Charakterystyka molekularna bakterii z rodzaju Enterococcus

Transkrypt

1 Charakterystyka molekularna bakterii z rodzaju Enterococcus Literatura: 1. Szewczyk Eligia M (red.), Diagnostyka mikrobiologiczna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2006, str Śledzińska A., Samet A., Bronk M. Enterokoki jako bakterie zakażeń szpitalnych. Śledzińska A., Samet A., Gładysz A. (red.), Wydawnictwo Continuo, Wrocław Domig K.J., Mayer H.K., Kneifel W. Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp. 1. Media for isolation and enumeration. Int J Food Microbiol 2003 Dec 1; 88(2 3): Domig K.J., Mayer H.K., Kneifel W. Methods used for the isolation, enumeration, characterisation and identification of Enterococcus spp. 2. Pheno and genotypic criteria. Int J Food Microbiol Dec 1; 88(2 3): Yean C.Y., Yin L.S., Lalitha P., Ravichandran M. A nanoplex PCR assay for the rapid detection of vancomycin and bifunctional aminoglycoside resistance genes in Enterococcus species. BMC Microbiol Dec 11; 7:112. Enterokoki zajmują obecnie trzecie miejsce pod względem bakterii, które są przyczyną zakażeń szpitalnych. Są to Gram-dodatnie względnie beztlenowe pałeczki, które stanowią naturalną mikroflorę jelita grubego człowieka oraz zwierząt. Najważniejszymi przedstawicielami rodzaju Enterococcus są Enterococcus faecalis i Enterococcus faecium. Należą do drobnoustrojów względnie chorobotwórczych. Powodują zakażania głównie u ludzi z obniżoną odpornością, długotrwale hospitalizowanych i poddawanych antybiotykoterapii. Identyfikacja enterokoków w obrębie gatunku przeprowadzana jest głównie na podstawie ich cech biochemicznych, zdolności do rozkładu cukrów i argininy. Bierze się również pod uwagę zdolność ruchu. Zarówno E. faecalis jak i E. faecium charakteryzuje zdolność do rozkładu mannitolu i argininy oraz brak zdolności rozkładu sorbozy. Zdolność do rozkładu sorbitolu jest w tej grupie cechą zmienną. Oba gatunki, E. faecalis oraz E. faecium rozkładają laktozę i nie wykazują zdolności do ruchu, ale E. faecalis w odróżnieniu od E. faecium nie rozkłada arabinozy.

2 Ćwiczenie 4.1. Sprawdzanie przynależności badanych izolatów do gatunku E. faecium i E. faecalis Metody oparte na reakcji PCR stanowią użyteczne i szybkie narzędzie diagnostyczne. Technika oparta na amplifikacji fragmentu genu tuf, który koduje czynnik elongacji translacji EF-Tu, pozwala na wykrycie enterokoków na poziomie rodzaju. Gen ten jest niezbędny u wszystkich bakterii, jego sekwencja jest silnie zakonserwowana ewolucyjnie u enterokoków. Metoda ta pozwala na wykrycie większości gatunków enterokoków i nie daje produktów amplifikacji genów większości bakterii należących do innych rodzajów. Inna metoda opiera się na amplifikacji fragmentu genu 16S rrna i pozwala na rozróżnienie bakterii z rodzaju Enterococcus i Lactococcus. Do identyfikacji na poziomie gatunku wykorzystuje się amplifikację fragmentów takich genów jak: ddl, soda i groesl. Gen ddl koduje ligazę D-Ala-D-Ala. Startery specyficzne do fragmentu tego genu pozwalają na identyfikację E. faecalis i E. faecium. Metoda oparta na amplifikacji fragmentów genu soda kodującego dysmutazę ponadtlenkową pozwala na dobre różnicowanie między 23 gatunkami enterokoków. Startery oparte na sekwencji genów groesl, kodujących białka szoku termicznego, pozwalają natomiast na specyficzną identyfikację gatunku E. faecium. Cel ćwiczenia Określenie przynależności gatunkowej izolatów do gatunku E. faecium i E. faecalis Materiały: genomowe DNA bakterii E. faecium i E. faecalis Nazwa / numer X Szczepy bakteryjne, 1) wpisać numer szczepu podany przez prowadzącego Szczep Opis 1) Szczep badany o nieznanej przynależności gatunkowej i nieznanym genotypie K1+A Enterococcus faecium Kontrole dodatnie przynależności K2+A Enterococcus faecalis gatunkowej Tabela 1 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mm roztwór MgCl 2, 8 mm mieszanina dntps polimeraza DNA termostabilna PwoHypernova [2U/µl] woda jałowa, agaroza, bufor 1xTEA,

3 termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok, statywy do probówek startery do reakcji PCR (tabela2) Charakterystyka starterów do reakcji PCR Tabela 2 Układ Gen Długość produktu PCR Nazwa startera Sekwencja A ddl (E.faecium) ddl (E.faecalis) ECIUMF 5' GGCAGAGCATGAAGTGTCCA 3' ECIUMR 5' CTTCTGGGTTTTCTGCTTTTGTA 3' ELISF2 5' GGCCCTCTTTTATCTGAACGA 3' ELISR3 5' GCGACTTAAGCCACTTCCAT 3' Wykonanie 1. Przygotować 4 probówki 0,2 ml. Probówki odpowiednio opisać, zaznaczając próbę badaną X oraz kontrole dodatnie K+ i kontrole ujemne K- 2. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX (wg tabeli 3), zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem starterów i matrycy DNA, wymieszać, rozporcjować do probówek po 10 µl. Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR Skład mieszaniny reakcyjnej Tabela 3 Skład x1 Ilość [µl] Master MIX (x6) Woda 7,3 10 x bufor Shark 1,5 MgCl 2 [20 mm] 1,5 dntps [8 mm] 1,5 Polimeraza Pwo [2U/µl] 0,2 12 Rozporcjować Starter ECIUMF [10µM] 1,0 X Starter ECIUMR [10µM] 1,0 X Starter ELISF2 [10µM] 1,0 X Starter ELISR3 [10µM] 1,0 X 14 DNA 1,0 X Objętość całkowita 15

4 3. Do probówek K1+ i X1 dodać po 1,0 µl startery ECIUMF, ECIUMR, 4. Do probówek K2+ i X2 dodać po 1,0 µl startery ELISF2 i ELISR3. 5. Do probówki z kontrolą ujemna K- dodać mix starterów w ilości po 0,5 µl. 6. Do probówek oznaczonych X1 ze starterami dla E. faecium i X2 ze starterami dla E. faecalis dodać 1µl genomowego DNA badanego szczepu. 7. Do probówki oznaczonej K1+ dodać 1µl genomowego DNA E. faecium, do probówki oznaczonej K2+ dodać 1µl genomowego DNA E. faecalis a do probówki K- 1µl wody. 8. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo czasowym, przedstawionym w tabeli 4. Profil temperaturowo-czasowy reakcji PCR Profil reakcji Tabela 4. Temperatura [ C] Czas [s] Liczba cykli Produkty PCR rozdzielać w żelu agarozowym 1,5% z dodatkiem bromku etydyny (0,5 mg/ml), w buforze 1xTAE przy napięciu ok. 7 V/cm długości żelu. Żel analizować w świetle UV. Wyniki i wnioski 1. Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, próby badane, kontrole dodatnie oraz kontrole ujemne. Zaznacz wielkości produktów PCR. 2. Uzupełnij tabelę 5 wstawiając + w przypadku obecności produktu PCR (próba pozytywna), - w przypadku braku produktu PCR (próba negatywna). Na podstawie uzyskanych wyników określ przynależność gatunkową badanego szczepu.

5 Tabela 5. Wyniki identyfikacji gatunkowej bakterii z rodzaju Enterococcus Gen ddl (E. faecium) ddl (E. faecalis) Długość produktu PCR X K+ K-

6 Ćwiczenie 4.2. Wykrywanie oporności na wankomycynę i gentamycynę u bakterii z rodzaju Enterococcus Antybiotyki glikopeptydowe takie jak wankomycyna i teikoplanina blokują biosyntezę ściany komórkowej u bakterii Gram-dodatnich. Wankomycyna wiąże się z dużym powinowactwem do dipeptydu D-Ala-D-Ala na C-końcu pentapeptydu, przez co blokuje etap dołączania pentapeptydu N-acetylomuramylowego do peptydoglikanu w reakcji transglikozylacji oraz zapobiega sieciowaniu peptydoglikanu w reakcji transpeptydacji. Powoduje to osłabienie ściany komórkowej, przez co komórka podatna jest na lizę osmotyczną. Mechanizm oporności na glikopeptydy wiąże się z: a) obecnością genów, które kodują enzymy syntetyzujące prekursory peptydoglikanu wykazujące małe powinowactwo do wankomycyny. C-końcowa reszta D-alaniny zostaje zastąpiona resztą D-mleczanu (D-Lac) lub D-seryny (D-Ser); b) eliminacją prekursorów peptydoglikanu o wysokim powinowactwie do glikopeptydów, które są nadal produkowane przez gospodarza U enterokoków można wyróżnić sześć fenotypów oraz genotypów na podstawie poziomu oporności na wankomycynę i teikoplaninę oraz tego czy oporność ta jest konstytutywna czy indukowana. Typy VanA, B, D, E i G reprezentują nabyty typ oporności. Typ oporności VanC jest cechą naturalną właściwą dla E. gallinarum oraz E. casseliflavus/e. flavescens. Największe znaczenie kliniczne mają typy oporności VanA i VanB. Typ oporności VanA jest najczęściej spotykany i charakteryzuje się wysokim stopniem oporności indukowanej na wankomycynę i teikoplaninę. Posiadają go najczęściej szczepy E. faecium, ale spotykany jest także u E. faecalis oraz w mniejszym stopniu E. durans, E. raffinosus, E. hirae, E. avium i E. gallinarum. Geny warunkujące ten typ oporności znajdują się na transpozonie Tn1546, który może występować na plazmidzie lub integrować się z chromosomem bakteryjnym. Posiadanie genotypu VanA zwykle wiąże się z posiadaniem fenotypu VanA, spodziewane jest u nich występowanie oporności na wankomycynę i teikoplaninę. Cel ćwiczenia Określenie oporności na wankomycynę i wysokie stężenia gentamycyny u bakterii z rodzaju Enterococcus na podstawie obecności genów vana oraz aac(6')-aph(2'')

7 Materiały genomowe DNA bakterii E. faecium i E. faecalis Nazwa / numer Szczepy bakteryjne, 1) wpisać numer szczepu podany przez prowadzącego Szczep Opis X 1) Szczep badany o nieznanym genotypie K+B K+C Enterococcus vana+ Enterococcus aac(6 )- aph(2 )+ Kontrole dodatnie zawierające geny oporności na antybiotyki Tabela 1 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mm roztwór MgCl 2, 8 mm mieszanina dntps polimeraza DNA termostabilna PwoHypernova [2U/µl] woda jałowa, agaroza, bufor 1xTEA, termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok, statywy do probówek startery do reakcji PCR (tabela 2) Układ Gen Długość produktu PCR B vana 931 C aac(6')- aph(2'') 156 Charakterystyka starterów do reakcji PCR Nazwa startera Sekwencja vanaf 5' TTGGGGGTTGCTCAGAGGAG 3' vanar 5' CTTCGTTCAGTACAATGCGG 3' acphfil 5' GATTTGCCAGAACATGAATTACACGA 3' acphril 5' CATAACCACTACCGATTATTTCAAT 3' Tabela 2. Wykonanie 1. Przygotować po 3 probówki 0,2 ml dla dla układów B i C. Probówki odpowiednio opisać, zaznaczając próbę badaną X oraz kontrole dodatnie K+ i kontrole ujemne K- 2. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX (wg tabeli 3), zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem starterów i matrycy DNA, wymieszać, rozporcjować do probówek po 12µl.

8 Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR Skład mieszaniny reakcyjnej Ilość [µl] Skład x1 Master MIX (x7) Woda 7,3 10 x bufor Shark 1,5 MgCl 2 [20 mm] 1,5 dntps [8 mm] 1,5 Polimeraza Pwo [2U/µl] 0,2 12 Rozporcjować Starter vanaf [10µM] 1,0 X Układ B Starter vanar [10µM] 1,0 X Starter acphfil [10µM] 1,0 X Układ C Starter acphril [10µM] 1,0 X 14 DNA 3) 1,0 X Objętość całkowita 15 Tabel 3 3. Do probówek układu B dodać po 1 µl starterów vanaf i vanar 4. Do probówek układu C dodać po 1 µl starterów acphfil i acphril 5. Do pobówek oznaczonych X dodać 1µl genomowego DNA badanego szczepu. 6. Do probówek oznaczonych K+ dodać 1µl genomowego DNA odpowiedniego do układu szczepu kontrolnego, a do probówek K- 1µl wody. 7. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo czasowym, przedstawionym w tabeli 4. Profil temperaturowo-czasowy reakcji PCR Profil reakcji Tabela 4. Temperatura [ C] Czas [s] Liczba cykli

9 4 8. Produkty PCR rozdzielać w żelu agarozowym 1,5% z dodatkiem bromku etydyny (0,5 mg/ml), w buforze 1xTAE przy napięciu ok. 7 V/cm długości żelu. Żel analizować w świetle UV. Wyniki i wnioski 1. Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, kolejne układy, próby badane, kontrole dodatnie oraz kontrole ujemne. Zaznacz wielkości produktów PCR. Uzupełnij tabelę 5 wstawiając + w przypadku obecności produktu PCR (próba pozytywna), - w przypadku braku produktu PCR (próba negatywna). Na podstawie uzyskanych wyników określ genotyp oporności na wankomycynę i gentamycynę badanego szczepu. Tabela 5. Wyniki wykrywania oporności na wankomycynę i gentamycynę bakterii z rodzaju Enterococcus Próba B C Gen vana aac(6')-aph(2'') Długość produktu PCR X K+ K-

10 Ćwiczenie5.. Wykrywanie czynników wirulencji u bakterii z rodzaju Enterococcus Enterokoki posiadają szereg czynników, które mogą decydować o ich zjadliwości: cytolizynę, żelatynazę, proteazę serynową, białko wiążące kolagen, czynnik agregujący, adhezyny, otoczki, białka powierzchniowe, zdolność wytwarzania nadtlenków, hialuronidazę, fibronektynę, kwasy lipotejchojowe i DNA-zę. Cel ćwiczenia Określenie posiadanych czynników wirulencji u bakterii z rodzaju Enterococcus na podstawie obecności genów: gele (żelatynaza), cyla (cytolizyna), asa1 (substancja agregująca), hyl (hialuronidaza), esp (białko powierzchniowe). Materiały Nazwa / numer genomowe DNA bakterii E. faecium i E. faecalis Szczepy bakteryjne, 1) wpisać numer szczepu podany przez prowadzącego Szczep Opis X 1) Szczep badany o nieznanym genotypie K+D Enterococcus asa 1+ K+E K+F K+G K+H Enterococcus cyla+ Enterococcus gele+ Enterococcus hyl+ Enterococcus esp+ Kontrole dodatnie zawierające badany czynnik wirulencji Tabela 1. 10x stężony bufor do reakcji PCR Shark, 20 mm roztwór MgCl 2, 8 mm mieszanina dntps polimeraza DNA termostabilna PwoHypernova [2U/µl] woda jałowa, agaroza, bufor 1xTEA, termocykler, aparat do elektroforezy poziomej, transilluminator, zimny blok, statywy do probówek startery do reakcji PCR (tabela 2)

11 Układ Gen Długość produktu PCR D asa1 379 E cyla 517 F gele 213 G hyl 276 H esp 954 Nazwa startera Tabela 2 Charakterystyka starterów do reakcji PCR Sekwencja Agg1 5' GGTGCCACAATCAAATTAGG 3' Agg2 5' GATTCTTCGATTGTGTTGGTAAACG 3' TE17 5' TGGATGATAGTGATAGGAAGT 3 TE18 5' TCTACAGTAAATCTTTCGTCA 3 gel11 5' TATGACAATGCTTTTTGGGAT 3' gel12 5' AGATGCACCCGAAATAATATA 3' hyl1 5' ACAGAAGAGCTGCAGGAAATG 3' hyl2 5' GACTGACGTCCAAGTTTCCAA 3' Esp11 5' TTGCTAATGCTAGTCCACGACC 3' Esp12 5' GCGTCAACACTTGCATTGCCGAA 3' Wykonanie 1. Przygotować po 3 probówki 0,2 ml dla układów D, E, F, G i H. Probówki odpowiednio opisać, zaznaczając próbę badaną X oraz kontrole dodatnie K+ i kontrole ujemne K- 2. W probówce 1,5 ml przygotować mieszaninę Master MIX (wg tabeli 3), zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem starterów i matrycy DNA, wymieszać, rozporcjować do probówek po 12µl.

12 Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji PCR Skład mieszaniny reakcyjnej Ilość [µl] Skład x1 Master MIX (x16) Woda 17,3 10 x bufor Shark 1,5 MgCl 2 [20 mm] 1,5 dntps [8 mm] 1,5 Polimeraza Pwo [2U/µl] 0,2 22 Rozporcjować Starter Agg1 [10µM] 1,0 X Układ D Starter Agg2 [10µM] 1,0 X Starter TE17 [10µM] 1,0 X Układ E Starter TE18 [10µM] 1,0 X Starter gel11 [10µM] 1,0 X Układ F Starter gel12 [10µM] 1,0 X Starter hyl1 [10µM] 1,0 X Układ G Starter hyl2 [10µM] 1,0 X Starter Esp11 [10µM] 1,0 X Układ H Starter Esp12 [10µM] 1,0 X 24 DNA 3) 1,0 X Objętość całkowita 25 Tabel Do probówek układu D dodać po 1,0 µl starterów Agg1 i Agg2 4. Do probówek układu C dodać po 1,0 µl starterów TE17 i TE18 5. Do probówek układu C dodać po 1,0 µl starterów gel11 i gel12 6. Do probówek układu C dodać po 1,0 µl starterów hyl1 i hyl2 7. Do probówek układu C dodać po 1,0 µl starterów Esp11 i Esp12 8. Do probówek oznaczonych X dodać 1µl genomowego DNA badanego szczepu. 9. Do probówek oznaczonych K+ dodać 1µl genomowego DNA szczepu kontrolnego, a do probówek K- 1µl wody. 10. Umieścić probówki w termocyklerze. Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z profilem temperaturowo czasowym, przedstawionym w tabeli 4. Profil temperaturowo-czasowy reakcji PCR Tabela 4.

13 Profil reakcji Temperatura [ C] Czas [s] Liczba cykli Produkty PCR rozdzielać w żelu agarozowym 1,5% z dodatkiem bromku etydyny (0,5 mg/ml), w buforze 1xTAE przy napięciu ok. 7 V/cm długości żelu. Żel analizować w świetle UV. Wyniki i wnioski 1. Wklej i opisz zdjęcie przedstawiające elektroforetyczny rozdział produktów PCR, zaznacz marker wielkości DNA, kolejne układy, próby badane, kontrole dodatnie oraz kontrole ujemne. Zaznacz wielkości produktów PCR. 2. Uzupełnij tabelę 5. wstawiając + w przypadku obecności produktu PCR (próba pozytywna), - w przypadku braku produktu PCR (próba negatywna). Na podstawie uzyskanych wyników genotyp wirulencji. Tabela 5 Wyniki wykrywania czynników wirulencji bakterii Enterococcus Próba D E F G H Gen asa1 cyla gele hyl esp Długość produktu PCR X K+ K-

14