(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US03/022566

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (51) Int.Cl. A61K 39/395 ( ) C07K 16/00 ( ) A61P 1/00 ( ) A61P 19/00 ( ) (54) Neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnfα, zastosowanie tego przeciwciała, kryształ zawierający ludzkie przeciwciało anty-tnfα i preparat zawierający ten kryształ (73) Uprawniony z patentu: ABBVIE BIOTECHNOLOGY LTD., Hamilton, BM (30) Pierwszeństwo: , US, 60/397, , US, 60/411, , US, 60/417, , US, 60/455,777 (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 23/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 02/15 (72) Twórca(y) wynalazku: SUBHASHIS BANERJEE, Shrewsbury, US LORI K. TAYLOR, Wadsworth, US CLIVE E. SPIEGLER, Reading, GB DANIEL E. TRACEY, Harvard, US ELLIOT K. CHARTASH, Randolph, US REBECCA S. HOFFMAN, Wilmette, US WILLIAM T. BARCHUK, Madison, US PHILIP YAN, Vernon Hills, US ANWAR MURTAZA, Westborough, US JOCHEN G. SALFELD, North Grafton, US STEVEN FISCHKOFF, Short Hills, US (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Urszula Bartnik

2 2 PL B1 Opis wynalazku Dziedzina techniki Przedmiotem wynalazku jest neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnfα, zastosowanie tego przeciwciała, kryształ zawierający ludzkie przeciwciało anty-tnfα i preparat zawierający ten kryształ. Stan techniki Cytokiny takie jak interleukina-1 (IL1) i czynnik martwicy nowotworów (TNF) są cząsteczkami wytwarzanymi przez różnorodne komórki, takie jak monocyty i makrofagi, zidentyfikowanymi jako mediatory procesów zapalnych. Cytokiny, włączając w to TNF, regulują intensywność i czas trwania odpowiedzi zapalnej, która pojawia się w wyniku zranienia lub infekcji. TNFα (także nazywany TNF) bierze udział w patofizjologii różnych ludzkich chorób i zaburzeń, włączając w to zakażenie ogólne, choroby autoimmunologiczne, odrzucanie przeszczepu i chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi (patrz np.: Moeller i wsp., (1990) Cytokine 2:162; U.S. Patent No Moeller i wsp., Europejska Publikacja Patentowa No B1 Moeller A. i wsp., Vasili (1992) Annu. Rev. Immonol. 10:411; Tracey i Cerami (1994) Annu. Rev. Med. 45:491). Streszczenie wynalazku Istnieje potrzeba leczenia w sposób bezpieczny i skuteczny związanych z TNFα chorób, w których aktywność TNFα jest szkodliwa. Obecny wynalazek wychodzi naprzeciw tej potrzebie i pozwala na bezpieczne i skuteczne leczenie związanych z TNFα chorób, w których aktywność TNFα jest szkodliwa. Przedmiotem wynalazku jest neutralizujące o wysokim powinowactwie izolowane ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen do zastosowania w leczeniu zaburzeń wybranych grupy składającej się z dolegliwości skórnych, spondyloartropatii, zaburzeń metabolicznych, zapalenia naczyń, dolegliwości płucnych, zaburzeń wieńcowych, niedokrwistości, bólu, dolegliwości wątroby, dolegliwości paznokci, tocznia rumieniowatego układowego, wieloukładowej choroby autoimmunologicznej, utraty słuchu na podłożu autoimmunologicznym, endometriozy, zapalenia gruczołu krokowego, neowaskularyzacji podsiatkówkowej, zespołu Sjörgensa, rwy kulszowej, mokrej degeneracji plamki żółtej, osteoporozy, związanego z wiekiem wyniszczenia, choroby Alzheimera, obrzęku mózgu, zapalnego urazu mózgu, raka, wyniszczenia nowotworowego, zespołu chronicznego zmęczenia, zapalenia skórno-mięśniowego, reakcji na leki, obrzęku rdzenia kręgowego w i/lub wokół rdzenia kręgowego, okresowej gorączki rodzinnej, zespołu Felty, zwłóknienia, kłębkowego zapalenia nerek, utraty protez, mikroskopowego zapalenia wielonaczyniowego, kolagenozy mieszanej, choroby wielonarządowej, zespołu mielodysplastycznego, osteolizy w przebiegu zapalenia jąder, zapalenia trzustki, choroby przyzębia, zapalenia wielomięśniowego, postępującej niewydolności nerek, innej choroby dającej objawy podobne do dny, piodermii zgorzelinowej, nawracającego zapalenia wielochrząstkowego, reumatycznej choroby serca, stwardnienia przewodów żółciowych, udaru, operacji tętniaka odcinka piersiowo-brzusznego tętnicy (TAAA), cyklicznego zespołu związanego z receptorem dla TNF (TRAPS), objawów związanych ze szczepieniem przeciw żółtej febrze, chorobami zapalnymi związanymi z uchem, chronicznego zapalenia ucha, perlakowego chronicznego zapalenia ucha środkowego, bezperlakowego chronicznego zapalenia ucha środkowego, zapalenia mięśni i terapii związanej z indukowanym zespołem zapalnym; a) ewentualnie, reakcja lekowa jest zespołem Stevensa-Johnsona lub Jarisch-Herxheimera; b) ewentualnie kłębkowe zapalenie nerek jest paciorkowcowym kłębkowym zapaleniem nerek lub nefropatią IgA; c) ewentualnie rak jest wybrany z grupy składającej się z szpiczaka mnogiego, raka jajnika i raka jelita grubego; d) ewentualnie zapalenie trzustki jest ostrym zapaleniem trzustki, chroniczne zapalenie trzustki jest ropniem trzustki; i e) ewentualnie terapia związana z indukowanym zespołem zapalnym po podaniu IL-2, przez podawanie przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen osobnikowi tego potrzebującemu, tak, że wspomniana choroba jest leczona, i f) przy czym ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen dysocjuje z ludzkiego TNFα z K d 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości K off 1 x 10-3 s -1 lub mniejszą, oba parametry wyznaczone przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego,

3 PL B1 3 oraz neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFα w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 lub mniej. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen posiada następującą charakterystykę: a) dysocjuje z ludzkiego TNFα ze stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; b) posiada domenę CDR3 lekkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i c) posiada domenę CDR3 ciężkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen charakteryzuje się tym, że ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen; a) posiada region zmienny lekkiego łańcucha (LCVR), posiadający domenę CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3, otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; oraz domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 5 i domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 7; i b) posiada region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) posiadający domenę CDR3, zawierająca sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4, lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12 oraz domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID No: 6 i domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen charakteryzuje się tym, że ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen zawiera region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR), zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR), zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen charakteryzuje się tym, że ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen stanowi adalimumab lub jego część wiążąca antygen. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen charakteryzuje się tym, że ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen ma stały region łańcucha ciężkiego IgG1 lub IgG4. Korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen charakteryzuje się tym, że wspomniana część wiążąca antygen jest wybrana z grupy składającej się z fragmentu Fab, fragmentu F(ab') 2, fragmentu Fd, fragmentu Fv pojedynczego łańcucha, dab oraz izolowanego CDR. Korzystnie zaburzenie jest chorobą Behceta, przy czym kompozycja jest do podawania z jednym czynnikiem terapeutycznym wybranym z grupy składającej się z prenisonu cyklofosfamidu, azatiopryny, metotreksatu, timetoprymu/sulfametoksazolu i kwasu foliowego. Korzystne dawką, według wynalazku jest dawka pomiędzy około 10 mg do 150 mg tego przeciwciała lub części wiążącej antygen. Bardziej korzystnie zawiera dawkę 20 mg do około 80 mg. Jeszcze bardziej korzystnie zawiera dawkę około 40 mg. Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen, korzystnie jest do podawania człowiekowi w dwutygodniowym schemacie dawkowania, i również korzystnie do podskórnego podawania człowiekowi. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie neutralizującego o wysokim powinowactwie ludzkiego przeciwciała anty-tnfα lub jego części wiążącej antygen do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia wybranego z grupy składającej się z dolegliwości skórnych, spondyloartropatii, zaburzeń metabolicznych, zapalenia naczyń, dolegliwości płucnych, zaburzeń wieńcowych, niedokrwistości, bólu, dolegliwości wątroby, dolegliwości paznokci, tocznia rumieniowatego układowego, wieloukładowej choroby autoimmunologicznej, utraty słuchu na podłożu autoimmunologicznym, endometrizy, zapalenia gruczołu krokowego, neowaskularyzacji podsiatkówkowej, zespołu Sjörgensa, rwy kulszowej,

4 4 PL B1 mokrej degeneracji plamki żółtej, osteoporozy, związanego z wiekiem wyniszczenia, choroby Alzh e- imera, obrzęku mózgu, zapalnego urazu mózgu, raka, wyniszczenia nowotworowego, zespołu chronicznego zmęczenia, zapalenia skórno-mięśniowego, reakcji na leki, obrzęku rdzenia kręgowego w i/lub wokół rdzenia kręgowego, okresowej gorączki rodzinnej, zespołu Felty, zwłóknienia, kłębkowego zapalenia nerek, utrata protez, mikroskopowego zapalenia wielonaczyniowego, kolagenozy mieszanej, choroby wielonarządowej, zespołu mielodysplastycznego, osteolizy w przebiegu zapalenia jąder, zapalenia trzustki, choroby przyzębia, zapalenia wielomięśniowego, postępującej niewydolności nerek, innej choroby dającej objawy podobne do dny, piodermii zgorzelinowej, nawracającego zapalenia wielochrząstkowego, reumatycznej choroby serca, stwardnienia przewodów żółciowych, udaru, operacji tętniaka odcinka piersiowo-brzusznego tętnicy (TAAA), cyklicznego zespołu związanego z receptorem dla TNF (TRAPS), objawów związanych ze szczepieniem przeciw żółtej febrze, chorobami zapalnymi związanymi z uchem, chronicznego zapalenia ucha, perlakowego chronicznego zapalenia ucha środkowego, bez-perlakowego chronicznego zapalenia ucha środkowego, zapalenia mięśni i terapii związanej z indukowanym zespołem zapalnym; a) ewentualnie, reakcja lekowa jest zespołem Stevensa-Johnsona lub Jarisch-Herxheimera; b) ewentualnie kłębkowe zapalenie nerek jest paciorkowcowym kłębkowym zapaleniem nerek lub nefropatią IgA; c) ewentualnie rak jest wybrany z grupy składającej się z szpiczaka mnogiego, raka jajnika i raka jelita grubego; d) ewentualnie zapalenie trzustki jest ostrym zapaleniem trzustki, chroniczne zapalenie trzustki jest ropniem trzustki; i e) ewentualnie terapia związana z indukowanym zespołwm zapalnym po podaniu IL-2, przez podawanie przeciwciała jego części wiążącej antygen osobnikowi tego potrzebującemu, tak, że wspomniana choroba jest leczona, i f) przy czym ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen dysocjuje z ludzkiego TNFα z K d 1 x 10-8 M lub mniej i stałej szybkości K off 1 x 10-3 s -1 lub mniejszej, oba parametry wyznaczone przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego, oraz neutralizuje cytotoksyczność ludzkiego TNFα w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 lub mniej. W zastosowaniu według wynalazku, korzystnie ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen posiada następującą charakterystykę: a) dysocjuje z ludzkiego TNFα ze stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; b) posiada domenę CDR3 lekkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasową w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i c) posiada domenę CDR3 ciężkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasową w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. Korzystnie ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen: a) posiada region zmienny lekkiego łańcucha (LCVR) posiadający domenę CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; oraz domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 5 i domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 7; i b) posiada region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR), posiadający domenę CDR3, zawierająca sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4, lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasową w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8 9, 10, 11 i/lub 12 oraz domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID No: 6 i domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 8.

