This copy is for personal use only - distribution prohibited.

Transkrypt

1 (6): Candida 2 Candida Magdalena Nowak, Piotr Kurnatowski Candida and Candida on Candida Candida Candida Wprowadzenie Wysoka prewalencja raka krtani, znaczny stopień zaawansowania w momencie rozpoznania i stąd często konieczność wykonywania całkowitego usuwania krtani sprawiają, że osoby chore pozbawione są ważnego narządu i możliwości komunikowania się z otoczeniem. Fakt ten skłania do poszukiwania nowych metod rehabilitacji chorych po całkowitej laryngektomii; jedną z nich jest wszczepianie silikonowych protez głosowych, które ułatwiają szybkie tworzenie głosu przełykowego, umożliwiającego swobodne komunikowanie się w życiu codziennym i przystosowanie chorego do nowej sytuacji życiowej. Proteza głosowa nie jest jednak implantem wszczepionym na stałe, ale wymaga okresowej wymiany, głównie z powodu tworzenia się na niej biofilmu, bakteryjnego i/lub grzybiczego, który modyfikuje, degraduje i niszczy powierzchnię, a zwłaszcza zastawkę [1 3]. Najpoważniejszym następstwem tworzenia się na protezach głosowych biofilmu jest, wzrastająca wraz z dojrzewaniem jego struktury, oporność tworzących go mikroorganizmów (bakterii/grzybów) na większość obecnie stosowanych leków [4 9]. Grzybem tworzącym biofilm jest m.in. Candida albicans, który jest także by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów / jednym z najczęstszych czynników etiologicznych kandydoz narządowych i uogólnionych u ludzi. W ostatnich latach zaobserwowano także rosnący udział innych niż Candida albicans gatunków, takich jak: C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis czy C. tropicalis [10 15]. Wiele doświadczeń in vitro z użyciem materiałów, z których wykonane są biomedyczne implanty (polimetakrylan metylu, elastomer silikonowy, PCV etc.), pozwoliło na poznanie procesu tworzenia się biofilmu, który w odniesieniu do grzybów z rodzaju Candida, zachodzi w czterech odległych rozwojowo fazach: wczesnej (0 11 h), pośredniej (12 30 h), dojrzewania (38 72 h) oraz rozproszenia komórek. W fazie pierwszej następuje przyleganie blastospor do powierzchni, a następnie tworzenie mikrokolonii, które stanowią podstawową jednostkę strukturalną biofilmu. Pojawienie się materiału pozakomórkowego, strzępek oraz pseudostrzępek w dwóch kolejnych fazach, decyduje o jego dojrzałości. W fazie dojrzewania, wraz z czasem inkubacji, wzrasta ilość materiału pozakomórkowego, aż do momentu całkowitego pokrycia powierzchni przez komórki grzyba. W ostatniej fazie, w chwili osiągnięcia krytycznej

2 gęstości komórek, blastospory lub całe mikrokolonie odłączają się od biofilmu i ulegają rozproszeniu [16 19]. Celem niniejszej pracy było poznanie zjawiska tworzenia się biofilmu, utworzonego przez grzyby z rodzaju Candida, na protezach głosowych typu Provox 2 oraz Provox Acti Valve. Materiał do badań stanowiły protezy głosowe typu Provox 2 oraz Provox Acti Valve oraz kawałki silikonu, z którego wykonane są protezy, o średnicy ok. 2 mm i długości ok.1 cm (kontrola). Szczepy grzybów i użyte protezy. W celu utworzenia biofilmu na protezach głosowych typu Provox 2 użyto szczep Candida albicans wyizolowany z jamy ustnej pacjenta po laryngektomii z założoną protezą głosową. Szczep ten charakteryzował się wysoką aktywnością enzymatyczną arylamidazy leucynowej (40 nanomoli), aglukozydazy (30 nanomoli) oraz średnimi wartościami aktywności esterazy (C4), lipazy esterazowej (C8), kwaśnej fosfatazy oraz Nacetylobglukozaminidazy (20 nanomoli). Szczep Candida krusei pochodził ze zbiorów Zakładu Biologii i Parazytologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. W doświadczeniu z protezą głosową typu Provox Acti Valve, użyto szczep wzorcowy C. albicans ATCC (American Type Culture Collection) oraz Candida krusei, pochodzący ze zbiorów Zakładu Biologii i Parazytologii Lekarskiej. Sposób postępowania. Szczepy grzybów posiewano na stałe podłoże YNB, wzbogacone 50 μm glukozy i inkubowane przez noc w temperaturze 37 C. Protezy głosowe umieszczano w 12dołkowych studzienkach płytek testowych do hodowli komórkowych i inkubowano przez 24 godziny w jałowej, płodowej surowicy bydlęcej (FBS), przez noc na wytrząsarce (3D, BIOSAN). Następnie protezy przenoszono do pustych, jałowych studzienek i przemywano za pomocą roztworu PBS (roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami) w celu pozbycia się FBS. W kolejnym etapie doświadczenia protezy zanurzano w standaryzowanej zawiesinie komórek (1x107 komórek/ml) i inkubowano w temperaturze 37 C przez 90 minut na wytrząsarce. Po tym czasie protezy przenoszono do jałowych studzienek i przemywano za pomocą roztworu PBS. Następnie protezy zanurzano w płynnym podłożu YNB, wzbogaconym 50 μm glukozy i inkubowano przez 30 godzin w temperaturze 37 C na wytrząsarce. Analizę powtórzono czterokrotnie, w warunkach obecności wyżej wymienionych szczepów oraz bez użycia szczepów grzybów (kontrola). Doświadczenia przeprowadzano zgodnie z metodyką podaną przez Chandra J. i wsp. [5, 17]. Dokumentowanie wyników w SEM. Utworzony na powierzchni protez głosowych i kawałkach silikonu biofilm analizowano przy użyciu elektronowego mikroskopu skaningowego VEGA 5135 MM firmy Tescan. Badania Ryc. 1. Ryc. 2. przeprowadzano w Pracowni Badań Materiałowych, Wydziału Fizyki i Informatyki Stosowanej, Katedry Fizyki Ciała Stałego, Uniwersytetu Łódzkiego w Łodzi. Po osuszeniu badany materiał naklejano na aluminiowe dyski przy użyciu taśmy węglowej. Rejestracji obrazów 359

3 ed. ibu tio np roh ibit d istr Ryc. 3. & DOELFDQV L]RODW ]bmdp\ XVWQHM QD SURWH]LH 3URYR[ 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ nly eo )LJ & NUXVHL RQ 3URYR[ņ YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ for pe rs on al us op y is Ryc. 6. & NUXVHL QD SURWH]LH 3URYR[ 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ )LJ & DOELFDQV LVRODWHG IURP RUDO FDYLW\ RQ 3URYR[ YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ )LJ & NUXVHL RQ 3URYR[ņ YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ is c Ryc. 4. & DOELFDQV L]RODW ]bmdp\ XVWQHM QD SURWH]LH 3URYR[ 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ Th Ryc. 5. & NUXVHL QD SURWH]LH 3URYR[ 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ )LJ & DOELFDQV LVRODWHG IURP RUDO FDYLW\ RQ 3URYR[ YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ 360 zbadanych preparatów dokonywano za pomocą cyfrowego układu detekcji. Specjalistyczny program komputerowy, MultiScanBase V.8.08 (Computer Scanning Systems Ltd.), umożliwiał obserwację, obróbkę, precyzyjne określenie wymiarów badanego obiektu i archiwizację obrazów oraz rejestrację na nośniku. Materiały oglądano w powiększeniach: 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 5000, 8000 i razy w warunkach niskiej próżni (10 Pa, HV: 30,0 KV, detektor BSE), rzadziej w warunkach wysokiej próżni (HV: 30,0 KV; detektor SE). 2 WROD U \QJRORJLD 3ROVND WRP QU OLV WRSDG JU XG]LHñ

