojowe odmiany amfoterycyny B oparte na liposomach (Bumie, J.P., 1997, jw.), potrzeba znalezienia skutecznych środków do leczenia infekcji grzybiczych pozostaje paląca. [0006] Określona wyżej potrzeba stanowiła przedmiot zainteresowania w dokumencie WO 01/76627, który przedstawił kompozycję służącą do leczenia infekcji grzybiczych u ludzi lub zwierząt. Kompozycja ta obejmuje przeciwciało specyficzne dla zachowanego epitopu białka stresowego syntetyzowanego w odpowiedzi na infekcje grzybicze, hsp90, które to przeciwciało zostało połączone ze znanymi polienowymi środkami grzybobójczymi, zwłaszcza z amfoterycyną B. Dokładnie przeciwciało to (zwane dalej Mycograb (RTM)) rozpoznaje epitop przedstawiany przez peptyd o sekwencji SEQ ID NO: 1, występującej u wielu gatunków grzybów. Co zaskakujące, wykazano, że skuteczność amfoterycyny B przeciwko różnorodnym ważnym z punktu widzenia patologii szczepom grzybów (na przykład z gatunku Candida)

3 - 2 - była poważnie zwiększona w obecności przeciwciała, co umożliwiało albo stosowanie mniejszych dawek leku, albo skuteczniejsze leczenie daną dawką, a to z kolei prowadziło do ograniczenia niepożądanych działań ubocznych. Ponadto kompozycja przedstawiona w WO 01/76627 umożliwia skuteczne leczenie infekcji grzybiczych charakteryzujących się wrodzoną opornością na środek grzybobójczy stosowany w kompozycji. [0007] Co ważne, flukonazol (doustny azolowy środek grzybobójczy) w połączeniu z przeciwciałem Mycograb (RTM) wykazywał niewielki efekt synergii w zwalczaniu szczepów z gatunku Candida. [0008] Wszystkie azolowe środki grzybobójcze działają według jednakowego mechanizmu zapobiegając syntezie ergosterolu, ważnego sterolowego składnika grzybiczych błon komórkowych, przez inhibicję grzybiczego enzymu zależnego od cytochromu P450 lanosterolo-14-α-demetylazy. Powstający niedobór ergosterolu i towarzyszące mu gromadzenie się 14-α-metylowanych prekursorów zakłóca podstawowe działanie ergosterolu w błonach komórek grzybów i zmienia zarówno płynność błony, jak i aktywność kilku osadzonych na błonie enzymów. Ostateczny efekt polega na zahamowaniu wzrostu i rozmnażania się grzyba (Maertens, J.A., 2004, Clin. Microbiol. Infect. 10 (Suppl. 1):1-10). [0009] Skoro flukonazol w połączeniu z przeciwciałem Mycograb (RTM) wykazywał niewielki efekt synergii w zwalczaniu szczepów z gatunku Candida, a mechanizm działania doustnych azolowych środków grzybobójczych jest jednakowy, logiczne było założyć, że inne doustne azolowe środki grzybobójcze, takie jak mikonazol, ketokonazol, itrakonazol i worikonazol również nie wykażą synergii w połączeniu z przeciwciałem Mycograb (RTM). [0010] Twórcy niniejszego wynalazku odkryli obecnie, iż pomimo wcześniejszych ustaleń, azolowe środki grzybobójcze wykazują niewielki efekt synergiczny w połączeniu z przeciwciałem Mycograb (RTM) opisanym w dokumencie WO 01/76627 lub jego brak w leczeniu infekcji wywołanych przez szczepy z gatunku Aspergillus lub Candida, istnieje lecznicza synergia między doustnymi azolowymi środkami grzybobójczymi itrakonazolem i worikonazolem a przeciwciałem Mycograb (RTM). Opisane poniże eksperymenty wykazały, że synergia ta jest jak dotąd ograniczona do itrakonazolu i worikonazolu, choć jest możliwe, że inne doustne azolowe środki grzybobójcze, których jeszcze nie badano lub które są opracowywane, również będą wykazywać pewną synergię z przeciwciałem Mycograb (RTM). [0011] Zgodnie z niniejszym wynalazkiem przedstawia się kompozycję zawierającą przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 pochodzącego z organizmu z rodzaju Aspergillus, oraz co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol. [0012] Ponadto przedstawia się połączony preparat, na przykład pakiet leczniczy zawierający przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 pochodzącego z organizmu z rodzaju Aspergillus, oraz co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol, do jednoczesnego, oddzielnego lub kolejnego stosowania w leczeniu infekcji grzybiczych. [0013] Ponadto przedstawia się sposób wytwarzania leku do leczenia infekcji grzybiczych u człowieka lub zwierzęcia, charakteryzujący się użyciem przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen, specyficznych dla co najmniej jednego epitopu hsp90 pochodzącego z organizmu z rodzaju Aspergillus, oraz co najmniej jednego środka grzybobójczego wybranego z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol. [0014] Ponadto przedstawia się zastosowanie kompozycji zawierajacej przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen, specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 pochodzącego z organizmu z rodza-

