Temat: Wpływ substancji czynnych izolowanych z Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium majus) na wybrane szczepy bakterii i grzybów.

Transkrypt

1 Temat: Wpływ substancji czynnych izolowanych z Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium majus) na wybrane szczepy bakterii i grzybów. Streszczenie. Celem przeprowadzonych doświadczeo było zbadanie wpływu ekstraktu z korzenia i liścia Glistnika jaskółcze ziele (Chelidonium majus) na wzrost wybranych szczepów bakterii i grzybów. Potwierdzono, że izolowane substancje z korzenia i liścia mają właściwości bakterio-i grzybobójcze. Największe zahamowanie wzrostu wśród wybranych szczepów bakterii na wyciąg z korzenia Chelidonium majus wykazały szczepy Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis oraz Micrococcus luteus należące do bakterii Gram-dodatnich. U żadnej z badanych bakterii nie zaobserwowano zahamowania pod wpływem ekstraktu z liścia. Wyciąg z obu części rośliny, dawał hamujący efekt na szczep grzybów Candida albicans, zaś z korzenia na Candida glabrata. Wstęp. Wiele roślin stosowanych w medycynie ludowej działa bakteriobójczo i grzybobójczo. Jedną z takich roślin jest Chelidonium majus. Ziele to wykorzystywano wcześniej do smarowania brodawek, gdyż sok glistnika posiada silne właściwości drażniące. Przed zastosowaniem zmiękczano brodawkę wodą z mydłem. Następnie smarowano ją sokiem z ziela kurzajkowego, jak też nazywano tą roślinę. Dodatkowo roślina ta była stosowana jako środek leczniczy na wszelkie choroby związane z wątrobą. Obecnie w aptekach możemy spotkad wiele leków na bazie właśnie tej rośliny. Są to głównie specyfiki zawierające domieszkę etanolu i wody. Mają zastosowanie jako środek wspomagający proces usuwania piasku i kamieni z pęcherzyka żółciowego oraz walkę z egzemą. Dodatkowo łagodzą objawy uporczywego kaszlu, a także wspomagają pracę śluzówek i śledziony. Badanie wpływu Glistnika jaskółcze ziele na bakterie i grzyby może przynieśd nowe rozwiązanie dla wielu innych ważnych problemów, z którymi spotykamy się codziennie i które dotyczą nie tylko naszego zdrowia, ale również gospodarki. Oprócz odkrycia nowych możliwości w leczeniu chorób człowieka i zwierząt, tego typu badania mogą prowadzid także do odkrycia nieznanych dotąd właściwości tej rośliny. Może okazad się ona pomocna na przykład w leczeniu chorób roślin uprawnych. Materiał badawczy i metody. Na początku wybrano szczepy bakterii (Citrobacter freundii, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Sarcina spp) oraz grzybów (Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida albicans, Candida glabrata, Candida spp), które były w kolekcji mikroorganizmów Katedry Mikrobiologii UG. Następnie posiano je na podłoża krwawe w celu otrzymania pojedynczych kolonii szczepów. Zastosowano posiew redukcyjny, aby dokładnie upewnid się, że na szalkach znajdują się czyste kultury bakterii i grzybów. Z dojrzałej, kwitnącej rośliny Chelidonium majus pobranej z podłoża wraz z korzeniem w maju, pobrano liście i fragment korzenia. Odważono je w porcjach po 2,5 g każda i zamrożono w temperaturze -70 o C. Niska temperatura zapobiegała - 1 -