4 Obserwacje protez głosowych Provox w elektronowym mikroskopie skaningowym oraz analiza zdjęć dostarczyły informacji o różnicy w budowie biofilmów, utworzonych przez różne gatunki grzybów z rodzaju Candida (ryciny 1 12). W wyniku inkubacji protezy Provox 2 z Candida albicans, pochodzącym z jamy ustnej, zaobserwowano tworzenie się biofilmu na jej powierzchni (Ryc.1 4). Biofilm ten składał się niemal wyłącznie z blastospor, o wymiarach komórek około 3 5 μm; rzadko występowały elementy strzępek bądź pseudostrzępek. Blastospory występowały w postaci luźno rozproszonych w nierównościach protezy (Ryc. 1), przestrzennie ułożonych skupisk komórek pączkujących (Ryc. 1 3) lub były całkowicie pokryte materiałem pozakomórkowym (Ryc. 2, 4). Inkubacja protezy Provox 2 z C. krusei, wykazała tworzenie bardziej obfitego biofilmu na jej powierzchni (Ryc. 5 7). Zaobserwowano występowanie dużej ilości blastospor, gęstej sieci strzępek/pseudostrzępek (Ryc. 6) oraz blastospor i strzępek/pseudostrzępek pokrytych materiałem pozakomórkowym (Ryc. 7). Blastospory występowały także w charakterystycznych skupiskach na granicy brzegu części środkowej protezy głosowej a jej kołnierza (Ryc. 5). W wyniku inkubacji protezy Provox Acti Valve ze szczepem wzorcowym C. albicans ATCC nie zaobserwowano obecności biofilmu bądź żadnych elementów komórek grzyba (Ryc. 8). Inkubacja protezy Provox Acti Valve z C. krusei wykazała występowanie komórek pączkujących, strzępek/ pseudostrzępek oraz chlamydospor (Ryc. 9 12). Blastospory występowały w charakterystycznych skupiskach (Ryc. 9) lub, podobnie jak strzępki/pseudostrzępki, pokryte materiałem pozakomórkowym (Ryc. 12). W odróżnieniu od doświadczenia ze szczepem C. krusei, utworzonego na protezie Provox 2, biofilm powstały na protezie Acti Valve był mniej obfity, z mniejszą ilością strzępek/pseudostrzępek. Zasadniczą różnicą było jednak rozmieszczenie komórek na zastawkach protez głosowych. W przypadku protezy Provox 2, blastospory oraz pseudostrzępki ściśle przylegały do jej powierzchni (Ryc. 5). Na zastawce protezy Acti Valve nie znaleziono elementów strzępek/pseudostrzępek, a blastospory nie tworzyły gęstej sieci, występując nielicznie w specyficznych skupiskach (Ryc. 11). Zdolność grzybów do tworzenia struktury biofilmu decyduje o ich patogenności, a wzrost zakażeń związanych z obecnością biofilmu przesądza o jego znaczeniu klinicznym [20]. Z tego powodu podejmowano próby stworzenia modeli doświadczalnych, które pozwoliły na poznanie faz rozwoju biofilmu, jego struktury, określenia biomasy oraz wykazania Ryc. 7. Ryc. 8. różnic w jego tworzeniu przez różne gatunki grzybów z rodzaju Candida. Z danych piśmiennictwa wynika, że najczęściej wykorzystywanym do tego celu modelami badawczymi były fragmenty biomateriału zbudowane z polichlorku 361