5 PL B1 5 Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen zawiera LCVR, zawierające sekwencje aminokwasową SEQ ID nr 1 i HCVR, zawierające sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2. Korzystnie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen stanowi adalimumab lub jego część wiążąca antygen. Korzystnie w zastosowaniu według wyanalazku ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen posiada stały region ciężkiego łańcucha IgG1 lub IgG4. Ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen korzystnie jest wybrana z grupy składającej się z fragmentu Fab, fragmentu F(ab') 2, fragmentu Fd, fragmentu Fv pojedynczego łańcucha, dab oraz izolowanego CDR. Korzystnie zaburzeniem jest choroba Behceta i ponadto obejmuje zastosowanie dodatkowego czynnika terapeutycznego wybranego z grupy składającej się z prenisonu cyklofosfamidu, azatiopryny, metotreksatu, timetoprymu/sulfametoksazolu i kwasu foliowego. Korzystnie lek zawiera dawkę pomiędzy około 10 mg do 150 mg przeciwciała lub części wiążącej antygen. Również korzystnie lek zawiera dawkę pomiędzy około 20 mg do około 80 mg przeciwciała lub części wiążącej antygen. Bardziej korzystnie lek zawiera dawkę około 40 mg. Zastosowanie według wynalazku wskazuje, że lek jest do podawania człowiekowi, korzystnie jest stosowany w dwutygodniowym schemacie dawkowania. Lek w zastosowaniu według wynalazku, również korzystnie jest do podskórnego podawania człowiekowi. Przedmiotem wynalazku jest także kryształ zawierający ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążąca antygen, charakteryzujący się tym, że antygen ten lub jego część wiążąca antygen ma następującą charakterystykę: a) dysocjuje z ludzkiego TNFα ze stałą szybkości K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; b) posiada domenę CDR3 lekkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i c) posiada domenę CDR3 ciężkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11, lub przez jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. Według wynalazku w korzystnym jego wykonaniu kryształ charakteryzuje się tym, że ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążącą antygen zawiera LCVR, zawierający domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 5 i domenę CDR1, zawierająca sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 7 i zawiera HCVR, zawierający domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 6 i domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 8. Bardziej korzystnie, ludzkie przeciwciało anty-tnfα lub jego część wiążącą antygen zawiera region zmienny lekkiego łańcucha (LCVR), zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 1 i region zmienny ciężkiego łańcucha, zawierający sekwencję aminokwasową SEQ ID nr 2. Również korzystnie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen stanowi adalimumab, lub jego część wiążącą antygen, a także bardziej korzystnie przeciwciało lub jego część wiążącą antygen stanowi fragment F(ab') 2 lub fragment F(ab). Przedmiotem wynalazku jest także preparat zawierający kryształ, jak zdefiniowano powyżej. W stosunku do osobnika, który posiada zaburzenia związane z TNFα, w oparciu o wynalazek można opracować metodę leczenia, która polega na podawaniu terapeutycznie skutecznej ilości neutralizującego przeciwciała TNFα o wysokim powinowactwie, tak że to zaburzenie jest leczone. Zaburzeniem związanym z TNFα jest między innymi artropatia kręgosłupa, dolegliwości płuc, zaburzenie wieńcowe, zaburzenie metaboliczne, niedokrwistość, ból, dolegliwości wątroby, dolegliwości skórne, choroba paznokci lub zapalenie naczyń. W innej postaci zaburzeniem związanym z TNFα jest związane z wiekiem wyniszczenie, choroba Alzheimera, obrzęk mózgu, uszkodzenie mózgu w przebiegu zapalenia, syndrom chronicznego zmęczenia, zapalenie skórnomięśniowe, reakcje na leki, obrzęk rdzeniowy i około rdzeniowy, rodzinna okresowa gorączka, syndrom Felty, zwłóknienia, zapalenie kłębków nerkowych (np. popaciorkowcowe zapalenie kłębków nerkowych lub nefropatia IgA), utrata protez, zapalenie wielonaczyniowe, kolagenoza mieszana, szpiczak mnogi i wyniszczenie w przebiegu raka, zaburzenia wielonarządowe, zespół mielodysplastyczny, osteoliza w przebiegu zapalenia

6 6 PL B1 jąder komórek kostnych, zapalenie trzustki, włączając w to zapalenie ostre, przewlekłe i ropień trzustki, choroba przyzębia zapalenie wielomięśniowe, postępująca niewydolność nerek, rzekoma skaza moczanowa, zgorzelinowe ropne zapalenie skóry, nawracające zapalenie wielochrząstkowe, reumatyczna choroba serca, sarkoidoza, twardniejące zapalenie dróg żółciowych, udar, operacja tętniaka aorty odcinka piersiowo-brzusznego (TAAA), cykliczny zespół związany z receptorem dla TNF (TRAPS), objawy związane ze szczepieniem przeciwko żółtej febrze, choroby zapalne związane z uchem, przewlekłe zapalenie ucha lub zapalenie ucha wieku dziecięcego. W jeszcze innej postaci wynalazku, związaną z TNFα chorobą jest zaburzenie związane z chorobą Crohna, choroba Stila (młodzieńcza postać reumatoidalnego zapalenia stawów) (JRA), zapalenie błony naczyniowej oka, rwa kulszowa, zapalenie gruczołu krokowego, neoangiogeneza w obrębie naczyniówki, toczeń, zespół Sjogrensa i mokra degeneracja plamki żółtej. W jednej postaci, przeciwciało według wynalazku, jest izolowanym ludzkim przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNFα z Kd wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, oba parametry wyznaczono przy pomocy powierzchniowego rezonansu plazmowego. W standardowym badaniu L929 in vitro neutralizuje ono cytotoksyczność ludzkiego TNFα z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. W innej postaci wynalazku, przeciwciało jest izolowanym ludzkim przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNFα ze stałą szybkością dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak to wyznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; ma domenę lekkiego łańcucha CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną poprzez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez podstawienia jednego do pięciu konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i ma domenę ciężkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną poprzez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez podstawienia jednego do pięciu konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. W innej postaci wynalazku, przeciwciało jest izolowanym ludzkim przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen, ze zmiennym regionem lekkiego łańcucha (LCVR), zawierającym sekwencję aminokwasów SEQ ID NO:1 i zmiennym regionem ciężkiego łańcucha (HCVR), zawierającym sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2. W kolejnej postaci wynalazku, przeciwciałem jest D2E7 określane także jako HUMIRA lub adalimumab. Inny aspekt wynalazku zawiera sposób leczenia podmiotu cierpiącego na zaburzenie związane z TNFα, zawierający podawanie terapeutycznie efektywnej ilości przeciwciała dla TNFα lub jego fragmentu wiążącego antygen, gdzie przeciwciało dysocjuje od ludzkiego TNFα z K d 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, oba parametry wyznaczono przy pomocy powierzchniowego rezonansu plazmowego. Neutralizuje ono w standardowym badaniu in vitro L929 cytotoksyczność ludzkiego TNFα z IC 50 wynoszącym 1 x 1 x 10-7 M lub mniej, tak, że to związane z TNFα zaburzenie jest leczone. Jeszcze inny aspekt wynalazku obejmuje sposób leczenia podmiotu cierpiącego na związane z TNFα zaburzenie, w którym stosuje się podawanie terapeutycznie efektywnych ilości przeciwciała dla TNFα lub jego fragmentu wiążącego antygen, gdzie przeciwciało dysocjuje od ludzkiego TNFα z stałą szybkości dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy pomocy powierzchniowego rezonansu plazmowego. Ma domenę lekkiego łańcucha CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez podstawienia jednego do pięciu konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; i ma domenę ciężkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną poprzez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez podstawienia jednego do pięciu konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12 tak, że to związane z TNFα zaburzenie jest leczone. Kolejny aspekt wynalazku zawiera sposób leczenia podmiotu cierpiącego na zaburzenie związane z TNFα, zawierający podawanie terapeutycznie efektywnej ilości przeciwciała dla TNFα lub jego fragmentu wiążącego antygen, ze zmiennym regionem lekkiego łańcucha (LCVR), zawierającym sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 i zmiennym regionem ciężkiego łańcucha (HCVR), zawierającym sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2 tak, że to związane z TNFα zaburzenie jest leczone.

7 PL B1 7 W jednej z postaci przeciwciałem dla TNFα lub jego fragmentem wiążącym antygen jest D2E7. W innej postaci, przeciwciało dla TNFα jest podawane z przynajmniej jednym dodatkowym środkiem terapeutycznym. Jeszcze inny aspekt wynalazku opisuje sposób hamowania aktywności ludzkiego TNFα u ludzi cierpiących na zaburzenia związane z TNFα, zawierający podawanie terapeutycznie efektywnej ilości przeciwciała dla TNFα lub jego fragmentu wiążącego antygen, gdzie przeciwciało dysocjuje od ludzkiego TNFα z K d 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkością dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, oba parametry wyznaczone przy pomocy powierzchniowego rezonansu plazmowego. Neutralizuje ono w standardowym badaniu in vitro L929 cytotoksyczność ludzkiego TNFα z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. W jednej z postaci przeciwciałem dla TNFα lub jego fragmentem wiążącym antygen jest D2E7. Jeszcze inny aspekt wynalazku zawiera sposób leczenia podmiotu cierpiącego na związane z TNFα zaburzenie, zawierający podawanie podmiotowi terapeutycznie efektywnej ilości D2E7 lub jego fragmentu wiążącego antygen tak, że zaburzenie jest leczone. Jeszcze inny aspekt wynalazku zawiera sposób leczenia podmiotu cierpiącego na związane z TNFα zaburzenie, zawierający podawanie terapeutycznie efektywnej ilości D2E7 lub jego fragmentu wiążącego antygen podmiotowi tak, że choroba jest leczona. W jednej z postaci wynalazku, D2E7 (także nazywany HUMIRA lub adalimumab) jest podawany z przynajmniej jednym dodatkowym środkiem terapeutycznym. Innym aspektem wynalazku jest zestaw zawierający farmaceutyczną kompozycję zawierającą przeciwciało dla TNFα lub jego część wiążącą antygen i dopuszczalny nośnik farmaceutyczny oraz instrukcję podawania podmiotom, kompozycji farmaceutycznej TNFα przeznaczonej do leczenia podmiotów cierpiących na związane z TNFα zaburzenie. W jednej z postaci, przeciwciałem dla TNFα albo jego częścią wiążącą antygen jest D2E7 (HUMIRA ). Szczegółowy opis wynalazku Ten wynalazek dotyczy sposobów leczenia związanych z TNFα zaburzeń, w których aktywność TNFα, np. aktywność ludzkiego TNFα, jest szkodliwa. Te sposoby obejmują podawanie osobnikowi leczonemu, terapeutycznie skutecznych ilości inhibitora TNFα, tak, że związane z TNFα zaburzenie jest leczone. Wynalazek dotyczy także sposobów, w których inhibitor TNFα jest podawany w połączeniu z innym środkiem terapeutycznym, w celu leczenia związanego z TNFα zaburzenia. Różne aspekty wynalazku związane są z leczeniem przeciwciałami i fragmentami przeciwciał oraz farmaceutycznymi kompozycjami zawierającymi inhibitor TNFα i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do leczenia związanych z TNFα zaburzeń. Definicje Aby niniejszy wynalazek był łatwiej zrozumiały, na początku zostaną zdefiniowane pewne terminy. Termin ludzki TNFα (używany tutaj skrót htnfα lub prościej htnf), tak jak to jest używane tutaj, jest przeznaczony do określenia ludzkiej cytokiny, która występuje w formie 17 kd, która jest wydzielana i w połączonej z błoną formie 26 kd. Biologicznie aktywna forma jest trimerem niekonwalencyjnie powiązanych cząsteczek 17 kd. Strukturę htnfα dodatkowo opisano, na przykład w Pennica, D., i wsp., (1984) Nature 312: ; Davis J.M., i wsp., (1987) Biochemistry 26: ; i Jones E.Y., i wsp., (1989) Nature 338: Termin ludzki TNFα obejmuje ludzki zrekombinowany TNFα (rhtnfα), który może być otrzymany standardowymi metodami ekspresji produktów rekombinacji lub zakupiony komercyjnie (R&D Systems, Nr Katalogowy 210-TA, Minneapolis, MN). TNFα jest także określany, jako TNF. Termin inhibitor TNFα obejmuje środki, które hamują TNFα. Przykłady inhibitorów TNFα obejmują etanercept (Enbrel, Amgen), infliksimab (Remicade, Johnson and Johnson), ludzkie monoklonalne przeciwciało anty-tnf (D2E7/HUMIRA, Abbott Laboratories), CDP 571 (Celltech) i CDP 870 (Celltech) i inne związki, które hamują aktywność TNFα tak, że kiedy są podawane podmiotowi cierpiącemu na zaburzenie lub objętemu ryzykiem cierpienia na zaburzenie, w którym aktywność TNFα jest szkodliwa, zaburzenie to jest leczone. W jednej z postaci, inhibitor TNFα jest związkiem, wyłączając etanercept i infliksimab, który hamuje aktywność TNFα. W innej postaci, inhibitory TNFα będące przedmiotem wynalazku są stosowane do leczenia związanego z TNFα zaburzenia, jak to bardziej szczegółowo opisano w sekcji II. W jednej z postaci, inhibitor TNFα, wyłączając etanercept i infliksimab, jest stosowany do leczenia związanego z TNFα zaburzenia. W innej postaci, inhibitor TNFα, wyłączając etanercept i infliksimab, jest stosowany do leczenia zapalenia zesztywniającego stawów kręgosłupa. Ten termin także obejmuje każde ludzkie przeciwciało anty-tnfα i części przeciwciała

