HercepTest Nr kat. K5204

Transkrypt

1 HercepTest Nr kat. K5204 Wydanie 21 Do barwienia immunocytochemicznego. Zestaw na 35 testów (70 szkiełek). ( ) P04454PL_01/K / s. 1/56

2 Spis treści Strona Przeznaczenie... 4 Streszczenie i wyjaśnienia - sutek... 5 Dodatkowe informacje... 5 Właściwości... 5 Zasada testu - sutek... 6 Odczynniki - sutek... 6 Dostarczane materiały... 6 Materiały wymagane, lecz niedostarczone... 8 Przechowywanie - sutek... 8 Przygotowanie próbek - sutek... 9 Skrawki zatapiane w parafinie... 9 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu... 9 Środki ostroŝności - sutek SPOSÓB UśYTKOWANIA - sutek A. Przygotowanie odczynników A.1 Epitope Retrieval Solution A.2 Bufor płuczący A.3 Roztwór substrat-chromogen (DAB) A.4 Barwienie kontrastowe A.5 Środek do zatapiania B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury B.2 Wykonanie odczynu Kontrola jakości - sutek Interpretacja wyniku barwienia - sutek Ograniczenia - sutek Ograniczenia ogólne Ograniczenia specyficzne dla produktu Charakterystyka przebiegu testu - sutek Dodatkowe informacje Badania porównawcze Porównanie z testem uŝywanym w badaniach klinicznych (CTA) Dokładność Powtarzalność Immunoreaktywność Rozwiązywanie problemów - sutek ( ) P04454PL_01/K / s. 2/56

3 Streszczenie i wyjaśnienia - Ŝołądek Dodatkowe informacje Właściwości Zasada testu - Ŝołądek Odczynniki - Ŝołądek Dostarczane materiały Materiały wymagane, lecz niedostarczone Przechowywanie - Ŝołądek Przygotowanie próbek - Ŝołądek Skrawki zatapiane w parafinie Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu Środki ostroŝności - Ŝołądek SPOSÓB UśYTKOWANIA - Ŝołądek A. Przygotowanie odczynników A.1 Epitope Retrieval Solution A.2 Bufor płuczący A.3 Roztwór substrat-chromogen (DAB) A.4 Barwienie kontrastowe A.5 Środek do zatapiania B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury B.2 Wykonanie odczynu Kontrola jakości - Ŝołądek Interpretacja wyniku barwienia - Ŝołądek Ograniczenia - Ŝołądek Ograniczenia ogólne Ograniczenia specyficzne dla produktu Charakterystyka przebiegu testu - Ŝołądek Dodatkowe informacje Powtarzalność Immunoreaktywność Rozwiązywanie problemów - Ŝołądek Piśmiennictwo Objaśnienie symboli ( ) P04454PL_01/K / s. 3/56

4 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. HercepTest to półilościowy test immunocytochemiczny słuŝący do wykrywania nadmiernej ekspresji białka HER2 w tkankach raka sutka poddawanych rutynowym badaniom histologicznym i w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawkach tkanek raka od pacjentów z gruczolakorakiem połączonym zespoleniem Ŝołądkowo-przełykowym. HercepTest jest przeznaczony do wspomagania badania pacjentów, u których rozwaŝane jest podjęcie leczenia lekiem Herceptin (trastuzumab) (zob. ulotka dołączona do opakowania Herceptin ). UWAGA dotycząca wyłącznie raka sutka: Wszystkich pacjentów uczestniczących w badaniach klinicznych leku Herceptin wybierano przy uŝyciu testu immunocytochemicznego przeznaczonego do badań klinicznych (CTA, ang. clinical trial assay). śadnego z pacjentów uczestniczącego w tych badaniach nie wybierano przy uŝyciu testu HercepTest. Test HercepTest porównano z testem przeznaczonym do badań klinicznych na niezaleŝnie wybranym zbiorze próbek, stwierdzając moŝliwą do przyjęcia zgodność wyników. Nie ustalono jednak faktycznej korelacji między wynikami testu HercepTest a klinicznymi wynikami stosowania leku Herceptin. UWAGA dotycząca wyłącznie nowotworów Ŝołądka: Wszyscy pacjenci fazy III badania BO18255 (ToGA), sponsorowanego przez Hoffmann-La Roche, zostali dobrani z zastosowaniem testu Dako HercepTest (IHC) i zestawu Dako HER2 FISH pharmdx Kit (FISH). Badanie wykazało uŝyteczność kliniczną obu testów przy ocenie statusu HER2 pacjentów z nieoperacyjnym, miejscowo zaawansowanym gruczolakorakiem Ŝołądka, nawracającym i/lub przerzutowym gruczolakorakiem Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego. Gruczolakorak Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, jest w tym dokumencie nazywany rakiem Ŝołądka. Szczegółowe informacje o aplikacji raka sutka na stronach Szczegółowe informacje o aplikacji raka Ŝołądka na stronach WaŜne: NaleŜy zwrócić uwagę na róŝnice pomiędzy tkanką nowotworu sutka i Ŝołądka, zwłaszcza przy interpretacji wyniku barwienia. ( ) P04454PL_01/K / s. 4/56

5 Rak sutka Streszczenie i wyjaśnienia - sutek Dodatkowe informacje Ludzki gen HER2 (znany takŝe jako ERBB2 lub NEU) koduje białko oznaczane najczęściej symbolem HER2 lub p185 HER2. Białko HER2 to transbłonowe białko receptorowe o aktywności kinazy tyrozynowej, wykazujące homologię do receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR lub HER1) (1-8). Białko HER2 jest składnikiem prawidłowym, wykazującym ekspresję w róŝnych typach komórek nabłonkowych (8). U pewnego ułamka chorych na raka sutka białko HER2 wykazuje nadmierną ekspresję w procesie zezłośliwiania i progresji nowotworu (9). Nadmierna ekspresja białka HER2 na powierzchni komórek raka sutka stała się punktem wyjścia do opracowania metody leczenia przeciwciałami skierowanymi przeciwko temu białku. Herceptin (trastuzumab) to uczłowieczone przeciwciało monoklonalne (10), które wiąŝe się z białkiem HER2, wykazując do niego silne powinowactwo. W badaniach in vitro i in vivo stwierdzono, Ŝe przeciwciało to blokuje rozrost ludzkich komórek nowotworowych wykazujących nadmierną ekspresję białka HER2 (11-13). Właściwości Test HercepTest opracowano jako alternatywę dla testu badawczego CTA uŝywanego w badaniach klinicznych leku Herceptin. Charakterystykę wydajnościową testu HercepTest w określaniu nadmiernej ekspresji białka HER2 oceniano w niezaleŝnym badaniu porównującym wyniki testu HercepTest z wynikami testu do badań klinicznych na 548 próbkach tkanki raka sutka, przy czym Ŝadna z tych próbek nie pochodziła od pacjentów uczestniczących w badaniach klinicznych leku Herceptin. Wyniki wykazały 79-procentową zgodność między wynikami obu testów wykonanych na tych próbkach tkankowych. Ponadto dane zgodności wskazują, Ŝe odczyt 3+ przy uŝyciu HercepTest z wysokim prawdopodobieństwem odpowiadał dodatniemu odczytowi za pomocą CTA, co stanowiło spełnienie kryteriów włączenia do badania (2+ lub 3+). Wyniki 2+ w teście HercepTest nie były równie dobrze skorelowane z wynikami testu badawczego. Około 42% (53/126) wyników w teście HercepTest 2+ odpowiadało ujemnym wynikom testu badawczego (0 1+), które nie spełniają kryteriów włączenia do badań klinicznych leku Herceptin. Wynik testu HercepTest w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2 interpretuje się jako ujemny (odczyn o intensywności 0 i 1+), słabo dodatni (intensywność odczynu 2+) albo silnie dodatni (intensywność odczynu 3+). Pacjenci ani lekarze nie powinni wykorzystywać wyników testu HercepTest jako podstawy do prognoz; test HercepTest nie został zatwierdzony do takich zastosowań. ( ) P04454PL_01/K / s. 5/56

6 Rak sutka Zasada testu - sutek Test HercepTest zawiera odczynniki konieczne do wykonania dwuetapowej procedury barwienia immunocytochemicznego dla rutynowo przygotowanych próbek zanurzonych w parafinie. W omawianym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał króliczych z ludzkim białkiem HER2 następuje reakcja z gotowym barwnym odczynnikiem Visualization Reagent produkowanym w oparciu o technologię stosowaną do wytwarzania dekstranu. W skład odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał kozich skierowanych przeciw immunoglobulinom króliczym oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym szkieletem polimerowym dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego stosowania przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Reakcję krzyŝową odczynnika Visualization Reagent z immunoglobulinami ludzkimi i płodową surowicą cielęcą wyeliminowano poprzez absorpcję w fazie stałej. Po dodaniu chromogenu następuje reakcja enzymatyczna, której efektem jest widoczny produkt, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie moŝna wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji ocenia się w mikroskopii świetlnej. Zestaw zawiera szkiełka kontrolne zawierające trzy utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka, dające odczyny o nasileniu odpowiednio 0, 1+ i 3+. SłuŜą one do weryfikacji serii odczynów. Nasilenie odczynu tych linii komórkowych jest skorelowane z liczbą receptorów przypadających na komórkę. Test HercepTest Nr kat. K5204 jest odpowiedni zarówno dla testów barwienia wykonywanych ręcznie jak i na automatach przy uŝyciu Autostainera. Odczynniki - sutek Dostarczane materiały Wyszczególnione poniŝej materiały wystarczają na wykonanie 35 testów (35 szkiełek mikroskopowych inkubowanych z odczynnikiem przeciwciałem pierwotnym przeciwko białku HER2 oraz 35 szkiełek inkubowanych z odpowiednim odczynnikiem do kontroli ujemnej). Liczba testów opiera się na zastosowaniu 3 kropli (100 µl) na sekcje tkanki fiolek z numerem 1, 2, 3 i 4 oraz roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB). Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na wykonanie co najwyŝej 5 pojedynczych serii oznaczeń. Fiolka nr Ilość Opis 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent: 3% roztwór nadtlenku wodoru z dodatkiem azydku sodu (NaN 3 ) w stęŝeniu 15 mmol/l. Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Gotowe do uŝycia przeciwciała wyizolowane ze względu na powinowactwo. Dostarczany w buforze Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, ph 7,2, z dodatkiem białka stabilizującego. Immunogen: syntetyczny fragment C-końcowy (część wewnątrzcytoplazmatyczna) białka HER2 sprzęŝony z KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin). Swoistość: białko HER2. Metoda oczyszczania: przeciwciała są izolowane ze względu na powinowactwo przy uŝyciu immobilizowanego peptydu białka HER2. ( ) P04454PL_01/K / s. 6/56

7 Rak sutka 3 1 x 7 ml 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml 5 szkiełek Visualization Reagent: Polimer dekstranowy skoniugowany z peroksydazą chrzanową oraz przeciwciała kozie izolowane ze względu na powinowactwo, skierowane przeciw antygenom króliczym. Dostarczany w buforze Tris/HCl zawierającym białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny. Negative Control Reagent: Frakcja immunoglobulinowa prawidłowej surowicy króliczej rozcieńczona do takiego samego stęŝenia białek, jak przeciwciało przeciwko białku HER2. Dostarczany w buforze Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, ph 7,2, z dodatkiem białka stabilizującego. DAB Buffered Substrate: Roztwór buforowy substratu, ph 7,5, zawierający roztwór nadtlenku wodoru o stęŝeniu < 0,1 %, substancje stabilizujące, substancje wzbogacające i środek przeciwbakteryjny. DAB Chromogen: Roztwór tetracholorowodorku 3,3 -diaminobenzydyny o stęŝeniu 5% w roztworze chromogenu Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): Roztwór cytrynianowy o stęŝeniu 0,1 mol/l z dodatkiem środka przeciwbakteryjnego. Wash Buffer (10x): Bufor Tris/HCl z detergentem i środkiem przeciwbakteryjnym. Szkiełka kontrolne: KaŜdy preparat zawiera skrawki trzech utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie linii komórkowych raka sutka wykazujących róŝne poziomy ekspresji białka HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) i SK-BR-3 (3+). Preparaty do kontroli jakości zostały poddane obróbce cieplnej w celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek. Jakakolwiek dodatkowa obróbka cieplna preparatów do kontroli jakości przeprowadzona w celu poprawy przylegania skrawków do szkiełek moŝe negatywnie wpłynąć na wyniki odczynu. UWAGA: Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały przygotowane specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z instrukcją nie naleŝy uŝywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, zamiast którego moŝna uŝyć Dako Nr kat. S3006. ( ) P04454PL_01/K / s. 7/56

8 Rak sutka Materiały wymagane, lecz niedostarczone Waciki Wodorotlenek amonu, 15 mol/l rozcieńczony do 37 mmol/l Barwnik kontrastowy: Hematoksylina, taka jak rozcieńczana wodą Mayer's Hematoxylin, Dako Nr kat. S3301 (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, A.4) Szkiełka nakrywkowe Marker, taki jak Dako Pen, Nr kat. S2002 Woda destylowana lub dejonizowana (Washing Water) Suszarka umoŝliwiająca utrzymanie temperatury 60 C lub niŝszej Etanol absolutny i roztwór o stęŝeniu 95% Komora wilgotna (opcjonalna) Mikroskop optyczny (powiększenie obiektywu 4 40x) Środek do montowania, taki jak Dako Faramount, Nr kat. S3025 lub Glycergel Nr kat. C0563 Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej (zobacz część Kontrola jakości) Szkiełka, SuperFrost Plus, szkiełka opłaszczone poli-l-lizyną lub silanizowane szkiełka Dako Silanized Slides Nr kat. S3003 (zobacz Przygotowanie próbek) Słoje lub łaźnie barwiące Stoper (odpowiedni do wyznaczenia 2 40-minutowych okresów) Tryskawki Łaźnia wodna z przykrywką (odpowiednia do utrzymywania temperatury Epitope Retrieval Solution C) Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu Przechowywanie - sutek Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie uŝywać zestawu po dacie waŝności ostemplowanej na zewnętrznej stronie opakowania. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane na wkładce informacyjnej do opakowania, UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość (14a,14b). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe równieŝ preparaty do kontroli jakości powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego teŝ naleŝy wykonywać Kontrole Dodatnie i Ujemne jednocześnie z badaniem próbki pacjentki. Jeśli zauwaŝone zostanie nieoczekiwane zabarwienie, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych i podejrzewa się, Ŝe przyczyną moŝe być HercepTest, naleŝy niezwłocznie skontaktować się z serwisem technicznym firmy Dako. ( ) P04454PL_01/K / s. 8/56

9 Rak sutka Przygotowanie próbek - sutek Materiał biopsyjny naleŝy traktować tak, by zachować materiał tkankowy do wykonania odczynów immunocytochemicznych. Do wszystkich preparatów naleŝy stosować standardowe metody przeprowadzania tkanek (15). Skrawki zatapiane w parafinie Testu moŝna uŝywać do tkanek konserwowanych w obojętnym roztworze buforowanej formaliny lub płynie Bouina, poddanych standardowej obróbce i zatopionych w parafinie. Na przykład materiał biopsyjny naleŝy pociąć na bloczki o grubości 3 lub 4 mm i utrwalać przez godzin w obojętnym roztworze buforowanej formaliny. Następnie tkanki zostają odwodnione w szeregu alkoholi i w ksylenie, a następnie przesiąknięte stopioną parafiną utrzymywaną w temperaturze nie wyŝszej niŝ 60 C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki z e kspresją białka HER2 mogą być przechowywane przez nieograniczony czas przed podzieleniem na skrawki i zamontowaniem na szkiełka, pod warunkiem, Ŝe są przechowywane w chłodnym miejscu (15 25 C) (15, 1 6). W Stanach Zjednoczonych dokument Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (Zmiany w zasadach postępowania w laboratoriach klinicznych, 42 CFR (b)) nakłada na uŝytkowników wymóg przechowywania wybarwionych szkiełek przez co najmniej 10 lat od daty badania i zachowania bloczków próbek przez co najmniej dwa lata od daty badania (16). Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o wymiarach 4 5 µm, zatopić w szkiełkach i suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin (lub do wysuszenia) albo w temperaturze 37 C przez całą noc lub w temperaturze 60 C w ciągu jednej godziny. PRZESTROGA: Nadmierne ogrzewanie przez ponad jedną godzinę w temperaturze 60 C moŝe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2 związanej z odczynem błonowym (17). Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe zatopione na szkiełkach (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine lub szkiełka silanizowane) powinny zostać poddane barwieniu w ciągu 4 6 tygodni od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C) (18). Szkiełka wymagane do oceny białka HER2 i zweryfikowania obecności guza naleŝy przygotować w tym samym czasie. Zaleca się minimum 5 szkiełek, 1 szkiełko dla obecności guza, 2 szkiełka dla oceny białka HER2 (1 dla inkubacji z fiolką nr 2 i 1 dla inkubacji z fiolką nr 4) oraz 2 szkiełka zapasowe. Zastosowanie HercepTest na tkankach odwapnionych nie zostało zatwierdzone i nie jest zalecane. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowywania próbek przedstawiono w podręczniku Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19), a takŝe odsyłacze 15 i 16. Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu Dla uzyskania optymalnych wyników testu naleŝy zastosować specyficzną metodę odzyskiwania epitopu, polegającą na gotowaniu w 10 mmol/l buforu cytrynianowego. Roztwór do odmaskowania antygenu wchodzi w skład zestawu HercepTest. Metoda obejmuje podgrzewanie skrawków tkanek zamontowanych na szkiełkach, które zostają zanurzone w buforze cytrynianowym 10 mmol/l (20) w skalibrowanej łaźni wodnej utrzymującej Epitope Retrieval Solution w wymaganej temperaturze (95 99 C). Laboratoria znaj dujące się na duŝych wysokościach powinny określić najlepszą metodę utrzymania wymaganej temperatury łaźni wodnej. Odzyskanie epitopu musi zostać wykonane w łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one odtwarzalnych wyników. Niezwłocznie po odzyskaniu epitopu naleŝy rozpocząć procedurę barwienia. Odstępstwa od opisywanej procedury mogą mieć wpływ na wyniki. ( ) P04454PL_01/K / s. 9/56

10 Rak sutka Środki ostroŝności - sutek 1. Do stosowania w diagnostyce in vitro. 2. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 3. Fiolka 1, Peroxidase-Blocking Reagent, zawiera 3% nadtlenek wodoru. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie. 4. Fiolka 6, DAB Chromogen, zawiera 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride (czterochlorek dwufenylo-3,3, 4,4 -tetryloczteroamonowego) i jest oznaczony: Niebezpieczeństwo H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Za ogólną regułę naleŝy przyjąć, Ŝe osoby poniŝej 18 lat nie mogą pracować z tym produktem. NaleŜy poinformować uŝytkowników testu o prawidłowej procedurze pracy, niebezpiecznych własnościach produktu oraz o niezbędnych instrukcjach BHP. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa (SDS). 5. Fiolka 8, Wash Buffer, zawiera 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride i 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. MoŜe wywoływać reakcje alergiczne. Produkt Wash Buffer (10x) jest oznaczony: Uwaga H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Działa draŝniąco na oczy. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. 6. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3 ), w czystej postaci. StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji (21, 22). 7. Fiolki 2, 3 i 4 zawierają materiał pochodzenia zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 8. Preparaty kontrolne i próbki (przed i po utrwaleniu) oraz wszystkie przyrządy i materiały mające z nimi kontakt, powinny być traktowane jako mogące przenosić zakaŝenia i likwidowane z zachowaniem odpowiednich środków ostroŝności (23). Nigdy nie pipetować odczynników ustami i unikać naraŝania skóry i błon śluzowych na kontakt z odczynnikami i próbkami. W razie kontaktu odczynników z wraŝliwymi okolicami skóry naleŝy je spłukać obfitą ilością wody. ( ) P04454PL_01/K / s. 10/56

11 Rak sutka 9. Zminimalizować skaŝenie mikrobiologiczne odczynników, aby uniknąć nieswoistego barwienia. 10. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasów inkubacji, temperatur lub metod moŝe powodować błędne wyniki badania. Nadmierne suszenie w temperaturze 60 C przez ponad jedną godzinę moŝe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2 związanej z odczynem błonowym (17). 11. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŝe powodować utratę odczynu antygenów. 12. Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały przygotowane specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z instrukcją nie naleŝy uŝywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, posiadającego Nr kat. S Wystawienie Visualization Reagent i DAB Chromogenu na działanie silnego światła moŝe mieć na nie niekorzystny wpływ. Nie naleŝy przechowywać składników systemu ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 14. Aby uniknąć kontaktu z oczami i skórą, naleŝy uŝywać odpowiedniego osobistego wyposaŝenia ochronnego. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa (SDS). 15. Pozostałości parafiny mogą być przyczyną wyników fałszywie ujemnych. 16. UŜycie objętości odczynnika innych niŝ zalecane moŝe doprowadzić do widocznej utraty immunoreaktywności HER2. JeŜeli obwiedziony skrawek tkanki nie zostanie pokryty 3 kroplami (100 µl) odczynnika, naleŝy dodać kolejne 3 krople. ( ) P04454PL_01/K / s. 11/56

12 Rak sutka SPOSÓB UśYTKOWANIA - sutek A. Przygotowanie odczynników Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia: A.1 Epitope Retrieval Solution Dla planowanej procedury barwienia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) w stosunku 1:10 uŝywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony roztwór nie nadaje się do uŝycia. A.2 Bufor płuczący Dla etapów przemycia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 8 (Wash Buffer 10x) w stosunku 1:10 uŝywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany rozcieńczony bufor moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia bufor nie nadaje się do uŝycia. Wodę destylowaną lub dejonizowaną moŝna uŝyć do płukania po odczynniku Peroxidase-Blocking Reagent, Substrate-Chromogen Solution i inkubacji hematoksykliny. Wszystkie pozostałe etapy wymagają uŝycia Wash Buffer. A.3 Roztwór substrat-chromogen (DAB) Następująca procedura daje 1 ml roztworu Substrate-Chromogen Solution. KaŜdy 1 ml jednakowej objętości roztworu jest wystarczający dla dziesięciu skrawków tkanek. Etap 1: Przenieść do probówki 1 ml zbuforowanego substratu DAB z fiolki 5. Etap 2: Dodać jedną kroplę (25 30 µl) Chromogenu DAB z fiolki 6. Wymieszać i nałoŝyć na skrawki tkanek za pomocą pipety. Przygotowany Substrate-Chromogen Solution (DAB) jest stabilny przez około 5 dni, jeśli jest przechowywany w temperaturze 2 8 C. Przed uŝyciem roztwór naleŝy dokładnie wymieszać. Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu. UWAGA: DAB Chromogen w fiolce 6 moŝe przyjmować barwę od przezroczystej po lawendowobrązową. Nie ma to wpływu na działanie produktu. NaleŜy go rozcieńczyć zgodnie ze wskazówkami podanymi w niniejszej ulotce. Dodanie nadmiernej ilości roztworu DAB Chromogen do buforu DAB Buffered Substrate spowoduje pogorszenie jakości odczynu dodatniego. A.4 Barwienie kontrastowe Barwny produkt końcowy reakcji barwienia chromogenem DAB jest nierozpuszczalny w alkoholu i wodzie. Zastosować barwienie negatywne hematoksyliną i dopasować intensywność barwienia hematoksyliny do podobnego poziomu pokazanego w atlasie HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Atlas interpretacji odczynów HercepTest - rak sutka). MoŜna uŝyć hematoksylinę rozcieńczoną alkoholem lub wodą, taką jak Dako Mayer's Hematoxylin Nr kat. S3301. Po barwieniu negatywnym hematoksyliną wykonać dokładne płukanie w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, następnie zanurzyć szkiełka z tkankami w wodzie amoniakalnej o stęŝeniu 37 mmol/l (zobacz Część B.2, etap 6). Woda amoniakalna (37 mmol/l) jest przygotowana przez zmieszanie 2,5 ml 15 mol/l (stęŝonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystana woda amoniakalna o stęŝeniu 37 mmol/l moŝe być przechowywana w temperaturze pokojowej (20 25 C) w szczelnie zamkn iętej butelce do 12 miesięcy. ( ) P04454PL_01/K / s. 12/56

13 Rak sutka A.5 Środek do zatapiania Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest jednak równieŝ zatapianie wodne. Do montowania wodnego zaleca się Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, gotowe do uŝycia, Nr kat. S3025 lub Glycergel Mounting Medium Nr kat. C0563. Doprowadzić Glycergel do postaci płynnej przez podgrzewanie do około 40 (±5) C przed uŝyciem. B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury Przed uŝyciem naleŝy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się ze wszystkimi składnikami (patrz Środki ostroŝności). Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Podobnie, wszystkie inkubacje naleŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Zakryć szkiełka wystawione na działanie przeciągów. Jeśli stosowane są wydłuŝone inkubacje umieścić tkanki w wilgotnym środowisku. Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po inkubacji pierwszego przeciwciała (etap 3) szkiełka moŝna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny, w temperaturze pokojowej (20 25 C) bez wpływu na jakość barwienia. Usunięcie parafiny i ponowne uwodnienie: Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŝy odparafinować preparaty w celu usunięcia środka zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny. Pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie odczynu nieswoistego. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Umieścić szkiełka w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 2. Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar płynu i umieścić je w bezwodnym etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić szkiełka w 95% etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 4. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w destylowanej lub dejonizowanej wodzie na minimum 30 sekund. Rozpocząć procedurę barwienia zgodnie z instrukcją podana w Części B 2, etap 1, Odzyskanie epitopu. Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŝy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu. Zamiast ksylenu moŝna stosować zamienniki toluenu lub ksylenu np. Histoclear. UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. RóŜnice w metodach przetwarzania tkanek oraz procedurach technicznych stosowanych w laboratorium uŝytkownika mogą spowodować, Ŝe wyniki testu nie będą waŝną podstawą wyboru pacjentów do terapii lekiem Herceptin. ( ) P04454PL_01/K / s. 13/56

14 Rak sutka B.2 Wykonanie odczynu Wykonana w temperaturze pokojowej, C. Etap 1: Odmaskowanie antygenu Pojemniki do barwienia, np. naczynka Coplina, napełnić rozcieńczonym Epitope Retrieval Solution (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.1). Naczynia do barwienia zawierające Epitope Retrieval Solution umieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i Epitope Retrieval Solution do C. Po ogrzaniu roztworu Epitope Retrieval Solution pojawia się zmętnienie. Zakryć naczynia wieczkami, aby zapewnić stabilną temperaturę i uniknąć parowania. Zanurzyć pozbawione parafiny skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze odzyskiwania epitopu w naczyniach do barwienia. PONOWNIE DOPROWADZIĆ TEMPERATURĘ ŁAŹNI WODNEJ I EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION DO C. Inkubować w temperaturze C przez 40 (±1) minut. Wyjąć całe naczynie ze szkiełkami z łaźni wodnej. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w Epitope Retrieval Solution na 20 (±1) minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór Epitope Retrieval Solution i wypłukać skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.2). Dla uzyskania optymalnych wyników po odzyskaniu epitopu i przed barwieniem naleŝy nasączyć skrawki w Wash Buffer przez 5 20 minut. UWAGA: Roztwór Epitope Retrieval Solution jest przeznaczony do jednokrotnego stosowania. Nie uŝywać ponownie. Etap 2: Peroxidase-Blocking Reagent: Strząsnąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub płatka gazy) ostroŝnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynników w określonym miejscu. Za pomocą Dako Pen obwieść skrawek tkanki. NałoŜyć 3 krople (100 µl) odczynnika Peroxidase-Blocking Reagent dla zakrycia próbki. Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną lub buforem Wash Buffer z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŝej kąpieli buforu. Etap 3: Primary Antibody lub Negative Control Reagent Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio. Pokryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µl) białka Anti-HER2 Protein lub odczynnika Negative Control Reagent. Inkubować przez 30 (±1) minut. Delikatnie przepłukać buforem Wash Buffer z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŝej kąpieli buforu. Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po wykonaniu etapu 3 szkiełka moŝna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny w temperaturze pokojowej (20 25 C), bez wpływu na wykonanie barwi enia. ( ) P04454PL_01/K / s. 14/56

15 Rak sutka Etap 4: Visualization Reagent Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio. Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µl) odczynnika Visualization Reagent. Inkubować przez 30 (±1) minut. Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 3. Etap 5: Roztwór substrat-chromogen (DAB) Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej. Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µl) roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB). Inkubować przez 10 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną z butelki przemycia (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Zebrać odpady roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB) do pojemnika na odpady skaŝone w celu właściwego ich usunięcia. Etap 6: Barwienie negatywne (instrukcje podano dla hematoksyliny) Zanurz szkiełka w hematoksylinie. Inkubuj przez 2 5 minut, zaleŝnie od stęŝenia zastosowanej hematoksyliny. Delikatnie przepłukaj wodą destylowaną lub dejonizowaną. Upewnij się, Ŝe pozostałości hematoksyliny zostały usunięte. Opcjonalnie: Zanurz szkiełka 10 razy w wodzie amoniakalnej o stęŝeniu 37 mmol/l (zobacz Część A.4). Delikatnie przepłukaj szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2 5 minut. UWAGA: ZaleŜnie od czasu trwania inkubacji oraz stęŝenia uŝytej hematoksyliny barwienie negatywne spowoduje zabarwienie jądra komórkowego od jasno do ciemnoniebieskiego. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać prawidłową interpretację wyników. Etap 7: Zatapianie preparatu Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest jednak równieŝ zatapianie wodne. Próbki moŝna montować i zakrywać szkiełkiem nakrywkowym przy uŝyciu środka do montowania takiego, jak Dako Faramount Nr kat. S3025 lub Glycergel Nr kat. C0563. UWAGA: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić w dogodnym dla uŝytkownika momencie. Jednak, jeŝeli do nakrywania zastosowano wodny środek do zatapiania, ekspozycja na silne światło przez okres jednego tygodnia moŝe powodować zblaknięcie. Aby ograniczyć blaknięcie, naleŝy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze pokojowej (20 25 C). ( ) P04454PL_01/K / s. 15/56

16 Rak sutka Kontrola jakości - sutek Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania tkanek moŝe spowodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania dodatkowej wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŝnie od standardowych załączonych preparatów kontroli jakości Dako. W przypadku testów wykonywanych na terenie Stanów Zjednoczonych naleŝy sprawdzić wskazówki dotyczące kontroli jakości zawarte w Programie Certyfikacji dla Immunochemii College of American Pathologists (CAP), ponadto w celu uzyskania dalszych informacji naleŝy sprawdzić Zapewnienie Jakości dla Badań Immunochemicznych, Zatwierdzone Wskazówki CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for Immunochemistry, Approved Guideline (24) oraz odsyłacz (25). Tabela 1. Cel codziennej kontroli jakości Rodzaj tkanki: utrwalona i przeprowadzona identycznie jak próbki pochodzące od pacjenta Swoiste przeciwciało i drugie przeciwciało Nieswoiste przeciwciało* lub Buffer Plus takie samo przeciwciało jak uŝyte ze swoistym przeciwciałem Kontrola dodatnia: Tkanki lub komórki zawierające antygen docelowy (mogą występować w tkankach pacjenta). Idealna próba kontrolna jest tkanką wykazującą słabo dodatni odczyn i moŝliwie największą czułość na utratę właściwości przez przeciwciała lub antygeny. Kontrola wszystkich etapów badania. Weryfikacja odczynnika i procedur stosowanych do odczynu białka HER2. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Kontrola ujemna: Tkanki lub komórki z oczekiwanym ujemnym wynikiem odczynu (mogą występować w tkankach pacjenta lub dodatniej kontroli tkankowej). Detekcja niepoŝądanej reakcji krzyŝowej przeciwciał z komórkami lub strukturami komórkowymi. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Tkanka pochodząca od pacjenta. Detekcja odczynu swoistego. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Preparat kontrolny dostarczony przez Dako. Wyłącznie odczyn z preparatami kontrolnymi. * Surowica tego samego gatunku, co swoiste przeciwciało, ale nie skierowana przeciwko temu samemu antygenowi docelowemu. SłuŜy do wykrywania nieswoistego wiązania przeciwciał, tzn. wiązania fragmentu Fc przeciwciała przez tkankę. Preparat kontrolny (w zestawie): KaŜdy z dostarczonych preparatów kontrolnych zawiera trzy odwirowane, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka, dające odczyny o nasileniu 0, 1+ i 3+. W kaŝdej serii naleŝy wykonać odczyn tylko na jednym preparacie kontrolnym. Ocena linii komórkowych preparatów kontrolnych dostarczonych przez Dako pozwala ustalić waŝność serii odczynów. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Preparaty kontrolne naleŝy sporządzić ze świeŝych materiałów sekcyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych, moŝliwie szybko utrwalonych i zatopionych w sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzących od pacjenta. Wynik dodatniej kontroli potwierdza właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia. Dla wszystkich serii odczynów i dla kaŝdego rodzaju warunków badania naleŝy uwzględnić jedną dodatnią kontrolę tkankową. Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni, pozwalający na wykrywanie niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty kontrolne dostarczane z opisywanym zestawem lub preparaty przeprowadzane w sposób odmienny od próbek pochodzących od pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację działania odczynników; preparaty kontrolne nie nadają się do weryfikacji prawidłowego przygotowania tkanek. Dla najlepszej dodatniej kontroli tkankowej naleŝy zastosować tkankę z uprzednio oznaczoną nadekspresją inwazyjnego (naciekającego) ludzkiego raka sutka z obecnością białka 2+ HER2. ( ) P04454PL_01/K / s. 16/56

17 Rak sutka UWAGA: Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo do formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących od pacjentów. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów pochodzących od pacjentów są niewaŝne. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki dającej odczyn ujemny, w której nie występują białka HER2. Dla kaŝdej serii odczynów tkanka powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób identyczny do próbki (próbek) pochodzącej od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i identyfikacji swoistego odczynu tła. Tkankami odpowiednimi do ujemnej próby kontrolnej są tkanki okręŝnicy, wątroby lub tarczycy. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŝna wykorzystywać róŝne rodzaje komórek pochodzące z większości tkanek. Preparaty do kontroli ujemnej powinny zostać zweryfikowane przez UŜytkownika. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŝna stosować prawidłowe tkanki przewodów sutkowych. Jeśli tkanka do ujemnej próby kontrolnej lub wewnętrznej kontroli ujemnej daje odczyn swoisty, wyniki dla próbek pochodzących od pacjentów naleŝy uznać za niewaŝne, a test naleŝy powtórzyć. Nieswoisty odczynnik Negative Control Reagent: W celu oceny występowania odczynu nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach występowania antygenów, dla kaŝdego wycinka pochodzącego od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŝy stosować odczynnik do kontroli ujemnej. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Weryfikacja testu: Przed pierwszym uŝyciem przeciwciała lub systemu barwienia w procedurze diagnostycznej, uŝytkownik powinien sprawdzić swoistość przeciwciała testując go na serii posiadanych w laboratorium komórek o znanej charakterystyce działania immunocytochemicznego, stanowiących tkanki kontroli dodatniej i ujemnej. NaleŜy zapoznać się z procedurami kontroli jakości omówionymi wcześniej w tej sekcji ulotki oraz z wymaganiami określonymi w dokumentach CAP Certification Program for Immunohistochemistry oraz CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). PowyŜsze procedury kontroli jakości naleŝy powtarzać z kaŝdą nową partią przeciwciał i za kaŝdym razem, gdy wystąpi zmiana w parametrach odczynu. Do weryfikacji testu odpowiednie są tkanki raka sutka o znanej intensywności barwienia białka HER2 od 0-3+ oraz tkanki ujemne, np. z okręŝnicy, wątroby lub tarczycy. Interpretacja wyniku barwienia - sutek Wykrywanie nadmiernej ekspresji białka HER2 powinno odbywać się wyłącznie w oparciu o nasilenie odczynu błonowego, który naleŝy oceniać na podstawie skali przedstawionej w Tabeli 2. Oceny preparatów powinien dokonywać patolog, posługując się mikroskopem świetlnym. W celu oceny obecności i nasilenia odczynu immunocytochemicznego naleŝy stosować obiektyw o powiększeniu 10x. Zastosowanie obiektywu o powiększeniu 20 40x jest korzystne dla potwierdzenia wyniku. Odczyn cytoplazmatyczny naleŝy uznać za nieswoisty i nie naleŝy go brać pod uwagę przy ocenie nasilenia odczynu błonowego (8). W rozróŝnianiu poziomów nasilenia 0, 1+, 2+ i 3+ pomocny jest wydany przez firmę Dako atlas HercepTest Interpretation Manual Breast Cancer (Atlas interpretacji odczynów HercepTest - rak sutka), który zawiera obrazy typowych wyników barwienia o róŝnej intensywności. Oceniać naleŝy wyłącznie próbki pochodzące od chorych, u których występuje inwazyjny rak sutka. Jeśli w próbce występują jednocześnie komórki raka in situ oraz inwazyjnego, naleŝy oceniać wyłącznie składnik inwazyjny. ( ) P04454PL_01/K / s. 17/56

18 Rak sutka Tabela 2. Kryteria oceny intensywności barwienia błony komórkowej Wzór barwienia Wynik (przekazywany lekarzowi prowadzącemu leczenie) Białko HER2 Ocena nadmiernej ekspresji (przekazywany lekarzowi prowadzącemu leczenie) odczynu lub odczyn błonowy w mniej niŝ 10% komórek nowotworu. 0 Ujemny Blady, ledwie rozpoznawalny odczyn błonowy w więcej niŝ 10% komórek nowotworu. Wybarwione są tylko fragmenty błon poszczególnych komórek. 1+ Ujemny Słaby/umiarkowany odczyn błonowy (na całych błonach) w więcej niŝ 10% komórek nowotworu. Silny odczyn błonowy (na całych błonach) w więcej niŝ 10% komórek nowotworu Słabo dodatni Silnie dodatni Wynik testu HercepTest w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2 interpretuje się jako ujemny (odczyn o intensywności 0 i 1+), słabo dodatni (intensywność odczynu 2+) albo silnie dodatni (intensywność odczynu 3+). Pacjenci ani lekarze nie powinni wykorzystywać wyników testu HercepTest jako podstawy do prognoz; test HercepTest nie został zatwierdzony do takich zastosowań. W kaŝdej serii preparaty naleŝy badać w kolejności podanej w Tabeli 3, co pozwoli na określenie waŝności wyników z danej serii oraz półilościową ocenę nasilenia odczynu próbki tkankowej. ( ) P04454PL_01/K / s. 18/56

19 Rak sutka Tabela 3. Kolejność oceny szkiełek. Kolejność odczytu preparatów Uzasadnienie 1. Preparat kontrolny zawierający trzy linie komórkowe. Obecność 3+ brązowego zabarwienia błony komórkowej (zabarwienie obwódkowe, rimming) w linii komórek kontrolnych 3+ SK-BR-3, częściowe brązowe zabarwienie obwódkowe w linii komórek kontrolnych 1+ MDA-175 oraz brak zabarwienia w linii komórek kontrolnych 0 MDA-231 wskazuje, Ŝe test jest waŝny Punktowe i nieciągłe wybarwienie nastąpiło w małej do umiarkowanej liczbie komórek słabo dodatnich 1+ linii komórek kontrolnych MDA-175. Ponadto w tej linii komórek moŝna zaobserwować punktowe immunobarwienie ciałek Golgiego cytoplazmy. Obecność brązowego odczynu w kontrolnej linii komórkowej 0 MDA-231 (ujemnej w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2) wskazuje na wystąpienie nieswoistego odczynu. Wyniki testu mogą być niewaŝne w związku z nadmiernym wybarwieniem. 2. Preparat z tkanki do dodatniej próby kontrolnej. Powinien być widoczny brązowy odczyn błonowy. Wybarwienie cytoplazmy i tkanki ujemnej nie powinno przekraczać Preparat tkankowy do ujemnej próby kontrolnej. BRAK odczynu swoistego w preparacie tkankowym do kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŝowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. Jeśli pojawi się swoiste barwienie na Szkiełku Tkanki Kontroli Ujemnej, wówczas wyniki próbki pacjentki naleŝy uwaŝać za niewaŝne. 4. Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany działaniu odczynnika Negative Control Reagent 5. Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany działaniu przeciwciała pierwotnego swoistego wybarwienia błony weryfikuje swoistość znakowania docelowego antygenu przez pierwsze przeciwciało. Inne jasnobrązowe lub brązowe zabarwienie występujące w cytoplazmie próbki poddanej działaniu odczynnika kontroli ujemnej, np. w tkance łącznej, leukocytach, erytrocytach lub tkance martwiczej naleŝy uwaŝać za nieswoiste barwienie tła i naleŝy je podać w części przeznaczonej na uwagi w arkuszu danych. Jeśli wykryta jest nadekspresja białka HER2 w próbce, będzie to widoczne jako brązowe zabarwienie obwódkowe błony komórkowej komórek guza poddanych działaniu pierwszego przeciwciała. 1. Preparat kontrolny (w zestawie): W pierwszej kolejności naleŝy zbadać preparat kontrolny przebadany testem HercepTest, aby upewnić się, Ŝe wszystkie odczynniki działają prawidłowo. Obecność brązowego produktu reakcji (3,3 -diaminobenzydyny, DAB) na błonach komórkowych świadczy o reaktywności dodatniej. Obecność brązowego odczynu błonowego (na obwodzie) w kontrolnej linii komórkowej 3+ SK-BR-3, brązowego odczynu na części obwodu w kontrolnej linii komórkowej 1+ MDA-175 oraz brak odczynu w kontrolnej linii komórkowej 0 MDA-231 świadczy o prawidłowym przebiegu testu. Jeśli którakolwiek z kontrolnych linii komórkowych nie spełnia powyŝszych kryteriów, wszystkie wyniki uzyskane z próbek pochodzących od pacjentów naleŝy uznać za niewaŝne. 2. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Następnie naleŝy zbadać preparat dodatniej kontroli tkankowej. Ten preparat słuŝy do potwierdzania skuteczności zastosowanej metody utrwalania i procesu odmaskowania antygenu. Do interpretacji naleŝy wybierać jedynie komórki prawidłowe, gdyŝ w komórkach z martwicą lub uszkodzonych często występują odczyny nieswoiste (26). W komórkach nowotworu powinien występować brązowy odczyn błonowy. Nasilenie brązowego odczyn cytoplazmatycznego w tkankach ujemnych nie powinno przekraczać wartości 1+. ( ) P04454PL_01/K / s. 19/56

20 Rak sutka 3. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: Szkiełko z Tkanką Kontroli Ujemnej naleŝy badać po tkance kontroli dodatniej, aby sprawdzić swoistość znakowania docelowego antygenu przez pierwsze przeciwciało. odczynu swoistego w preparacie tkankowym do kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŝowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŝy uznać za niewaŝne. W charakterze tkanki do kontroli ujemnej moŝna równieŝ wykorzystać ujemne fragmenty preparatu tkankowego do kontroli dodatniej, jednak w takim przypadku wymagana jest weryfikacja przeprowadzona przez uŝytkownika. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe słabą reakcję (intensywność barwienia 0-1+) moŝna zauwaŝyć w większości normalnych tkanek nabłonka. Do uŝycia w charakterze kontroli ujemnej nadają się np. tkanki: okręŝnicy, wątroby i tarczycy. Jeśli odczyn nieswoisty występuje, ma on charakter rozproszony (rozlany). W preparatach tkanek poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŝe niekiedy występować odczyn w obrębie tkanki łącznej Tkanka pochodząca od pacjenta: Na końcu naleŝy zbadać próbki pochodzącej od pacjenta, poddane działaniu testu HercepTest. Intensywność odczynu dodatniego naleŝy oceniać w kontekście nieswoistego odczynu tła występującego w próbce z odczynnikiem kontroli ujemnej. Podobnie jak w kaŝdym badaniu immunocytochemicznym, wynik ujemny oznacza, Ŝe antygen nie został wykryty, a nie Ŝe nie występował w badanych komórkach/tkankach. Konkretne informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest moŝna znaleźć w sekcji Streszczenie i wyjaśnienia, Ograniczenia oraz Charakterystyka wydajnościowa. Dodatkowe zalecenia dotyczące interpretacji odczynu w teście HercepTest W testach większości tkanek przerzutowego raka sutka badanych w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2 uzyskuje się wynik od 0 do 3+. W większości przypadków wynik jest bardzo jednoznaczny, jednak niewielki odsetek próbek z wynikiem 1+ i 2+ moŝe nastręczać trudności interpretacyjnych. PoniŜej wymieniono wskazówki dotyczące interpretacji odczynu w teście HercepTest. Ocenić kontrolne linie komórkowe w celu zweryfikowania działania testu. Ocenić preparaty do kontroli dodatniej i ujemnej. Przy pierwszej ocenie zaleca się wybarwienie preparatu tkankowego hematoksyliną i eozyną (H+E). (Charakter nowotworowy moŝe nie być jednoznacznie widoczny w próbkach wybarwionych testem HercepTest. Szkiełko wybarwione H&E jest wymagane dla patologa, abysprawdzić obecność guza.). Test HercepTest naleŝy wykonać na parze skrawków (skrawki seryjne) z tego samego bloczku parafinowego próbki. Skrawki, na których wykonano odczyn w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2, naleŝy najpierw badać w małym powiększeniu. Większość przypadków dodatnich będzie ewidentnie rozpoznawalna przy małym powiększeniu. Do ustalania odsetka dodatnich komórek nowotworowych naleŝy wykorzystać dobrze zachowane i dobrze wybarwione obszary próbki. Z reguły wynik testu powinien być oczywisty przy małym powiększeniu. Jeśli rozróŝnienie przypadków granicznych 1+/2+ przy niewielkim powiększeniu jest utrudnione, to zwykle wynik wynosi 1+. Aby sprawdzić wybarwienie błony naleŝy uŝyć powiększenia 20 40x. Jeśli w większości komórek nowotworu występuje odczyn na całej błonie komórkowej, to wynik wynosi 2+ lub 3+. NaleŜy przejść do powiększenia 20 40x, aby potwierdzić wynik. W większości przypadków 3+ co najmniej 80% komórek nowotworowych daje odczyn, zaś odczyn błonowy jest intensywny. ( ) P04454PL_01/K / s. 20/56

21 Rak sutka Jeśli odsetek nowotworowych komórek dodatnich w próbce jest bliski granicznej wartości 10%, zaleca się zliczenie co najmniej 100 komórek nowotworowych w celu określenia prawidłowego odsetka komórek wybarwionych. Jeśli w więcej niŝ 10% komórek nowotworowych występuje słaby lub umiarkowany odczyn błonowy (na całym obwodzie), to wynik dla próbki wynosi 2+. Zwykle towarzyszy mu odczyn na fragmentach obwodu błon większości pozostałych komórek nowotworowych. Jeśli odczyn na całym obwodzie błon komórkowych występuje w mniej niŝ 10% komórek nowotworowych, przy odczynie na niepełnym obwodzie innych komórek nowotworowych, wynik wynosi 1+. Jeśli odczyn błonowy (na całym obwodzie lub na części obwodu) występuje w mniej niŝ 10% komórek nowotworowych, wynik wynosi 0. Ograniczenia - sutek Ograniczenia ogólne 1. Immunocytochemia jest wieloetapową metodą diagnostyczną wymagającą specjalistycznego przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do immunocytochemii i interpretacji wyników barwienia. 2. Wybarwienie tkanek jest uzaleŝnione od obróbki i przetworzenia tkanki przed wykonaniem odczynu. Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŝanie, rozmraŝanie, przemywanie, suszenie, ogrzewanie lub zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŝe powodować artefakty, ukrycie przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych wyników moŝe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub właściwości zaleŝne od tkanek. 3. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać prawidłową interpretację wyników. 4. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście objawów klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych i innych badań diagnostycznych. Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŝy wykonać w akredytowanej pracowni histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych. 5. Tkanki pochodzące od osób z zakaŝeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową (27). 6. W typach tkanek, które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać nieoczekiwane reakcje. Nie moŝna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji w przetestowanych tkankach z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo (28). W przypadku udokumentowanych nieoczekiwanych reakcji naleŝy skontaktować się z Serwisem Technicznym firmy Dako. 7. Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych niŝ immunologiczne moŝe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą równieŝ wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności peroksydazy (cytochromu C) (28). 8. Procedurę barwienia naleŝy wykonywać w temperaturze pokojowej C. ( ) P04454PL_01/K / s. 21/56

22 Rak sutka Ograniczenia specyficzne dla produktu 1. Antygen obecny w linii komórkowej 1+, MDA-175, z czasem ulega rozkładowi. Odczyn preparatu kontrolnego naleŝy oceniać w kontekście daty waŝności tego preparatu. Ujemny odczyn komórek MDA-175 moŝe być jedynie objawem rozkładu preparatu. Preparaty kontrolne muszą być przechowywane w temperaturze 2 8 C. 2. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. Próbki naleŝy wybarwiać w ciągu 4-6 tygodni od zamontowania tkanek na szkiełkach, jeŝeli są one przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C) (29). 3. JeŜeli tkanki są rutynowo utrwalane (neutralna zbuforowana formalina lub utrwalacz Bouin a) i zatapiane w parafinie, dla uzyskiwania optymalnego i odtwarzalnego wyniku białko HER2 wymaga odzyskiwania epitopu w podwyŝszonej temperaturze. Ta wstępna obróbka musi być zakończona na początku całego procesu barwienia. Instrukcje podano w części Przygotowanie Próbek, Obróbka tkanek przed Barwieniem 4. Wzbudzane temperaturą odzyskiwanie epitopu białka HER2 naleŝy wykonywać wyłącznie w skalibrowanej łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one odtwarzalnych wyników. 5. Nie wolno zastępować odczynników znajdujących się w zestawie odczynnikami posiadającymi inne numery partii lub odczynnikami innych producentów. Jedynym wyjątkiem jest Wash Buffer, który moŝna zastępować Dako Wash Buffer Nr kat. S Ocena odczynu cytoplazmatycznego moŝe doprowadzić do uzyskania fałszywych wyników. W interpretacji naleŝy brać pod uwagę wyłącznie nasilenie odczynu błonowego. 7. Barwione preparaty kontrolne naleŝy stosować wyłącznie w celu weryfikacji wyników serii odczynów, a nie w celu oceny odczynu w skrawkach tkankowych. 8. MoŜliwe jest sporadyczne występowanie silnego (3+) odczynu ogniskowego. MoŜe to być efektem nierównomiernego utrwalenia i/lub przetwarzania tkanki. Zaleca się wykonanie odczynu drugiego bloczka tkanki z tej samej próbki. 9. Nie zweryfikowano uŝycia testu HercepTest do próbek utrwalanych w środkach innych niŝ obojętny roztwór buforowanej formaliny i płyn Bouina. 10. Komórki prawidłowego nabłonka sutka powinny dawać odczyn o intensywności od 0 do 1+. W razie zaobserwowania w prawidłowym nabłonku odczynu silniejszego niŝ 1+ naleŝy powtórzyć test. Uwaga: prawidłowy nabłonek migdałków i przełyku moŝe dawać odczyn o intensywności dochodzącej do 2+. Charakterystyka przebiegu testu - sutek Dodatkowe informacje Test do badań klinicznych (CTA, ang. clinical trial assay) uŝywany do kwalifikacji pacjentów do badań nad lekiem Herceptin był przeznaczony do badań naukowych i nie jest juŝ dostępny. Test HercepTest opracowano jako porównywalny test alternatywny w stosunku do testu uŝywanego w badaniach klinicznych. Bezpieczeństwo i skuteczność leku Herceptin badano w randomizowanym kontrolowanym badaniu klinicznym oraz w badaniu otwartym (zob. ulotka dołączona do opakowania leku Herceptin ). U wszystkich pacjentów wybranych do badań klinicznych leku Herceptin test CTA zastosowany w laboratorium centralnym wykazał nadmierną ekspresję białka HER2. Pacjentki zostały zakwalifikowane do leczenia preparatem Herceptin, jeŝeli ich guz wykazywał poziom nadekspresji białka HER2 2+ lub 3+ (w oparciu o skalę 0-3+, gdzie 3+ stanowi najwyŝszy wynik). ( ) P04454PL_01/K / s. 22/56

23 Rak sutka Analiza podgrup wyników tych badań nasuwa wniosek, Ŝe u pacjentów, których tkanki dają silnie dodatni (3+) wynik w teście na nadmierną ekspresję białka HER2, stosowanie leku Herceptin moŝe odnieść lepszy skutek niŝ u pacjentów, których tkanki dają wynik słabo dodatni (2+). Stopień nadmiernej ekspresji białka HER2 jest potencjalnie waŝnym wskaźnikiem pozwalającym na przewidzenie skuteczności leczenia lekiem Herceptin. PoniewaŜ Ŝadnego z pacjentów uczestniczących w badaniach leku Herceptin nie zakwalifikowano do tych badań na podstawie wyniku testu HercepTest, nie jest znana korelacja między wynikami dodatnimi a prawdopodobieństwem klinicznej skuteczności leczenia lekiem Herceptin. Badania porównawcze W celu określenia charakterystyki testu HercepTest przeprowadzono dwa badania. 1) Porównanie z testem badania klinicznego (CTA) 2) Dokładność w porównaniu z pięcioma dodatkowymi testami. Porównanie z testem uŝywanym w badaniach klinicznych (CTA) HercepTest porównywano z testem uŝywanym do identyfikacji pacjentów kwalifikujących się do leczenia lekiem Herceptin. W porównaniu uŝyto 274 HER2-dodatnich (2+ lub 3+) próbek tkanki raka sutka oraz identycznej liczby próbek HER2-ujemnych. W Tabeli 4 przedstawiono wyniki w macierzy 2 x 2, przy czym wyniki 0 i 1+ uznano za ujemne, a 2+ i 3+ uznano za dodatnie. Tabela 4. Zgodność 2 x 2 testu HercepTest z Testem Badania Klinicznego (liczba próbek). CTA: test uŝywany w badaniach klinicznych Dodatni Razem Razem HercepTest Dodatni Ujemny Razem Zgodność: 79%, przy 95-procentowym przedziale ufności (76 82%). Ogólna zgodność par wyników testu HercepTest i CTA wynosiła 79% (431/548), przy 95-procentowym dwustronnym przedziale ufności 76 82%. W dwudziestu jeden procent (21%) testów badane metody dały wyniki rozbieŝne. Wyniki testu HercepTest są podawane w skali 0-3+ i interpretowane jako ujemne dla nadekspresji białka HER2 przy intensywności barwienia 0 i 1+), słabo dodatnie przy intensywności barwienia 2+) i silnie dodatnie przy intensywności barwienia 3+). Tabela 5. Zgodność 3 x 3 testu HercepTest i Testu Badania Klinicznego. CTA: test uŝywany w badaniach klinicznych Razem HercepTest Razem ( ) P04454PL_01/K / s. 23/56

24 Rak sutka Ta prezentacja 3 x 3 zgodności badania wskazuje, Ŝe istnieje wysokie prawdopodobieństwo, Ŝe odczyt wyniku 3+ w teście HercepTest byłby zgodny z dodatnim wynikiem testu CTA, który spełniałby kryteria włączenia pacjentek do badania preparatu Herceptin (2+ lub 3+). Wyniki 2+ w teście HercepTest nie były równie dobrze skorelowane z wynikami testu badawczego. Około 42% (53/126) wyników w teście HercepTest 2+ odpowiadało ujemnym wynikom testu badawczego (0 1+), które nie spełniają kryteriów włączenia do badań klinicznych leku Herceptin. Dokładność HercepTest testowano równieŝ na 2 szkiełkach mikroskopowych zawierających zatopione w parafinie skrawki tkankowe z 168 nowotworów sutka. Nowotwory te przebadano wcześniej pięcioma róŝnymi metodami w celu określenia amplifikacji genu GER2 i nadmiernej ekspresji białka HER2, w tym wewnętrznie metodą Southern Blot, metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w celu amplifikacji DNA, poprzez analizę RNA metodą Northern Blot, metodą Western Blot oraz metodą immunocytochemiczną (ICC) na skrawkach mroŝakowych (29). Odpowiednie wyniki przedstawiono w Tabeli 6. Tabela 6. Porównanie testu HercepTest z łącznymi wynikami (OE) pochodzącymi z testów amplifikacji genu i nadekspresji białka HER2. Referencyjna klasyfikacja OE + - Razem HercepTest Razem Zgodność wyników dodatnich: 43/69 = 62% Zgodność wyników ujemnych: 99/99 = 100% Wyniki wskazują na zgodność na poziomie 85% (142/168) (przy 95-procentowym przedziale ufności 78-89%) między odczynami dodatnimi (2+ i 3+) a ujemnymi (0 i 1+) w teście HercepTest. śadna z próbek dająca wynik ujemny w testach prowadzonych 5 róŝnymi metodami nie dała wyniku dodatniego w teście HercepTest, natomiast w łącznych wynikach 5 róŝnych metod więcej jest przypadków dodatnich. Powtarzalność Odtwarzalność wewnątrz testu: Powtarzalność w ramach jednej serii odczynów testowano w jednym laboratorium na 5 próbkach dających odczyny immunocytochemiczne o róŝnym nasileniu. KaŜda próbka była badana trzykrotnie w randomizowanej próbie ślepej. Procedurę zastosowano podczas barwienia ręcznego oraz ponownie barwienia na automatach. Dla wszystkich próbek uzyskano 100% powtarzalność wyników. Odtwarzalność pomiędzy testami: Powtarzalność między seriami odczynów testowano przez 4 dni w trzech laboratoriach na 5 próbkach dających odczyty immunocytochemiczne o róŝnym nasileniu. Przeprowadzono randomizowaną próbę ślepą, w której odczyny wykonywane były techniką automatyczną. Ponadto jedno laboratorium powtórzyło tę procedurę przy uŝyciu metody ręcznej. Zaobserwowano doskonałą odtwarzalność w zakresie wyników dodatnich w stosunku do wyników ujemnych (0 i 1+ wobec 2+ i 3+), z wyjątkiem dwóch próbek w jednym laboratorium stosującym metodę automatyczną, gdzie wynik róŝnił się pomiędzy 1+ a 2+. Dla próbek z wynikami 2+ i 3+ stwierdzono 100% powtarzalność. ( ) P04454PL_01/K / s. 24/56

25 Rak sutka Odtwarzalność pomiędzy laboratoriami: Powtarzalność między pracowniami testowano w trzech pracowniach połoŝonych w róŝnych obszarach geograficznych, przy uŝyciu 40 identycznych randomizowanych i maskowanych preparatów zawierających tkanki o róŝnych nasileniach odczynu immunocytochemicznego. ŚwieŜo przygotowane wycinki dostarczono do kaŝdego laboratorium w celu wykonania ręcznego i automatycznego barwienia oraz oceny przez patologa. WyraŜona procentowo zgodność międzylaboratoryjna pod względem rozróŝnienia między wynikami dodatnimi/ujemnymi wynosiła od 82% do 90%, przy czym za wynik ujemny uznawano odczyn o nasileniu 0 lub 1+, a za dodatni odczyn o nasileniu 2+ lub 3+. W porównaniu z wynikami uzyskanymi w laboratorium referencyjnym, które wykonywało testy w badaniach klinicznych (CTA), dla 12,5% (15/120) wyników zaszła rozbieŝność między kwalifikacją ujemną (0 lub 1+) a dodatnią (2+ lub 3+). Dodatkowo w 10% (12/120) wyników zachodziła rozbieŝność między nasileniem 2+ a 3+. Immunoreaktywność W Tabeli 7 przedstawiono zbiorcze informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest z zalecanym panelem tkanek prawidłowych. Wszystkie tkanki zostały utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie oraz wybarwione testem HercepTest zgodnie z instrukcją podaną w ulotce załączonej do opakowania. Tabela 7. Zestawienie reaktywności testu HercepTest dla tkanek normalnych. Rodzaj tkanki (liczba testowanych przypadków) Struktura wykazująca dodatni odczyn oraz rodzaj odczynu Nadnerczowa (3) Szpik kostny (3) Mózgowa/móŜdŜkowa (3) Mózgowa/mózgowa (3) Piersiowa (3) Szyjki macicy (3) OkręŜnicy (3) Przełyku (3) Sercowa (3) Nerkowa (3) Wątrobowa (3) Płucna (3) Komórek mezotelialnych (3) Jajnikowa (3) Trzustkowa (3) Gruczołu przytarczycy (3) Nerwu obwodowego (3) Przysadkowa (3) Prostaty (3) Gruczołu ślinowego (3) Mięśnia szkieletowego (3) Skórna (3) Jelita cienkiego (3) Śledziony (3) śołądkowa (3) Jąder (3) Grasicy (3) Tarczycy (3) Migdałków (3) Maciczna (3) Gruczoł sutkowy (2 tkanki z 3, natęŝenie wybarwienia +1, < 5% komórek) Komórki nabłonkowe (1 tkanka z 3, natęŝenie wybarwienia 1+, < 5% komórek, odczyn błonowy i cytoplazmatyczny, ziarnisty) Komórki nabłonkowe pęcherzyków (1 tkanka z 3, natęŝenie wybarwienia +1, < 5% komórek, odczyn błonowy i cytoplazmatyczny) Nabłonek płaski (1 tkanka z 3, natęŝenie wybarwienia +1, < 5% komórek. 2 tkanki z 3, natęŝenie wybarwienia 2+, 10 20% komórek. Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny) Tkanka endometrium (2 tkanki z 3, natęŝenie wybarwienia 1+, 30 60% komórek, odczyn cytoplazmatyczny, ziarnisty) O ile nie zaznaczono inaczej, we wszystkich tkankach stwierdzano odczyn błonowy. JeŜeli nie podano inaczej, wszystkie trzy próbki kaŝdego typu tkanek miały taką samą intensywność barwienia. ( ) P04454PL_01/K / s. 25/56

26 Rak sutka Rozwiązywanie problemów - sutek W celu uzyskania informacji o działaniach naprawczych naleŝy zapoznać się z wymienionym wcześniej podręcznikiem firmy Dako (19) lub skontaktować z Działem Pomocy Technicznej firmy Dako, aby poinformować o nietypowym wybarwieniu. Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. barwienia szkiełek 1a. Odczynniki nie zostały uŝyte w prawidłowej kolejności 1a. Sprawdzić stosowanie odczynników 2. Słabe barwienie szkiełek 1b. Azydek sodu w Wash Solution 1c. Nadmierne ogrzewanie skrawków tkankowych zatopionych na szkiełkach przed odparafinowaniem i cieplnym odmaskowaniem antygenu moŝe doprowadzić do widocznej utraty immunoreaktywności HER2. 2a. Nieodpowiednie odzyskiwanie epitopu 2b. Nieodpowiednie czasy inkubacji odczynników 2c. Zastosowana nieodpowiednia metoda utrwalania 2d. Nadmierne ogrzewanie skrawków tkankowych zatopionych na szkiełkach przed odparafinowaniem i cieplnym odmaskowaniem antygenu moŝe doprowadzić do widocznej utraty immunoreaktywności HER2 2e. Naniesiono niedostateczną objętość odczynnika. 1b. Zastosować świeŝy Wash Buffer dostarczony w zestawie 1c. Pozostawić na powietrzu skrawki tkankowe w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin lub do całkowitego wysuszenia. Lub suszyć w temperaturze 37 C przez noc albo suszyć w temperaturze 60 C przez maksymalnie jedną godzinę. Suszenie skrawków tkankowych w podwyŝszonej temperaturze moŝna przeprowadzać wyłącznie w piecu z regulacją temperatury i równomiernym rozkładem ciepła (17). 2a. Sprawdzić, czy Epitope Retrieval Solution osiąga temperaturę C przez pełne 40 minut oraz czy jest pozostawiony do ostygnięcia przez dalsze 20 minut. 2b. Sprawdzić instrukcje odnośnie procedury barwienia 2c. Zapewnić, aby tkanka pacjentki nie była nadmiernie utrwalona, ani nie został uŝyty alternatywny utrwalacz 2d. Pozostawić na powietrzu skrawki tkankowe w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin lub do całkowitego wysuszenia. Lub suszyć w temperaturze 37 C przez noc albo suszyć w temperaturze 60 C przez maksymalnie jedną godzinę. Suszenie skrawków tkankowych w podwyŝszonej temperaturze moŝna przeprowadzać wyłącznie w piecu z regulacją temperatury i równomiernym rozkładem ciepła (17). 2e. Sprawdzić naniesioną objętość odczynnika. ( ) P04454PL_01/K / s. 26/56

27 Rak sutka Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 3. Nadmierne barwienie tła szkiełek 3a. Parafina nie została całkowicie usunięta 3a. UŜyć świeŝych roztworów czyszczących oraz postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w Części B.1 4. Tkanka odkleja się od szkiełka 5. Nadmiernie silne swoiste barwienie 3b. Do zamontowania skrawków do szkiełek uŝyto skrobiowych substancji dodatkowych 3c. Szkiełka nie zostały dokładnie wypłukane 3d. Skrawki wyschły podczas procedury barwienia 3e. Zastosowana nieodpowiednia metoda utrwalania 3f. Nieswoiste wiązanie odczynników do tkanki 4a. Zastosowano nieprawidłowe szkiełka 5a. Zastosowana nieodpowiednia metoda utrwalania 5b. Zastosowanie nieprawidłowego źródła ciepła dla odzyskiwania epitopu np. wytwornica pary, kuchenka mikrofalowa lub autoklaw 5c. Zbyt długie okresy inkubacji odczynników 5d. Zastosowanie nieprawidłowego roztworu przemywającego 3b. Unikać stosowania zawierających skrobię dodatków zwiększających przyczepność skrawków do szkiełek mikroskopowych. Wiele substancji dodatkowych jest immunoreaktywnych. 3c. Zastosować świeŝy roztwór dla kąpieli buforowej i tryskawek. 3d. Zastosować komorę wilgotną. Jednorazowo wycierać tylko trzy do czterech szkiełek przed nałoŝeniem odczynnika. 3e. Stosować tylko zatwierdzone środki utrwalające. Alternatywny utrwalacz moŝe powodować nadmierne barwienie tła. 3f. Sprawdzić metodę utrwalania próbki i obecność martwicy 4a. Stosować silanizowane szkiełka, takie jak Dako Silanized Slides, Nr kat. S3003, szkiełka pokryte SuperFrost Plus lub poli-l-lizyną 5a Zapewnić, aby były stosowane tylko odpowiednie utrwalacze i metody utrwalania 5b. Zapewnić, aby tylko łaźnia wodna była uŝywana podczas etapu odzyskiwania epitopu. 5c. Sprawdzić instrukcje odnośnie procedury barwienia 5d. Stosować wyłącznie Wash Buffer zalecany dla testu ( ) P04454PL_01/K / s. 27/56

28 Rak sutka Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 6. Słabe barwienie Szkiełka kontrolnego z linią komórek 1+ 6a. Nieprawidłowo wykonana procedura odzyskania epitopu 6a. Zanurzyć szkiełka we wstępnie podgrzanym roztworze Epitope Retrieval Solution. Doprowadzić temperaturę Epitope Retrieval Solution ponownie do C i podgrzewać przez pełne 40 minut. 6b. reakcji z Substrate- Chromogen Solution (DAB) 6b. Zapewnić, aby zastosowano pełne 10 minut inkubacji. Zapewnić, aby tylko jedna kropla DAB Chromogen została dodana do 1 ml DAB Buffered Substrate 7. Po ogrzaniu roztworu Epitope Retrieval Solution pojawia się zmętnienie. 8 Przy przechowywaniu (przed ogrzaniem) roztwór Epitope Retrieval Solution jest mętny. 6c. Degeneracja szkiełka kontrolnego 7. Po ogrzaniu roztworu pojawia się zmętnienie. 8. Roztwór był nieprawidłowo przechowywany lub jest przeterminowany. 6c. Sprawdzić datę waŝności i warunki przechowywania zestawu podane na zewnętrznej części opakowania 7. Jest to normalne zjawisko, które nie ma wpływu na wynik barwienia. 8. Sprawdzić datę waŝności i warunki przechowywania zestawu podane na zewnątrz opakowania. Usunąć roztwór Epitope Retrieval Solution. UWAGA: Jeśli problemu nie moŝna przypisać Ŝadnemu z powyŝszych powodów lub, gdy sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŝy skontaktować się z Serwisem Technicznym firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŝna znaleźć we wspomnianym wcześniej podręczniku firmy Dako (19) (dostępny w firmie Dako), Atlasie Immunohistologii (30) oraz Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04454PL_01/K / s. 28/56

29 Rak Ŝołądka Streszczenie i wyjaśnienia - Ŝołądek Dodatkowe informacje Ludzki gen HER2 (znany takŝe jako ERBB2 lub NEU) koduje białko oznaczane najczęściej symbolem HER2 lub p185 HER2. Białko HER2 to transbłonowe białko receptorowe o aktywności kinazy tyrozynowej, wykazujące homologię do receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR lub HER1) (1-8). Białko HER2 jest składnikiem prawidłowym, wykazującym ekspresję w róŝnych typach komórek nabłonkowych (8). Nadmierną ekspresję białka HER2 i amplifikację genu HER2 raka Ŝołądka wykazano w licznych badaniach. Wynik dodatni HER2 wykryto w ok. 20 % pacjentów w zakresie IHC lub FISH (32). Przedkliniczne badania in vitro i in vivo wykazały skuteczność preparatu trastuzumab (Herceptin ) na przykładzie róŝnych modeli raka Ŝołądka, co doprowadziło do rozpoczęcia badań klinicznych (32-36). W fazie III badania BO18255 zwanym ToGA, pacjentów z dodatnim HER2 z nieoperacyjnym miejscowo zaawansowanym gruczolakorakiem Ŝołądka i/lub przerzutowym gruczolakorakiem Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego randomizowano do przyjmowania preparatu 5-FU lub capecitabine i cisplatin oddzielnie lub w połączeniu z preparatem trastuzumab. Zaobserwowano statystyczny znaczny wzrost okresu przeŝycia (OS) u pacjentów biorących udział w leczeniu preparatem trastuzumab i chemioterapią (37, 38). Trastuzumab to uczłowieczone przeciwciało monoklonalne (10), które wiąŝe się z białkiem HER2, wykazując do niego silne powinowactwo. W badaniach in vitro i in vivo stwierdzono, Ŝe przeciwciało to blokuje rozrost ludzkich komórek nowotworowych wykazujących nadmierną ekspresję białka HER2 (33-36). Właściwości Badaniu przesiewowemu pod kątem statusu HER2, w celu włączenia do badania ToGA poddano 3803 pacjentów. W tym badaniu zaobserwowano nadmierną ekspresję białka HER2 na przykładzie metody IHC (HercepTest, Dako) i aplikację genu HER2 na przykładzie metody FISH (HER2 FISH pharmdx, Dako). WaŜne wyniki testów uzyskano dla 3665 próbek w testach IHC lub FISH i dla 3280 próbek w obu testach. Wyniki badania ToGA wykazały, Ŝe 22,1% pacjentów z zaawansowanym rakiem Ŝołądka było HER2- pozytywnych przy uŝyciu metody IHC lub FISH, zgodnie z definicją kryteriów selekcji ToGA HER2 (38). Więcej informacji na temat uŝycia preparatu HercepTest przy wspomaganiu badania pacjentów, u których rozwaŝane jest podjęcie leczenia lekiem trastuzumab moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania Herceptin ). Zasada testu - Ŝołądek Test HercepTest zawiera odczynniki konieczne do wykonania dwuetapowej procedury barwienia immunocytochemicznego dla rutynowo przygotowanych próbek zanurzonych w parafinie. W omawianym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał króliczych z ludzkim białkiem HER2 następuje reakcja z gotowym barwnym odczynnikiem Visualization Reagent produkowanym w oparciu o technologię stosowaną do wytwarzania dekstranu. W skład odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał kozich skierowanych przeciw immunoglobulinom króliczym oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym szkieletem polimerowym dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego stosowania przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Reakcję krzyŝową odczynnika Visualization Reagent z immunoglobulinami ludzkimi i płodową surowicą cielęcą wyeliminowano poprzez absorpcję w fazie stałej. Po dodaniu chromogenu następuje reakcja enzymatyczna, której efektem jest widoczny produkt, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie moŝna wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji ocenia się w mikroskopii świetlnej. Zestaw zawiera szkiełka kontrolne zawierające trzy utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka, dające odczyny o nasileniu odpowiednio 0, 1+ i 3+. SłuŜą one do weryfikacji serii odczynów. Nasilenie odczynu tych linii komórkowych jest skorelowane z liczbą receptorów przypadających na komórkę. Test HercepTest Nr kat. K5204 jest odpowiedni zarówno dla testów barwienia wykonywanych ręcznie jak i na automatach przy uŝyciu Autostainera. ( ) P04454PL_01/K / s. 29/56

30 Rak Ŝołądka Odczynniki - Ŝołądek Dostarczane materiały Wyszczególnione poniŝej materiały wystarczają na wykonanie 35 testów (35 szkiełek mikroskopowych inkubowanych z odczynnikiem przeciwciałem pierwotnym przeciwko białku HER2 oraz 35 szkiełek inkubowanych z odpowiednim odczynnikiem do kontroli ujemnej). Liczba testów opiera się na zastosowaniu 3 kropli (100 µl) na sekcję tkanki fiolek z numerem 1, 2, 3 i 4 oraz roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB). Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na wykonanie co najwyŝej 5 pojedynczych serii oznaczeń. Fiolka nr Ilość 1 1 x 7 ml 2 1 x 3,5 ml 3 1 x 7 ml 4 1 x 3,5 ml 5 1 x 10 ml 6 1 x 0,5 ml Opis Peroxidase-Blocking Reagent: 3% roztwór nadtlenku wodoru z dodatkiem azydku sodu (NaN 3 ) w stęŝeniu 15 mmol/l. Rabbit Anti-Human HER2 Protein: Gotowe do uŝycia przeciwciała wyizolowane ze względu na powinowactwo. Dostarczany w buforze Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, ph 7,2, z dodatkiem białka stabilizującego. Immunogen: syntetyczny fragment C-końcowy (część wewnątrzcytoplazmatyczna) białka HER2 sprzęŝony z KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin). Swoistość: białko HER2. Metoda oczyszczania: przeciwciała są izolowane ze względu na powinowactwo przy uŝyciu immobilizowanego peptydu białka HER2. Visualization Reagent: Polimer dekstranowy skoniugowany z peroksydazą chrzanową oraz przeciwciała kozie izolowane ze względu na powinowactwo, skierowane przeciw antygenom króliczym. Dostarczany w buforze Tris/HCl zawierającym białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny. Negative Control Reagent: Frakcja immunoglobulinowa prawidłowej surowicy króliczej rozcieńczona do takiego samego stęŝenia białek, jak przeciwciało przeciwko białku HER2. Dostarczany w buforze Tris/HCl 0,05 mol/l, NaCl 0,1 mol/l, NaN 3 15 mmol/l, ph 7,2, z dodatkiem białka stabilizującego. DAB Buffered Substrate: Roztwór buforowy substratu, ph 7,5, zawierający roztwór nadtlenku wodoru o stęŝeniu < 0,1 %, substancje stabilizujące, substancje wzbogacające i środek przeciwbakteryjny. DAB Chromogen: Roztwór tetracholorowodorku 3,3 -diaminobenzydyny o stęŝeniu 5% w roztworze chromogenu ( ) P04454PL_01/K / s. 30/56

31 Rak Ŝołądka 7 1 x 500 ml 8 1 x 250 ml 5 szkiełek Epitope Retrieval Solution (Containing Detergent) (10x): Roztwór cytrynianowy o stęŝeniu 0,1 mol/l z dodatkiem środka przeciwbakteryjnego. Wash Buffer (10x): Bufor Tris/HCl z detergentem i środkiem przeciwbakteryjnym. Szkiełka kontrolne: KaŜdy preparat zawiera skrawki trzech utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie linii komórkowych raka sutka wykazujących róŝne poziomy ekspresji białka HER2: MDA-231 (0), MDA-175 (1+) i SK-BR-3 (3+). Preparaty do kontroli jakości zostały poddane obróbce cieplnej w celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek. Jakakolwiek dodatkowa obróbka cieplna preparatów do kontroli jakości przeprowadzona w celu poprawy przylegania skrawków do szkiełek moŝe negatywnie wpłynąć na wyniki odczynu. UWAGA: Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały przygotowane specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z instrukcją nie naleŝy uŝywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, zamiast którego moŝna uŝyć Dako Nr kat. S3006. Materiały wymagane, lecz niedostarczone Waciki Wodorotlenek amonu, 15 mol/l rozcieńczony do 37 mmol/l Barwnik kontrastowy: Hematoksylina, taka jak rozcieńczana wodą Mayer's Hematoxylin, Dako Nr kat. S3301 (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, A.4) Szkiełka nakrywkowe Marker, taki jak Dako Pen, Nr kat. S2002 Woda destylowana lub dejonizowana (Washing Water) Suszarka umoŝliwiająca utrzymanie temperatury 60 C lub niŝszej Etanol absolutny i roztwór o stęŝeniu 95% Komora wilgotna (opcjonalna) Mikroskop optyczny (powiększenie obiektywu 4 40x) Środek do montowania, taki jak Dako Faramount, Nr kat. S3025 lub Glycergel Nr kat. C0563 Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej (zobacz część Kontrola jakości) Szkiełka, SuperFrost Plus, szkiełka opłaszczone poli-l-lizyną lub silanizowane szkiełka Dako Silanized Slides Nr kat. S3003 (zobacz Przygotowanie próbek) Słoje lub łaźnie barwiące Stoper (odpowiedni do wyznaczenia 2 40-minutowych okresów) Tryskawki Łaźnia wodna z przykrywką (odpowiednia do utrzymywania temperatury Epitope Retrieval Solution C) Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu ( ) P04454PL_01/K / s. 31/56

32 Przechowywanie - Ŝołądek Przechowywać w temperaturze 2 8 C. Rak Ŝołądka Nie uŝywać zestawu po dacie waŝności ostemplowanej na zewnętrznej stronie opakowania. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane na wkładce informacyjnej do opakowania, UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość (14a,14b). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe równieŝ preparaty do kontroli jakości powinny być przechowywane w temperaturze 2 8 C. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego teŝ naleŝy wykonywać Kontrole Dodatnie i Ujemne jednocześnie z badaniem próbki pacjentki. Jeśli zauwaŝone zostanie nieoczekiwane zabarwienie, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych i podejrzewa się, Ŝe przyczyną moŝe być HercepTest, naleŝy niezwłocznie skontaktować się z serwisem technicznym firmy Dako. Przygotowanie próbek - Ŝołądek Próbki gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, pochodzące z biopsji, wycinki lub resekcje naleŝy poddać obróbce, aby utrwalić tkanki do barwienia immunocytochemicznego. Do wszystkich preparatów naleŝy stosować standardowe metody przeprowadzania tkanek (15). W przypadku badania małych preparatów biopsyjnych naleŝy upewnić się, czy do oceny IHC zachowano morfologię guza i obecność wystarczającej liczby komórek guza. Przy analizie HercepTest preparatów biopsyjnych, do uzyskania wiarygodnych danych na temat statusu HER2 wyniku naleŝy przeanalizować kilka (7-8) preparatów, pobranych z róŝnych regionów guza. Skrawki zatapiane w parafinie Do uŝytku nadają się tkanki utrwalone w obojętnie buforowanej formalinie i zatopione w parafinie. Próbki naleŝy np. pociąć na bloczki o grubości od 3 do 4 mm i utrwalać przez godziny w obojętnie zbuforowanej formalinie. Preparaty biopsyjne utrwalano przez 6 8 godzin w badaniu ToGA (opis badania w punkcie (37)). Następnie tkanki zostają odwodnione w szeregu alkoholi i w ksylenie, a następnie przesiąknięte stopioną parafiną utrzymywaną w temperaturze nie wyŝszej niŝ 60 C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki z eksp resją białka HER2 mogą być przechowywane przez nieograniczony czas przed podzieleniem na skrawki i zamontowaniem na szkiełka, pod warunkiem, Ŝe są przechowywane w chłodnym miejscu (15 25 C) (15, 16). W Stanach Zjednoczonych dokument Clinical Laboratory Improvement Act of 1988 (Zmiany w zasadach postępowania w laboratoriach klinicznych, 42 CFR (b)) nakłada na uŝytkowników wymóg przechowywania wybarwionych szkiełek przez co najmniej 10 lat od daty badania i zachowania bloczków próbek przez co najmniej dwa lata od daty badania (16). Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o wymiarach 4 5 µm, zatopić w szkiełkach i suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin (lub do wysuszenia) albo w temperaturze 37 C przez całą noc lub w temperaturze 60 C w ciągu jednej godziny. PRZESTROGA: Nadmierne ogrzewanie przez ponad jedną godzinę w temperaturze 60 C moŝe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2 związanej z odczynem błonowym (17). Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe zatopione na szkiełkach (SuperFrost Plus, Poly-L-lysine lub szkiełka silanizowane) powinny zostać poddane barwieniu w ciągu 4 6 tygodni od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C) (18). Szkiełka wymagane do oceny białka H ER2 i zweryfikowania obecności guza naleŝy przygotować w tym samym czasie. Zaleca się minimum 5 szkiełek, 1 szkiełko dla obecności guza, 2 szkiełka dla oceny białka HER2 (1 dla inkubacji z fiolką nr 2 i 1 dla inkubacji z fiolką nr 4) oraz 2 szkiełka zapasowe. Zastosowanie HercepTest na tkankach odwapnionych nie zostało zatwierdzone i nie jest zalecane. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowywania próbek przedstawiono w podręczniku Dako Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods (19), a takŝe odsyłacze 15 i 16. ( ) P04454PL_01/K / s. 32/56

33 Rak Ŝołądka Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu Dla uzyskania optymalnych wyników testu naleŝy zastosować specyficzną metodę odzyskiwania epitopu, polegającą na gotowaniu w 10 mmol/l buforu cytrynianowego. Roztwór do odmaskowania antygenu wchodzi w skład zestawu HercepTest. Metoda obejmuje podgrzewanie skrawków tkanek zamontowanych na szkiełkach, które zostają zanurzone w buforze cytrynianowym 10 mmol/l (20) w skalibrowanej łaźni wodnej utrzymującej Epitope Retrieval Solution w wymaganej temperaturze (95 99 C). Laboratoria znajdujące się na duŝych wysokościach powinny określić najlepszą metodę utrzymania wymaganej temperatury łaźni wodnej. Odzyskanie epitopu musi zostać wykonane w łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one odtwarzalnych wyników. Niezwłocznie po odzyskaniu epitopu naleŝy rozpocząć procedurę barwienia. Odstępstwa od opisywanej procedury mogą mieć wpływ na wyniki. Środki ostroŝności - Ŝołądek 1. Do stosowania w diagnostyce in vitro. 2. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 3. Fiolka 1, Peroxidase-Blocking Reagent, zawiera 3% nadtlenek wodoru. Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie. 4. Fiolka 6, DAB Chromogen, zawiera 5-<10% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride (czterochlorek dwufenylo-3,3, 4,4 -tetryloczteroamonowego) i jest oznaczony: Niebezpieczeństwo H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zasięgnąć porady/zgłosić się pod opiekę lekarza. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Za ogólną regułę naleŝy przyjąć, Ŝe osoby poniŝej 18 lat nie mogą pracować z tym produktem. NaleŜy poinformować uŝytkowników testu o prawidłowej procedurze pracy, niebezpiecznych własnościach produktu oraz o niezbędnych instrukcjach BHP. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa (SDS). 5. Fiolka 8, Wash Buffer, zawiera 5-<10% 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride i 0.1-<0.2% 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane. MoŜe wywoływać reakcje alergiczne. Produkt Wash Buffer (10x) jest oznaczony: Uwaga H319 P280 P264 P305 + P351 + P338 Działa draŝniąco na oczy. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. 6. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. ( ) P04454PL_01/K / s. 33/56

34 Rak Ŝołądka Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji (21, 22). 7. Fiolki 2, 3 i 4 zawierają materiał pochodzenia zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 8. Preparaty kontrolne i próbki (przed i po utrwaleniu) oraz wszystkie przyrządy i materiały mające z nimi kontakt, powinny być traktowane jako mogące przenosić zakaŝenia i likwidowane z zachowaniem odpowiednich środków ostroŝności (23). Nigdy nie pipetować odczynników ustami i unikać naraŝania skóry i błon śluzowych na kontakt z odczynnikami i próbkami. W razie kontaktu odczynników z wraŝliwymi okolicami skóry naleŝy je spłukać obfitą ilością wody. 9. Zminimalizować skaŝenie mikrobiologiczne odczynników, aby uniknąć nieswoistego barwienia. 10. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasów inkubacji, temperatur lub metod moŝe powodować błędne wyniki badania. Nadmierne suszenie w temperaturze 60 C przez ponad jedną godzinę moŝe spowodować znaczny zanik lub brak immunoreaktywności HER2 związanej z odczynem błonowym (17). 11. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŝe powodować utratę odczynu antygenów. 12. Wszystkie odczynniki, w tym Epitope Retrival Solution i Wash Buffer zostały przygotowane specjalnie do wykorzystania w tym teście. W celu wykonania testu zgodnie z instrukcją nie naleŝy uŝywać Ŝadnych zamienników z wyjątkiem Wash Buffer, posiadającego Nr kat. S Wystawienie Visualization Reagent i DAB Chromogenu na działanie silnego światła moŝe mieć na nie niekorzystny wpływ. Nie naleŝy przechowywać składników systemu ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 14. Aby uniknąć kontaktu z oczami i skórą, naleŝy uŝywać odpowiedniego osobistego wyposaŝenia ochronnego. Dodatkowe informacje znajdują się w Karcie Charakterystyki Bezpieczeństwa (SDS). 15. Pozostałości parafiny mogą być przyczyną wyników fałszywie ujemnych. 16. Do precyzyjnej interpretacji metodą HercepTest barwienia próbek gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, pochodzących z biopsji, zaleca się skupisko co najmniej 5 wybarwionych komórek guza. Skupisko przynajmniej 5 wybarwionych komórek guza składa się z 5 połączonych, wybarwionych komórek guza. 17. Ze względu na heterogenną naturę preparatów biopsyjnych raka Ŝołądka waŝne jest, aby przeprowadzić badanie HER2 IHC na wielu skrawkach (7-8) materiału z róŝnych obszarów guza dla uzyskania wiarygodnych wyników. 18. UŜycie objętości odczynnika innych niŝ zalecane moŝe doprowadzić do widocznej utraty immunoreaktywności HER2. JeŜeli obwiedziony skrawek tkanki nie zostanie pokryty 3 kroplami (100 µl) odczynnika, naleŝy dodać kolejne 3 krople. 19. Zaleca się zbadanie więcej niŝ jednego bloku tkankowego wycinków raka Ŝołądka w przypadku, gdy próbka wykazuje wysoki poziom heterogenności (41). ( ) P04454PL_01/K / s. 34/56

35 Rak Ŝołądka SPOSÓB UśYTKOWANIA - Ŝołądek A. Przygotowanie odczynników Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia: A.1 Epitope Retrieval Solution Dla planowanej procedury barwienia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 7 (Epitope Retrieval Solution 10x) w stosunku 1:10 uŝywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony roztwór nie nadaje się do uŝycia. A.2 Bufor płuczący Dla etapów przemycia rozcieńczyć odpowiednią ilość fiolki 8 (Wash Buffer 10x) w stosunku 1:10 uŝywając wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystany rozcieńczony bufor moŝna przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia bufor nie nadaje się do uŝycia. Wodę destylowaną lub dejonizowaną moŝna uŝyć do płukania po odczynniku Peroxidase-Blocking Reagent, Substrate-Chromogen Solution i inkubacji hematoksykliny. Wszystkie pozostałe etapy wymagają uŝycia Wash Buffer. A.3 Roztwór substrat-chromogen (DAB) Następująca procedura daje 1 ml roztworu Substrate-Chromogen Solution. KaŜdy 1 ml jednakowej objętości roztworu jest wystarczający dla dziesięciu skrawków tkanek. Etap 1: Przenieść do probówki 1 ml zbuforowanego substratu DAB z fiolki 5. Etap 2: Dodać jedną kroplę (25 30 µl) Chromogenu DAB z fiolki 6. Wymieszać i nałoŝyć na skrawki tkanek za pomocą pipety. Przygotowany Substrate-Chromogen Solution (DAB) jest stabilny przez około 5 dni, jeśli jest przechowywany w temperaturze 2 8 C. Przed uŝyciem roztwór naleŝy dokładnie wymieszać. Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu. UWAGA: DAB Chromogen w fiolce 6 moŝe przyjmować barwę od przezroczystej po lawendowobrązową. Nie ma to wpływu na działanie produktu. NaleŜy go rozcieńczyć zgodnie ze wskazówkami podanymi w niniejszej ulotce. Dodanie nadmiernej ilości roztworu DAB Chromogen do buforu DAB Buffered Substrate spowoduje pogorszenie jakości odczynu dodatniego. A.4 Barwienie kontrastowe Barwny produkt końcowy reakcji barwienia chromogenem DAB jest nierozpuszczalny w alkoholu i wodzie. Zastosować barwienie negatywne hematoksyliną i dopasować intensywność barwienia hematoksyliny do podobnego poziomu pokazanego w atlasie HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Atlas interpretacji odczynów HercepTest - rak Ŝołądka). MoŜna uŝyć hematoksylinę rozcieńczoną alkoholem lub wodą, taką jak Dako Mayer's Hematoxylin Nr kat. S3301. Po barwieniu negatywnym hematoksyliną wykonać dokładne płukanie w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, następnie zanurzyć szkiełka z tkankami w wodzie amoniakalnej o stęŝeniu 37 mmol/l (zobacz Część B.2, etap 6). Woda amoniakalna (37 mmol/l) jest przygotowana przez zmieszanie 2,5 ml 15 mol/l (stęŝonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem wody destylowanej lub dejonizowanej. Niewykorzystana woda amoniakalna o stęŝeniu 37 mmol/l moŝe być przechowywana w temperaturze pokojowej (20 25 C) w szczelnie zamkniętej butelce do 12 miesięcy. ( ) P04454PL_01/K / s. 35/56

36 Rak Ŝołądka A.5 Środek do zatapiania Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest jednak równieŝ zatapianie wodne. Do montowania wodnego zaleca się Dako Faramount Aqueous Mounting Medium, gotowe do uŝycia, Nr kat. S3025 lub Glycergel Mounting Medium Nr kat. C0563. Doprowadzić Glycergel do postaci płynnej przez podgrzewanie do około 40 (±5) C przed uŝyciem. B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury Przed uŝyciem naleŝy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się ze wszystkimi składnikami (patrz Środki ostroŝności). Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Podobnie, wszystkie inkubacje naleŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Zakryć szkiełka wystawione na działanie przeciągów. Jeśli stosowane są wydłuŝone inkubacje umieścić tkanki w wilgotnym środowisku. Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po inkubacji pierwszego przeciwciała (etap 3) szkiełka moŝna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny, w temperaturze pokojowej (20 25 C) bez wpływu na jakość barwienia. Usunięcie parafiny i ponowne uwodnienie: Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŝy odparafinować preparaty w celu usunięcia środka zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny. Pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie odczynu nieswoistego. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Umieścić szkiełka w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 2. Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar płynu i umieścić je w bezwodnym etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić szkiełka w 95% etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 4. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w destylowanej lub dejonizowanej wodzie na minimum 30 sekund. Rozpocząć procedurę barwienia zgodnie z instrukcją podana w Części B 2, etap 1, Odzyskanie epitopu. Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŝy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu. Zamiast ksylenu moŝna stosować zamienniki toluenu lub ksylenu np. Histoclear. UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. RóŜnice w metodach przetwarzania tkanek oraz procedurach technicznych stosowanych w laboratorium uŝytkownika mogą spowodować, Ŝe wyniki testu nie będą waŝną podstawą wyboru pacjentów do terapii lekiem Herceptin. ( ) P04454PL_01/K / s. 36/56

37 Rak Ŝołądka B.2 Wykonanie odczynu Wykonana w temperaturze pokojowej, C. Etap 1: Odmaskowanie antygenu Pojemniki do barwienia, np. naczynka Coplina, napełnić rozcieńczonym Epitope Retrieval Solution (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.1). Naczynia do barwienia zawierające Epitope Retrieval Solution umieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i Epitope Retrieval Solution do C. Po ogrzaniu roztworu Epitope Retrieval Solution pojawia się zmętnienie. Zakryć naczynia wieczkami, aby zapewnić stabilną temperaturę i uniknąć parowania. Zanurzyć pozbawione parafiny skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze odzyskiwania epitopu w naczyniach do barwienia. PONOWNIE DOPROWADZIĆ TEMPERATURĘ ŁAŹNI WODNEJ I EPITOPE RETRIEVAL SOLUTION DO C. Inkubować w temperaturze C przez 40 (±1) minut. Wyjąć całe naczynie ze szkiełkami z łaźni wodnej. Pozostawić szkiełka do ostygnięcia w Epitope Retrieval Solution na 20 (±1) minut w temperaturze pokojowej. Zdekantować roztwór Epitope Retrieval Solution i wypłukać skrawki w rozcieńczonym buforze Wash Buffer (zobacz INSTRUKCJE UśYCIA, Część A.2). Dla uzyskania optymalnych wyników po odzyskaniu epitopu i przed barwieniem naleŝy nasączyć skrawki w Wash Buffer przez 5 20 minut. UWAGA: Roztwór Epitope Retrieval Solution jest przeznaczony do jednokrotnego stosowania. Nie uŝywać ponownie. Etap 2: Peroxidase-Blocking Reagent: Strząsnąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub płatka gazy) ostroŝnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynników w określonym miejscu. Za pomocą Dako Pen obwieść skrawek tkanki. NałoŜyć 3 krople (100 µl) odczynnika Peroxidase-Blocking Reagent dla zakrycia próbki. Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną lub buforem Wash Buffer z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŝej kąpieli buforu. Etap 3: Primary Antibody lub Negative Control Reagent Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio. Pokryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µl) białka Anti-HER2 Protein lub odczynnika Negative Control Reagent. Inkubować przez 30 (±1) minut. Delikatnie przepłukać buforem Wash Buffer z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŝej kąpieli buforu. Jeśli zachodzi konieczność przerwania procedury barwienia, po wykonaniu etapu 3 szkiełka moŝna przechowywać zanurzone w buforze do jednej godziny w temperaturze pokojowej (20 25 C), bez wpływu na wykonanie barwie nia. ( ) P04454PL_01/K / s. 37/56

38 Etap 4: Visualization Reagent Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio. Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µl) odczynnika Visualization Reagent. Inkubować przez 30 (±1) minut. Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 3. Etap 5: Roztwór substrat-chromogen (DAB) Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej. Rak Ŝołądka Zakryć próbkę badaną 3 kroplami (100 µl) roztworu Substrate-Chromogen Solution (DAB). Inkubować przez 10 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną z butelki przemycia (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Zebrać odpady roztworu Substrate- Chromogen Solution (DAB) do pojemnika na odpady skaŝone w celu właściwego ich usunięcia. Etap 6: Barwienie negatywne (instrukcje podano dla hematoksyliny) Zanurz szkiełka w hematoksylinie. Inkubuj przez 2 5 minut, zaleŝnie od stęŝenia zastosowanej hematoksyliny. Delikatnie przepłukaj wodą destylowaną lub dejonizowaną. Upewnij się, Ŝe pozostałości hematoksyliny zostały usunięte. Opcjonalnie: Zanurz szkiełka 10 razy w wodzie amoniakalnej o stęŝeniu 37 mmol/l (zobacz Część A.4). Delikatnie przepłukaj szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2 5 minut. UWAGA: ZaleŜnie od czasu trwania inkubacji oraz stęŝenia uŝytej hematoksyliny barwienie negatywne spowoduje zabarwienie jądra komórkowego od jasno do ciemnoniebieskiego. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać prawidłową interpretację wyników. Etap 7: Zatapianie preparatu Zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Dopuszczalne jest jednak równieŝ zatapianie wodne. Próbki moŝna montować i zakrywać szkiełkiem nakrywkowym przy uŝyciu środka do montowania takiego, jak Dako Faramount Nr kat. S3025 lub Glycergel Nr kat. C0563. UWAGA: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić w dogodnym dla uŝytkownika momencie. Jednak, jeŝeli do nakrywania zastosowano wodny środek do zatapiania, ekspozycja na silne światło przez okres jednego tygodnia moŝe powodować zblaknięcie. Aby ograniczyć blaknięcie, naleŝy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze pokojowej (20 25 C). ( ) P04454PL_01/K / s. 38/56

39 Rak Ŝołądka Kontrola jakości - Ŝołądek Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania tkanek moŝe spowodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania dodatkowej wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŝnie od standardowych załączonych preparatów kontroli jakości Dako. W przypadku testów wykonywanych na terenie Stanów Zjednoczonych naleŝy sprawdzić wskazówki dotyczące kontroli jakości zawarte w Programie Certyfikacji dla Immunochemii College of American Pathologists (CAP), ponadto w celu uzyskania dalszych informacji naleŝy sprawdzić Zapewnienie Jakości dla Badań Immunochemicznych, Zatwierdzone Wskazówki CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for Immunochemistry, Approved Guideline (24) oraz odsyłacz (25). Tabela 8. Cel codziennej kontroli jakości Rodzaj tkanki: utrwalona i przeprowadzona identycznie jak próbki pochodzące od pacjenta Swoiste przeciwciało i drugie przeciwciało Nieswoiste przeciwciało* lub Buffer Plus takie samo przeciwciało jak uŝyte ze swoistym przeciwciałem Kontrola dodatnia: Tkanki lub komórki zawierające antygen docelowy (mogą występować w tkankach pacjenta). Idealna próba kontrolna jest tkanką wykazującą słabo dodatni odczyn i moŝliwie największą czułość na utratę właściwości przez przeciwciała lub antygeny. Kontrola wszystkich etapów badania. Weryfikacja odczynnika i procedur stosowanych do odczynu białka HER2. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Kontrola ujemna: Tkanki lub komórki z oczekiwanym ujemnym wynikiem odczynu (mogą występować w tkankach pacjenta lub dodatniej kontroli tkankowej). Detekcja niepoŝądanej reakcji krzyŝowej przeciwciał z komórkami lub strukturami komórkowymi. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Tkanka pochodząca od pacjenta. Detekcja odczynu swoistego. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Preparat kontrolny dostarczony przez Dako. Wyłącznie odczyn z preparatami kontrolnymi. * Surowica od tego samego gatunku i izotypu, co w przypadku przeciwciała pierwotnego, ale nie skierowana przeciwko temu samemu antygenowi. Do wykrywania nieswoistego wiązania przeciwciał, tzn. wiązania fragmentu Fc przeciwciała przez tkankę. Preparat kontrolny (w zestawie): KaŜdy z dostarczonych preparatów kontrolnych zawiera trzy odwirowane, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie ludzkie linie komórkowe raka sutka, dające odczyny o nasileniu 0, 1+ i 3+. W kaŝdej serii naleŝy wykonać odczyn tylko na jednym preparacie kontrolnym. Ocena linii komórkowych preparatów kontrolnych dostarczonych przez Dako pozwala ustalić waŝność serii odczynów. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Preparaty kontrolne naleŝy sporządzić ze świeŝych materiałów sekcyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych, moŝliwie szybko utrwalonych i zatopionych w sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzących od pacjenta. Wynik dodatniej kontroli potwierdza właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia. Dla wszystkich serii odczynów i dla kaŝdego rodzaju warunków badania naleŝy uwzględnić jedną dodatnią kontrolę tkankową. Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni, pozwalający na wykrywanie niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty kontrolne dostarczane z opisywanym zestawem lub preparaty przeprowadzane w sposób odmienny od próbek pochodzących od pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację działania odczynników; preparaty kontrolne nie nadają się do weryfikacji prawidłowego przygotowania tkanek. Jako idealną kontrolę tkankową naleŝy zastosować tkankę z uprzednio oznaczoną nadekspresją białka HER2 2+ gruczolakoraka Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego. ( ) P04454PL_01/K / s. 39/56

40 Rak Ŝołądka UWAGA: Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo do formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących od pacjentów. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów pochodzących od pacjentów są niewaŝne. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki dającej odczyn ujemny, w której nie występują białka HER2. Dla kaŝdej serii odczynów tkanka powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób identyczny do próbki (próbek) pochodzącej od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i identyfikacji swoistego odczynu tła. Tkankami odpowiednimi do ujemnej próby kontrolnej są tkanki okręŝnicy, wątroby lub tarczycy. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŝna wykorzystywać róŝne rodzaje komórek pochodzące z większości tkanek. Preparaty do kontroli ujemnej powinny zostać zweryfikowane przez UŜytkownika. JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŝy uznać za niewaŝne, a test naleŝy powtórzyć. Nieswoisty odczynnik Negative Control Reagent: W celu oceny występowania odczynu nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach występowania antygenów, dla kaŝdego wycinka pochodzącego od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŝy stosować odczynnik do kontroli ujemnej. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Weryfikacja testu: Przed pierwszym uŝyciem przeciwciała lub systemu barwienia w procedurze diagnostycznej, uŝytkownik powinien sprawdzić swoistość przeciwciała testując go na serii posiadanych w laboratorium komórek o znanej charakterystyce działania immunocytochemicznego, stanowiących tkanki kontroli dodatniej i ujemnej. NaleŜy zapoznać się z procedurami kontroli jakości omówionymi wcześniej w tej sekcji ulotki oraz z wymaganiami określonymi w dokumentach CAP Certification Program for Immunohistochemistry oraz CLSI (dawniej NCCLS) Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (24). PowyŜsze procedury kontroli jakości naleŝy powtarzać z kaŝdą nową partią przeciwciał i za kaŝdym razem, gdy wystąpi zmiana w parametrach odczynu. Do weryfikacji testu odpowiednie są tkanki gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, o znanej intensywności barwienia białka HER2 od 0-3+ oraz tkanki ujemne, np. z okręŝnicy, wątroby lub tarczycy. Interpretacja wyniku barwienia - Ŝołądek Wykrywanie nadmiernej ekspresji białka HER2 powinno odbywać się wyłącznie w oparciu o nasilenie odczynu błonowego, który naleŝy oceniać na podstawie skali przedstawionej w Tabeli 9. Oceny preparatów powinien dokonywać patolog, posługując się mikroskopem świetlnym. W celu oceny obecności i nasilenia odczynu immunohistochemicznego naleŝy stosować obiektyw o powiększeniu 10x. Zastosowanie obiektywu o powiększeniu 5 40x jest korzystne dla potwierdzenia wyniku. Odczyn cytoplazmatyczny naleŝy uznać za nieswoisty i nie naleŝy go brać pod uwagę przy ocenie nasilenia odczynu błonowego (8). W rozróŝnianiu poziomów nasilenia 0, 1+, 2+ i 3+ pomocny jest wydany przez firmę Dako atlas HercepTest Interpretation Manual Gastric Cancer (Atlas interpretacji odczynów HercepTest - rak Ŝołądka), który zawiera obrazy typowych wyników barwienia o róŝnej intensywności. Oceniać naleŝy wyłącznie próbki pochodzące od chorych, u których występuje gruczolakorak Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego. W przypadku metaplazji nabłonka Ŝołądka w nabłonek jelitowy i gruczolakoraka Ŝołądka w tym samym preparacie, naleŝy oceniać tylko składnik gruczolakoraka Ŝołądka. W przypadku interpretacji barwienia preparatów biopsyjnych metodą HercepTest zaleca się skupisko co najmniej 5 wybarwionych komórek guza. Skupisko przynajmniej 5 wybarwionych komórek guza składa się z 5 połączonych, wybarwionych komórek guza. ( ) P04454PL_01/K / s. 40/56

41 Rak Ŝołądka Tabela 9. Interpretacja i ocena znakowania immunohistochemicznego HER2 Wynik Preparat chirurgiczny Wzór barwienia Preparat biopsyjny Wzór barwienia Ocena nadmiernej ekspresji HER2 0 reaktywności lub brak reaktywności błonowej w < 10% komórek guza reaktywności lub brak reaktywności błonowej (lub w skupisku < 5 komórek) w jakiejkolowiek komórce guza Ujemny 1+ Blada, ledwo rozpoznawalna reaktywność błonowa w 10% komórek guza; reaktywne są tylko fragmenty błon poszczególnych komórek Skupisko komórek ( 5 komórek) guza z bladą, ledwo rozpoznawalną reaktywnością błonową, niezaleŝnie od odsetka wybarwionych komórek guza Ujemny 2+ Słaba/umiarkowana reaktywność na całej powierzchni, na podstawnobocznych lub bocznych brzegach błony w 10% komórek guza 3+ Silna reaktywność na całej powierzchni, na podstawno-bocznych lub bocznych brzegach błony w 10% komórek guza Wskazówki wg Hofmann i in. (40). Słaby/umiarkowany odczyn błonowy na całej powierzchni, na podstawnobocznych lub bocznych brzegach skupiska ( 5 komórek) komórek guza, niezaleŝnie od odsetka wybarwionych komórek guza Silny odczyn błonowy na całej powierzchni, na podstawno-bocznych lub bocznych brzegach skupiska ( 5 komórek) komórek guza, niezaleŝnie od odsetka wybarwionych komórek guza Niejednoznaczny Dodatni Wynik testu HercepTest w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2 interpretuje się jako ujemny (odczyn o intensywności 0 i 1+), niejednoznaczny (2+) albo dodatni (3+). Pacjenci ani lekarze nie powinni wykorzystywać wyników testu HercepTest jako podstawy do rokowania; test HercepTest nie został zatwierdzony do takich zastosowań. W kaŝdej serii preparaty naleŝy badać w kolejności podanej w Tabeli 10, co pozwoli na określenie waŝności wyników z danej serii oraz półilościową ocenę nasilenia odczynu próbki tkankowej. ( ) P04454PL_01/K / s. 41/56

42 Rak Ŝołądka Tabela 10. Kolejność oceny szkiełek. Kolejność odczytu preparatów Uzasadnienie 1. Preparat kontrolny zawierający trzy linie komórkowe. Obecność 3+ brązowego zabarwienia błony komórkowej (zabarwienie obwódkowe, rimming) w linii komórek kontrolnych 3+ SK-BR-3, częściowe brązowe zabarwienie obwódkowe w linii komórek kontrolnych 1+ MDA-175 oraz brak zabarwienia w linii komórek kontrolnych 0 MDA-231 wskazuje, Ŝe test jest waŝny Punktowe i nieciągłe wybarwienie nastąpiło w małej do umiarkowanej liczbie komórek słabo dodatnich 1+ linii komórek kontrolnych MDA-175. Ponadto w tej linii komórek moŝna zaobserwować punktowe immunobarwienie ciałek Golgiego cytoplazmy. Obecność brązowego odczynu w kontrolnej linii komórkowej 0 MDA-231 (ujemnej w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2) wskazuje na wystąpienie nieswoistego odczynu. Wyniki testu mogą być niewaŝne w związku z nadmiernym wybarwieniem. 2. Preparat z tkanki do dodatniej próby kontrolnej. Powinien być widoczny brązowy odczyn błonowy. Wybarwienie cytoplazmy i tkanki ujemnej nie powinno przekraczać Preparat tkankowy do ujemnej próby kontrolnej. BRAK odczynu swoistego w preparacie tkankowym do kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŝowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. Jeśli pojawi się swoiste barwienie na Szkiełku Tkanki Kontroli Ujemnej, wówczas wyniki próbki pacjentki naleŝy uwaŝać za niewaŝne. 4. Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany działaniu odczynnika Negative Control Reagent 5. Preparat z tkanki pochodzącej od pacjenta poddany działaniu przeciwciała pierwotnego swoistego wybarwienia błony weryfikuje swoistość znakowania docelowego antygenu przez pierwsze przeciwciało. Inne jasnobrązowe lub brązowe zabarwienie występujące w cytoplazmie próbki poddanej działaniu odczynnika kontroli ujemnej, np. w tkance łącznej, leukocytach, erytrocytach lub tkance martwiczej naleŝy uwaŝać za nieswoiste barwienie tła i naleŝy je podać w części przeznaczonej na uwagi w arkuszu danych. Jeśli wykryta jest nadekspresja białka HER2 w próbce, będzie to widoczne jako brązowe zabarwienie obwódkowe błony komórkowej komórek guza poddanych działaniu pierwszego przeciwciała. 1. Preparat kontrolny (w zestawie): W pierwszej kolejności naleŝy zbadać preparat kontrolny przebadany testem HercepTest, aby upewnić się, Ŝe wszystkie odczynniki działają prawidłowo. Obecność brązowego produktu reakcji (3,3 -diaminobenzydyny, DAB) na błonach komórkowych świadczy o reaktywności dodatniej. Obecność brązowego odczynu błonowego (na obwodzie) w kontrolnej linii komórkowej 3+ SK-BR-3, brązowego odczynu na części obwodu w kontrolnej linii komórkowej 1+ MDA-175 oraz brak odczynu w kontrolnej linii komórkowej 0 MDA-231 świadczy o prawidłowym przebiegu testu. Jeśli którakolwiek z kontrolnych linii komórkowych nie spełnia powyŝszych kryteriów, wszystkie wyniki uzyskane z próbek pochodzących od pacjentów naleŝy uznać za niewaŝne. 2. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej: Następnie naleŝy zbadać preparat dodatniej kontroli tkankowej. Ten preparat słuŝy do potwierdzania skuteczności zastosowanej metody utrwalania i procesu odmaskowania antygenu. Do interpretacji naleŝy wybierać jedynie komórki prawidłowe, gdyŝ w komórkach z martwicą lub uszkodzonych często występują odczyny nieswoiste (26). W komórkach nowotworu powinien występować brązowy odczyn błonowy. Nasilenie brązowego odczyn cytoplazmatycznego w tkankach ujemnych nie powinno przekraczać wartości 1+. ( ) P04454PL_01/K / s. 42/56

43 Rak Ŝołądka 3. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej: Szkiełko z Tkanką Kontroli Ujemnej naleŝy badać po tkance kontroli dodatniej, aby sprawdzić swoistość znakowania docelowego antygenu przez pierwsze przeciwciało. odczynu swoistego w preparacie tkankowym do kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŝowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŝy uznać za niewaŝne. W charakterze tkanki do kontroli ujemnej moŝna równieŝ wykorzystać ujemne fragmenty preparatu tkankowego do kontroli dodatniej, jednak w takim przypadku wymagana jest weryfikacja przeprowadzona przez uŝytkownika. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe słabą reakcję (intensywność barwienia 0-1+) moŝna zauwaŝyć w większości normalnych tkanek nabłonka. Do uŝycia w charakterze kontroli ujemnej nadają się np. tkanki: okręŝnicy, wątroby i tarczycy. Jeśli odczyn nieswoisty występuje, ma on charakter rozproszony (rozlany). W preparatach tkanek poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŝe niekiedy występować odczyn w obrębie tkanki łącznej Tkanka pochodząca od pacjenta: Na końcu naleŝy zbadać próbki pochodzącej od pacjenta, poddane działaniu testu HercepTest. Intensywność odczynu dodatniego naleŝy oceniać w kontekście nieswoistego odczynu tła występującego w próbce z odczynnikiem kontroli ujemnej. Podobnie jak w kaŝdym badaniu immunocytochemicznym, wynik ujemny oznacza, Ŝe antygen nie został wykryty, a nie Ŝe nie występował w badanych komórkach/tkankach. Konkretne informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest moŝna znaleźć w sekcji Streszczenie i wyjaśnienia, Ograniczenia oraz Charakterystyka wydajnościowa. Dodatkowe zalecenia dotyczące interpretacji odczynu w teście HercepTest W testach gruczolakoraka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego badanych w kierunku nadekspresji białka HER2, uzyskuje się wynik od 0 do 3+. W przypadkach oceny 0 i 3+ wynik jest bardzo jednoznaczny, jednak niewielki odsetek próbek z wynikiem 1+ i 2+ moŝe nastręczać trudności interpretacyjnych. PoniŜej wymieniono wskazówki dotyczące interpretacji odczynu w teście HercepTest. Ocenić kontrolne linie komórkowe w celu zweryfikowania działania testu. Ocenić preparaty do kontroli dodatniej i ujemnej. Przy pierwszej ocenie zaleca się wybarwienie preparatu tkankowego hematoksyliną i eozyną (H+E). (Charakter nowotworowy moŝe nie być jednoznacznie widoczny w próbkach wybarwionych testem HercepTest. Szkiełko wybarwione H&E jest wymagane dla patologa, abysprawdzić obecność guza.). Test HercepTest naleŝy wykonać na parze skrawków (skrawki seryjne) z tego samego bloczku parafinowego próbki. Skrawki, na których wykonano odczyn w kierunku nadmiernej ekspresji białka HER2, naleŝy najpierw badać w małym powiększeniu. Większość przypadków dodatnich będzie ewidentnie rozpoznawalna przy małym powiększeniu. W przypadkach oceny 1+, w celu potwierdzenia odczynu błonowego naleŝy uŝyć 40-krotnego powiększenia. W przypadkach oceny 2+, w celu potwierdzenia odczynu błonowego naleŝy uŝyć krotnego powiększenia. Preparaty chirurgiczne Do ustalania odsetka dodatnich komórek nowotworowych naleŝy wykorzystać dobrze zachowane i dobrze wybarwione obszary próbki. Jeśli w większości komórek nowotworu występuje odczyn na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 2+ lub 3+. Jeśli w więcej niŝ 10% komórek nowotworowych występuje silny odczyn na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 3+. ( ) P04454PL_01/K / s. 43/56

44 Rak Ŝołądka Jeśli w więcej niŝ 10% komórek nowotworowych występuje słaby lub umiarkowany odczyn na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik dla próbki wynosi 2+. Jeśli w więcej niŝ 10% komórek nowotworowych w preparatach chirurgicznych, wybarwione są tylko fragmenty błon poszczególnych komórek, mają bladą, ledwo rozpoznawalną intensywność, to wynik dla próbki wynosi 1+. Jeśli w mniej niŝ 10% komórek nowotworowych próbki pooperacyjnej występuje odczyn, to niezaleŝnie od wzoru barwienia (np. na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach), wynik dla próbki wynosi 0. Jeśli nie obserwuje się barwienia, wynik dla próbki pooperacyjnej wynosi 0. Preparaty biopsyjne Skupisko przynajmniej 5 wybarwionych komórek guza składa się z 5 połączonych, wybarwionych dla HER2 komórek guza. Jeśli w skupisku co najmniej 5 komórkach nowotworu występuje silny odczyn na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 3+, niezaleŝnie od odsetka wybarwionych komórek guza. Jeśli w skupisku co najmniej 5 komórkach nowotworu występuje słaby lub umiarkowany odczyn na całej błonie komórkowej, na podstawno-bocznych lub bocznych jej brzegach, to wynik wynosi 2+, niezaleŝnie od odsetka wybarwionych komórek guza. Jeśli w skupisku co najmniej 5 komórkach nowotworu występuje odczyn o bladej, ledwo rozpoznawalnej intensywności i wybarwione są tylko fragmenty błon, to wynik wynosi 1+, niezaleŝnie od odsetka wybarwionych komórek guza. Jeśli w mniej niŝ 5 komórkach nowotworowych występuje brak odczynu lub odczynu błonowego, to wynik dla próbki wynosi 0. Ograniczenia - Ŝołądek Ograniczenia ogólne 1. Immunocytochemia jest wieloetapową metodą diagnostyczną wymagającą specjalistycznego przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do immunocytochemii i interpretacji wyników barwienia. 2. Wybarwienie tkanek jest uzaleŝnione od obróbki i przetworzenia tkanki przed wykonaniem odczynu. Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŝanie, rozmraŝanie, przemywanie, suszenie, ogrzewanie lub zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŝe powodować artefakty, ukrycie przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych wyników moŝe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub właściwości zaleŝne od tkanek. 3. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać prawidłową interpretację wyników. 4. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście objawów klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych i innych badań diagnostycznych. Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŝy wykonać w akredytowanej pracowni histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych. ( ) P04454PL_01/K / s. 44/56

45 Rak Ŝołądka 5. Tkanki pochodzące od osób z zakaŝeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową (27). 6. W typach tkanek, które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać nieoczekiwane reakcje. Nie moŝna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji w przetestowanych tkankach z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo (28). W przypadku udokumentowanych nieoczekiwanych reakcji naleŝy skontaktować się z Serwisem Technicznym firmy Dako. 7. Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych niŝ immunologiczne moŝe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą równieŝ wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności peroksydazy (cytochromu C) (28). 8. Procedurę barwienia naleŝy wykonywać w temperaturze pokojowej C. Ograniczenia specyficzne dla produktu 1. Antygen obecny w linii komórkowej 1+, MDA-175, z czasem ulega rozkładowi. Odczyn preparatu kontrolnego naleŝy oceniać w kontekście daty waŝności tego preparatu. Ujemny odczyn komórek MDA-175 moŝe być jedynie objawem rozkładu preparatu. Szkiełka Control Slide naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. 2. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. Próbki naleŝy wybarwiać w ciągu 4-6 tygodni od zamontowania tkanek na szkiełkach, jeŝeli są one przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C ) (29). 3. JeŜeli tkanki są rutynowo utrwalane i zatapiane w parafinie (neutralna zbuforowana formalina), dla uzyskiwania optymalnego i odtwarzalnego wyniku białko HER2 wymaga odzyskiwania epitopu w podwyŝszonej temperaturze. Ta wstępna obróbka musi być zakończona na początku całego procesu barwienia. Instrukcje podano w części Przygotowanie Próbek, Obróbka tkanek przed Barwieniem 4. Wzbudzane temperaturą odzyskiwanie epitopu białka HER2 naleŝy wykonywać wyłącznie w skalibrowanej łaźni wodnej. Testowano inne metody podgrzewania i nie dały one odtwarzalnych wyników. 5. Nie wolno zastępować odczynników znajdujących się w zestawie odczynnikami posiadającymi inne numery partii lub odczynnikami innych producentów. Jedynym wyjątkiem jest Wash Buffer, który moŝna zastępować Dako Wash Buffer Nr kat. S Ocena odczynu cytoplazmatycznego moŝe doprowadzić do uzyskania fałszywych wyników. W interpretacji naleŝy brać pod uwagę wyłącznie nasilenie odczynu błonowego. 7. Barwione preparaty kontrolne naleŝy stosować wyłącznie w celu weryfikacji wyników serii odczynów, a nie w celu oceny odczynu w skrawkach tkankowych. 8. MoŜliwe jest sporadyczne występowanie silnego (3+) odczynu ogniskowego. MoŜe to być efektem nierównomiernego utrwalenia i/lub przetwarzania tkanki. Zaleca się wykonanie odczynu drugiego bloczka tkanki z tej samej próbki. 9. Nie zweryfikowano uŝycia testu HercepTest do próbek utrwalanych w środkach innych niŝ obojętny roztwór buforowanej formaliny. 10. Uwaga: prawidłowy nabłonek migdałków i przełyku moŝe dawać odczyn o intensywności dochodzącej do NaleŜy unikać stosowania zmiaŝdŝonych próbek raka Ŝołądka i interpretacji przypadkowego barwienia przy krawędzi preparatu biopsyjnego. ( ) P04454PL_01/K / s. 45/56

46 Rak Ŝołądka Charakterystyka przebiegu testu - Ŝołądek Dodatkowe informacje Bezpieczeństwo i skuteczność metody przy uŝyciu preparatu trastuzumab (Herceptin ) zostało wykazane w badaniach klinicznych (ToGA) (38, 39). Badanie zaprojektowano, jako otwarte, randomizowane, wieloośrodkowe badanie fazy III, obejmujące pacjentów HER2-dodatnich, z nieoperacyjnym, zaawansowanym miejscowo, nawracającym i/lub przerzutowym gruczolakorakiem Ŝołądka lub połączenia Ŝołądkowo-przełykowego. W badaniu ToGA, wynik HER2-dodatni zdefiniowano jako dodatni wynik IHC (3+) (HercepTest, Dako) i/lub dodatni wynik HER2 FISH (HER2/CEN17 2,0) (HER2 FISH pharmdx Kit, Dako). Wybrani losowo pacjenci byli poddawani chemioterapii (preparatem 5-FU lub capecitabine oraz cisplatin) lub chemioterapii razem z przyjmowaniem preparatu trastuzumab. Końcowym wynikiem badań był okres przeŝycia (OS). W ramach badania, randomizacji poddano 594 pacjentów a 584 pacjentów otrzymało badany lek i zostało ujętych w pełnym zestawie analiz (FAS). Wykazano, Ŝe statystyczne wyniki w przypadku połączenia chemioterapii z preparatem trastuzumab były lepsze względem wyników samej chemioterapii. Mediana OS wzrosła z 11,1 do 13,8 miesiąca (p=0,0046) ze współczynnikiem ryzyka 0,74 (95 % CI: 0,60 0,91). Krzywą Kaplana-Meiera opisującą OS pokazano na Rysunku 1. Prawdopodobieństwo przeŝycia 1,0 0,9 0,8 0,7 Test log-rank P = 0,0046 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,1 13,8 Czas (miesiące) Liczba próbek Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Grupa leczonych Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Rysunek 1. Krzywa Kaplana-Meiera opisująca OS (n=584). Gdy dane stały się dostępne, wykonano wstępnie sprecyzowane analizy badanej podgrupy pod kątem ich statusu HER2. Nowe dwie podgrupy HER2 zdefiniowano później w oparciu o klasyfikację IHC: Grupa 1 ( grupa z niską ekspresją HER2 ): Grupa 2 ( grupa z wysoką ekspresją HER2 ): IHC 0/FISH+ oraz IHC 1+/FISH+ (n=131) IHC 2+/FISH+ i IHC 3+ (FISH+ lub FISH- lub brak wyniku FISH (n=446) ( ) P04454PL_01/K / s. 46/56

47 Rak Ŝołądka Późniejsze powtórzenie wyników analizy okresu przeŝycia (OS) w przypadku grupy z wysoką ekspresją HER2 (n=446) wykazało jeszcze większą przewagę metody połączonej. Mediana OS dla grupy pacjentów przyjmujących chemioterapię oraz preparat trastuzumab wzrosła do 16,0 miesięcy w porównaniu z 11,8 miesiąca w przypadku pacjentów z samą chemioterapią. Współczynnik ryzyka w przypadku tej metody obniŝył się do 0,65 (95 % CI: 0,51 0,83). Krzywe Kaplana-Meiera opisujące OS dla grupy z wysoką ekspresją HER2 są pokazane na Rysunku 2. Prawdopodobieństwo przeŝycia 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 11,8 16,0 Czas (miesiące) Liczba próbek Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Grupa leczonych Fluoro/Cisp Tras/Fluoro/Cisp Rysunek 2. Krzywe Kaplana-Meiera opisujące OS dla grupy z wysoką ekspresją HER2 (n=446). Badania ToGA wykazały, Ŝe połączenie metod testowych IHC i FISH ma znaczenie rokownicze pod kątem wyników łączonej terapii chemioterapią i preparatem trastuzumab, jakkolwiek późniejsza analiza statystyczna wydaje się wskazywać, Ŝe większe korzyści z jej zastosowania odnoszą pacjenci o wyŝszej eksprecji białka HER2 (IHC2+/FISH+ i IHC3+). Otrzymane wyniki wskazują, Ŝe białko jest punktem wyjścia dla preparatu trastuzumab. Więcej informacji na temat badań ToGA moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania Herceptin. ( ) P04454PL_01/K / s. 47/56

48 Rak Ŝołądka Powtarzalność Odtwarzalność wewnątrz testu: Powtarzalność w ramach jednej serii odczynów testowano w jednym laboratorium na 11 próbkach dających róŝne odczyny w metodzie IHC. KaŜda próbka była badana trzykrotnie. Odczyny wykonano metodą ręczną. Dla wszystkich próbek uzyskano 100% powtarzalność wyników. Powtarzalność w ramach jednej serii odczynów testowano w jednym laboratorium na 3 próbkach dających róŝne odczyny w metodzie IHC. KaŜda próbka była badana trzykrotnie. Odczyny wykonywano metodą automatyczną. Dla wszystkich próbek uzyskano 100% powtarzalność wyników. Odtwarzalność pomiędzy seriami i laboratoriami: Analizę HercepTest 60 róŝnych próbek raka Ŝołądka, w tym połączenia Ŝołądkowo-przełykowego, uzyskanych podczas operacji lub biopsji, przeprowadzonej w ciągu pięciu dni nienastępujących po sobie, w trzech róŝnych ośrodkach. Wśród 60 próbek z badania rozkład trzech kategorii statusu HER2 był równomierny. Sześciu patologów wykonało łącznie 2040 ocen HER2. Zgodność wyników pomiędzy dniami badań (ujemny, wątpliwy, dodatni) wynosiła od 83,1% do 98,3%. W 47 z 60 moŝliwych porównań współczynnik zgodności wynosił przynajmniej 90,0%. W Tabela 11, poszczególne przykłady porównań wyników badań pomiędzy dniami wskazują średnią zgodność na poziomie 91,2%, 92,5% i 92,5% dla trzech ośrodków. Pomiędzy ośrodkami uzyskano odpowiednio zgodność równą 82,7%, 75,0% i 88,0% przy porównaniu parami (patrz tabela 12). Zgodnie z dokładnym testem Fishera, wyniki nie róŝniły się pomiędzy ośrodkami. Pomiędzy obserwatorami uzyskano odpowiednio zgodność równą 88,0%, 83,6% i 81,0% w trzech ośrodkach (Tabela 13). Podsumowując, analiza HercepTest próbek raka Ŝołądka w trzech ośrodkach wykazała wysoki poziom zgodności pomiędzy patologami, dniami badania, ośrodkami i obserwatorami. Tabela 11. Ogólna zgodność pomiędzy dniami w procentach - podzbiór 12 z 60 porównań Ośrodek 1 Ośrodek 2 Ośrodek 3 Obserwator 1 Obserwator 2 Średnia Zgodność CI95 LL 1 Zgodność CI95 LL 1 Zgodność Dzień 2 a dzień 1 85,0 74,4 93,3 84,9 91,2 Dzień 3 a dzień 4 93,3 84,9 93,3 84,9 Dzień 1 a dzień 2 95,0 87,3 83,1 72,0 92,5 Dzień 3 a dzień 4 96,7 89,7 95,0 87,3 Dzień 1 a dzień 2 90,0 80,5 91,7 82,7 92,5 Dzień 3 a dzień 4 96,7 89,7 91,7 82,7 1 CI95 LL: 95% dolna granica przedziału ufności. ( ) P04454PL_01/K / s. 48/56

49 Rak Ŝołądka Tabela 12. Ogólna zgodność pomiędzy ośrodkami w procentach Zgodność CI95 LL 1 Średnia zgodność Ośrodek 1 a ośrodek 2 Ośrodek 1 a ośrodek 3 Ośrodek 2 a ośrodek 3 Dzień 1 a dzień 1 83,3 72,4 Dzień 2 a dzień 2 85,0 74,4 Dzień 3 a dzień 3 85,0 74,4 Dzień 4 a dzień 4 81,7 70,5 Dzień 5 a dzień 5 78,3 66,7 Dzień 1 a dzień 1 80,0 68,6 Dzień 2 a dzień 2 73,3 61,2 Dzień 3 a dzień 3 78,3 66,7 Dzień 4 a dzień 4 68,3 55,9 Dzień 5 a dzień 5 75,0 63,0 Dzień 1 a dzień 1 88,3 78,5 Dzień 2 a dzień 2 86,7 76,4 Dzień 3 a dzień 3 90,0 80,5 Dzień 4 a dzień 4 86,7 76,4 Dzień 5 a dzień 5 88,3 78,5 82,7 75,0 88,0 1 CI95 LL: Dolna granica przedziału ufności 95%. Tabela 13. Ogólna zgodność pomiędzy obserwatorami w procentach Zgodność CI 95 LL 1 Średnia zgodność Ośrodek 1 Dzień 1 91,7 82,7 Dzień 2 91,7 82,7 Dzień 3 93,3 84,9 88,0 Ośrodek 2 Ośrodek 3 Dzień 4 83,3 72,4 Dzień 5 80,0 68,6 Dzień 1 86,4 76,0 Dzień 2 83,3 72,4 Dzień 3 83,3 72,4 Dzień 4 83,3 72,4 Dzień 5 81,7 70,5 Dzień 1 80,0 68,6 Dzień 2 78,3 66,7 Dzień 3 80,0 68,6 Dzień 4 78,3 66,7 Dzień 5 90,0 80,5 83,6 81,0 1 CI95 LL: Dolna granica przedziału ufności 95%. ( ) P04454PL_01/K / s. 49/56

50 Rak Ŝołądka Immunoreaktywność W Tabeli 14 przedstawiono zbiorcze informacje na temat immunoreaktywności testu HercepTest z zalecanym panelem tkanek prawidłowych. Wszystkie tkanki zostały utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie oraz wybarwione testem HercepTest zgodnie z instrukcją podaną w ulotce załączonej do opakowania. Tabela 14. Zestawienie reaktywności testu HercepTest dla tkanek normalnych. Rodzaj tkanki (liczba testowanych przypadków) Nadnerczowa (3) Szpik kostny (3) Mózgowa/móŜdŜkowa (3) Mózgowa/mózgowa (3) Piersiowa (3) Szyjki macicy (3) OkręŜnicy (3) Przełyku (3) Sercowa (3) Nerkowa (3) Wątrobowa (3) Płucna (3) Komórek mezotelialnych (3) Jajnikowa (3) Trzustkowa (3) Gruczołu przytarczycy (3) Nerwu obwodowego (3) Przysadkowa (3) Prostaty (3) Gruczołu ślinowego (3) Mięśnia szkieletowego (3) Skórna (3) Jelita cienkiego (3) Śledziony (3) śołądkowa (3) Jąder (3) Grasicy (3) Tarczycy (3) Migdałków (3) Maciczna (3) Struktura wykazująca dodatni odczyn oraz rodzaj odczynu Gruczoł sutkowy (2 tkanki z 3, natęŝenie wybarwienia +1, < 5% komórek) Komórki nabłonkowe (1 tkanka z 3, natęŝenie wybarwienia 1+, < 5% komórek, odczyn błonowy i cytoplazmatyczny, ziarnisty) Komórki nabłonkowe pęcherzyków (1 tkanka z 3, natęŝenie wybarwienia +1, < 5% komórek, odczyn błonowy i cytoplazmatyczny) Nabłonek płaski (1 tkanka z 3, natęŝenie wybarwienia +1, < 5% komórek. 2 tkanki z 3, natęŝenie wybarwienia 2+, 10 20% komórek. Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny) Tkanka endometrium (2 tkanki z 3, natęŝenie wybarwienia 1+, 30 60% komórek, odczyn cytoplazmatyczny, ziarnisty) O ile nie zaznaczono inaczej, we wszystkich tkankach stwierdzano odczyn błonowy. JeŜeli nie podano inaczej, wszystkie trzy próbki kaŝdego typu tkanek miały taką samą intensywność barwienia. ( ) P04454PL_01/K / s. 50/56

51 Rak Ŝołądka Rozwiązywanie problemów - Ŝołądek W celu uzyskania informacji o działaniach naprawczych naleŝy zapoznać się z wymienionym wcześniej podręcznikiem firmy Dako (19) lub skontaktować z Działem Pomocy Technicznej firmy Dako, aby poinformować o nietypowym wybarwieniu. Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. barwienia szkiełek 1a. Odczynniki nie zostały uŝyte w prawidłowej kolejności 1a. Sprawdzić stosowanie odczynników 2. Słabe barwienie szkiełek 1b. Azydek sodu w Wash Solution 1c. Nadmierne ogrzewanie skrawków tkankowych zatopionych na szkiełkach przed odparafinowaniem i cieplnym odmaskowaniem antygenu moŝe doprowadzić do widocznej utraty immunoreaktywności HER2. 2a. Nieodpowiednie odzyskiwanie epitopu 2b. Nieodpowiednie czasy inkubacji odczynników 2c. Zastosowana nieodpowiednia metoda utrwalania 2d. Nadmierne ogrzewanie skrawków tkankowych zatopionych na szkiełkach przed odparafinowaniem i cieplnym odmaskowaniem antygenu moŝe doprowadzić do widocznej utraty immunoreaktywności HER2 2e. Naniesiono niedostateczną objętość odczynnika. 1b. Zastosować świeŝy Wash Buffer dostarczony w zestawie 1c. Pozostawić na powietrzu skrawki tkankowe w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin lub do całkowitego wysuszenia. Lub suszyć w temperaturze 37 C przez noc albo suszyć w temperaturze 60 C przez maksymalnie jedną godzinę. Suszenie skrawków tkankowych w podwyŝszonej temperaturze moŝna przeprowadzać wyłącznie w piecu z regulacją temperatury i równomiernym rozkładem ciepła (17). 2a. Sprawdzić, czy Epitope Retrieval Solution osiąga temperaturę C przez pełne 40 minut oraz czy jest pozostawiony do ostygnięcia przez dalsze 20 minut. 2b. Sprawdzić instrukcje odnośnie procedury barwienia 2c. Zapewnić, aby tkanka pacjentki nie była nadmiernie utrwalona, ani nie został uŝyty alternatywny utrwalacz 2d. Pozostawić na powietrzu skrawki tkankowe w temperaturze pokojowej przez min. 12 godzin lub do całkowitego wysuszenia. Lub suszyć w temperaturze 37 C przez noc albo suszyć w temperaturze 60 C przez maksymalnie jedną godzinę. Suszenie skrawków tkankowych w podwyŝszonej temperaturze moŝna przeprowadzać wyłącznie w piecu z regulacją temperatury i równomiernym rozkładem ciepła (17). 2e. Sprawdzić naniesioną objętość odczynnika. ( ) P04454PL_01/K / s. 51/56

52 Rak Ŝołądka Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 3. Nadmierne barwienie tła szkiełek 3a. Parafina nie została całkowicie usunięta 3a. UŜyć świeŝych roztworów czyszczących oraz postępować zgodnie z instrukcjami podanymi w Części B.1 4. Tkanka odkleja się od szkiełka 5. Nadmiernie silne swoiste barwienie 3b. Do zamontowania skrawków do szkiełek uŝyto skrobiowych substancji dodatkowych 3c. Szkiełka nie zostały dokładnie wypłukane 3d. Skrawki wyschły podczas procedury barwienia 3e. Zastosowana nieodpowiednia metoda utrwalania 3f. Nieswoiste wiązanie odczynników do tkanki 4a. Zastosowano nieprawidłowe szkiełka 5a. Zastosowana nieodpowiednia metoda utrwalania 5b. Zastosowanie nieprawidłowego źródła ciepła dla odzyskiwania epitopu np. wytwornica pary, kuchenka mikrofalowa lub autoklaw 5c. Zbyt długie okresy inkubacji odczynników 5d. Zastosowanie nieprawidłowego roztworu przemywającego 3b. Unikać stosowania zawierających skrobię dodatków zwiększających przyczepność skrawków do szkiełek mikroskopowych. Wiele substancji dodatkowych jest immunoreaktywnych. 3c. Zastosować świeŝy roztwór dla kąpieli buforowej i tryskawek. 3d. Zastosować komorę wilgotną. Jednorazowo wycierać tylko trzy do czterech szkiełek przed nałoŝeniem odczynnika. 3e. Stosować tylko zatwierdzone środki utrwalające. Alternatywny utrwalacz moŝe powodować nadmierne barwienie tła. 3f. Sprawdzić metodę utrwalania próbki i obecność martwicy 4a. Stosować silanizowane szkiełka, takie jak Dako Silanized Slides, Nr kat. S3003, szkiełka pokryte SuperFrost Plus lub poli-l-lizyną 5a Zapewnić, aby były stosowane tylko odpowiednie utrwalacze i metody utrwalania 5b. Zapewnić, aby tylko łaźnia wodna była uŝywana podczas etapu odzyskiwania epitopu. 5c. Sprawdzić instrukcje odnośnie procedury barwienia 5d. Stosować wyłącznie Wash Buffer zalecany dla testu ( ) P04454PL_01/K / s. 52/56

53 Rak Ŝołądka Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 6. Słabe barwienie Szkiełka kontrolnego z linią komórek 1+ 6a. Nieprawidłowo wykonana procedura odzyskania epitopu 6a. Zanurzyć szkiełka we wstępnie podgrzanym roztworze Epitope Retrieval Solution. Doprowadzić temperaturę Epitope Retrieval Solution ponownie do C i podgrzewać przez pełne 40 minut. 6b. reakcji z Substrate- Chromogen Solution (DAB) 6b. Zapewnić, aby zastosowano pełne 10 minut inkubacji. Zapewnić, aby tylko jedna kropla DAB Chromogen została dodana do 1 ml DAB Buffered Substrate 7. Po ogrzaniu roztworu Epitope Retrieval Solution pojawia się zmętnienie. 8 Przy przechowywaniu (przed ogrzaniem) roztwór Epitope Retrieval Solution jest mętny. 6c. Degeneracja szkiełka kontrolnego 7. Po ogrzaniu roztworu pojawia się zmętnienie. 8. Roztwór był nieprawidłowo przechowywany lub jest przeterminowany. 6c. Sprawdzić datę waŝności i warunki przechowywania zestawu podane na zewnętrznej części opakowania 7. Jest to normalne zjawisko, które nie ma wpływu na wynik barwienia. 8. Sprawdzić datę waŝności i warunki przechowywania zestawu podane na zewnątrz opakowania. Usunąć roztwór Epitope Retrieval Solution. UWAGA: Jeśli problemu nie moŝna przypisać Ŝadnemu z powyŝszych powodów lub, gdy sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŝy skontaktować się z Serwisem Technicznym firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŝna znaleźć we wspomnianym wcześniej podręczniku firmy Dako (19) (dostępny w firmie Dako), Atlasie Immunohistologii (30) oraz Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis (31). ( ) P04454PL_01/K / s. 53/56

54 Piśmiennictwo 1. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985;230: King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbb-related gene in a human mammary carcinoma. Science 1985;229: Semba K, Kamata N, Toyoshima K, Yamamoto T. A v-erbb-related protooncogene, c-erbb-2, is distinct from the c-erbb-1/epidermal growth factor-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. Proc Natl Acad Sci USA 1985;82: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, et al. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986;319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, et al. The neu gene: an erbb-homologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985;229: Bargmann CI, Hung M-C, Weinberg RA. The neu oncogene encodes an epidermal growth factor receptor-related protein. Nature 1986;319: Natali PG, Nicotra MR, Bigotti A, Venturo I, Slamon DJ, Fendly BM, et al. Expression of the p185 encoded by HER2 oncogene in normal and transformed human tissues. Int J Cancer 1990;45: Press MF, Cordon-Cardo C, Slamon DJ. Expression of the HER-2/neu proto-oncogene in normal human adult and fetal tissues. Oncogene 1990;5: Lonardo F, Di Marco E, King CR, Pierce JH, Segatto O, Aaronson SA, et al. The normal erbb-2 product is an atypical receptor-like tyrosine kinase with constitutive activity in the absence of ligand. New Biologist 1990;2: Carter P, Presta L, Gorman CM, Ridgway JBB, Henner D, Wong WLT, et al. Humanization of an antip185 HER2 antibody for human cancer therapy. Proc Natl Acad Sci USA 1992;89: Hudziak RM, Lewis GD, Winget M, Fendly BM, Shepard HM, Ullrich A. p185 HER2 monoclonal antibody has antiproliferative effects in vitro and sensitizes human breast tumor cells to tumor necrosis factor. Mol Cell Biol 1989;9: Lewis GD, Figari I, Fendly B, Wong WL, Carter P, Gorman C, et al. Differential responses of human tumor cell lines to anti-p185 HER2 monoclonal antibodies. Cancer Immunol Immunother 1993;37: Baselga J, Norton L, Albanell J, Kim Y-M, Mendelsohn J. Recombinant humanized anti-her2 antibody (Herceptin ) enhances the antitumor activity of paclitaxel and doxorubicin against HER2/neu overexpressing human breast cancer xenografts. Cancer Res 1998;58: a. Medical Laboratories Particular requirements for quality and competence, ISO 15189:2003. b. Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57CFR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory & practice. New York: Pergamon Press; Lundgaard Hansen B, Winther H, Moller K. Excessive section drying of breast cancer tissue prior to deparaffinisation and antigen retrieval causes a loss in HER2 immunoreactivity, Immunocytochemistry 2008;6, DakoCytomation California Inc., Data on file. 19. Key M. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Fifth Edition. Dako, Carpinteria, California; Leong AS-Y, Milios J, Leong FJ. Epitope retrieval with microwaves. A comparison of citrate buffer and EDTA with three commercial retrieval solutions. Appl Immunohistochem 1996;4: "Procedures for decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides", Department of Health, Education, and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD, "Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts." Center for Disease Control Manual Guide: Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA, April 30, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA; ( ) P04454PL_01/K / s. 54/56

55 25. Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, et al. Special report: quality control in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 1989;92: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: Part I. The technique and its pitfalls. Lab Med 1983;14: Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980;73: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994;54: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; 1986: Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press; Jørgensen JT. Targeted HER2 Treatment in Advanced Gastric Cancer. Oncology 2010 (in press). 33. Tanner M, Hollmén M, Junttila TT, Kapanen AI, Tomola S, SoiniY et al. Amplification of HER-2 in gastric carcinoma: association with Topoisomerase II alpha gene amplification, intestinal type, poor prognosis and sensitivity to trastuzumab. Ann Oncol 2005;16: Matsui Y, Inomata M, Tojigamori M, Sonoda K, Shiraishi N, Kitano S. Suppression of tumor growth in human gastric cancer with HER2 overexpression by an anti-her2 antibody in a murine model. Int J Oncol 2005; 27: Fujimoto-Ouchi K, Sekiguchi F, Yasuno H, Moriya Y, Mor K, Tanaka Y. Antitumor activity of trastuzumab in combination with chemotherapy in human gastric cancer xenograft models. Cancer Chemother Pharmacol 2007; 59: Kim SY, Kim HP, Kim YJ, Oh DY, Im S-A, Lee D et al. Trastuzumab inhibits the growth of human gastric cancer cell lines with HER2 amplification synergistically with cisplatin. Int J Oncol 2008; 32: Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A et al. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-esophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomized controlled trial. Lancet Bang Y, Chung J, Xu J, Lordick F, Sawaki A, Lipatov O et al. Pathological features of advanced Gastric Cancer (GC): Relationship to human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global screening programme of the ToGA trial. J Clin Oncol 2009; 27:15s (suppl; abstr 4556). 39. Van Cutsem E, Kang YK, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, et al. Efficacy results from the ToGA trial: a phase III study of trastuzumab added to standard chemotherapy in first-line human epidermal growth factor receptor 2 (HER2)-positive advanced gastric cancer. (presentation ASCO 2009). 40. Hofmann M, Stoss O, Shi D, Büttner R, van de Vijver M, Kim W, et al. Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopath 2008;52: Asioli S, Maletta F, Verdun di Cantogno L, Satolli MA, Schena M, Pecchioni C, et al. Approaching heterogeneity of human epidermal growth factor receptor 2 in surgical specimens of gastric cancer. Human Pathol 2012; 43;11: ( ) P04454PL_01/K / s. 55/56

56 Objaśnienie symboli Nr katalogowy Ograniczenia temperatury Kod serii Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostroŝności) Materiał medyczny przeznaczony do badań in vitro Nie rzucać, nie przewracać Stosować do Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostroŝności) Sprawdzić w instrukcji uŝycia Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n> badań. Producent Wyprodukowano przez: Dystrybutor w USA: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dania Tel Faks Dako North America, Inc Via Real, Carpinteria, California 93013, USA Tel. 805/ , Linia bezpłatna: 800/ Informacje nt. zamawiania: Tel. 800/ Faks 805/ Wsparcie techniczne: Tel. 800/ HercepTest i Herceptin są znakami towarowymi firmy Genentech, Inc. i są wykorzystywane na licencji udzielonej firmom Dako Denmark A/S oraz F. Hoffmann-La Roche Ltd. ( ) P04454PL_01/K / s. 56/56