2 rozkładowi materiału biologicznego. Po kilku dniach wyjęto po jednej porcji z części nadziemnej i korzenia i ucierano je w 50 ml 96% etanolu do uzyskania homogennego ekstraktu, po czym przełożono je do przeźroczystych słoiczków i włożono do sonikatora, który poprzez użycie ultradźwięków (15 sec impuls, 1 min przerwa, 30 cykli), pozwalała na fragmentację błony komórkowej i uwolnienie zawartości komórek wraz z substancjami czynnymi, które miały byd badane. Po wyjęciu z sonikatora roztwór odparowano do sucha w 37 o C, a powstały osad zważono i zawieszono w 2 ml 96% etanolu. Określono stężenia obu ekstraktów jako 25 mg/ml. Wiele substancji czynnych z roślin nie rozpuszcza sie z wodzie, a w alkoholach, stąd wybór etanolu. Tak przygotowanych ekstraktów użyto do przeprowadzenia dwóch testów. Test jakościowy. Przygotowane ekstrakty z liścia i korzenia Chelidonium majus zakraplano na krążki bibuły o średnicy 6 mm, po 20 l na jeden. Następnie przygotowano płytki z pożywką stałą LA (skład: 10 g tryptonu, 10 g chlorek sodu, 5 g ekstrakt drożdżowy, 15 g agar, 1000 ml woda). W przypadku podłoża dla grzybów Candida to samo podłoże LA zostało zakwaszone kwasem solnym do wartości ph 5,5, co dało bardzie optymalne środowisko dla rozwoju tych organizmów. Na podłoże LA wysiano murawę poszczególnych bakterii i grzybów, a następnie na każdej płytce rozłożono po trzy wcześniej przygotowane krążki nasączone odpowiednio: 20 μl ekstraktu z liścia, 20 μl ekstraktu z korzenia oraz 20 μl etanolu jako kontroli. Materiał inkubowano w temperaturze 37 o C przez noc, po czym odczytano wynik doświadczenia, dokonując pomiaru wielkości przejrzystej strefy wokół krążka, która świadczyła o braku wzrostu. Wykonano dwa powtórzenia. Test ilościowy. Wybrano dwa szczepy bakterii i jeden grzyba i przystąpiono do dokładnego badania wpływu ekstraktów Chelidonium majus na ich wzrost w hodowli płynnej, w pożywce LB (ph dla bakterii oraz ph 5,5 w wypadku Candida). Przygotowano hodowle nocne danego mikroorganizmu. Następnie rozdzielono je do 3 kolb, po 20 ml pożywki oraz po 300 μl hodowli nocnej. Po inkubowaniu hodowli w kolbkach w wytrząsarce w wodzie o temperaturze 37 o C (bakterie) lub 30 o C (dla grzybów) przez około 0,5 h dokonano pierwszego pomiaru gęstości optycznej bakterii (OD) za pomocą spektrofotometru. Następnie do trzech kolbek dodano: 50 μl etanolu (próba kontrolna), 50 μl wyciągu z korzenia oraz 50 μl wyciągu z liścia Chelidonium majus. Poczym hodowle kontynuowano i zbierano pomiary co 0,5 h, aż do czasu kiedy OD nie wzrastało. Równolegle, wykonano preparaty mikroskopowe badanych mikroorganizmów i oglądano w polu mikroskopu kształty pojedynczych bakterii. Przygotowano preparaty rozprowadzając zawiesinę bakterii na szkiełku podstawowym oraz utrwalając materiał poprzez ogrzewanie nad płomieniem palnika. Do barwienia preparatów użyto błękitu metylenu. Następnie obserwowano komórki bakterii pod mikroskopem

3 Wyniki. W teście jakościowym, gdzie badano bakterie i grzyby na pożywce stałej najpierw upewniono sie, ze żaden mikroorganizm nie był wrażliwy na etanol w próbie kontrolnej, w którym rozpuszczono ekstrakty rośliny. Największą wrażliwością na wyciąg z korzenia i liścia odznaczył się Candida albicans (Rysunek 1). Strefy hamowania w pobliżu krążków nasączonych ekstraktem z korzenia i liścia wynosiły po 3 mm. U Candida glabrata zahamowanie wzrostu zaobserwowano tylko na ekstrakt z korzenia (Rysunek 2), strefa hamowania wynosiła 4 mm. Inne gatunki Candida okazały się odporne na substancje zawarte w korzeniu i liściu Chelidonium majus. Wśród bakterii największą strefę hamowania wzrostu odczytano u bakterii Micrococcus luteus (Rysunek 3) oraz Bacillus subtilis (Rysunek 4). Dodatkowo strefę hamowania dało się odczytad u bakterii Staphylococcus epidermidis oraz Sarcina spp. U żadnej z bakterii nie odczytano stref hamowania przy krążku z wyciągiem z liścia

4 Dokładne wyniki doświadczenia na bakteriach i grzybach przedstawiono w tabeli, by ułatwid ich odczyt (Tabela 1). Gatunek bakterii Strefa hamowania przez ekstrakt Gatunek grzyba Strefa hamowania przez ekstrakt z korzenia z liścia z korzenia z liścia Citrobacter freundii - - Candida parapsilosis - - Micrococcus luteus 5 mm - Candida tropicalis - - Bacillus subtilis 5 mm - Candida albicans 3 mm 3 mm Staphylococcus epidermidis 4 mm - Candida glabrata 4 mm - Escherichia coli - - Candida spp - - Sarcina spp 3 mm - Tabela 1 Odczyt strefy hamowania danego ekstraktu. Minus (-) oznacza odpornośd na ekstrakt. Do badao w podłożu płynnym wybrałam bakterię z największą strefą hamowania przy krążku z ekstraktem z korzenia czyli Bacillus subtilis i bakterię która okazała się najbardziej odporna na działanie wyciągu z Chelidonium majus, Escherichia coli. Podczas pomiarów okazało się, że najniższe OD odnotowano w kolbie z Bacillus subtilis i wyciągiem z korzenia w stosunku do próby kontrolnej (Wykres 1), zaś w kolbkach z Escherichia coli nie zauważono żadnego hamowania w stosunku do próby z etanolem (Wykres 2). OD ,5 0,25 0,125 Bacillus subtilis czas (h) Wykres 1 Wzrost hodowli Bacillus subtilis pod wpływem ekstraktu C. majus etanol liść korzeń 4 2 OD 1 0,5 0,25 0,125 Escherichia coli czas (h) Wykres 2 Wzrost hodowli Escherichia coli pod wpływem ekstraktu C. majus etanol liść korzeń Co do grzybów z rodzaju Candida do badao wybrano Candida glabrata, której wyniki również potwierdziły poprawnośd wcześniejszego doświadczenia. Dodatkowo odczytano hamowanie wzrostu, podobne do hamowania korzenia, jednak nieco mniejsze, pod wpływem wyciągu z liścia Chelidonium majus (Wykres 3). Postanowiono bliżej przyjrzed się komórkom Bacillus subtilis pod mikroskopem z powodu dużego hamowania wzrostu przez wyciąg z korzenia. Normalnie komórki tej bakterii OD 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Wykres 1 Wzrost Candida glabrata pod wpływem ekstraktu C. majus Candida glabrata czas (h) etanol liść korzeń

5 są kształtu pałeczki. Pod wpływem podanej ilości etanolu (takiej jak przy próbie kontrolnej), bakterie zachowały swój kształt (Rysunek 5A). Pod wpływem wyciągu z korzenia Chelidonium majus skurczyły się i stały się okrągłe (Rysunek 5B), można było zauważyd wśród nich także nieliczne wydłużone formy. Dyskusja. W Chelidonium majus stwierdzono obecnośd około 20 alkaloidów, które stanowią 0,5-4% soków rośliny. Ich stężenie w korzeniu jest prawie 20 razy większe niż w części nadziemnej. Jak donosi literatura wiele z nich ma właściwości bakterioi grzybobójcze. Są to między innymi sangwineryna i cheledonina (Colombo, Bosisio 1996). Roślina zawiera także alkaloid cheleretrynę, która wykazuje działanie bakterio- i fungistatyczne (Różaoski, Poznao ). Hamuje ona wzrost i namnażanie się komórek organizmów, ale nie zabija istniejących już drobnoustrojów. Można wnioskowad, że to między innymi także ta substancja zadziałała podczas przeprowadzonego doświadczenia. Dodatkowo zauważono, że najbardziej hamujący wpływ wywiera on na bakterie Gram-dodatnie, takie jak Bacillus subtilis czy Staphylococcus epidermidis, zaś na bakterie Gram-ujemne, takie jak Escherichia coli, nie ma on żadnego wpływu. Może mied to związek z budową osłon komórkowych. U bakterii Gram-dodatnich ściana komórkowa jest gruba (kilkadziesiąt warstw), zbudowana głównie z peptydoglikanu, zaś u bakterii Gram-ujemnych ma tylko dwie warstwy, cienką peptydoglikanu i błonę zewnętrzną, zawierającą polisacharydy przyłączone do lipidów (Solomon, Berg, Martin, 2007). Mając takie wyniki, mogę sugerowad, że substancje zawarte w Chelidonium majus działają na komórki Gram-dodatnie podobnie jak penicylina. Antybiotyk ten działa głównie na bakterie Gram-dodatnie, zaburzając syntezę peptydoglikanu, przez co ściana komórkowa staje się nietrwała i nie jest w stanie ochronid komórki (Solomon, Berg, Martin, 2007). U bakterii Bacillus subtilis zauważono słabą odpowiedź SOS. System ten włącza się w komórce, jeśli dochodzi do uszkodzenia DNA lub innego stresu - 5 -

6 (Singleton P., 2000). U wielu bakterii, jak i u Bacillus subtilis, kiedy komórka broni się przed zagrożeniem ze strony zmian w DNA, kształt jej wydłuża się, ponieważ naprawia ona swoje DNA, przez co wstrzymuje podziały aż do zakooczenia jego naprawy. Pod wpływem etanolu zaobserwowano typowy kształt komórek Bacillus subtilus (Rysunek 5A), jednak pod wpływem ekstraktów z Chelidonium majus w preparacie zaobserwowano strzępki martwych bakterii (Rysunek 5B, czarna strzałka), jak i komórki okrągłe, z niewielką otoczką dookoła (Rysunek 5B, czerwona strzałka) oraz nieliczne wydłużone komórki (Rysunek 5B, zielona strzałka). Obserwowane pod mikroskopem okrągłe formy bakterii mogą potwierdzad, że skoro bakteria straciła swoje rusztowanie w postaci peptydoglikanu, będzie dążyła do optymalnego dla niej kształtu kuli. Możliwe, że substancje czynne współdziałały ze sobą w zwalczaniu bakterii. Podczas przeprowadzonego doświadczenia działały razem substancje zarówno bakterio- i grzybobójcze, jak i bakterio- i fungistatyczne. Może świadczyd o tym obecnośd w badanej pod mikroskopem próbce zarówno bakterii przyjmujących kształt okrągły, strzępek nieżywych bakterii oraz odpowiedzi SOS bakterii pod wpływem stresu. Można zastanowid się nad znaczeniem efektu bakteriobójczego ze strony Chelidonium majus na bakterie Gram-dodatnie, gdyż może mied to duże znaczenie dla przemysłu farmaceutycznego, ponieważ wiele gatunków takich jak gronkowce czy paciorkowce należące do tej grupy, stanowią grupę potencjalnych patogenów i przyczyniają się do wielu zakażeo, także szpitalnych. Candida albicans występuje u ok. 40%-80% ludzi jako składnik flory przewodu pokarmowego. Ona też może stad się groźna dla organizmu, czemu sprzyja przewlekła antybiotykoterapia, osłabienie odporności, sztuczne zastawki, cewniki, zabiegi inwazyjne etc. Pożytecznym byłoby prowadzenie dalszych badao w zakresie wyizolowania z Chelidonium majus odpowiedniego leku na te patogeny. Literatura. 1. Colombo M. L., Bosisio E., Pharmacological activities of Chelidonium majus L. (Papaveraceae), Institute of Pharmacological Sciences, University of Milan, Italy Różaoski H.: Zioła w praktycznej terapii: Chelidonium maius (majus) L. glistnik jaskółcze ziele, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego, Zakład Historii Nauk Medycznych, Poznao Singleton P., Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, Wydawnictwo Naukowe PWN, Waraszawa Solomon E. P., Berg L. R., Martin D. W.: Biologia, MULTICO Oficyna Wydawnicza, Warszawa