5 ed. ibu tio np roh ibit d istr for pe rs on al us op y is Ryc. 12 & NUXVHL QD SURWH]LH 3URYR[ $FWL 9DOYH 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ )LJ & NUXVHL RQ 3URYR[ $FWL 9DOYH YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ )LJ & NUXVHL RQ 3URYR[ $FWL 9DOYH YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ winylu (PCV), poliuretanu, elastomeru silikonowego, silikonu, lateksu lub akrylu (polimetakylan metylu); większość badań przeprowadzano z użyciem szczepów C. albicans, rzadziej C. tropicalis, C. parapsilosis, C. kefyr, C. glabrata, zaś biofilm analizowano za pomocą technik mikroskopowych, m.in. skaningowej mikroskopii elektronowej SEM (analiza jakościowa) czy konfokalnej, laserowej mikroskopii elektronowej CLSM (analiza jakościowa i ilościowa) [17 19, 21 25]. W dostępnym piśmiennictwie nie znaleziono prac, w których obserwowano tworzenia się biofilmu na protezach głosowych w warunkach doświadczalnych. is c Ryc. 10 & NUXVHL QD SURWH]LH 3URYR[ $FWL 9DOYH 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ Th )LJ & NUXVHL RQ 3URYR[ $FWL 9DOYH YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ eo )LJ & NUXVHL RQ 3URYR[ $FWL 9DOYH YRLFH SURVWKHVLV 6(0 [ PDJQLğFDWLRQ Ryc. 11 & NUXVHL QD SURWH]LH 3URYR[ $FWL 9DOYH 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ nly Ryc. 9. & NUXVHL QD SURWH]LH 3URYR[ $FWL 9DOYH 6(0 SRZLÚNV]HQLH [ WROD U \QJRORJLD 3ROVND WRP QU OLV WRSDG JU XG]LHñ

6 Opisy dotyczą jedynie protez usuwanych pacjentom i badanych pod kątem obecności biofilmu. Pozostałe publikacje dotyczą zagadnienia tworzenia się biofilmu grzybiczego na różnych biomateriałach, stosowanych do produkcji medycznych implantów. Badania Hawser i Douglas dostarczyły informacji na temat budowy biofilmu, utworzonego na powierzchniach, z których wykonane są cewniki. Izolaty C. parapsilosis, C. kefyr oraz C. glabrata wytwarzały znacznie mniejszą, a C. krusei podobną do C. albicans ilość biofilmu. Wykazano także, że tworzenie się biofilmu na powierzchni wykonanej z lateksu lub elastomeru silikonowego było znacznie większe, niż na polichlorku winylu, a bardzo małe na powierzchni poliuretanowej lub wykonanej z silikonu. Analiza SEM biofilmów C. albicans, utworzonych na powierzchni silikonowej i wykonanej z elastomeru silikonowego (z lateksowym rdzeniem) wykazała różnice w topografii ich powierzchni. Analizowany w SEM 48godzinny biofilm C. albicans, utworzony na powierzchni wykonanej z polichlorku, składał się z gęstej sieci blastospor, germ tubes, pseudostrzępek oraz strzępek, a na ich powierzchni widoczny był materiał pozakomórkowy [18]. W badaniach Hawser i wsp., utworzony na fragmentach materiału wykonanego z polichlorku winylu dojrzały, 48godzinny biofilm C. albicans zbudowany był z gęstej sieci blastospor, germ tubes, pseudostrzępek i strzępek oraz małej ilości materiału pozakomórkowego (warunki statyczne). Biofilm utworzony w warunkach wstrząsania charakteryzował się znacznie większą ilością materiału pozakomórkowego [23]. Chandra i wsp. zbadali biofilmy C. albicans na biomateriałach, z których wykonane są biomedyczne implanty: na elastomerze silikonowym i polimetakrylanie metylu, w warunkach in vitro. Tak utworzone biofilmy analizowano w konfokalnym, laserowym mikroskopie elektronowym (CLSM) oraz w elektronowym mikroskopie skaningowym (SEM). Biofilmy charakteryzowały się wysoce heterogenną strukturą, pod względem rozmieszczenia komórek grzybów oraz materiału pozakomórkowego. W pierwszym etapie tworzenia się biofilmu nie zaobserwowano obecności materiału pozakomórkowego, a jedynie tworzenie się mikrokolonii, zaś komórki C. albicans występowały w postaci blastospor. W dojrzałym biofilmie, podobnie jak