8 8 PL B1 opisane tutaj oraz w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr ; ; ; i Zgłoszeniu Patentowym Stanów Zjednoczonych Seria Nr 09/ i 10/ Termin przeciwciało, tak jak użyto tutaj, ma odnosić się do cząsteczek immunoglobulin, które zawierają cztery polipeptydowe łańcuchy, dwa ciężkie (H) i dwa lekkie (L) łańcuchy połączone wzajemnie mostkami dwusiarczkowymi. Każdy ciężki łańcuch zawiera region zmienny ciężkiego łańcucha (tutaj w skrócie określany, jako HCVR lub VH) i region stały ciężkiego łańcucha. Region stały ciężkiego łańcucha zawiera trzy domeny, CH1, CH2 i CH3. Każdy lekki łańcuch zawiera region zmienny lekkiego łańcucha (tutaj w skrócie określany jako LCVR lub VL) i region stały lekkiego łańcucha. Region stały lekkiego łańcucha zawiera jedną domenę, CL. Regiony VH i VL mogą być następnie podzielone na regiony nadzmienne określane jako regiony determinujące dopasowanie (CDR), przeplatane regionami, które są bardziej zachowawcze, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech CDRów i czterech FRów uporządkowanych od końców amino do końców karboksy w następującej kolejności: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Dalsze szczegóły dotyczące przeciwciał będących przedmiotem wynalazku opisano w Patentach Stanów Zjednoczonych o Nr ; ; i i w Serii Zgłoszeń Patentowych Nr 09/ i 10/ Każdy z nich jest włączony tutaj całościowo przez odnośniki. Termin wiążąca antygen część przeciwciała (lub prościej część przeciwciała ), tak jak użyto tutaj odnosi się do jednego lub więcej fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność do specyficznego wiązania do antygenu (np. htnfα). Wykazano, że czynność wiązania antygenu przez przeciwciało może być wykonana przez fragmenty przeciwciała pełnej długości. Przykłady wiążących fragmentów przeciwciała, zawarte w terminie wiążąca antygen część obejmują: (i) fragment Fab monowalentny fragment, składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab') 2, biwalentny fragment, zawierający dwa fragmenty Fab połączone mostkiem dwusiarczkowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd, zawierający domeny VH i CH1; (iv) fragment Fv, zawierający domeny VL i VH pojedynczego ramienia przeciwciała; (v) (vi) fragment dab (Ward i wsp., (1989) Nature 341: ), który zawiera domenę VH; i izolowany region determinujący dopasowanie (CDR), co więcej, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH są kodowane przez dwa oddzielne geny, mogą być one połączone przy użyciu metod rekombinacji, przy zastosowaniu syntetycznego linkera, który pozwala im na utworzenie pojedynczego białkowego łańcucha, w którym regiony VL i VH łączą się, żeby utworzyć monowalentną cząsteczkę (znaną jako pojedynczy łańcuch Fv (scfv); patrz np. Bird i wsp., (1988) Science 242: ; i Huston i wsp., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ). Takie przeciwciała jednołańcuchowe przeciwciała są także obejmowane terminem część przeciwciała wiążąca antygen. Są w nim zawarte inne postacie jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak podwójne fragmenty przeciwciała (ang. diabodies). Podwójne fragmenty przeciwciała są biwalentnymi, bispecyficznymi przeciwciałami, w których domeny VH i VL są wyrażone, jako pojedynczy polipeptydowy łańcuch, ale użycie linkera, który jest za krótki, by umożliwić sparowanie dwóch domen w ten sam łańcuch, zmusza domeny do parowania z komplementarnymi domenami innego łańcucha i tworzenia dwóch miejsc wiążących antygen (patrz np., Holliger P i wsp., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ; Poljak R.J., i wsp., (1994) Structure 2: ). Dalsze szczegóły dotyczące będących przedmiotem wynalazku części przeciwciała opisano w Patentach Stanów Zjednoczonych Nr , , i Serii Zgłoszeń Patentowych Stanów Zjednoczonych Nr 09/ i 10/302356, z których każdy z nich jest włączony całościowo przez odnośniki. Fragmenty wiążące są otrzymywane technikami rekombinacji DNA albo przez enzymatyczne lub chemiczne rozszczepienie nienaruszonych immunoglobulin. Fragmenty wiążące obejmują Fab, Fab', F(ab') 2, Fabc, Fv, pojedyncze łańcuchy i przeciwciała będące pojedynczym łańcuchem. Inaczej niż dla bispecyficznych lub bifunkcjonalnych immunoglobulin lub przeciwciał, immunoglobulina lub przeciwciało jest rozumiane, że ma każde ze swoich miejsc wiążących identyczne. Bispecyficzne lub bifunkcjonalne przeciwciało jest sztucznym przeciwciałem hybrydowym, mającym dwie różne pary łańcuchów ciężki/lekki i dwa różne miejsca wiążące. Bispecyficzne przeciwciała mogą być produkowane różnymi sposobami, włączając w to fuzję hybrydomów lub łączenie

9 PL B1 9 fragmentów Fab'. Patrz np., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: (1990); Kostelny i wsp., J Immunol. 148: (1992). Tak jak to użyto tutaj, podstawienie aminokwasu konserwatywnego jest takim podstawieniem, w którym reszta jednego aminokwasu jest zastąpiona przez resztę innego aminokwasu, mającą podobny boczny łańcuch. Rodziny reszt aminokwasów, mających podobne łańcuchy boczne są określone w tej dziedzinie, obejmując zasadowe boczne łańcuchy (np.: lizynę, argininę, histydynę) kwasowe boczne łańcuchy (np.: kwas asparaginianowy, kwas glutaminowy) polarne boczne łańcuchy bez ładunku (np.: glicyna, asparagina, glutamina, seryna, treonina, tyrozyna, cysteina) niepolarne boczne łańcuchy (np.: alanina, walina, leucyna, izoleucyna, prolina, fenyloalanina, metionina, tryptofan), rozgałęzione boczne łańcuchy beta (np. treonina, walina, izoleucyna) i aromatyczne łańcuchy boczne (np. tyrozyna, fenyloalanina, tryptofan, histydyna). Tak jak użyto tutaj, termin ludzkie przeciwciała ma obejmować przeciwciała mające zmienne i stałe regiony pochodzące od sekwencji immunoglobulin linii zarodków ludzkich. Będące przedmiotem wynalazku ludzkie przeciwciała mogą obejmować reszty aminokwasów nie kodowane przez sekwencję immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej (np., mutacje wprowadzone przez losową lub miejscowo specyficzną mutagenezę in vitro albo przez somatyczną mutację in vivo), na przykład w CDRach i w szczególności w CDR3. Jednak termin ludzkie przeciwciało, tak jak to użyto tutaj, nie jest użyty z zamiarem objęcia nim przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z linii zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak myszy, były przeszczepione do ludzkich sekwencji zrębowych. Termin ludzkie zrekombinowane przeciwciało, tak jak użyto to tutaj, ma obejmować wszystkie ludzkie przeciwciała, które są otrzymywane, wyrażane, tworzone lub izolowane metodami rekombinacji, takie jak przeciwciała powstałe w wyniku ekspresji przy użyciu zrekombinowanego wektora ekspresji transfekowanego do komórki gospodarza (opisano poniżej), przeciwciała izolowane z biblioteki ludzkich zrekombinowanych kombinatoryjnych przeciwciał (opisano poniżej), przeciwciała izolowane od zwierzęcia (np., myszy), które jest transgeniczne w stosunku do genów ludzkiej immunoglobuliny (patrz np. Taylor L. D. i wsp., (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287) lub przeciwciała otrzymywane, wyrażane, tworzone lub izolowane jakąś inną techniką, która obejmuje splajsing sekwencji genu lud z- kiej immunoglobuliny do innej sekwencji DNA. Takie zrekombinowane ludzkie przeciwciało ma regiony zmienny i stały, pochodzące od sekwencji immunoglobuliny ludzkiej linii zarodkowej. W pewnych postaciach wszelako, takie zrekombinowane ludzkie przeciwciała są poddawane m u- tagenezie in vitro (lub kiedy używane są zwierzęta transgeniczne w stosunku do sekwencji lud z- kiej Ig, mutagenezie somatycznej in vivo) i w ten sposób sekwencje aminokwasów regionów VH i VL zrekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które kiedy pochodzą od i odpowiadają sekwencji VH i VL ludzkiej linii zarodkowej mogą naturalnie nie występować in vivo w repertuarze linii zarodkowej ludzkich przeciwciał. Izolowane przeciwciało, tak jak użyto to tutaj ma odnosić się do przeciwciała, które jest istotnie wolne od innych przeciwciał mających odmienną antygenową specyficzność (np. izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże htnfα jest istotnie wolne od przeciwciał, które specyficznie wiążą antygeny inne niż htnfα). Izolowane przeciwciało, które specyficznie wiąże htnfα może wykazywać krzyżową reaktywność z innymi antygenami, takimi jak cząsteczki TNFα pochodzące od innych gatunków (dyskusja dalszych szczegółów poniżej). Co więcej, izolowane przeciwciało, może być istotnie wolne od innego komórkowego materiału i/lub chemikalii. Przeciwciało neutralizujące, tak jak użyto to tutaj (lub przeciwciało, które neutralizowało aktywność htnfα ), ma odnosić się do przeciwciała, które wiążąc się do htnfα powoduje hamowanie biologicznej aktywności htnfα. Takie hamowanie biologicznej aktywności htnfα może być badane przez pomiar jednego lub więcej wskaźników biologicznej aktywności htnfα, takich jak indukowana htnfα cytotoksyczność (albo in vitro, albo in vivo), indukowana htnfα aktywacja komórkowa i wiązanie htnfα do receptorów dla htnfα. Te wskaźniki biologicznej aktywności htnfα mogą być badane przez jedno lub więcej spośród kilku znanych w tej dziedzinie standardowych badań in vivo i in vitro (patrz Patent Stanów Zjednoczonych ). Wskazane jest badanie zdolności przeciwciał do neutralizowania aktywności htnfα przez badanie hamowania indukowanej htnfα cytotoksyczności komórek L929. Jako dodatkowy lub alternatywny wskaźnik aktywności htnfα, może być badana zdolność przeciwciała do hamowania indukowanej htnfα ekspresji ELAM-1 w HUVEC, będącej miarą indukowanej htnfα aktywacji komórkowej. Termin powierzchniowy rezonans plazmowy, tak jak użyto to tutaj, odnosi się do optycznego zjawiska, które pozwala na analizę biospecyficznych reakcji w czasie rzeczywistym, poprzez detekcję

10 10 PL B1 zmian w stężeniu białka wewnątrz biosensorowej matrycy, na przykład używając systemu BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Upsala, Sweden and Piscataway, NJ). Dalsze szczegóły, patrz Przykład 1 Patentu Stanów Zjednoczonych Nr i Jönsson i wsp., (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jönsson i wsp., (199) Biotechniques 11: ; Johnsson i wsp., (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; Johnnson i wsp., (1991) Anal. Biochem. 198:268. Termin K off tak jak to użyto tutaj, ma odnosić się do stałej szybkości dysocjacji oddysocjowywania przeciwciała z kompleksu przeciwciało - antygen. Termin K d, tak jak użyto to tutaj, ma odnosić się do stałej dysocjacji specyficznej interakcji przeciwciało - antygen. Termin IC 50 tak jak użyto to tutaj, ma odnosić się do stężenia inhibitora wymaganego do zahamowania będącego przedmiotem zainteresowania biologicznego punktu końcowego, np. zneutralizowania cytotoksycznej aktywności. Termin cząsteczka kwasu nukleinowego, tak jak użyto to tutaj, ma obejmować cząsteczki DNA i cząsteczki RNA. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być jednoniciowa lub dwuniciowa, ale wskazane jest, żeby była dwuniciowym DNA. Termin izolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, tak jak użyto to tutaj w odniesieniu do kwasów nukleinowych kodujących przeciwciała lub części przeciwciał (np. VH, VL, CDR3), które wiążą htnfα, ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego, w której sekwencje nukleotydów kodujące przeciwciało lub część przeciwciała są wolne od innych nukleotydowych sekwencji kodujących przeciwciała lub części przeciwciał, które wiążą antygen inny niż htnfα, które to inne sekwencje mogą naturalnie flankować kwas nukleinowy w ludzkim genomowym DNA. Tak więc na przykład, izolowany kwas nukleinowy, będący przedmiotem niniejszego wynalazku koduje region VH przeciwciała antyhtnfα i nie zawiera innych sekwencji kodujących inne regiony VH, które wiążą antygeny inne niż htnfα. Termin wektor, tak jak użyto to tutaj, ma odnosić się do cząsteczki kwasu nukleinowego, zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, do którego została przyłączona. Pewnym typem wektora jest plazmid", nazwa ta odnosi się do kolistej dwuniciowej pętli DNA, do której dodatkowy segment DNA, może być ligowany. Innym typem wektora, jest wektor wirusowy, w którym dodatkowe segmenty DNA, mogą być ligowane do genomu wirusowego. Pewne wektory są zdolne do niezależnej replikacji w komórce gospodarza, do której zostaną wprowadzone (np., wektory bakteryjne, mające bakteryjny sposób replikacji i episomalne wektory ssaków). Inne wektory (np. nieepisomalne wektory ssaków), mogą być scalane z genomem komórki gospodarza po wprowadzeniu do komórki gospodarza i w wyniku tego są replikowane razem z genomem gospodarza. Co więcej, pewne wektory są zdolne do kierowania ekspresją genów, do których są operacyjnie przyłączone. Takie wektory są określane tutaj, jako zrekombinowane wektory ekspresyjne (lub po prostu wektory ekspresyjne ). Ogólnie, wektory ekspresyjne, mające zastosowanie w technikach rekombinacji DNA często są w formie plazmidów. W obecnej specyfikacji, plazmid i wektor mogą być używane wymiennie, jako że plazmid jest najbardziej rozpowszechnioną w użyciu formą wektora. Jednakże, wynalazek ma obejmować także inne formy wektorów ekspresyjnych, takie jak wektory wirusowe (np., wadliwe retrowirusy replikacyjne, adenowirusy i wirusy związane z adeno), które służą równoważnymi funkcjami. Termin zrekombinowana komórka gospodarza (lub po prostu komórka gospodarza ) ma odnosić się do komórki, do której został wprowadzony zrekombinowany wektor ekspresyjny. Powinno być zrozumiałe, że taki termin ma odnosić się nie tylko do konkretnej komórki, ale też do potomstwa takiej komórki. Ponieważ w następnych pokoleniach mogą pojawić się pewne modyfikacje związane albo z mutacją albo z wpływem środowiska, w rzeczywistości, takie potomstwo może nie być identyczne z komórką rodzicielską, ale ciągle jest włączone w zakres objęty terminem komórka gospodarza, tak jak to użyto tutaj. Termin dawkowanie, tak jak to użyto tutaj, odnosi się do podawania substancji (np., przeciwciała anty TNFα) żeby osiągnąć cel terapeutyczny (np., leczenie zaburzeń związanych z TNFα). Termin dwutygodniowa procedura dawkowania dwutygodniowe dawkowanie i dwutygodniowe podawanie dotyczą zależności czasowej podawania substancji (np., przeciwciała anty-tnfα), aby osiągnąć terapeutyczne działanie (np., leczenie związanych z TNFα zaburzeń). Dwutygodniowa procedura dawkowania nie obejmuje tygodniowej procedury dawkowania. Wskazane, żeby substancja była podawana raz w którymś spośród dni 9-19, lepiej w którymś spośród dni jeszcze lepiej w którymś spośród dni i najlepiej co 14 dni.

11 PL B1 11 Termin połączenie, tak jak w wyrażeniu pierwszy środek w połączeniu z drugim środkiem obejmuje wspólne podawanie pierwszego środka z drugim środkiem, który na przykład może być rozpuszczony lub razem zmieszany z tym samym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem, albo po podaniu pierwszego środka podawany jest drugi, albo po podaniu drugiego środka podawany jest środek pierwszy. Niniejszy wynalazek obejmuje, więc sposoby łączenia terapeutycznych działań i łączenie farmaceutycznych kompozycji. Termin towarzyszące w wyrażeniu towarzyszące terapeutyczne leczenie obejmuje podawanie środka w obecności drugiego środka. Towarzyszący sposób terapeutycznego leczenia obejmuje sposoby, w których pierwszy, drugi, trzeci lub dodatkowe środki są wspólnie podawane. Towarzyszący sposób terapeutycznego leczenia także obejmuje sposoby, w których pierwszy lub dodatkowe środki są podawane w obecności drugiego lub dodatkowych środków, w których na przykład, drugi lub dodatkowe środki, mogły być podane poprzednio. Sposób towarzyszącego terapeutycznego leczenia może być wykonywany stopniowo przez różnych wykonawców. Na przykład jeden wykonawca może podawać leczonemu pierwszy środek i drugi wykonawca może podawać leczonemu drugi środek i etapy podawania mogą być wykonywane w tym samym czasie, lub prawie w tym samym czasie, albo w odległym czasie, tak długo, jak długo pierwszy środek (i dodatkowe środki) są obecne po podaniu drugiego środka (i dodatkowych środków). Wykonawca i leczony mogą być tą samą istotą (np., człowiekiem). Termin terapia łączona, tak jak to użyto tutaj odnosi się do podawania dwóch lub więcej terapeutycznych substancji, np. przeciwciała anty TNFα i innego leku takiego jak DMRD lub NSAID. Inny lek (leki) może być podawany jednocześnie z, przed lub po podaniu przeciwciała dla TNFα. Termin stan kliniczny z udziałem TNFα lub związane z TNFα zaburzenie odnosi do miejscowych i/lub ogólnoustrojowych zaburzeń, w których TNFα jest głównym mediatorem wiodącym do manifestowania się zaburzenia. Termin zaburzenie zapalne lub choroba zapalna, tak jak wymiennie używa się tutaj, dotyczy chorób przenoszonych przez stany zapalne, które także mają lub nie podłoże immunologiczne. Zaburzenia zapalne są zaburzeniami, w których nadmierna lub nieregulowana odpowiedź zapalna prowadzi do nadmiernych objawów zapalenia, niszczenia tkanki gospodarza lub utraty funkcji tkanki. Przykłady obejmują reumatyczny artretyzm, i artropatię kręgosłupa. W jednej z postaci, zaburzenia zapalne, będące przedmiotem niniejszego wynalazku, dotyczą chorób przenoszonych przez zapalenie, wyłączając zapalenie kości i stawów i reumatyczne zapalenie kręgosłupa. Termin choroby płucne, tak jak użyto to tutaj, dotyczy samoistnej śródmiąższowej choroby płuc i/lub chronicznej niedrożności dróg oddechowych. W jednej z postaci wynalazku, termin choroba płucna obejmuje jakąś chorobę płuc i/lub chroniczną niedrożność dróg oddechowych wyłączając płuco wstrząsowe, chroniczne zapalenie płuc, sarkoidozę płucną, zwłóknienie płuc i silikozę. Termin samoistna śródmiąższowa choroba płuc lub samoistne śródmiąższowe zaburzenie płucne jak to jest tutaj używane wymiennie dotyczy którejkolwiek z kilku chorób o nieznanej etiologii z podobnymi cechami klinicznymi, powodującej rozprzestrzenianie się patologicznych zmian przede wszystkim w otworach międzypęcherzykowych płuc. Przykłady samoistnej śródmiąższowej choroby płuc obejmują, ale nie są ograniczone do, śródmiąższowego zwłóknienia płuc (IPF). W jednej z postaci, samoistne śródmiąższowe choroby płuc obejmują którąkolwiek z kilku chorób o nieznanej etiologii z podobnymi cechami klinicznymi powodującej rozprzestrzenianie się patologicznych zmian początkowo w otworach międzypęcherzykowych płuc, wyłączając płuco wstrząsowe, chroniczne zapalenie płuc, sarkoidozę płucną, zwłóknienie płuc i silikozę. Termin chroniczna niedrożność dróg oddechowych, tak jak użyto tutaj, odnosi się do chorób płucnych, które spowodowane są fizjologicznie zdeterminowaną chroniczną niedrożnością dróg oddechowych, bez względu na etiologię. Przykłady zaburzeń chronicznej niedrożności dróg odd e- chowych obejmują, ale nie są ograniczone do: astmy i choroby chronicznej niedrożności płuc (COPD). W jednej z postaci zaburzenie chronicznej niedrożności dróg oddechowych obejmuje ch o- roby spowodowane fizjologicznie zdeterminowaną chroniczną niedrożnością dróg oddechowych z wyłączeniem płuca wstrząsowego, choroby chronicznego zapalenia płuc, sarkoidozy płuc, zwłóknienia płuc i silikozy. Termin niedrożność dróg oddechowych, dotyczy zwiększonej oporności dla przepływu powietrza wykazywanej przy użyciu spirometrii. Termin zaburzenie sercowo-naczyniowe lub zaburzenie wieńcowe, jak użyto tutaj wymiennie, dotyczy jakiejś choroby, zaburzenia lub stanu obejmującego układ sercowo-naczyniowy np., serce,