4 - 3 - ju Aspergillus, oraz co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol, w sposobie wytwarzania leku służącego do leczenia infekcji grzybiczych. [0015] Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen mogą być specyficzne dla epitopu przedstawionego jako peptyd o sekwencji SEQ ID NO: 1. [0016] Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen mogą być specyficzne dla epitopu przedstawionego jako peptyd o sekwencji SEQ ID NO: 2. [0017] Przeciwciała, ich wytwarzanie i zastosowania są dobrze znane i opisane na przykład w monografii Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, [0018] Przeciwciała mogą być wytwarzane standardowymi metodami znanymi w branży. Do przykładów przeciwciał należą między innymi: przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, chimeryczne, jednołańcuchowe, fragmenty Fab, fragmenty wytwarzane przez zestaw ekspresji Fab, fragmenty przeciwciał wiążące antygeny. [0019] Przeciwciała mogą być wytwarzane przez różnorodnych nosicieli, na przykład kozy, króliki, szczury, myszy, ludzi i innych. Nosiciele mogą być uodporniani przez zastrzyki z białek stresowych syntetyzowanych w odpowiedzi na infekcje grzybicze lub dowolnych ich fragmentów lub oligopeptydów, mających właściwości immunogenne. Zależnie od gatunku nosiciela można stosować różne środki wspomagające, które intensyfikowałyby reakcję immunologiczną. Do takich środków wspomagających należą między innymi związki Freunda, żele mineralne w rodzaju wodorotlenku glinu oraz środki powierzchniowo czynne, takie jako lizolecytyna, poliole pluronowe, polianiony, peptydy, emulsje olejowe, hemocyjanina Fissurellidae i dinitrofenol. Wśród środków wspomagających stosowanych w przypadku człowieka szczególnie użyteczne są BCG (Bacille Calmette-Guerin) i Corynebacterium parvum. [0020] Przeciwciała monoklonalne wobec białek stresowych syntetyzowanych w odpowiedzi na infekcje grzybicze lub dowolny fragment ich oligopeptydu można otrzymać z zastosowaniem dowolnej techniki umożliwiającej produkcję cząsteczek przeciwciał przez hodowlę ciągłych linii komórkowych. Należą do nich między innymi technika hybridoma, technika hybridoma ludzkiego limfocytu B i technika hybridoma wirusa Epsteina-Barr (EBV) (Koehler et al., 1975, Nature, 256: ; Kosbor et al., 1983, Immunol. Today 4: 72; Cote et al., 1983, PNAS USA, 80: ; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss Inc., New York, pp ). [0021] Ponadto zastosować można techniki opracowane na potrzeby produkcji przeciwciał chimerycznych, łączenia mysich genów przeciwciał z ludzkimi genami przeciwciał w celu uzyskania cząsteczki o odpowiedniej specyficzności antygenowej i aktywności biologicznej (Morrison et al., 1984, PNAS USA, 81: ; Neuberger et al., 1984, Nature, 312: ; Takeda et al., 1985, Nature, 314: ). Można też zaadaptować techniki opisane na potrzeby produkcji przeciwciał jednołańcuchowych, stosując metody znane w branży, aby otrzymać przeciwciała jednołańcuchowe specyficzne dla białek stresowych syntetyzowanych w odpowiedzi na infekcje grzybicze. Przeciwciała o spokrewnionej specyficzności, ale różnym składzie idiotypowym można wytwarzać przez tasowanie łańcucha z losowych bibliotek kombinatorycznych immunoglobulin (Burton, D.R., 1991, PNAS USA, 88: ). [0022] Przeciwciała mogą być też wytwarzane przez stymulowanie produkcji in vivo w populacji limfocytów lub przez przesiewanie bibliotek immunoglobuliny lub paneli wysoce specyficznych reagentów wiążących (Orlandi et al., 1989, PNAS USA, 86: ; Winter, G. et al., 1991, Nature, 349: ).

5 - 4 - [0023] Można też wytwarzać fragmenty wiążące antygen, na przykład fragmenty F(ab )2, które mogą być otrzymywane przez trawienie pepsyną cząsteczki przeciwciała, oraz fragmenty Fab, które mogą być otrzymywane przez redukcję mostków disiarczkowych fragmentów F(ab )2. Ponadto można konstruować biblioteki ekspresji Fab w celu umożliwienia szybkiej i łatwej identyfikacji monoklonalnych fragmentów Fab o pożądanej specyficzności (Huse et al., 1989, Science, 256: ). [0024] Różne badania na odporność można zastosować do przesiewania w celu zidentyfikowania przeciwciał o pożądanej specyficzności. Liczne protokoły konkurencyjnego wiązania lub radiometryczne badania na odporność z użyciem przeciwciał poli- lub monoklonalnych o określonych specyficznościach są dobrze znane w branży. Takie badania na odporność są zwykle związane z pomiarem tworzenia kompleksu białka stresowego syntetyzowanego w odpowiedzi na infekcje grzybicze lub jego dowolnego fragmentu lub oligopeptidu ze specyficznym przeciwciałem. Można zastosować dwupunktowe monoklonalne badanie na odporność z użyciem przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla dwóch nieprzeszkadzających epitopów białka stresowego syntetyzowanego w odpowiedzi na infekcje grzybicze, ale można też wykorzystać badanie wiązania konkurencyjnego (Maddox et al., 1983, J. Exp. Med., 158: ). [0025] Przeciwciało stosowane w kompozycji lub w preparacie łączonym może charakteryzować się na przykład sekwencją SEQ ID NO: 3. [0026] Kompozycję lub preparat łączony można stosować do leczenia infekcji grzybiczych. Wspomniana infekcja grzybicza może być wywołana mikroorganizmem z rodzaju Aspergillus. [0027] Infekcja grzybicza może być oporna na wymieniony środek grzybobójczy sam w sobie (per se). [0028] Kompozycja lub preparat łączony mogą być stosowane w sposobie leczenia infekcji grzybiczych w organizmie człowieka lub zwierząt. [0029] Kompozycja lub preparat mogą ponadto zawierać farmaceutycznie akceptowalny nośnik, rozcieńczalnik lub rozczynnik. Podobnie dowolna metoda produkcji niniejszego wynalazku lub jego zastosowania może też obejmować zastosowanie farmaceutycznie akceptowalnego nośnika, rozcieńczalnika lub rozczynnika. Przykłady farmaceutycznie akceptowalnych nośników, rozcieńczalników lub rozczynników są dobrze znane w branży; patrz na przykład: Remington's Pharmaceutical Sciences and US Pharmacopoeia, (1984, Mack Publishing Company, Easton, PA, USA). [0030] Kompozycja lub preparat łączony mogą być podawane doustnie. [0031] Ponadto przedstawia się zestaw zawierający przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen specyficzny dla co najmniej jednego epitopu hsp90 organizmu z rodzaju Aspergillus i co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol. [0032] Zestaw może być stosowany w leczeniu infekcji grzybiczych. [0033] Przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen zgodne z niniejszym wynalazkiem mogą znakowane wykrywalnym znacznikiem lub sprzężone z cząsteczką efektora, na przykład leku takiego jak środek grzybobójczy w rodzaju itrakonazolu lub worikonazolu, lub toksyną taką jak rycyna, lub enzymem, za pomocą konwencjonalnych procedur. Wynalazek rozciąga się na znakowane w ten sposób przeciwciała lub sprzężenia przeciwciał. [0034] W razie potrzeby do diagnostyki lub leczenia można stosować mieszaniny przeciwciał, na przykład mieszaniny dwu lub więcej przeciwciał rozpoznających różne epitopy białka stresowego syntetyzowanego w odpowiedzi na infekcje grzybicze zgodne z wynalazkiem, i/lub mieszaniny przeciwciał różnych klas, na przykład mieszaniny przeciwciał IgG i IgM rozpoznających te same lub różne epitopy będące przedmiotem wynalazku.

6 - 5 - [0035] Niniejszy wynalazek zostanie dokładniej przedstawiony przez poniższy opis, prezentujący (wyłącznie na przykładach) specyficzne wdrożenia kompozycji i eksperymenty przeprowadzone z jej udziałem. CZĘŚĆ EKSPERYMENTALNA [0036] Opisane poniżej eksperymenty dotyczyły badania grzybobójczego działania przeciwciała Mycograb (RTM) zastosowanego w połączeniu ze środkami grzybobójczymi amfoterycyną B, kaspofunginą, worikonazolem i itrakonazolem. Przeciwciało Mycograb (RTM) rozpoznaje epitopy przedstawiane przez peptydy o sekwencji SEQ ID NOs: 1 i 2. Wyniki pokazują, że worikonazol i itrakonazol wykazują w połączeniu z przeciwciałem Mycograb (RTM) zaskakująco silny efekt synergiczny w zwalczaniu różnorodnych istotnych klinicznie gatunków z rodzaju Aspergillus. Ten efekt synergiczny ma znaczące konsekwencje dla klinicznego leczenia infekcji grzybiczych. Materiały i metody Środki grzybobójcze [0037] Przygotowano roztwory podstawowe amfoterycyny B (AMB, Sigma), kaspofunginy (Caspo), worikonazolu (VOR) i itrakonazolu (ITZ) zgodnie z wzorcami National Committee for Clinical Laboratory Standards (M38-A) w RPMI 1640 z użyciem glutaminowej pożywki bulionowej, doprowadzono ph do 7,0 za pomocą bufora 0,165 mmol/litr kwasu morfolinopropanosulfonowego (MOPS). Roztwory podstawowe AMB przygotowano w seriach po 100 w 100% sulfotlenku dimetylu (DMSO) i rozcieńczono w pożywce do zakresu stężeń 0,03125 do 16 μg/ml. Kaspofunginę, worikonazol oraz itrakonazol badano w zakresie stężeń 0,03125 do 1024 μg/ml, a Mycograb (RTM) (NeuTec Pharma plc) w zakresie stężeń 0,25 do 1024 μg/ml. Izolaty testowe [0038] Kliniczne izolaty Aspergillus fumigatus (2), A. flavus (1), A. terreus (1) i A. niger (1) otrzymano z Oddziału Mikrobiologii, Manchester Royal Infirmary, Manchester, Wielka Brytania. Przeciwciało [0039] Sekwencja DNA przeciwciała Mycograb (RTM), specyficznego dla epitopu białka stresowego syntetyzowanego w odpowiedzi na infekcje grzybicze hsp90 o sekwencji SEQ ID NO: 1 (zgodnie z opisem zamieszczonym w GB i EP ) została genetycznie zmodyfikowana w celu optymalizacji kodonu dla ekspresji w Escherichia coli (Operon Technologies Inc., Alameda, CA, USA) i wstawiona do wektora ekspresji E. coli. Sekwencja aminokwasowa Mycograb (RTM) będącego przedmiotem niniejszego wynalazku stanowi sekwencję SEQ ID NO: 3 (włącznie z domeną ciężką, lekką i łącznika). [0040] Przeciwciało Mycograb (RTM) uległo ekspresji w nośniku Escherichia coli i zostało oczyszczone metodą chromatografii powinowactwa z użyciem kolumny wymiennej z imidazolem, zgodnie ze standardowymi procedurami biologii molekularnej (patrz na przykład Harlow & Lane, jw.; Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook, J. & Russell, D., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). Przeciwciało Mycograb (RTM) zostało wyizolowane do czystości 95 %.

7 - 6 - [0041] Preparaty zawierające przeciwciało Mycograb (RTM) przygotowano w sposób następujący: 10 mg czystego przeciwciała Mycograb (RTM), 150 mg mocznika o czystości farmakopealnej (Ph Eur) i 174 mg L-argininy (Ph Eur) umieszczono w fiolce i rozpuszczono w 5 ml wody. Reaktywność krzyżowa przeciwciała Mycograb (RTM) z hsp90 Aspergillus sp. [0042] Immunoblotting stosowano wcześniej do analizy reakcji przeciwciała na Aspergillus fumigatus u pacjentów chorych na alergiczną aspergilozę oskrzelowo-płucną, grzybniaka kropidlakowego i aspergilozę inwazyjną. Pozwoliło to zidentyfikować liczne antygeny o masie cząsteczkowej w przedziale kda. Antygen o masie 88 kda na podstawie jego reakcji krzyżowej z przeciwciałem Mycograb (RTM) zidentyfikowano jako homolog hsp90 (Bumie, J. P., and R. C. Matthews J. Clin. Microbiol. 29: ). Mapowanie epitopowe ujawniło, że przeciwciało Mycograb (RTM) reaguje na epitop przedstawiający się jako peptyd o sekwencji SEQ ID NO: 2, zachowywanej zarówno u A. fumigatus, jak i u A. niger. Test wrażliwości na działanie grzybobójcze [0043] Minimalne stężenia hamujące (MIC) amfoterycyny B, kaspofunginy, worikonazolu i itrakonazolu oraz przeciwciała Mycograb (RTM) zostały oznaczone metodą mikrorozcieńczeń bulionu zgodnie z dokumentem M38-A National Committee for Clinical Laboratory Standards. Mówiąc w skrócie, przetestowano AMB (0,03125 do 16 μg/ml), kaspofungina, worikonazol i itrakonazol (0,03125 do 1024 μg/ml) oraz Mycograb (RTM) (0,25 do 1024 μg/ml) z osobna i w kombinacji przez badanie punktów końcowych miareczkowań MIC i szachownicowych. Przygotowano zawiesinę szczepionki w buforowanym RPMI na pożywce glutaminowej, testując kolonie z 7-dniowej płytki Sabourauda. Zawiesina została doprowadzona do 0,09-0,11 (transmitancja 80 do 82%) dla gatunku z rodzaju Aspergillus, 0,15-0,17 (transmitancja 68 do 70%). Następnie szczepionka została jeszcze rozcieńczona w stosunku 1:2 przy dodawaniu do badanych środków grzybobójczych (końcowa szczepionka (0,4 x 10 4 do 0,5 x 10 4 ). W przypadku AMB i Mycograb (RTM), osobnych lub w kombinacji, punkt końcowy oznaczono jako stężenie przy którym brak rozwoju (MIC-0). Płytki mikromianowane inkubowano w temperaturze 37 C bez mieszania przez 48 godzin w przypadku gatunku z rodzaju Aspergillus. W przypadku kaspofunginy, worikonazolu i itrakonazolu, stosowanych osobno lub w kombinacji z przeciwciałem Mycograb (RTM), punkt końcowy MIC został oznaczony jako stężenie prowadzące do wyraźnego spadku mętności (hamowanie wzrostu 50%, MIC-2) w porównaniu z kontrolą wzrostu (Keele et al. 2001; Espinel-Ingroff 2003). Końcowe stężenie hamujące (FIC) obliczono dla każdego leku, dzieląc MIC w obecności drugiego leku przez MIC przy jego braku. Dla każdej kombinacji otrzymano dwie frakcje, które zsumowano w celu otrzymania ułamkowego końcowego stężenia hamującego. Synergia została określona dla wartości 0,5, obojętność została określona dla wartości >0,5 do <4,0, a antagonizm został określony dla wartości 4,0 (Matthews et al., 2003). Wyniki [0044] Przeciwciało Mycograb (RTM) poza rozpoznaniem epitopu przedstawianego przez peptyd o sekwencji SEQ ID NO: 1 rozpoznaje też zachowany epitop rodzaju Aspergillus przedstawiany przez peptyd o sekwencji SEQ ID NO: 2. [0045] Eksperymenty in vitro, służące badaniu wpływu połączenia przeciwciała Mycograb (RTM) ze środkami grzybobójczymi przedstawiono w tablicach 1-4.

8 - 7 - Tablica 1. Zastosowanie metody szachownicy w stosunku do działania amfoterycyny B i przeciwciała Mycograb (RTM) na gatunki z rodzaju Aspergillus Szczep Środek MIC-0 (μg/ml) każdego środka FIC (μg/ml) FICI Wynik Osobno Kombinacja A. fumigatus AMB 2 1 0,5 0,5 Obojętność Mycograb ,01 A. fumigatus CI2 AMB 2 1 0,5 0,531 Obojętność Mycograb ,031 A. niger AMB 2 1 0,5 0,5 Obojętność Mycograb ,01 A. flavus AMB Obojętność Mycograb A. terreus AMB Obojętność Mycograb Tablica 2. Zastosowanie metody szachownicy w stosunku do działania kaspofunginy i przeciwciała Mycograb (RTM) na gatunki z rodzaju Aspergillus Szczep Środek MIC-2 (μg/ml) każdego środka FIC (μg/ml) FICI Wynik Osobno Kombinacja A. fumigatus Caspo 0,125 0,0625 0,5 0,562 Obojętność Mycograb ,062 A. fumigatus CI2 Caspo 0,125 0,0625 0,5 0,562 Obojętność Mycograb ,062 A. niger Caspo 1 0,125 0,125 0,125 Synergia Mycograb 256 0,0625 0,0001 A. flavus Caspo 1 0,5 0,5 0,500 Obojętność Mycograb 512 0,0625 0,0001 A. terreus Caspo 0,3125 0,078 0,25 0,312 Synergia Mycograb ,031 Tablica 3. Zastosowanie metody szachownicy w stosunku do działania itrakonazolu i przeciwciała Mycograb (RTM) na gatunki z rodzaju Aspergillus Szczep Środek MIC-2 (μg/ml) każdego środka FIC (μg/ml) FICI Wynik Osobno Kombinacja A. fumigatus ITZ 0,5 0,0312 0,0625 0,0781 Synergia

9 - 8 - Mycograb ,016 A. fumigatus CI2 ITZ 0,5 0,125 0,25 0,2578 Synergia Mycograb ,008 A. niger ITZ 0,125 0,0156 0,125 0,375 Synergia Mycograb ,25 A. flavus ITZ 0,125 0,0312 0,25 0,25 Synergia Mycograb 512 0,25 0,0005 A. terreus ITZ 0,125 0,0312 0,25 0,281 Synergia Mycograb ,031 Tablica 4. Zastosowanie metody szachownicy w stosunku do działania worikonazolu i przeciwciała Mycograb (RTM) na gatunki z rodzaju Aspergillus Szczep Środek MIC-2 (μg/ml) każdego środka FIC (μg/ml) FICI Wynik Osobno Kombinacja A. fumigatus VOR 0,0625 0,0312 0,5 0,5 Synergia Mycograb ,25 0,0002 A. fumigatus CI2 VOR 0,25 0,125 0,5 0,5 Synergia Mycograb ,25 0,0002 A. niger VOR 0,125 0, Obojętność Mycograb A. flavus VOR 0,25 0,0625 0,25 0,25 Synergia Mycograb 512 0,25 0,0005 A. terreus VOR 0,25 0,125 0,5 0,5 Synergia Mycograb ,25 0,0002 Podsumowanie [0046] Wyniki przedstawione w tablicach 1-4 pokazują, że o ile przeciwciało Mycograb (RTM) samo w sobie było w stanie hamować wzrost niektórych gatunków z rodzaju Aspergillus, zaskakująco wysoki poziom działania grzybobójczego na wszystkie badane gatunki obserwowano wtedy, gdy przeciwciało było stosowane w kombinacji z itrakonazolem, a ponadto zaskakująco wysoki poziom działania grzybobójczego na wszystkie badane gatunki z wyjątkiem A. niger obserwowano wtedy, gdy przeciwciało było stosowane w kombinacji z worikonazolem. Ten zaskakujący efekt łączenia przeciwciała i itrakonazolu/worikonazolu nie pojawia się w przypadku innych doustnych azolowych środków grzybobójczych takich flukonazol, lub w połączeniu przeciwciała z amfoterycyną B lub kaspofunginą. Wnioski [0047] Przedstawione dane wyraźnie pokazują istnienie zaskakującej synergii między przeciwciałem Mycograb (RTM) a środkami grzybobójczymi itrakonazolem i worikonazolem. Efekt tej synergii wzmacnia grzybobójcze działanie tych środków przeciwko szerokiemu zakresowi ważnych z punktu widzenia patologii szczepów Aspergillus. Wyniki te umożliwiają stosowanie kompozycji zawierających itrakonazol albo worikonazol i przeciwciało Mycograb (RTM) do leczenia infekcji grzybiczych u ludzi lub zwierząt.

10 - 9 - Niniejszy wynalazek umożliwia albo stosowanie niższych dawek leków lub skuteczniejsze leczenie przy tych samych dawkach, redukując dzięki temu niepożądane efekty uboczne. [0048] Istnieje kilka ważnych klinicznych następstw niniejszego wynalazku. Po pierwsze synergiczne kombinacje itrakonazolu/worikonazolu i przeciwciała Mycograb (RTM) przeznaczone do leczenia infekcji wywołanych przez Aspergillus powinny stać się standardową terapią. Doprowadziłyby one do spadku śmiertelności i zachorowalności na wspomniane infekcje. Po drugie, itrakonazol/worikonazol są związane z niepożądanymi skutkami ubocznymi u pacjentów otrzymujących te leki. Na przykład worikonazol bardzo powszechnie wiąże się z gorączką, bólami głowy i brzucha, mdłościami, wymiotami, biegunką, obrzękami obwodowymi, wysypką i zaburzeniami wzroku. Synergia zapewniana przez niniejszy wynalazek oznacza, że można stosować mniejszą dawkę itrakonazolu/worikonazolu przy zachowaniu skuteczności leku, a tym samym zmniejszyć toksyczność i niekorzystne skutki uboczne. Po trzecie, efekt obniżenia toksyczności przeciwciała Mycograb (RTM) umożliwiłby stosowanie kliniczne wyższych dawek itrakonazolu/worikonazolu, a tym samym dalszą poprawę wyników terapii klinicznej. WYKAZ SEKWENCJI [0049] <110> NeuTec Pharma PLC <120> Leczenie infekcji grzybiczych <130> GDM/JR-MP WO <160> 3 <170> Patent In version 3.2 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Candida sp. <400> 1 Asn Lys Ile Leu Lys Val Ile Arg Lys Asn Ile Val <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Aspergillus sp. <400> 2 Lys Ile Met Lys Val Ile 1 5 <210> 3 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3

11 His Met Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Cys Ile Ile Ser Ser Tyr Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly Lys Ile Asp Pro Gly Asp Ser Tyr Ile Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Arg Asp Phe Gly Asp Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Phe Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Gly Ile Ser Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Asn Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Ala Ala 245 Jolanta Górczak Rzecznik patentowy