w badaniach własnych, zaobserwowano tworzenie się materiału pozakomórkowego oraz elementów strzępek [5, 17]. W badaniach własnych, w wyniku inkubacji protezy Provox 2 z C. albicans, w mikroskopie skaningowym zaobserwowano biofilm zbudowany w głównej mierze z luźno rozproszonych, bądź przestrzennie ułożonych blastospor. Niektóre z nich były całkowicie pokryte materiałem pozakomórkowym, elementy strzępek lub pseudostrzępek występowały rzadko. W skaningowym mikroskopie elektronowym nie zaobserwowano natomiast żadnych elementów grzybów C. albicans ATCC (szczep wzorcowy) na protezie Provox Acti Valve. Przyczynę tego zjawiska można wytłumaczyć wykorzystaniem różnych szczepów grzybów bardziej patogennego szczepu C. albicans, pochodzącego z jamy ustnej pacjenta z wszczepioną protezą głosową i szczepu wzorcowego, w przypadku doświadczenia z użyciem protezy Provox Acti Valve. Ciekawe wyniki otrzymano w przypadku inkubacji protez Provox 2 i Provox Acti Valve, ze szczepem C. krusei, pochodzącym od pacjenta Zakładu Biologii i Parazytologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. W skaningowym mikroskopie elektronowym zaobserwowano utworzenie się dojrzałego biofilmu na silikonowej części powierzchni obu protez. Zauważono elementy blastospor, strzępek i pseudostrzępek, niektóre elementy morfologiczne były pokryte materiałem pozakomórkowym. Jednak biofilm powstały na protezie Provox Acti Valve charakteryzowała mniejsza obfitość, rzadziej też występowały elementy strzępek lub pseudostrzępek, choć zaobserwowano występowanie germ tubes. Różnice dotyczyły także kolonizacji zastawek protez głosowych na zastawce protezy Provox 2 zauważono występowanie biofilmu grzybiczego ze wszystkimi jego elementami morfologicznymi. Na zastawce protezy Acti Valve zaobserwowano nieliczne skupiska blastospor, nie występujące jednak jako elementy biofilmu. Podobne rezultaty otrzymali Hilgers i wsp., którzy zaobserwowali wzrost grzybów Candida jedynie na silikonowej części protezy. Przyczyną tego zjawiska jest odmienna niż w przypadku protezy Provox 2 budowa zastawki, która wykonana jest z materiału (podobnego do teflonu) opornego na osiedlanie się grzybów z rodzaju Candida [26]. Otrzymane wyniki dowiodły, iż grzyby z rodzaju Candida mogą tworzyć dojrzały biofilm w warunkach in vitro na powierzchniach protez głosowych Provox 2 oraz Provox Acti Valve, a różnice w jego budowie zależą od gatunku grzyba i rodzaju materiału, z którego wykonana jest zastawka protezy. 1. Bień S, Okła S. Analiza powikłań związanych z chirurgiczną rehabilitacją głosu i mowy u pacjentów po laryngektomii. Problemy związane z wszczepieniem i wymianą protez głosowych. Otolaryng Pol. 2006; 60: Op de Coul BM, Hilgers FJ, Balm AJ, van den Hoogen FJ, van Tinteren H. A decade of postlaryngectomy vocal rehabilitation in 318 patients. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2000; 126: Van Weissenbruch R, Bouckaert S, Remon JP, Nelis H, Aerts R, Albers FWJ. Chemoprophylaxis of fungal deterioration of the Provox silicone tracheoesophageal prosthesis 363