12 12 PL B1 naczynia krwionośne i/lub krew. Ogólnie, chorobę wieńcową, charakteryzuje się zwężeniem naczyń krwionośnych, które dostarczają krew i tlen do serca (tętnice wieńcowe). Choroba wieńcowa jest zazwyczaj wynikiem gromadzenia się złogu i materiału tłuszczowego. Gdy tętnice zwężają się, dopływ krwi do serca może się zmniejszyć lub ustać. Zaburzenia wieńcowe w odniesieniu do wynalazku, można stosować do jakiejkolwiek nieprawidłowości tętnic, strukturalnej, histologicznej, biochemicznej lub jakiejś innej nieprawidłowości. Przykładem wieńcowej choroby serca jest nawrót zwężenia. W jednej z postaci, zaburzenie wieńcowe odnosi się do jakiejś choroby, zaburzenia lub stanu, który obejmuje układ sercowo-naczyniowy z wyłączeniem niedokrwienia serca i niewydolności serca. Termin nawrót zwężenia, tak jak użyto tutaj, odnosi się do powtarzającego się zwężenia, które jest zwężeniem lub ograniczeniem tętnicy. Nawrót zwężenia często pojawia się, jako przedokluzyjna zmiana, która rozwija się w następstwie procesu rekonstrukcji w chorych naczyniach krwionośnych. Termin jest stosowany nie tylko do nawrotu uprzednio istniejącego zwężenia, ale także do poprzednio normalnych naczyń, które zostają częściowo okludowane w następstwie pomostu naczyniowego. W innej postaci, wynalazek dostarcza sposobu leczenia nawrotowego zwężenia, który zawiera podawanie będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała albo jego części wiążącej antygen podmiotowi, u którego występuje nawrót zwężenia lub ryzyko jego wystąpienia. Termin stent, tak jak użyto to tutaj dotyczy urządzenia, które jest włożone w światło anatomicznego naczynia, np., tętnicy, szczególnie w celu utrzymania otwarcia uprzednio blokowanej drogi przejścia. Stent jest używany do utrzymania przepływu płynów (np., krwi) z jednej części naczynia do drugiej i endogenne rusztowanie lub stent utrzymuje otwartą drogę przepływu w naczyniu podtrzymując przeszczep lub otoczkę. Stent jest często stosowany po angioplastyce balonowej, chociaż może być on użyty także, jako bezpośrednia terapia leczenia nawrotu zwężenia. W jednej z postaci wynalazku, stent jest stentem, z którego wymywa się lek. Termin wymywający lek dotyczy stentu, który jest pokryty formułą leku, który uwalnia się w tempie wolnym do umiarkowanego. Terminy wymywający lek, uwalniający lek lub pokryty lekiem są tutaj używane wymiennie. Stent może być pokryty jakimś lekiem, który leczy chorobę wieńcową serca, włączając w to np., będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub jego część wiążącą antygen. W innej postaci stent dostarcza D2E7. W kolejnej postaci stent zawiera D2E7 w połączeniu z innym lekiem stosowanym w leczeniu choroby wieńcowej włączając w to deksametazon, alkeran, cytoksan, leukeran, cisplatinum, BiCNU, adriamycynę, doksyrubicynę, cerubidynę, idamycynę, mitracyna, mutamycynę, fluorouracyl, metotreksat, tioguaninę, toxotere, etopozyd, vincristin, irinotecan, hycamptin, matulane, vumon, heksalin, hydroksymocznik, gemzar, Oncovin, etophophos, takrolimus (FK506) i następujące analogi sirolimusus'a: SDZ-RAD, CCI-779, 7-epi-rapamycyna, 7-tiometylo-rapamycyna, 7-epi-trimetoxyfenyl-rapamycyna, 7-epi-tiometylo-rapamycyna, 7-demetoxy-rapamycyna, 32-demetoxy, 2-desmetyl i prolina. Termin zaburzenie metaboliczne, tak jak użyto tutaj dotyczy chorób lub zaburzeń, które wpływają na to, jak w organizmie zachodzą przemiany substancji potrzebnych do przenoszenia fizjologicznych funkcji. Przykłady chorób metabolicznych obejmują, choć nie są ograniczone do: cukrzycy i otyłości. W jednej z postaci wynalazku, termin zaburzenie metaboliczne, odnosi się do zaburzeń, które zmieniają w organizmie przemiany substancji potrzebnych do przenoszenia fizjologicznych funkcji z wyłączeniem cukrzycy autoimmunologicznej. Termin cukrzyca lub zaburzenie cukrzycowe lub cukrzyca jak używane jest tutaj wymiennie, dotyczy choroby, która charakteryzuje się podwyższonym poziomem cukru (glukozy) we krwi. Cukrzyca może być powodowana albo zbyt małą ilością insuliny (związek chemiczny produkowany przez trzustkę potrzebny do regulacji poziomu cukru we krwi), opornością na insulinę lub oboma tymi czynnikami. Określenie choroby związane z cukrzycą, jak użyto to tutaj, odnosi się do stanów i innych chorób, które są zwykle związane z, lub odnoszą się do cukrzycy. Przykład zaburzeń związanych z cukrzycą obejmuje, na przykład hiperglikemię, hiperinsulinemię, hiperlipidemię, oporność na insulinę, upośledzony metabolizm glukozy, otyłość, retynopatię cukrzycową, zwyrodnienie plamki żółtej, kataraktę, nefropatię cukrzycową, stwardnienie kłębków nerkowych, neuropatię cukrzycową, dysfunkcję erekcji, syndrom przedmenstruacyjny, nawrót zwężenia naczyń, zapalenie okrężnicy wrzodziejące, chorobę wieńcową serca, nadciśnienie, anginę pektoris, zawał mięśnia sercowego, udar, zaburzenia skóry i tkanki łącznej, owrzodzenie stóp, kwasicę metaboliczną, artretyzm i osteoporozę. Termin otyłość, tak jak użyto tutaj, odnosi się do stanów, w których podmiot ma nadmiar tłuszczu w stosunku do beztłuszczowej masy ciała. W jednej z postaci, otyłość odnosi się do sytuacji,

13 PL B1 13 w której waga podmiotów przekracza przynajmniej o 20% lub więcej maksymalną wagę pożądaną dla ich wzrostu. Kiedy dorosły (on lub ona) ma ponad 100 funtów nadwagi, jest to uważane za chorobliwą otyłość. W innej postaci, otyłość jest zdefiniowana jako BMI (indeks masy ciała) przekraczający 30 kg/m 2. Termin niedokrwistość, tak jak użyto to tutaj, odnosi się do nienormalnie małej liczby krążących czerwonych krwinek lub obniżonego stężenia hemoglobiny we krwi. Termin ból, tak jak użyto to tutaj, odnosi się do wszystkich typów bólu. Ten termin powinien odnosić się do bólu ostrego i przewlekłego, takiego jak ból neuropatyczny, pooperacyjny, przewlekły ból odcinka krzyżowego, ból głowy gromadny, neuralgia półpaścowa, bóle fantomowe kończyn, ból ośrodkowy, ból zęba, ból oporny na opioidy, ból wewnętrzny, ból chirurgiczny, ból porodowy, ból będący wynikiem poparzenia, włączając w to poparzenie słoneczne, ból poporodowy, migrena, ból anginowy, ból związany z przewodem moczowo-płciowym włączając w to cystę. Termin ten obejmuje także ból nocyceptywny i nocycepcję. Termin zaburzenia wątroby, tak jak użyto to tutaj, dotyczy chorób wątroby ssaków, lepiej człowieka lub stanów związanych z uszkodzeniem komórek wątrobowych lub zaburzeniem dróg żółciowych. W jednej z postaci, zaburzenia wątrobowe odnoszą się do choroby ludzkiej wątroby, stanów związanych z uszkodzeniem komórek wątrobowych lub zaburzeniem dróg żółciowych, wyłączając w to zapalenie wątroby, poalkoholowe zapalenie wątroby i wirusowe zapalenie wątroby. Termin dolegliwości skórne lub choroba skóry, jak jest tutaj używane wymiennie, dotyczy innych niż zranienia nieprawidłowości skóry, które wywołały stan zapalny. W jednej z postaci, zapalenie skóry w rozumieniu tego wynalazku, jest zapalną chorobą skóry, gdzie występuje charakterystyczna kapilarna dylatacja, naciekanie leukocytów, zaczerwienienie, gorąco i/lub ból. Przykłady choroby skóry obejmują, ale nie są ograniczone do, łuszczycę, pęcherzycę zwykłą, twardzinę skóry, atopowe zapalenie skóry, sarkoidozę, rumień guzowaty, ropne zapalenie przydatków, liszaj płaski, syndrom Sweet'a i bielactwo nabyte. Termin łuszczyca, tak jak użyto tutaj dotyczy zaburzeń skóry związanych z rozrostem naskórka. Przykład łuszczycy obejmuje, ale nie jest ograniczony do, przewlekłą łuszczycę plackowatą, łuszczycę kroplowatą, łuszczycę odwróconą, łuszczycę trądzikową, łuszczycę zwykłą i łuszczycę z rumieniem skóry. Łuszczyca może także być związana z innymi zapalnymi zaburzeniami, włączając chorobę zapalenia jelit (IBD) i reumatyczne zapalenie stawów. Termin zdrowa skóra lub normalna skóra odnosi się do niezranionej skóry, tj. bez widocznego, w sposób oczywisty rumienia, obrzęku, hiper-, hipo- lub nierównomiernej pigmentacji, formowania łuski, nadmiernego rogowacenia lub tworzenia pęcherzy. Histologicznie zdrowa, normalna skóra, odnosi się do tkanki skóry morfologicznie zawierającej dobrze zorganizowane warstwy podstawową, kolczystą i ziarnistą oraz spójną wielowarstwową warstwę naskórka. Termin zaburzenie paznokcia lub choroba paznokcia, tak jak użyto tutaj, dotyczy stanów, gdzie paznokcie palców ręki lub nogi mają nieprawidłowy kolor, kształt, fakturę lub grubość. Termin zapalenie naczyń jak jest używane tutaj wymiennie dotyczy grupy zaburzeń, która charakteryzuje się zapaleniem naczyń krwionośnych. Wszystkie rozmiary naczyń krwionośnych mogą podlegać zmianie, począwszy od największych naczyń w organizmie (aorta) do najmniejszych naczyń w skórze (kapilar). Rozmiar zmienianych naczyń krwionośnych różni się w zależności od typu zapalenia naczyń. Termin zestaw, tak jak tutaj użyto, dotyczy opakowanego produktu, zawierającego składniki, z którymi będące przedmiotem wynalazku przeciwciało dla TNFα jest podawane w celu leczenia związanych z TNFα chorób. Dobrze, żeby zestaw zawierał pudełko lub pojemnik, w którym trzymane są składniki zestawu. Do pudełka lub pojemnika jest przymocowane oznaczenie lub protokół zatwierdzony przez Urząd do Spraw Żywności i Leków. Pudełko lub pojemnik zawiera składniki wynalazku, które są umieszczone w naczyniach, wskazane, żeby były z plastiku, polietylenu, polipropyleny, etylenu lub propylenu. Naczynia mogą być zamykanymi probówkami lub butelkami. Zestaw może także zawierać instrukcję podawania, będących przedmiotem wynalazku przeciwciał dla TNFα. Różne aspekty wynalazku są dalej opisane w szczegółach.

14 14 PL B1 I Inhibitory TNFαD, będące przedmiotem wynalazku Wynalazek ten dostarcza sposobu leczenia związanego z TNFα zaburzenia, w którym korzystne jest podawanie inhibitora TNFα. W jednej z postaci, te sposoby obejmują podawanie izolowanych ludzkich przeciwciał lub ich fragmentu wiążącego antygen. Wiążą się one do ludzkiego TNFα z wysokim powinowactwem i małą szybkością dysocjacji i mają dużą pojemność neutralizującą. Dobrze, jeżeli przeciwciała będące przedmiotem wynalazku są zrekombinowanymi, neutralizującymi ludzkimi przeciwciałami anty-htnfα. Najlepszym, będącym przedmiotem wynalazku ludzkim zrekombinowanym, neutralizującym przeciwciałem jest podawany tu D2E7, określany także jako HUMIRA i adalimumab (sekwencja aminokwasów regionu VL D2E7 jest pokazana w SEQ ID No: 1; sekwencja regionu VH D2E7 jest pokazana w SEQ ID NO: 2). Właściwości D2E7 (HUMIRA ) opisano w Slafeld i wsp., Patencie Stanów Zjednoczonych Nr , który jest tu włączony przez odnośnik. W jednej z postaci leczenie przy użyciu wynalazku, obejmuje podawanie przeciwciał D2E7 lub części przeciwciała, przeciwciał pokrewnych z D2E7 i części przeciwciała oraz innych ludzkich przeciwciał i części przeciwciał z własnościami równoważnymi własnościom D2E7, takimi jak wysokie powinowactwo wiązania do htnfα z niską kinetyką dysocjacji i wysoką pojemnością neutralizującą. W jednej z postaci, wynalazek dostarcza leczenia izolowanym ludzkim przeciwciałem albo jego częścią wiążącą antygen. Dysocjuje ono z ludzkiego TNFα z K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą szybkości dysocjacji K off 1 x 10-3 s -1 lub mniej, obie wielkości oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego. Neutralizuje ono cytotoksyczność ludzkiego TNFα w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. Lepiej, żeby izolowane ludzkie przeciwciało albo jego część wiążąca antygen dysocjowała z ludzkiego TNFα z K off 5 x 10-4 s -1 lub mniej, jeszcze lepiej z K off 1 x 10-4 s -1 lub mniej. Lepiej, żeby izolowane ludzkie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen neutralizowała cytotoksyczność ludzkiego TNFα w standardowym badaniu in vitro L929 z IC 50 wynoszącym 1 x 10-8 M lub mniej, jeszcze lepiej z IC 50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub mniej, a nawet jeszcze lepiej IC 50 wynoszącym 1 x M lub mniej. W preferowanej postaci przeciwciało jest izolowanym zrekombinowanym przeciwciałem lub jego częścią wiążącą antygen. Jest dobrze znane w tej dziedzinie, że domeny CDR3 ciężkiego i lekkiego łańcucha odgrywają ważną rolę w specyficzności/powinowactwie wiązania przeciwciała do antygenu. Zgodnie z tym, w innym aspekcie wynalazek odnosi się do sposobów leczenia związanego z TNFα zaburzenia, w którym aktywność TNFα jest szkodliwa, przez podawanie ludzkich przeciwciał, które mają powolną kinetykę dysocjacji dla wiązania z htnfα i które mają domeny CDR3 lekkiego i ciężkiego łańcucha, które są strukturalnie identyczne z/lub odpowiadają tym w D2E7. Pozycja 9 w CDR3 VL D2E7 może być zajęta przez Ala lub Thr bez istotnej zmiany K off. Zgodnie z tym uzgodniony wzór dla VL CDR3 D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Dodatkowo Pozycja 12 w CDR3 VH D2E7 może być zajęta przez Tyr lub Asn bez istotnej zmiany K off. Zgodnie tym uzgodniony wzór dla VH CDR3 D2E7 zawiera sekwencję aminokwasów: V-S-Y-L- -S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Co więcej, tak jak przedstawiono w przykładzie 2 Patentu Stanów Zjednoczonych Nr , domeny CDR3 łańcuchów ciężkiego i lekkiego D2E7 są podatne na podstawienie pojedynczą resztą alaninową (w pozycji 1, 5, 7 lub 8 wewnątrz VL CDR3 lub w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 wewnątrz VH CDR3) bez istotnego wpływu na K off. Co więcej, osoby wprawne w tej dziedzinie zdają sobie sprawę, że dana podatność domen CDR3 VL i VH D3E7 na podstawienie przez alaninę, podstawienie innych aminokwasów wewnątrz domen CDR3, może być możliwe przy ciągle zachowanej niskiej stałej szybkości dysocjacji przeciwciała, szczególnie przy podstawieniach konserwatywnymi aminokwasami. Wskazane jest, żeby nie było więcej niż jedno do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów wewnątrz domen CDR3 VL i/lub VH D2E7. Lepiej żeby nie było więcej niż jedno do trzech podstawień konserwatywnych aminokwasów wewnątrz domen CDR3 VL i/lub VH D2E7. Dodatkowo, podstawienia konserwatywnych aminokwasów nie powinny być robione w pozycjach aminokwasów krytycznych dla wiązania do htnfα. Pozycje 2 i 5 VL CDR3 D2E7 i pozycje 1 i 7 VH CDR3 D2E7 są krytyczne dla interakcji z htnfα i dlatego wskazane jest, żeby podstawienia konserwatywnych aminokwasów nie były robione w tych pozycjach (chociaż, jak to opisano powyżej, podstawienie alaniny w pozycji VL CDR3 D2E7 jest dopuszczalne) (patrz Patent Stanów Zjednoczonych Nr ). Zgodnie z tym, w innej postaci, wynalazek dostarcza sposobów leczenia zaburzenia związanego z TNFα przez podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen.

15 PL B1 15 Przeciwciało lub jego część wiążąca antygen posiada następującą charakterystykę: a) dysocjuje z ludzkiego z TNFα ze stałą szybkości K off, wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, jak oznaczono przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmowego; b) ma domenę CDR3 lekkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jeden do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, i/lub 9; c) ma domenę CDR3 ciężkiego łańcucha, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 3, 4, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jeden do pięciu podstawień konserwatywnych aminokwasów w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. Bardziej korzystnie, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen oddysocjowuje z ludzkiego TNFα z K off wynoszącą 5 x 10-4 s -1 lub mniej. Jeszcze bardziej korzystnie przeciwciało lub jego część wiążąca antygen oddysocjowuje z ludzkiego z TNFα z K off wynoszącą 1 x 10-4 s -1 lub mniejszą. W jeszcze innej postaci, wynalazek dostarcza sposobów leczenia zaburzenia, związanego z TNFα przez podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen. Wskazane jest, żeby przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawierała zmienny region lekkiego łańcucha (LCVR), mający domenę CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3 lub modyfikację SEQ ID NO: 3 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 i zmienny region ciężkiego łańcucha (HCVR), mający domenę CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4 lub modyfikację SEQ ID NO: 4 otrzymaną przez pojedyncze podstawienie alaniny w pozycji 2, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11. Wskazane, żeby LCVR miało domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5 (tzn. D2E7 VI CDR2) i dalej żeby HCVR miało domenę CDR2, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 6 (tzn. D2E7 VH CDR2). Jeszcze lepiej, żeby LCVR dalej miało domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7 (tzn. D2E7 VL CDR1) i HCVR miało domenę CDR1, zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8 (tzn. D2E7 VH CDR1). Dobrze, jeżeli regiony zrębowe dla VL są z rodziny ludzkiej linii zarodkowej V K I, jeszcze lepiej z genu Vk ludzkiej linii zarodkowej A20 i najlepiej z pokazanej na Ryc. 1A i 1B Patentu Stanów Zjednoczonych Nr , sekwencji zrębu VL D2E7. Dobrze, jeżeli regiony zrębowe dla VH są z rodziny ludzkiej linii zarodkowej V H 3, jeszcze lepiej z genu VH ludzkiej linii zarodkowej DP-31 a najlepiej z pokazanej na Ryc. 2A i 2B Patentu Stanów Zjednoczonych Nr , sekwencji zrębu VH D2E7. Zgodnie z tym, w innej postaci wynalazek dostarcza sposobów leczenia zaburzenia związanego z TNFα, przez podawanie izolowanego ludzkiego przeciwciała lub jego części wiążącej antygen. Wskazane, żeby przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawierało zmienny region lekkiego łańcucha (LCVR), zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1 (tzn. D2E7 VL) i zmienny region ciężkiego łańcucha (HCVR), zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2 (tzn. D2E7 VH). W pewnych postaciach, przeciwciało zawiera stały region ciężkiego łańcucha, taki jak stały region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD. Dobrze jeżeli stałym regionem ciężkiego łańcucha jest stały region ciężkiego łańcucha IgG1 lub stały region ciężkiego łańcucha IgG4. Co więcej, przeciwciało może zawierać stały region lekkiego łańcucha albo stały region lekkiego łańcucha kappa, albo stały region lekkiego łańcucha lambda. Wskazane, żeby przeciwciało zawierało stały region lekkiego łańcucha kappa. Alternatywnie, część przeciwciała może być na przykład fragmentem Fab lub fragmentem pojedynczego łańcucha Fv. W jeszcze innych postaciach, wynalazek dostarcza sposobów leczenia związanego z TNFα zaburzenia, w którym korzystne jest podanie przeciwciała anty-tnfα, które jest izolowanym ludzkim przeciwciałem lub jego części wiążącej antygen. Dobrze jeżeli przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera związane z D2E7 domeny CDR3 VL i VH, na przykład przeciwciała lub ich części wiążące antygen, zawierające zmienny region lekkiego łańcucha (LCVR) mający domenę CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 i SEQ ID NO: 26, lub zmiennego regionu ciężkiego łańcucha (HCVR) mającego domenę CDR3, zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy składającej się z: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 i SEQ ID NO: 35.

16 16 PL B1 W innej postaci, inhibitorem TNFα jest etanercept (opisany w WO 91/03553 i WO 09/406476), infliksimab (opisany w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr ), CDP571 (humanizowane monoklonalne przeciwciało anty TNF-alfa IgG4), CDP 870 (fragment humanizowanego monoklonalnego przeciwciała anty TNF-alfa), D2E7 (ludzkie mab anty TNF) rozpuszczalny receptor dla TNF typ I, lub pegylowany rozpuszczalny receptor dla TNF typ I (PEG TNF-R1). Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało dla TNFα może być modyfikowane. W pewnych postaciach, przeciwciało dla TNFα albo jego fragment wiążący antygen jest chemicznie modyfikowane w celu otrzymania pożądanych efektów. Na przykład, pegylacja przeciwciał lub fragmentów przeciwciał będących przedmiotem wynalazku może być przeprowadzana przez jakiekolwiek reakcje pegylacji znane w tej dziedzinie, jak opisano, na przykład w następujących odnośnikach: Focus on 40 Growth Factors 3:4-10 (1992; (EP ; i EP (każdy z nich jest włączony całościowo przez referencje). Wskazane, żeby pegylacja była przeprowadzana poprzez reakcję acylacji lub reakcję alkilacji z reaktywną cząsteczką glikolu polietylenowego (lub z podobnie reaktywnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem). Wskazanym do pegylacji będących przedmiotem wynalazku przeciwciał lub fragmentów przeciwciał, rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy (PEG). Jak użyto tutaj, termin glikol polietylenowy obejmuje jakiekolwiek formy PEG, które mogą być użyte do derywatyzacji innych białek, takie jak mono (CL-CLO) alkoksy- lub aryloksy- glikol polietylenowy. Ogólnie sposoby otrzymywania pegylowanych, będących przedmiotem wynalazku przeciwciał i fragmentów przeciwciał będą zawierały etapy: a) reakcji przeciwciała lub fragmentu przeciwciała z glikolem polietylenowym, takim jak reaktywny ester lub aldehyd będące pochodnymi PEG, w takich warunkach, że przeciwciało lub fragment przeciwciała zostaje przyłączone do jednej lub więcej grup PEG, i b) otrzymywanie produktów reakcji. Dla biegłych w tej dziedzinie będzie oczywiste wybranie optymalnych warunków reakcji lub reakcji acylacji w oparciu o znane parametry i pożądany wynik. Ogólnie, pegylowane przeciwciała i fragmenty przeciwciał mogą być używane do leczenia będących przedmiotem wynalazku zaburzeń związanych z TNFα, przez podawanie przeciwciał dla TNFα i fragmentów przeciwciał, jak to opisano tutaj. Ogólnie, pegylowane przeciwciała i fragmenty przeciwciał mają zwiększony okres półtrwania w porównaniu do niepegylowanych przeciwciał i fragmentów przeciwciał. Pegylowane przeciwciała i fragmenty przeciwciał mogą być stosowane same, razem lub w połączeniu z innymi farmaceutycznymi kompozycjami. W jeszcze innej postaci wynalazku, przeciwciała dla TNFα lub ich fragmenty mogą być zmienione tak, że stały region jest zmodyfikowany w celu zredukowania w stosunku do niezmodyfikowanego przeciwciała, przynajmniej jednej biologicznej efektorowej funkcji przenoszonej przez stały region. W celu zmodyfikowania będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała tak, że wykazuje zredukowane wiązanie do receptora Fe, segment stałego regionu immunoglobuliny może być mutowany w konkretnych regionach niezbędnych do interakcji z receptorem Fe (FcR) (patrz Canfield S.M. i S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173: ; i Lund J. i wsp. (1991) J. Immunol 147: ). Redukcja w zdolności wiązania przeciwciała przez FcR może redukować także inne efektorowe funkcje, które zależą od interakcji FcR, takie jak opsonizacja, fagocytoza i zależna od antygenu komórkowa cytotoksyczność. Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała może być derywatyzowane lub przyłączone do innej funkcjonalnej cząsteczki (np. innego peptydu lub białka). Zgodnie z tym, będące przedmiotem wynalazku przeciwciała i części przeciwciał mają obejmować derywatyzowane i w inny sposób zmodyfikowane formy ludzkich przeciwciał anty-htnfα tak, jak opisano tutaj, włączając immunoadhezyjne cząsteczki. Na przykład będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała, może być funkcjonalnie połączone (przez chemiczne sparowanie, genetyczną fuzję, niekowalencyjną asocjację lub inne) do jednej lub więcej jednostek molekularnych, takich jak inne przeciwciało (np. bispecyficzne fragmenty przeciwciała lub fragmenty przeciwciała (ang. Diabodies), czynnik umożliwiający detekcję, czynnik cytotoksyczny, czynnik farmaceutyczny i/lub białko lub peptyd, które może przenosić przeciwciało lub jego część związaną z inną cząsteczką (tak jak region rdzenia streptoavidyny lub polihistydynowy tag). Jeden typ derywatyzowanych przeciwciał jest wytwarzany przez wiązanie krzyżowe dwóch lub więcej przeciwciał (tego samego lub różnych typów, np. żeby utworzyć bispecyficzne przeciwciała). Odpowiednie kroslinkery obejmują te, które są heterobifunkcyjne, mające dwie odmiennie reaktywne grupy rozdzielone przez odpowiedni separator (np. ester m-maleimidobenzoyl-n hydroksysuccimidu)

17 PL B1 17 lub homobifunkcjonalne (np. disuccinimidylo suberan). Takie linkery są dostępne w Pierce Chemical Company, Rockford, IL. Użyteczne, pozwalające na detekcję czynniki, z którymi może być derywatyzowane będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała obejmują związki fluorescencyjne. Przykładowo fluorescencyjne, pozwalające na detekcję czynniki obejmują: fluresceinę, izocjonian fluoresceiny, rodaminę, chlorek 5-dimetyloamino-1-naftalenosulfonylu, fikoerytrynę i podobne. Przeciwciało może być także derywatyzowane z dającymi się wykrywać enzymami takimi jak fosfataza alkaliczna, peroksydaza chrzanowa, oksydaza glukozy i temu podobne. Jeżeli przeciwciało jest derywatyzowane z dającym się wykrywać enzymem, jest ono wykrywane poprzez dodanie dodatkowych odczynników, których enzym używa do wytworzenia dającego się wykryć produktu reakcji. Na przykład, kiedy jako pozwalający na detekcję czynnik występuje peroksydaza chrzanowa, dodanie nadtlenku wodoru i dwuaminobenzydyny prowadzi do otrzymania kolorowego produktu reakcji, który może być wykryty. Przeciwciało może także być derywatyzowane z biotyną i wykrywane przez pośredni pomiar związku z awidyną lub streptoawidyną. Będące przedmiotem wynalazku przeciwciało lub część przeciwciała, może być otrzymane przez ekspresję rekombinanta genów lekkiego i ciężkiego łańcucha immunoglobuliny w komórce gospodarza. Dla ekspresji przeciwciała otrzymanego w drodze rekombinacji, komórka gospodarza jest transfekowana jednym lub więcej zrekombinowanym wektorem ekspresyjnym przenoszącym fragmenty DNA kodujące lekkie i ciężkie łańcuchy immunoglobuliny tak, że w komórce gospodarza zachodzi ekspresja lekkich i ciężkich łańcuchów i wskazane jest, żeby były one wydzielane do pożywki, w której komórki gospodarza są hodowane. Z tej pożywki przeciwciała są odzyskiwane. Standardowe techniki rekombinacji DNA, stosowane do otrzymywania genów lekkich i ciężkich łańcuchów przeciwciała włączają te geny do zrekombinowanych wektorów ekspresyjnych i wprowadzają te wektory do komórek gospodarzy, tak jak opisano w Sambrook, Fritsch i Maniatis (eds), Molecular cloning: A Laboratory Mannual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. i wsp., (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) i w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr Boss i wsp.. W celu ekspresji D2E7 i pokrewnych z D2E7 przeciwciał, najpierw otrzymano fragmenty DNA kodujące zmienne regiony lekkiego i ciężkiego łańcucha. Te DNA mogą być otrzymane przez amplifikację i modyfikację sekwencji zmiennych regionów lekkiego i ciężkiego łańcucha linii zarodkowej przy użyciu reakcji łańcuchowej z polimerazą (PCR). Sekwencje DNA linii zarodkowej dla ludzkich genów zmiennego regionu lekkiego i ciężkiego łańcucha są znane w tej dziedzinie (patrz Vbase human germline sequence database; patrz także Kabat E. A. i wsp., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department Of Health and Human Services, NIH Publication No ; Tomlinson I.M. i wsp., (1992 The Repetoire of Human Germline V H Sequences Reveals about Fifty Groups of V H Segments with Different Hypervariable Loops J Mol. Biol. 227: ; i Cox J.P.L. i wsp., (1994) A Directory of Human Germ-line V 78 Segments Reveals a Strong Bias In their Useage Eur. J. Immunol. 24: ; zawartości wszystkich są tutaj specjalnie włączone przez referencje). Do otrzymania fragmentu DNA kodującego zmienny region ciężkiego łańcucha D2E7 lub przeciwciała pokrewnego D2E7, przy użyciu standardowego PCR, amplifikowany jest członek rodziny V H 3 genów VH ludzkiej linii zarodkowej. Najlepiej, jeżeli amplifikowana jest sekwencja linii zarodkowej DP-31 VH. Do otrzymania fragmentu DNA kodującego zmienny region lekkiego łańcucha D2E7 lub pokrewnego D2E7 przeciwciała, przy użyciu standardowego PCR, amplifikowany jest członek I rodziny V K genów VL ludzkiej linii zarodkowej. Najlepiej, jeżeli amplifikowana jest sekwencja linii zarodkowej A20 VL. Startery PCR odpowiednie do użycia przy amplifikacji sekwencji VH linii zarodkowej DP-31 i VL linii zarodkowej A20 mogą być zaprojektowane w oparciu o sekwencję nukleotydów ujawnioną w odnośnikach cytowanych powyżej, przy użyciu standardowych technik. Po otrzymaniu fragmentów VH i VL linii zarodkowej, sekwencje mogą być mutowane do otrzymania ujawnionych tutaj sekwencji aminokwasów D2E7 i pokrewnych D2E7. Sekwencje aminokwasów kodowane przez sekwencje DNA VH i VL linii zarodkowej są najpierw porównywane z sekwencjami aminokwasów VH i VL D2E7 i pokrewnych D2E7 w celu identyfikacji reszt aminokwasowych w D2E7 i pokrewnych D2E7, które różnią się od linii zarodkowej. Następnie, używając kodu genetycznego do oznaczenia, które zmiany nukleotydów powinny być zrobione, odpowiednie nukleotydy sekwencji DNA linii zarodkowej są mutowane tak, że zmutowana sekwencja linii zarodkowej koduje sekwencję aminokwasów D2E7 i pokrewnych D2E7. Mutageneza sekwencji linii zarodkowej

18 18 PL B1 jest przeprowadzana standardowymi technikami, takimi jak mutageneza przy użyciu PCR (w której mutowane nukleotydy są wprowadzane do starterów PCR tak, że produkt PCR zawiera mutacje) lub mutageneza miejscowo ukierunkowana. Po otrzymaniu fragmentów DNA kodujących segmenty VH i VL D2E7 i pokrewnych D2E7 (przez amplifikację i mutagenezę genów VH i VL linii zarodkowej, jak opisano powyżej) te fragmenty DNA mogą podlegać dalszej manipulacji przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA, na przykład w celu przekształcenia genów zmiennego regionu do genów łańcucha przeciwciała pełnej długości, do genów fragmentu Fab lub do genu scfv. W tych manipulacjach, fragment DNA kodujący VL lub VH jest operacyjnie połączony z innym fragmentem DNA kodującym inne białko, takie jak region stały przeciwciała lub dający się dostosować linker. Termin połączone operacyjnie, tak jak użyto w tym kontekście ma oznaczać, że dwa fragmenty DNA są połączone tak, że sekwencje aminokwasów kodowane przez dwa fragmenty DNA pozostają w ramce. Izolowany DNA kodujący region VH może być przekształcony do genu pełnej długości ciężkiego łańcucha przez operacyjne połączenie DNA kodującego VH z inną cząsteczką DNA kodującą stałe regiony ciężkiego łańcucha (CH1, CH2 i CH3). Sekwencje ludzkich genów stałego regionu ciężkiego łańcucha są znane w tej dziedzinie (patrz np. Kabat, E.A. i wsp (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr ) i fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być otrzymane przy użyciu standardowej amplifikacji PCR. Stały region ciężkiego łańcucha może być stałym regionem IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM lub IgD, ale najlepiej, jeżeli jest to stały region IgG1 lub IgG4. Dla genu ciężkiego łańcucha fragmentu Fab, DNA kodujące VH może być operacyjnie połączone z inną cząsteczką DNA kodującą tylko stały region CH1 ciężkiego łańcucha. Izolowany DNA kodujący region VL może być przekształcony do genu lekkiego łańcucha pełnej długości (równie dobrze jak do genu lekkiego łańcucha Fab) przez operacyjne połączenie DNA kodującego VL z inną cząsteczką DNA kodującą stały region lekkiego łańcucha CL. Sekwencje ludzkich genów stałego regionu lekkiego łańcucha są znane w tej dziedzinie (patrz np. Kabat, E.A. i wsp (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication Nr ) i fragmenty DNA obejmujące te regiony mogą być otrzymane przy użyciu standardowej amplifikacji PCR. Stały region lekkiego łańcucha może być stałym regionem kappa lub lambda, ale najlepiej jeżeli jest stałym regionem kappa. Do stworzenia genu scfv, fragmenty DNA kodujące VH i VL są operacyjnie połączone z innym fragmentem kodującym dającym się dostosować linkerem, np. kodujący sekwencję aminokwasów (Gly 4 -Ser) 3 tak, że sekwencje VH i VL mogą ulegać ekspresji jako przyległy pojedynczy łańcuch białka, z regionami VH i VL połączonymi dającym się dostosować linkerem (patrz Bird i wsp., (1988) Science 242: ; Huston i wsp., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: ). W celu ekspresji będących przedmiotem wynalazku przeciwciał lub części przeciwciał, otrzymywanych tak jak opisano powyżej, DNA kodujące częściowe lub pełnej długości lekkie i ciężkie łańcuchy są wstawiane do wektorów ekspresyjnych tak, że geny są operacyjnie połączone z transkrypcyjnymi i translacyjnymi sekwencjami kontrolnymi. W tym kontekście, termin połączone operacyjnie ma oznaczać, że gen przeciwciała jest ligowany do wektora tak, że transkrypcyjne i translacyjne sekwencje kontrolne wewnątrz wektora służą ich zaplanowanej funkcji w regulacji transkrypcji i translacji genu przeciwciała. Wektor ekspresyjny i sekwencje kontroli ekspresji są wybrane tak, żeby były kompatybilne z ekspresją używanej komórki gospodarza. Gen lekkiego łańcucha przeciwciała i gen ciężkiego łańcucha przeciwciała mogą być wstawione w oddzielne wektory, lub co jest bardziej typowe, oba geny są wstawiane w tym samym wektorze ekspresyjnym. Geny przeciwciała są wstawiane do wektora ekspresyjnego przy użyciu standardowych sposobów (np. ligacja komplementarnych miejsc restrykcyjnych na fragmencie genu przeciwciała i wektorze lub ligacja tępego końca, jeżeli nie ma miejsc restrykcyjnych). Przed wstawieniem sekwencji lekkiego lub ciężkiego łańcucha D2E7 lub pokrewnych D2E7, wektor ekspresyjny może poprzednio przenosić sekwencje stałego regionu przeciwciała. Na przykład jednym zastosowaniem do przenoszenia sekwencji VH i VL D2E7 lub pokrewnych D2E7 do genów pełnej długości przeciwciał jest wstawienie ich do wektorów ekspresyjnych poprzednio kodujących odpowiednio stałe regiony ciężkiego i lekkiego łańcucha takie, że segment VH jest operacyjnie połączony z segmentem(ami) CH wewnątrz wektora i segment VL jest operacyjnie połączony z segmentem CL wewnątrz wektora. Dodatkowo lub alternatywnie zrekombinowany wektor

19 PL B1 19 ekspresyjny może kodować białko sygnałowe, które ułatwia sekrecję łańcucha przeciwciała z komórki gospodarza. Gen łańcucha przeciwciała może być klonowany do wektora tak, że białko sygnałowe jest połączone w ramce do aminowego zakończenia genu łańcucha przeciwciała. Białko sygnałowe może być immunoglobulinowym białkiem sygnałowym lub heterologicznym białkiem sygnałowym (np. białko sygnałowe z białka nie będącego immunoglobuliną). Oprócz genów łańcucha przeciwciała, będące przedmiotem wynalazku zrekombinowane wektory ekspresyjne mogą przenosić sekwencje regulatorowe, które kontrolują ekspresję genów łańcucha przeciwciała w komórce gospodarza. Termin sekwencja regulatorowa ma obejmować promotory, enhancery i inne elementy kontroli ekspresji (np. sygnał poliadenylacji), który kontroluje transkrypcję lub translację genów łańcucha przeciwciała. Takie regulatorowe sekwencje są opisane na przykład w Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Będzie oczywiste dla biegłych w tej dziedzinie, że projekt wektora ekspresyjnego zawierający selekcję regulatorowych sekwencji może zależeć od takich czynników, jak wybór komórki gospodarza, która ma być transformowana, pożądany poziom ekspresji białka etc. Wskazane, żeby regulatorowe sekwencje ekspresji dla komórek gospodarza, które są komórkami ssaka obejmowały elementy wirusowe, które kierują wysokimi poziomami ekspresji białek w komórkach ssaków, tak jak promotory i/lub enhancery pochodzące z cytomegalowirusa (CMV) (taki jak CMV promotor/enhancer), wirus Simian 40 (SV40) (taki jak SV40 promotor/enhancer), adenowirus (np. główny późny promotor (AdMLP)) lub polyoma. Dalsze opisanie wirusowych elementów regulatorowych można znaleźć np. Patencie Stanów Zjednoczonych Nr Stinsky, Patencie Stanów Zjednoczonych Nr Bell i wsp., i Patencie Stanów Zjednoczonych Nr Schaffner i wsp.. Oprócz genów łańcucha przeciwciała i sekwencji regulatorowych, zrekombinowane wektory ekspresyjne, będące przedmiotem wynalazku, mogą przenosić dodatkowe sekwencje, takie jak sekwencje, które regulują replikację wektora w komórce gospodarza (np. początek replikacji) i geny markerów pozwalających na selekcję. Geny markerów pozwalających na selekcję ułatwiają selekcję komórek gospodarza, do których wektor został wprowadzony (patrz Patent Stanów Zjednoczonych Nr , i wszystkie Axel i wsp.). Na przykład typowy gen markera umożliwiającego selekcję nadaje oporność na lek, taki jak G418, higromycyna lub metotreksat w komórce gospodarza, do której wektor został wprowadzony. Preferowane geny dających się selekcjonować markerów obejmują gen reduktazy dihydrofolanu (DHFR) (do użycia w komórkach gospodarza dhfr z selekcją metotreksatem/amplifikacją) i neo gen (dla selekcji G418). Dla ekspresji łańcuchów lekkiego i ciężkiego wektor(y) ekspresji kodujący łańcuchy lekki i ciężki jest transfekowany do komórki gospodarza standardowymi technikami. Różne formy terminu transfekcja mają objąć szeroki zakres różnorodnych technik zwykle stosowanych dla wprowadz e- nia egzogennego DNA do prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza np. elektropor a- cja, strącanie fosforanem wapnia, transfekcja DEAE dekstranem i temu podobne. Chociaż teoretycznie jest możliwa ekspresja, będących przedmiotem wynalazku przeciwciał albo w priokariotycznych albo w eukariotycznych komórkach gospodarza, ekspresja przeciwciał w komórkach eukariotycznych najlepsza jest w komórkach gospodarza, które są komórkami ssaka, ponieważ jest bardziej prawdopodobne, że lepiej niż priokariotyczne, zgromadzą i wydzielą właściwie sfałdowane, immunologicznie aktywne przeciwciała. Donoszono, że priokariotyczna ekspresja genów przeci w- ciała była nieefektywna w produkcji na dużą skalę aktywnych przeciwciał (Boss M.A. i Wood CR. (1985) Immunology Today 6:12-13). Preferowane do ekspresji, będących przedmiotem wynalazku zrekombinowanych przeciwciał komórki gospodarza ssaków, obejmują jajniki chomika chińskiego (komórki CHO) (włączając komórki CHO dhfr opisane w Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Sci. USA 77: , używane z dającym się selekcjonować markerem DHFR np. jak opisano w R.J. Kaufman i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: ), komórki szpiczaka NS0, komórki COS i komórki SP2. Kiedy zrekombinowane wektory ekspresji, zawierające geny kodujące przeciwciało są wprowadzone do komórki gospodarza będącej komórką ssaka, przeciwciała są produkowane przez hodowanie komórek gospodarza przez okres czasu wystarczający by pozwolić na ekspresję przeciwciała w komórkach gospod a- rza, albo lepiej na sekrecję przeciwciała do pożywki hodowlanej, w której komórki gospodarza wzrastały. Przeciwciała mogą być odzyskane z pożywki hodowlanej przy użyciu standardowych technik oczyszczania białek. Komórki gospodarza mogą także być użyte do produkcji fragmentów nietkniętych przeciwciał, takich jak fragmenty Fab lub cząsteczki scfv. Zrozumiałe jest, że różnice w powyższej procedurze

20 20 PL B1 mieszczą się wewnątrz zakresu tego wynalazku. Na przykład, może być pożądane transfekowanie komórki gospodarza DNA kodującym albo lekki albo ciężki łańcuch (ale nie oba), będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała. Technologia rekombinacji DNA może także być użyta do usunięcia niektórych lub wszystkich DNA kodujących któryś z, albo oba łańcuchy lekki i ciężki, które nie są konieczne do wiązania do htnfα. Cząsteczki ulegające ekspresji z takich ciętych cząsteczek DNA są także uważane za przeciwciała będące przedmiotem wynalazku. Dodatkowo, mogą być produkowane przeciwciała bifunkcjonalne, w których jeden ciężki i jeden lekki łańcuch są przeciwciałem, będącym przedmiotem wynalazku a inny ciężki i lekki łańcuch są specyficzne w stosunku do antygenu innego niż htnfα poprzez łączenie krzyżowe, będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała i drugiego przeciwciała, przy użyciu standardowych chemicznych metod łączenia krzyżowego. W układzie preferowanym dla rekombinacyjnej ekspresji, będącego przedmiotem wynalazku przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, zrekombinowany wektor ekspresyjny kodujący i ciężki łańcuch przeciwciała i lekki łańcuch przeciwciała, jest wprowadzony do komórek CHO dhfr przez przenoszoną przy użyciu fosforanu wapnia transfekcję. W zrekombinowanym wektorze ekspresji każdy z genów (geny ciężkiego i lekkiego łańcucha przeciwciała) jest operacyjnie połączony z elementami regulatorowymi enhancer CMV/elementy regulatorowe promotora AdMLP dla osiągnięcia wysokiego poziomu transkrypcji genów. Zrekombinowany wektor ekspresji przenosi także gen DHFR, który pozwala na selekcję komórek CHO, które były transfekowane wektorem przy użyciu selekcji metotreksatem/amplifikacji. Wyselekcjonowane transformanty komórek gospodarza są hodowane tak by pozwolić na ekspresję ciężkiego i lekkiego łańcucha i nietknięte przeciwciało jest odzyskiwane z pożywki hodowlanej. Do otrzymywania zrekombinowanego wektora ekspresji, transfekowania komórek gospodarza, selekcji transformantów, hodowania komórek gospodarza i odzyskiwania przeciwciał z hodowli komórkowej stosowane są standardowe techniki biologii molekularnej. Będące przedmiotem wynalazku, ludzkie zrekombinowane przeciwciała obok D2E7 lub ich części wiążącej antygen albo przeciwciała pokrewne D2E7, ujawnione tutaj, mogą być izolowane przez skrining rekombinacyjnej kombinatoryjnej biblioteki przeciwciał, lepiej biblioteki pokazującej scfv faga otrzymanego przy użyciu cdna ludzkiego VL i VH otrzymanego z mrna pochodzącego z ludzkich limfocytów. Metodologie otrzymywania i skriningu takich bibliotek są znane w tej dziedzinie. W dodatku do komercyjnie dostępnych zestawów do wytwarzania takich bibliotek obrazowania fagów (np. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nr katalogowy ; i Stratagene SurfZAP kit obrazowania faga, nr katalogowy ) przykłady metod i odczynników szczególnie dostępnych do użycia w wytwarzaniu i skriningu bibliotek obrazowania przeciwciał można znaleźć na przykład w Ladner i wsp., Patent Stanów Zjednoczonych Nr ; Kang i wsp., Publikacja PCT Nr WO92/18619; Dower i wsp., Publikacja PCT Nr WO91/17271; Winter i wsp., Publikacja PCT Nr WO92/20791; Markland i wsp., Publikacja PCT Nr WO92/15679; Breitling i wsp., Publikacja PCT Nr WO93/01288; McCafferty i wsp., Publikacja PCT Nr WO92/01047; Garrard i wsp., Publikacja PCT Nr WO92/09690; Fuchs i wsp., (1991) Bio/Technology 9: ; Hay i wsp., (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse i wsp., (1989) Science 246: ; McCafferty i wsp., Nature (1990) 348: ; Griffiths i wsp., (1993) EMBO J 12: ; Hawkins i wsp., (1992) J Mol Biol 226: ; Clackson i wsp., (1991) Nature 352: ; Gram i wsp., (1992) PNAS 89: ; Garrard i wsp., (1991) Biol/Technology 9: ; Hoogenboom i wsp., (1991) Nuc Acid Res 19: ; i Barbas i wsp (1991) PNAS 88: Sposoby izolowania ludzkich przeciwciał z wysokim powinowactwem i niską stałą szybkości dysocjacji dla htnfα opisano w Patencie Stanów Zjednoczonych Nr i , każdy z nich jest włączony tutaj poprzez referencje. II Zastosowania, będących przedmiotem wynalazku inhibitorów TNFα Wynalazek dostarcza metod hamowania aktywności TNFαDu podmiotów cierpiących na zaburzenie związane z TNFα, w którym aktywność TNFαjest szkodliwa. W jednej z postaci inhibitorem TNFα jest D2E7 także określany jako HUMIRA (adalimumab). TNFα może być włączony w patofizjologię szerokiego wachlarza powiązanych z TNFα zaburzeń, włączając w to zakażenie ogólne, infekcje, choroby autoimmunologiczne, odrzucenie przeszczepów i chorobę przeszczep przeciw gospodarzowi (patrz Moeller i wsp., (1990) Cytokine 2: ; U.S.Patent nr Moeller i wsp.,; Europejska Publikacja Patentowa nr B1 Moeller A i wsp., Vasilli P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: ; Tracey K.J. i Cerami A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: ).