12 Zastrzeżenia patentowe 1. Kompozycja zawierająca przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 organizmu z rodzaju Aspergillus oraz co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol. 2. Preparat łączony zawierający przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 organizmu pochodzącego z rodzaju Aspergillus oraz najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol, do równoczesnego, oddzielnego lub kolejnego stosowania w leczeniu infekcji grzybiczych. 3. Kompozycja według zastrz.eżenia 1 lub preparat łączony według zastrzeżenia 2, w których wymienione przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest specyficzny dla epitopu przedstawionego przez peptyd o sekwencji SEQ ID NO: Kompozycja według zastrzeżenia 1 albo zastrzeżenia 3, lub preparat łączony według zastrzeżenia 2 albo zastrzeżenia 3, w których wymienione przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest specyficzny dla epitopu przedstawionego przez peptyd o sekwencji SEQ ID NO: Kompozycja lub preparat łączony według zastrzeżenia 3 albo zastrzeżenia 4, w których wymienione przeciwciało zawiera sekwencję SEQ ID NO: Kompozycja według dowolnego z zastrzeżeń 1 albo 3 do 5, lub preparat łączony według dowolnego z zastrzeżeń od 2 do 5 do stosowania w leczeniu infekcji grzybiczych. 7. Kompozycja lub preparat łączony według zastrzeżenia 6, w których wymieniona infekcja grzybicza została wywołana przez organizm z rodzaju Aspergillus. 8. Kompozycja lub preparat łączony według zastrzeżenia 5 albo zastrzeżenia 6, w których infekcja grzybicza jest oporna na wymieniony środek grzybobójczy per se. 9. Kompozycja według z dowolnego z zastrzeżeń 1 albo 3 do 8, lub preparat łączony według dowolnego z zastrzeżeń 2 do 8 do stosowania w metodzie leczenia infekcji grzybiczych organizmu człowieka lub zwierzęcia. 10. Sposób wytwarzania leku do leczenia infekcji grzybiczych organizmu człowieka lub zwierzęcia, charakteryzujący się użyciem przeciwciała lub jego fragmentu wiążącego antygen specyficzny dla co najmniej jednego epitopu hsp90 organizmu pochodzącego z rodzaju Aspergillus, oraz co najmniej jednego środka grzybobójczego wybranego z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol. 11. Zastosowanie kompozycji zawierającej przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 organizmu pochodzącego z rodzaju Aspergillus, oraz środek grzybobójczy zawierający co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol, w sposobie wytwarzania leku do leczenia infekcji grzybiczych. 12. Zastosowanie kompozycji według zastrzeżenia 11, w którym wymieniona infekcja grzybicza jest oporna na wymieniony środek grzybobójczy per se. 13. Zestaw zawierający przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen specyficzne dla co najmniej jednego epitopu hsp90 organizmu pochodzącego z rodzaju Aspergillus oraz co najmniej jeden środek grzybobójczy wybrany z grupy obejmującej itrakonazol i worikonazol. 14. Zestaw według zastrzeżenia 13 do stosowania w leczeniu infekcji grzybiczych. 15. Kompozycja według dowolnego z zastrzeżeń 1 albo 3 do 8 lub preparat łączony według dowol-

13 nego z zastrzeżeń 2 do 8, w których wymienione przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest znakowany wykrywalnym znacznikiem. 16. Kompozycja według dowolnego z zastrzeżeń 1 albo 3 do 8 lub preparat łączony według dowolnego z zastrzeżeń 2 do 8, w których wymienione przeciwciało lub jego fragment wiążący antygen jest sprzężony z cząsteczką efektora. Jolanta Górczak Rzecznik patentowy