7 ; 106: Baillie GS, Douglas LJ. Candida biofilms and their susceptibility to antifungal agents. Methods Enzymol. 1999; 310: Chandra J, Mukherjee PK, Leidich SD, Faddoul FF, Hoyer LL, Douglas LJ, i wsp. Antifungal resistance of candidal biofilms formed on denture acrylic in vitro. J Dent Res. 2001; 80: Hawser SP, Douglas LJ. Resistance of Candida albicans biofilms to antifungal agents in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 1995; 39: Kuhn DM, George T, Chandra J, Mukherjee PK, Ghannoum MA. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob Agents and Chemother. 2002; 46: Mukherjee PK, Chandra J, Kuhn DM, Ghannoum MA. Mechanism of fluconazole resistance in Candida albicans biofilms: phasespecific role of efflux pumps and membrane sterols. Infect Immun. 2003; 71: Ramage G, Vandewalle K, Wickes BL, LópezRibot JL. Standardized albicans and Candida tropicalis: chemical composition method for in vitro antifungal susceptibility testing and role in drug resistance. J Med Microbiol. 2006; 55: of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents and Chemother. 2001; 45: Bodey GP, Mardani M, Hanna HA, Boktour M, Abbas J, Girgawy E i wsp. The epidemiology of Candida glabrata and in postlaryngectomy patients. Ann Otol Rhinol Laryngol. 15. Xess I, Jain N, Hasan F, Mandal P, Banerjee U. Epidemiology of candidemia in a tertiary care centre of north India: 5year study. Infection. 2007: 35: Blankenship JR, Mitchell AP. How to build a biofilm: a fungal perspective. Curr Opin Microbiol. 2006; 9: Chandra J, Kuhn DM, Mukherjee PK, Hoyer LL, McCormick T, Ghannoum MA. Biofilm formation by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J Bacteriol. 2001; 183: Hawser SP, Douglas LJ. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 1994; 62: Ramage G, Vandewalle K, Wickes BL, LopezRibot JL. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev Iberoam Micol. 2001;18: Douglas LJ. Candida biofilms and their role in infection. Trends Microbiol. 2003; 11: Adam B, Baillie GS, Douglas LJ. Mixed species biofilms of Candida albicans and Staphylococcus epidermidis. J Med Microbiol. 2002; 51: AlFattani MA, Douglas LJ. Biofilm matrix of Candida Hawser SP, Baillie GS, Douglas LJ. Production of extracellular matrix by Candida albicans biofilms. J Med Microbiol. 1998; 47: Candida albicans fungemia in immunocompromised patients with cancer. Am J Med. 2002; 112: Candida dubliniensis: comparison of biofilm formation in 24. Henriques M, Azeredo J, Oliveira R. Candida albicans and 11. Celebi S, Hcimustafaoglu M, Ozdemir O, Ozkaya G. Nosocomial candidaemia in children: results of a 9year study terms of biomass and activity. Br J Biomed Sci. 2006; 63: Mycoses. 2008; 51: Kuhn DM, Chandra J, Mukherjee PK, Ghannoum MA. 12. Dimopoulos G, Ntziora F, Rachiotis G, Armaganidis A, Falagas ME. Candida albicans versus nonalbicans intensive Candida parapsilosis on bioprosthetic surfaces. Infect Im Comparison of biofilms formed by Candida albicans and care unitacquired bloodstream infections: differences in risk mun. 2002; 70: factors and outcome. Anesth Analg; 2008: 106, Hilgers FJ, Ackerstaff AH, Balm AJ, van den Brekel MWM, 13. Fidel PL Jr, Vazquez JA, Sobel JD. Candida glabrata: review Tan IB, Persson J. A new problemsolving indwelling voice of epidemiology, pathogenesis, and clinical disease with comparison to C. albicans. Clin Microbiol Rev. 1999; 12: underpressure related replacements: Provox Acti Valve. prosthesis, eliminating the need for frequent Candida and 14. Verduyn Lunel FM, Meis JF, Voss A. Nosocomial fungal infections: candidemia. Diagn Microbiol Infect Dis. 1999; 34: Acta Otolaryngol. 2003; 123: