EGFR pharmdx. Nr kat. K testów metodą manualną Wydanie 05/2015. Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro.

Transkrypt

1 EGFR pharmdx Nr kat. K testów metodą manualną Wydanie 05/2015 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Zestaw EGFR pharmdx jest przeznaczony do jakościowych testów immunohistochemicznych (IHC) w celu wykrywania ekspresji receptora nabłonkowego czynnika wzrostu (EGFR) w tkankach prawidłowych i nowotworowych standardowo utrwalanych przed badaniem histopatologicznym. Zestaw EGFR pharmdx pozwala na swoiste wykrywanie białka EGFR (HER1) w komórkach wykazujących ekspresję EGFR. Stosowanie zestawu EGFR pharmdx jest wskazane jako pomocnicza metoda identyfikacji pacjentów z rakiem jelita grubego, spełniających kryteria leczenia preparatem ERBITUX (cetuximab) lub Vectibix (panitumumab). Streszczenie i informacje ogólne Wprowadzenie Receptor nabłonkowego czynnika wzrostu o masie 170 kd, naleŝący do receptorów transbłonowych, jest kodowany przez ludzki gen HER1. W skład białka receptora EGFR wchodzi zewnątrzkomórkowa domena wiąŝąca ligandy, region transbłonowy oraz domena wewnątrzkomórkowa z wewnętrzną aktywnością białka kinazy tyrozynowej. Receptor EGFR jest homologiczny ze związkami naleŝącymi do rodziny receptorów EGF/erbB, np. HER2/erbB2 lub neu, HER3/erbB3 i HER4/erbB4. 1,2 Wiele rodzajów prawidłowych komórek, w tym komórek nabłonkowych oraz nowotworów wywodzących się z tych komórek wykazuje ekspresję białka EGFR. 3-9 Do komórek nienabłonkowych wykazujących ekspresję EGFR naleŝą komórki mięśni gładkich i nerwów obwodowych oraz fibroblasty. 10 Swoistość Mysie przeciwciała monoklonalne, klon 2-18C9, skierowane przeciw ludzkim antygenom EGFR są dostarczane jako supernatant hodowli tkankowej komórek hybrydoma. Przeciwciała są wytwarzane przez myszy immunizowane EGFR otrzymywanym metodą immunoprecypitacji z komórek linii A431 ludzkiego raka nabłonkowatego. Wyniki mapowania epitopów wskazują, ze przeciwciała rozpoznają epitop zlokalizowany w pozakomórkowym regionie o wysokiej zawartości cysteiny w obrębie łączącej subdomeny S2, proksymalnie do domeny transbłonowej. Mapowanie najwaŝniejszych aminokwasów wskazuje, Ŝe epitop ma strukturę konformacyjną, zaleŝną od mostków dwusiarczkowych w macierzystej cząsteczce. 11 Wykazano, Ŝe opisywany klon przeciwciał monoklonalnych nie wykazuje reakcji krzyŝowej z HER2, HER3, HER4 ani końcem wektora myc. Często spotyka się odczyn cytoplazmatyczny. Niemniej jednak, testy naleŝy powtórzyć jeŝeli znaczne zabarwienie cytoplazmy utrudnia identyfikację barwienia diagnostycznego błony komórkowej i interpretację wyników. Zasady procedury W skład zestawu IHC EGFR pharmdx wchodzą odczynniki konieczne do przeprowadzenia całej procedury barwienia ICH dla preparatów utrwalanych metodą standardową i utrwalanych w parafinie. W zastosowanym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał monoklonalnych 2-18C9 z ludzkim białkiem EGFR następuje reakcja z gotowym barwnym odczynnikiem produkowanym w oparciu o technologię stosowaną do wytwarzania dekstranu. W skład odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał owczych skierowanych przeciw antygenom mysim oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym polimerowym szkieletem dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego stosowania przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Po dodaniu chromogenu następuje przemiana enzymatyczna, której efektem jest widoczny produkt reakcji, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie moŝna wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji interpretuje się za pomocą mikroskopii świetlnej. Dostarczane są równieŝ dwa preparaty kontrolne zawierające utrwalane i zatapiane w parafinie komórki ludzkie o skali barwienia od 2+ do 0. Preparaty są przeznaczone do kontroli wydajności i zestawu odczynnikowego. Odczynniki EGFR pharmdx do testów metodą manualną Wyszczególnione materiały wystarczają na wykonanie 35 testów (35 szkiełek mikroskopowych inkubowanych z odczynnikiem Primary Antibody to EGFR Protein i 35 szkiełek inkubowanych z odpowiadającą ujemną kontrolą Negative Control Reagent. Obliczając liczbę testów przyjęto, Ŝe zuŝycie wynosi 3 krople gotowego odczynnika na kaŝde szkiełko. Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na wykonanie co najwyŝej 5 pojedynczych serii oznaczeń. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 1/14

2 Dostarczane materiały Ilość Opis 1x8 ml Proteinase K Enzym proteolityczny < 0,1% Proteinase K rozcieńczony buforem Tris-HCl zawierającym azydek sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 1x8 ml Peroxidase Block roztwór nadtlenku wodoru o stęŝeniu 3%. 1x4 ml EGFR pharmdx Monoclonal Mouse IgG 1 Antibody Nadsącz hodowli tkankowej monoklonalnych przeciwciał mysich IgG 1 skierowanych przeciw antygenom ludzkiego EGFR (klon 2-18C9) w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 1x4 ml Mouse IgG 1 Negative Control Reagent Nadsącz hodowli tkankowej monoklonalnych przeciwciał mysich IgG 1 w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 1x8 ml Labelled Polymer, HRP Polimer dekstranowy skoniugowany z peroksydazą chrzanową oraz przeciwciała kozie izolowane ze względu na powinowactwo, skierowane przeciw antygenom mysim. Dostarczany w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i środek przeciwbakteryjny. 1x10 ml DAB+ Substrate Buffer Roztwór buforowy substratu, ph 7,5, zawierający roztwór nadtlenku wodoru o stęŝeniu < 0,1%, substancje stabilizujące, substancje wzbogacające i środek przeciwbakteryjny. 1x1 ml Liquid DAB+ Chromogen Roztwór 3,3'-diaminobenzydyny o stęŝeniu 5% w roztworze chromogenu. 1x1 l Wash Buffer 10x Roztwór soli fizjologicznej z buforem Tris o ph 7,6, zawierający preparat Tween szkiełek EGFR pharmdx TM Control Slides Na kaŝdym szkiełku znajdują się wycinki z dwóch linii komórek ludzkich, odwirowane, utrwalane w formalinie i osadzane w parafinie, reprezentujące umiarkowany poziom ekspresji EGFR i brak ekspresji EGFR. Nasilenie odczynu wirowanych komórek wynosi 2+ i 0. Linia komórkowa: CAMA-1 Poziom ekspresji: 0 Linia komórkowa: HT-29 Poziom ekspresji: 2+ ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 2/14

3 Materiały wymagane, ale niedostarczane Roztwór wodorotlenku amonu o stęŝeniu 15 mol/l rozcieńczony do 0,037 mol/l Barwienie kontrastowe: Hematoksylina, roztwór alkoholowy lub wodny, np. Dako Hematoxylin (nr kat. S3302) lub Dako Automation Hematoxylin (nr kat. S3301) Szkiełka nakrywkowe Woda destylowana lub dejonizowana (woda do odczynników laboratoryjnych) Suszarka umoŝliwiająca utrzymanie temperatury C Etanol absolutny i roztwór o stęŝeniu 95% Komora nawilŝająca Mikroskop świetlny (wzmocnienie obiektywu 4x 40x) Środki do zatapiania, np. Dako Faramount (nr kat. S3025), Dako Glycergel (nr kat. C0563) lub Dako Ultramount (nr kat. S1964) Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej (zobacz część Kontrola jakości) Szkiełka mikroskopowe Fisher SuperFrost Plus, szkiełka z warstwą poli-l-lizyny, szkiełka elektrostatyczne lub szkiełka Dako Silanized Slides (nr kat. S3003) (zobacz część Przygotowanie preparatów) Naczynia lub kąpiele do barwienia Minutnik (pomiar w odstępach 2 30 minut) Butelka z roztworem płuczącym Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu Uwaga: Wszystkie odczynniki dostępne w zestawie lub oddzielnie (np. Dako Wash Buffer [nr kat. S3006]) są przeznaczone do stosowania wyłącznie w opisywanym teście. Warunkiem przeprowadzenia testu zgodnie z zaleceniami jest niestosowanie zamienników. Przygotowanie materiału Materiał biopsyjny naleŝy traktować tak, by zachować fragmenty tkanek do wykonania odczynów IHC. Dla wszystkich preparatów naleŝy stosować standardowe metody przeprowadzania tkanek. 13 Do testowania za pomocą systemu EGFR pharmdx nadają się preparaty przygotowane przy uŝyciu następujących substancji utrwalających: obojętnej buforowanej formaliny 10% (stęŝ. objętościowo-objętościowe), niebuforowanej formaliny 10% (stęŝ. objętościowo-objętościowe), niebuforowanej formaliny 25% (stęŝ. objętościowo-objętościowe), AFA (mieszanina alkoholu, kwasu octowego i formaliny), utrwalacza PEN firmy Richard-Allen Scientific i płynu Bouina. Preparaty tkanek utrwalonych w preparacie Anatech s PreFer nie nadają się do testowania w systemie EGFR pharmdx. Stosowanie systemu EGFR pharmdx w przypadku tkanek utrwalonych w preparacie PreFer powoduje zniekształcenie morfologii tkanek i moŝe prowadzić do błędnych wyników. 14 Skrawki zatapiane w parafinie Do badań nadają się tkanki poddawane rutynowemu przeprowadzaniu i zatapiane w parafinie. Preparaty biopsyjne naleŝy pociąć na bloki o grubości 3 lub 4 mm i utrwalać przez okres właściwy dla danej substancji utrwalającej. Następnie tkanki poddaje się uwodnieniu i oczyszczeniu stosując serię kąpieli alkoholowych i ksylenowych, po czym nasącza płynną parafiną. Temperatura parafiny nie powinna przekraczać 60 C. Właściwie utrwalone i zatopione bloczki tkanek wykazujących ekspresję białka EGFR nadają się do sporządzania preparatów po dowolnym okresie przechowywania, o ile były utrzymywane w chłodnym miejscu, w temperaturze (15 25 C). 13,15 Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o wymiarach 3 5 µm. Po sporządzeniu skrawków naleŝy umieścić preparaty na szkiełkach mikroskopowych i przełoŝyć do suszarki. Zaleca się stosowanie następujących rodzajów szkiełek mikroskopowych: Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized Slides (nr kat. S3003), szkiełka elektrostatyczne lub pokryte warstwą poli-l-lizyny. Stojaki na szkiełka naleŝy osuszyć, uderzając o pochłaniający ręcznik w celu usunięcia wody znajdującej się pod warstwą parafiny i na szkiełku, a następnie suszyć w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie stojak wraz z preparatami naleŝy umieścić na jedną godzinę w cieplarce, w temperaturze C. Po wyjęciu preparatów z cieplarki naleŝy usunąć nadmiar wody, uderzając o pochłaniający ręcznik w celu usunięcia wody znajdującej się pod warstwą parafiny i na szkiełku, a następnie znów suszyć w cieplarce przez jedną godzinę. Po wyjęciu z cieplarki, preparaty naleŝy przechowywać w temperaturze pokojowej aŝ do czasu ich schłodzenia i stwardnienia parafiny. Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe osadzone na szkiełkach (Fisher SuperFrost Plus, szkiełka z warstwą poli-l-lizyny, szkiełka elektrostatyczne lub szkiełka Dako Silanized Slides [nr kat. S3003]) powinny zostać poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C). 14 Szczegółowe informacje dotyczące przygotowywania próbek przedstawiono w podręczniku Dako Immunochemical Staining Methods 16 lub 13. i 15. pozycji piśmiennictwa. Z uwagi na brak odpowiednich badań, nie zaleca się stosowania opisywanego testu w odwapnionych tkankach. Preparaty słuŝące do oceny EGFR i weryfikacji obecności nowotworu naleŝy przygotowywać w tym samym czasie. Zaleca się stosowanie co najmniej 5 szkiełek jednego do badania obecności nowotworu, dwóch do oceny białka EGFR (jedno szkiełko dla przeciwciał pierwotnych i jedno dla odczynnika Negative Control Reagent) oraz dwóch szkiełek zapasowych. Środki ostroŝności 1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek czysty azydek sodu (NaN 3). StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Niemniej jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynników naleŝy uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydku w instalacji kanalizacyjnej Tak jak w wypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, podczas pracy z próbkami i odczynnikami naleŝy stosować odpowiednie procedury. 4. Aby uniknąć tworzenia nieswoistego odczynu naleŝy ograniczyć do minimum zanieczyszczenie mikrobiologiczne odczynnika. 5. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod moŝe powodować błędne wyniki badania. 6. Dostarczone odczynniki mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŝe powodować utratę odczynu antygenów. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 3/14

4 7. Nie naleŝy zastępować przeciwciał pierwotnych ani odczynników kontroli ujemnej przeciwciałami pierwotnymi lub odczynnikami kontroli ujemnej naleŝącymi do róŝnych partii produkcyjnych (numery partii podano na etykietach fiolek), bądź pochodzącymi od róŝnych producentów. 8. W przypadku ekspozycji na silne światło moŝe nastąpić pogorszenie wydajności preparatów Labeled Polymer, Liquid DAB+ Chromogen i gotowy roztwór DAB+ Substrate-Chromogen. Nie naleŝy przechowywać składników systemu ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 9. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą lub oczami. 18. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i ogólnokrajowymi. 10. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie UŜytkowników. 11. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkownicy muszą być dokładnie przeszkoleni w zakresie prawidłowych procedur roboczych, niebezpiecznych właściwości produktu i niezbędnych instrukcji bezpieczeństwa. Dodatkowe informacje zawiera Karta Charakterystyki Substancji. Niebezpieczeństwo DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P202 Nie uŝywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P281 Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Uwaga Wash Buffer (10X): 5-10% Sodium chloride, 5-10% 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol hydrochloride H319 Działa draŝniąco na oczy. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P264 Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. P305 + P351 + P338 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. P337 + P313 Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. Przechowywanie Zestaw EGFR pharmdx naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Preparaty kontrolne muszą być równieŝ przechowywane w temperaturze 2 8 C. Nie naleŝy uŝywać zestawu po upływie daty waŝności wydrukowanej na zewnętrznej części opakowania zestawu. PoniewaŜ nie istnieją ewidentne objawy wskazujące na utratę trwałości produktu, naleŝy wykonywać badanie próbek pochodzących od pacjenta i jednocześnie dodatni i ujemny odczyn kontrolny. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane na wkładce informacyjnej do opakowania, UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość. 12 Przygotowanie odczynników Przed przystąpieniem do barwienia naleŝy przygotować następujące odczynniki: Wash Buffer Solution Przygotować wystarczającą ilość roztworu bufora płuczącego, rozcieńczając odczynnik Wash Buffer 10x wodą destylowaną lub dejonizowaną (wodą do odczynników laboratoryjnych) w stosunku 1:10, dla potrzeb kolejnych etapów oznaczenia. W przypadku zmętnienia naleŝy odrzucić bufor. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Roztwór naleŝy dokładnie wymieszać przed uŝyciem. Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu. Sposób przygotowania 1 ml roztworu DAB+ Substrate-Chromogen. 1. ETAP. Wlać 1 ml roztworu DAB+ Substrate Buffer do probówki. 2. ETAP. Dodać jedną kroplę roztworu Liquid DAB+ Chromogenu. Zmieszać i nałoŝyć na skrawki tkankowe za pomocą pipety. Tak przygotowany roztwór Substrate-Chromogen Solution (DAB) zachowuje trwałość przez ok. 5 dni, o ile jest przechowywany w temperaturze 2 8 C. Uwaga: Roztwór Liquid DAB+ Chromogen w butelce moŝe przyjmować odcienie od przejrzystego do jasnofioletowo-brązowego. Barwa roztworu nie wpływa na wydajność produktu. Stosować rozcieńczenie zgodnie z opisem przedstawionym powyŝej. Dodanie nadmiernej ilości roztworu Liquid DAB+ Chromogen do buforu DAB+ Substrate spowoduje pogorszenie jakości dodatniego odczynu. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 4/14

5 Barwienie kontrastowe W razie potrzeby przygotować wodny roztwór amoniaku do barwienia kontrastowego na niebiesko. W celu przygotowania wodnego roztworu amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l naleŝy wymieszać 2,5 (±0,5) ml wodorotlenku amonu 15mol/L (stęŝonego) z 1 litrem wody do odczynników laboratoryjnych. Niewykorzystany wodny roztwór amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l moŝna przechowywać w temperaturze pokojowej (20-25 C) w szczelnie zamkniętej butelce przez okres do 12 miesięcy. Środek do zatapiania preparatu Zaleca się stosowanie następujących wodnych środków do zatapiania: gotowego preparatu Dako Faramount Aqueous Mounting Medium Ready-to-use (nr kat. S3025) lub Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŝyciem naleŝy przeprowadzić preparat Glycergel w stan płynny, ogrzewając do temperatury ok. 40 (±5) C. MoŜna równieŝ stosować bezwodne środki do zatapiania, np. Dako Ultramount (nr kat. S1964). Wykonanie odczynu Uwagi dotyczące procedury Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŝnie przeczytać podane instrukcje i zaznajomić się ze wszystkimi elementami zestawu (zobacz część Środki ostroŝności). Przed przystąpieniem do wykonania odczynu wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Wszystkie procedury inkubacji naleŝy przeprowadzać równieŝ w temperaturze pokojowej. Podczas wykonywania barwienia nie moŝna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Aby uniknąć wysuszenia preparatów tkankowych naleŝy umieścić szkiełka w komorze nawilŝającej. Usuwanie parafiny i ponowne uwadnianie Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŝy usunąć parafinę z preparatów w celu usunięcia środka zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny poniewaŝ pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie nieswoistego odczynu. 1. ETAP. Umieścić preparaty w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 2. ETAP. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w absolutnym etanolu na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 3. ETAP. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w roztworze etanolu o stęŝeniu 95% na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 4. ETAP. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w wodzie do odczynników laboratoryjnych na 5 (±1) minut. Rozpocząć wykonywanie odczynu zgodnie z opisem w części C, Wykonanie odczynu Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŝy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu. MoŜna stosować ksylen lub substytuty ksylenu, takie jak preparat Histoclear. Wykonanie odczynu 1. ETAP. Trawienie proteolityczne za pomocą Proteinase K Strząsnąć nadmiar wody do odczynników laboratoryjnych. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek (np. Kimwipe lub gazikiem) ostroŝnie otrzeć szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze zgodnym z zaleceniami. Nanieść tyle kropli roztworu Proteinase K, by zakryć próbkę (minimum 3 krople [100µl]). Inkubować przez 5 (±0,5) minut. Delikatnie przemyć wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŝy kierować strumienia wody bezpośrednio na tkankę. Umieścić w kąpieli ze świeŝej wody do odczynników laboratoryjnych na 5 (±1) minut. System EGFR pharmdx obejmuje etap preparatyki wstępnej trawienia enzymem proteolitycznym. Skrawki tkankowe mogą być niekiedy poddawane zbyt intensywnemu trawieniu, co powoduje uszkodzenie błon komórkowych i struktury tkanek. Wykonując odczyn, naleŝy zwracać baczną uwagę na czas trwania trawienia proteolitycznego. Uwaga: W przypadku powtarzającego się zbyt intensywnego trawienia moŝna dodatkowo utrwalić preparaty; skrawki utrwalane w 10% obojętnym roztworze buforowanej formaliny, naleŝy dodatkowo utrwalić w 10% obojętnym roztworze buforowanej formaliny przez 10 minut po odparafinowaniu. Zobacz opis procedury poniŝej: Postępowanie po zakończeniu utrwalania 1. Odparafinować skrawki i zanurzyć w wodzie do odczynników laboratoryjnych. 2. Zanurzyć preparaty w 10% neutralnym roztworze buforowanej formaliny na 10 min. 3. Dwukrotnie przepłukać preparaty wodą dejonizowaną lub destylowaną. 4. Kontynuować procedurę barwienia przy uŝyciu systemu EGFR pharmdx. 2. ETAP. Blok peroksydazowy Strząsnąć nadmiar wody i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Usunąć parafinę ze skrawków i zanurzyć w wodzie do odczynników laboratoryjnych. Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŝy kierować strumienia wody bezpośrednio na preparat. Umieścić w kąpieli ze świeŝym buforem Wash Buffer na 5 (±1) minut. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 5/14

6 3. ETAP. Przeciwciała pierwotne lub odczynnik do kontroli ujemnej Aby uniknąć wysuszenia tkanek, naleŝy umieścić preparaty w komorze nawilŝającej w czasie inkubacji przeciwciał pierwotnych i odczynnika kontroli ujemnej oraz znakowanego polimeru. Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść tyle kropli roztworu przeciwciał pierwotnych lub odczynnika kontroli ujemnej, by zakryć próbkę (minimum 3 krople [100µl]). Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŝacza. Przemyć preparaty tak jak w trakcie etapu ETAP. Labelled Polymer, HRP Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść taką ilość znakowanego polimeru, by preparat został zakryty (minimum 3 krople [100µl]). Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŝacza. Przemyć preparaty tak jak podczas etapu ETAP. DAB+ Substrate-Chromogen Solution Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść tyle kropli roztworu DAB+ Substrate-Chromogen Solution, aby zakryć preparat (minimum 3 krople [100 µl]). Inkubować przez 10 (±1) minut. OstroŜnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŝy kierować strumienia wody bezpośrednio na tkankę. Umieścić odpady roztworu DAB+ Substrate-Chromogen w pojemniku na materiały niebezpieczne w celu właściwego usunięcia. Umieścić w kąpieli z wody destylowanej na 2 5 minut. Barwienie kontrastowe (instrukcje dla hematoksyliny) Barwny produkt końcowy reakcji barwienia jest nierozpuszczalny w alkoholu i wodzie. MoŜna stosować roztwór alkoholowy lub wodny hematoksyliny, np. Dako Hematoxylin (nr kat. S3302) lub Dako Automation Hematoxylin (nr kat. S3301). Nie stosować regresyjnego barwienia kontrastowego. 1. ETAP. Zanurzyć preparaty w kąpieli z hematoksyliny. Inkubować przez 2 5 minut, w zaleŝności od stęŝenia stosowanego roztworu hematoksyliny. 2. ETAP. OstroŜnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych. NaleŜy zadbać, by pozostałości hematoksyliny zostały dokładnie wypłukane. Opcjonalnie: Dziesięciokrotnie zanurzyć preparaty w kąpieli wodnego roztworu amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l (zobacz część Przygotowanie odczynnika) Etap z uŝyciem wodnego roztworu amoniaku nie jest wymagany w przypadku stosowania preparatów Dako Hematoxylin (nr kat. S3302) lub Dako Automation Hematoxylin (nr kat. S3301). Uwaga: Zdecydowanie zaleca się stosowanie preparatów Dako Hematoxylin (nr kat. S3302) lub Dako Automation Hematoxylin (nr kat. S3301). Po pięciominutowym okresie inkubacji, w wyniku barwienia kontrastowego powstaje końcowy produkt reakcji o barwie jasnofioletowej lub niebieskiej, niezakłócający swoistego odczynu immunologicznego. Silne barwienie kontrastowe moŝe maskować słabą ekspresję EGFR. 3. ETAP. OstroŜnie przepłukiwać wodą do odczynników laboratoryjnych przez 2 5 minut. Zatapianie preparatu Zaleca się stosowanie następujących wodnych środków do zatapiania: gotowego preparatu Dako Faramount Aqueous Mounting Medium Ready-to-use (nr kat. S3025) lub Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŝyciem naleŝy przeprowadzić preparat Glycergel w stan płynny, ogrzewając temperatury ok. 40 (±5) C. MoŜna równieŝ uŝywać bezwodnych środków do zatapiania, np. Dako Ultramount (nr kat. S1964). Uwaga: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić w dogodnym momencie. Niemniej jednak, jeŝeli na powierzchni preparatów znajduje się wodny środek do zatapiania, ekspozycja na silne światło moŝe powodować zblaknięcie. Aby ograniczyć blaknięcie naleŝy przechowywać preparaty w zaciemnionym pomieszczeniu o temperaturze pokojowej (20 25 C). Kontrola jakości Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych niŝ zalecane metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania tkanek moŝe spowodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania dodatkowej wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŝnie od standardowych załączonych preparatów kontroli jakości Dako. W USA naleŝy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości wydanymi przez Kolegium Patologów Amerykańskich jako Program certyfikacji immunohistochemicznej (College of American Pathologists CAP: Certification Program for Immunohistochemistry). Dodatkowe informacje przedstawiono w dokumencie Kontrola jakości CLSI dla zatwierdzonych wytycznych dot. immunocytochemii (NCSS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline), 19 oraz pozycjach piśmiennictwa Preparaty kontrolne EGFR pharmdx (w zestawie) KaŜdy z dwóch dostarczanych preparatów kontrolnych zawiera odwirowane komórki pochodzące z dwóch ludzkich linii komórkowych utrwalane w formalinie i zatapiane w parafinie, o nasileniu odczynu 2+ i 0. Dla kaŝdego odczynu naleŝy wykonać barwienie jednego preparatu kontrolnego. Ocena linii komórkowych preparatów kontrolnych Dako pozwala na potwierdzenie waŝności serii odczynów. Preparaty kontrolne nie powinny być uŝywane pomocniczo w interpretacji wyników pacjenta. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej Preparaty kontrolne naleŝy sporządzić ze świeŝych materiałów autopsyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych, moŝliwie szybko przeprowadzanych i zatopionych w sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzącej od pacjenta. Dodatnia kontrola tkankowa potwierdza właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia. Dla wszystkich serii odczynów i dla kaŝdego rodzaju warunków badania naleŝy uwzględnić jedną dodatnią kontrolę tkankową. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 6/14

7 Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni, wskazujący na zdolność do wykrycia niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty kontrolne dostarczane z opisywanym systemem lub preparaty przeprowadzane w sposób odmienny od próbek pochodzących od pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację wydajności odczynników; te preparaty nie pozwalają na weryfikację prawidłowego przygotowania tkanek. Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo podczas formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących od pacjenta. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu za pomocą dodatnich kontroli tkankowych naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są niewaŝne. Do prawidłowych rodzajów komórek, które moŝna uŝyć do uzyskania słabo dodatniego odczynu EGFR naleŝą komórki nabłonka gruczołowego stercza oraz prawidłowy nabłonek oskrzeli płucnych. PoniewaŜ barwienie EGFR jest heterogenne, słabe odczyny prawidłowych struktur tkankowych mogą być interpretowane jako ujemne. Onerwie zapewnia silnie dodatnią kontrolę wewnętrzną. Do prawidłowych tkanek o umiarkowanie dodatnim odczynie EGFR zalicza się komórki nabłonkowe szyjki macicy i skóry. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki dającej odczyn ujemny, w której nie występują białka EGFR. Dla kaŝdej serii odczynów tkanka powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób identyczny do próbki (próbek) pochodzącej od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i identyfikacji swoistego odczynu tła. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŝna wykorzystywać róŝne rodzaje komórek pochodzące z większości przekrojów tkankowych. Pochodzenie tkanek kontrolnych powinno zostać zweryfikowane przez UŜytkownika. JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbek pochodzących od pacjenta naleŝy uznać za niewaŝne. Do struktur tkankowych, które mogą być wykorzystane w charakterze ujemnych kontroli zalicza się kardiomiocyty. Komórki zrazików trzustkowych dają równieŝ ujemny odczyn EGFR, natomiast komórki nabłonka przewodu Ŝółciowego odczyn dodatni. PoniewaŜ odczyn limfocytów teście EGFR pharmdx jest ujemny, te komórki moŝna stosować jako ujemną kontrolę wewnętrzną. Nieswoisty odczynnik do kontroli ujemnej W celu oceny występowania odczynu nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach występowania antygenów, w wycinku kaŝdej próbki pochodzącej od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŝy stosować odczynnik Negative Control Reagent. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Weryfikacja odczynu Przed pierwszym zastosowaniem systemu do wykonywania odczynów UŜytkownik powinien zweryfikować jakość barwienia. W tym celu naleŝy wykonać testy serii wewnętrznych tkanek kontrolnych o znanej charakterystyce odczynów w zakresie IHC, odpowiadających tkankom o dodatnim i ujemnym odczynie. PowyŜsze procedury weryfikacji naleŝy powtarzać dla kaŝdej nowej partii testów. Dodatkowe informacje dotyczące procedur kontroli jakości przedstawiono w poprzedniej części tej wkładki informacyjnej produktu, wymaganiach dotyczących kontroli jakości przedstawionych w dokumencie Program certyfikacji immunohistochemicznej CAP (Certification Program for Immunohistochemistry) i (lub) dokumencie Kontrola jakości CLSI dla zatwierdzonych wytycznych dot. immunocytochemii (NCSS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline). 19 Do weryfikacji odczynu moŝna stosować tkanki raków o znanych odczynach EGFR oraz tkanki o ujemnym odczynie. Tabela 1: Cel codziennej kontroli jakości Rodzaj tkanki: utrwalona i przeprowadzona identycznie jak próbki pochodzące od pacjenta. Preparat kontrolny dostarczany przez firmę Dako. Dodatnia tkanka kontrolna: tkanki lub komórki zawierające antygen. docelowy (mogą występować w tkankach pacjenta). Idealna próba kontrolna jest tkanką wykazującą słabo dodatni odczyn i moŝliwie największą czułość na utratę własności przez przeciwciała lub antygeny. Ujemna tkanka kontrolna: tkanki lub komórki z oczekiwanym ujemnym wynikiem odczynu (mogą występować w tkankach pacjenta lub dodatniej kontroli tkankowej). Swoisty system Antibody & Detection System Wyłącznie odczyn z preparatami kontrolnymi. Ocena linii komórkowych preparatów kontrolnych Dako świadczy o waŝności serii odczynów. Kontrola wszystkich etapów badania. Weryfikacja odczynników i procedur. stosowanych do odczynu EGFR. Detekcja niepoŝądanej reakcji krzyŝowej przeciwciał z komórkami lub strukturami komórkowymi. Dodatkowe informacje: w zestawie dostępne nieswoiste przeciwciała (Mouse IgG 1 Negative Control Reagent). Detekcja nieswoistego odczynu tła. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Tkanka pacjenta. Detekcja odczynu swoistego. Detekcja nieswoistego odczynu tła. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 7/14

8 Interpretacja odczynu Ocena preparatów powinna być prowadzona przez patologa pod mikroskopem świetlnym. Wszystkie analizy naleŝy prowadzić na podstawie oceny części preparatu zawierającej utkanie nowotworu. W celu oceny obecności i nasilenia odczynu immunocytochemicznego naleŝy stosować obiektyw o powiększeniu 10x lub 20x. Do interpretacji naleŝy wybierać jedynie komórki prawidłowe, gdyŝ w komórkach z martwicą lub degeneracją często występują odczyny nieswoiste. 19 Linie komórkowe dające odczyn dodatni i ujemny załączono do kaŝdego z zestawów EGFR pharmdx w celu weryfikacji serii odczynów podczas kaŝdego badania. Odpowiedni odczyn kontrolnej linii komórkowej stanowi dowód na prawidłowe funkcjonowanie testu EGFR pharmdx. odczynu błonowego kontrolnej linii komórkowej CAMA-1 (0) i barwienie całego lub części obwodu komórek kontrolnej linii komórkowej HT-29 na kolor brązowy (2+) wskazuje, Ŝe wynik serii odczynów jest waŝny. JeŜeli intensywność barwienia linii komórkowej kontroli dodatniej jest zbyt słaba lub zbyt silna, naleŝy powtórzyć test z uwagi na ryzyko otrzymania wyniku fałszywie dodatniego lub fałszywie ujemnego. Ilustracje zamieszczono w Przewodniku interpretacji wyników testu EGFR pharmdx. W teście EGFR pharmdx odczyn dotyczy głównie błon komórkowych, przez co barwienie jest widoczne wzdłuŝ całego obwodu komórki lub jego części. Rozmieszczenie zabarwienia jest często heterogenne, ze zróŝnicowanym natęŝeniem odczynu w obrębie pojedynczego nowotworu. Występowanie odczynu obserwowano równieŝ w cytoplazmie i przestrzeni pozakomórkowej. Często obserwuje się barwienie cytoplazmy. Niemniej jednak jeŝeli intensywne zabarwienie cytoplazmy utrudnia identyfikację barwienia diagnostycznego błony komórkowej i interpretację wyników, naleŝy powtórzyć test. Przypadki nowotworów naleŝy przekazywać jako dodatnie lub ujemne ze względu na EGFR na podstawie obserwowanego odczynu ocenianej struktury błony komórkowej. Dodatni wynik ekspresji EGFR jest zdefiniowany jako barwienie błony komórki nowotworowej silniejsze niŝ odczyn tła, obejmujące cały obwód komórki lub jego część. barwienia błonowego silniejszego niŝ odczyn tła naleŝy przekazywać jako wynik ujemny ze względu na EGFR. W zaleŝności od czasu inkubacji i stęŝenia roztworu hematoksyliny, barwienie kontrastowe powoduje wybarwienie jąder komórkowych na kolor blady do ciemnoniebieskiego. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać interpretację wyników. Tabela 2: Wyniki barwienia EGFR pharmdx Wynik przekazywany lekarzowi prowadzącemu leczenie Nowotwór EGFR-ujemny Nowotwór EGFR-dodatni Definicja barwienia błon komórkowych silniejszego niŝ tło we wszystkich komórkach nowotworowych Odczyn dodatni definiuje się jako wystąpienie jakiegokolwiek barwienia błon komórek nowotworu ponad poziom tła, niezaleŝnie czy barwienie dotyczy całego obwodu komórki czy jego części. Intensywność odczynu Udział procentowy wybarwionych komórek nowotworowych 1+, 2+ lub 3+ >0% PowyŜsze definicje wyników dodatnich i ujemnych są zgodne z piśmiennictwem 24, ale w niektórych kontekstach moŝe być konieczne zmodyfikowanie ich (Patrz sekcja Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu poniŝej). Ograniczenia metody Ograniczenia ogólne IHC jest wieloetapową metodą diagnostyczną, wymagającą specjalistycznego przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do IHC i interpretacji wyników barwienia. Odczyn tkankowy jest uzaleŝniony od obróbki i przeprowadzenia tkanki przed wykonaniem barwienia. Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŝanie, rozmraŝanie, przemywanie, suszenie, ogrzewanie lub zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŝe powodować artefakty, ukrycie przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych wyników moŝe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub naturalne zmienne czynniki związane z tkankami. Nadmierne lub niecałkowite barwienie kontrastowe moŝe utrudniać prawidłową interpretację wyników. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być dokonywana w kontekście objawów klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych i innych badań diagnostycznych. Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŝy wykonać w akredytowanej pracowni histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przegląd wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych. Tkanki pochodzące od osób z zakaŝeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową. 25 W tkankach które nie zostały uprzednio przetestowane odczynniki mogą wykazywać nieoczekiwane reakcje. Nie moŝna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji równieŝ w przetestowanych tkankach z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo. 22 W przypadku uzyskania nieoczekiwanych reakcji naleŝy przesłać odpowiednią dokumentację do działu wsparcia technicznego firmy Dako. Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych niŝ immunologiczne moŝe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą równieŝ wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności persksydazy (cytochromu C). 21 ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 8/14

9 Uwaga: Odczynniki i instrukcje dostarczane z systemem opracowano z myślą o uzyskaniu optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych lub niezgodnych wyników. Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu Odsetek odpowiedzi klinicznych u przyjmujących cetuximab pacjentów EGFR-ujemnych i EGFR-dodatnich z odczynem w mniej niŝ jednym procencie komórek nowotworowych nie jest znany, poniewaŝ w próbach klinicznych leku nie uczestniczyli pacjenci spełniający te kryteria. Nowotwory, w których dodatni odczyn ze względu na EGFR występuje w >1% komórek uznaje się za wykazujące ekspresję EGFR będącą obowiązującym obecnie wskazaniem do uŝycia cetuximabu. Pacjenci, u których odczyn błonowy z zestawem EGFR wystąpił w mniej niŝ jednym procencie komórek nowotworu, nie zostali włączeni do randomizowanej klinicznej próby kontrolnej panitumumabu, dlatego aktywność panitumumabu u tej populacji pacjentów nie jest znana. Nowotwory, w których >1% komórek wykazuje odczyn EGFR-dodatni, uznaje się za wykazujące ekspresję EGFR, co stanowi obecnie wskazanie do stosowania leku panitumumab. Wyniki fałszywie ujemne mogą być spowodowane procesem stopniowego rozkładu antygenu w tkankach. JeŜeli próbki przechowywano w temperaturze pokojowej (20 25 C), powinny być poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od osadzenia preparatów tkankowych na 14, 26 szkiełkach. W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, w preparatach utrwalanych standardowo i zatapianych w parafinie naleŝy zastosować proteolityczne trawienie białka EGFR. Charakterystyka wydajnościowa Swoistość Testowano reaktywność przeciwciał przeciw EGFR, klon 2-18C9 (2-18C9) z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję EGFR, HER2, HER3 i HER4. W testach Western blot lizatów komórkowych SKBR3 i A431 z przeciwciałami 2-18C9 uzyskano prąŝek odpowiadający masie cząsteczkowej 170 kd, zgodnej ze znaną masą cząsteczkową EGFR. Stwierdzono równieŝ, Ŝe klon 2-18C9 pozwala na rozpoznanie formy receptora EGFRvIII (145 kd) w badaniach immunohistochemicznych, cytometrii przepływowej i Western blot transfekowanych linii komórkowych. W badaniach eksperymentalnych metodą Western blot, przeciwciała 2-18C9 nie wykazywały reakcji z HER2, natomiast wykazywały reaktywność z lizatami komórek CAMA-1, ekstraktami białkowymi z transformowanych pod względem HER-3 szczepów E. coli BL-21 oraz transfekowanych lizatów komórkowych CHO-HER4. Poza tym w transfekowanych komórkach jajników chomika chińskiego (Chinese Hamster Ovary CHO) wykazujących ekspresję genu myc (koniec wektora) (zarówno samodzielnie jak i łącznie z jednym z białek z rodziny HER), stosowano hodowlę w szkiełkach z komorami hodowlanymi. Wykonano utrwalanie w formalinie i zatapianie w parafinie oraz test z przeciwciałami anty-myc i anty-2-18c9. Przeciwciała anty-myc dawały odczyn z wszystkimi pięcioma transfekowanymi liniami komórkowymi CHO, natomiast przeciwciała anty-2-18c9 dawały odczyn jedynie z komórkami CHO transfekowanymi genem HER1. Próby kliniczne Próby kliniczne cetuximabu Przeprowadzono trzy badania z uŝyciem cetuximabu w grupie pacjentów z rakiem jelita grubego (CRC) (EMD , IMCL CP i IMCL CP ). Dodatni wynik odczynu IHC EGFR Dako stosowano jako jedno z kryteriów spełnienia warunków badania. W 2 z 3 badań, w tym badaniu osiowym EMD , próg dodatniego wyniku ustalono dla odczynu o nasileniu 1+ (zakres wyników wynosił od 0 do +3) obecnego w > 1% wszystkich komórek nowotworowych. Ten próg ustalono, poniewaŝ analiza podgrup uwzględniających wszystkie progi kryteriów odczynu błonowego i inne kryteria róŝnicujące nie pozwoliła na wykrycie istotnych róŝnic pod względem wyników klinicznych. Badanie osiowe cetuximabu Do badania osiowego (EMD ) zakwalifikowano pacjentów, u których za pomocą testu EGFR pharmdx stwierdzono obecność komórek dodatnich ze względu na EGFR. We wszystkich nowotworach objętych badaniem odsetek komórek EGFR-dodatnich wynosił co najmniej 1% i nowotwory takie opisywano jako wykazujące ekspresję EGFR. Pacjenci z nowotworami wykazującymi ekspresję EGFR otrzymywali cetuximab w monoterapii lub cetuximab łącznie z irinotekanem. Badano 577 preparatów nowotworów. W 474 z 577 (82%, 95% przedział ufności = 78,1%, 86,1%) preparatów raka jelita grubego stwierdzono dodatni wynik badania na ekspresję EGFR. 329 pacjentów badanych testem EGFR pharmdx rozdzielono w sposób losowy w stosunku 2:1 do dwóch grup badania osiowego leku. W grupie pacjentów otrzymujących irinotekan i cetuximab uzyskano odsetek odpowiedzi klinicznych wynoszący 50/218 (22,9%, 95% przedział ufności = 17,5%, 29,1%). W grupie pacjentów otrzymujących wyłącznie cetuximab uzyskano odsetek odpowiedzi klinicznych wynoszący 12/111 (10,8%, 95% CI = 5,7%, 18,1%). Cetuximab stosowano tylko u pacjentów, u których test Dako wykazał ekspresję EGFR, zgodnie z powyŝszą definicją. Procentowa wartość odpowiedzi klinicznych w przypadku pacjentów bez ekspresji EGFR jest nieznana i jako taka nie moŝe być uwzględniona w porównaniach. Nie stwierdzono korelacji między nasileniem odpowiedzi nowotworu na leczenie a odsetkiem komórek wykazujących dodatni odczyn EGFR lub nasileniem odczynu na EGFR (patrz Tabela 3). ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 9/14

10 Tabela 3: Badanie osiowe cetuximabu (EMD ) odsetkowe wartości odpowiedzi Całkowita liczba badanych pacjentów Odsetkowa wartość odpowiedzi # pacjentów otrzymujących cetuximab i irinotekan Odsetkowa wartość odpowiedzi # pacjentów otrzymujących cetuximab EGFR pharmdx + (>1%) 474* 50/218 (22,9%, 12/111 (10,8%, 95% CI = 17,5%, 29,1%) 95% CI = 5,7%, 18,1%) EGFR pharmdx Nie leczeni Nie leczeni *329 pacjentów rozdzielono w sposób losowy w stosunku 2:1 do dwóch grup badania leku. # Ustalono, Ŝe odsetek odpowiedzi klinicznych oznacza procentowy udział pacjentów, u których uzyskano zmniejszenie o 50% sumy prostopadłych średnic mierzalnej tkanki nowotworowej (tj. zmniejszenie rozmiarów guza obliczane na podstawie jego powierzchni o co najmniej 50%), utrzymujące się przez co najmniej 28 dni. Procentowy udział określano w odniesieniu do całej populacji badania. Badania dodatkowe cetuximabu W fazie badań cetuximabu test EGFR pharmdx stosowano w ramach kryteriów włączania pacjentów do badania osiowego EMD oraz jednego badania dodatkowego (IMCL CP ). W badaniu IMCL CP testowano 140 preparatów. Z tej liczby stwierdzono dodatni wynik badania na obecność EGFR w 105 z 140 (75%, 95% CI = 66,9%, 83,1%) preparatów raka jelita grubego. Do badania włączono w sumie 61 pacjentów, a cetuximab otrzymywało 57 pacjentów. W drugim badaniu dodatkowym (IMCL CP ), prototypowy zestaw EGFR pharmdx, w skład w którego wchodziły przeciwciała pierwotne identyczne do opisywanych powyŝej, stosowano w celu włączenia pacjentów do badania. Testowano w sumie 412 preparatów pobranych od 401 pacjentów. Dodatni wynik badania stwierdzono u 292 z 401 (72,8%, 95% CI = 68,0%, 77,6%) pacjentów. Do badania zakwalifikowano 139 pacjentów; 138 pacjentów otrzymywało leczenie skojarzone za pomocą cetuximabu i irinotekanu. Tabela 4.: Podsumowanie wartości procentowych dodatniego wyniku EGFR u pacjentów z rakiem jelita grubego Nr badania Badanie osiowe EMD Badanie dodatkowe IMCL CP Badanie prototypowe EGFR IMCL CP Odsetek EGFR-dodatnich (l. dodatnich/l. badanych) % EGFRdodatnich 95% przedziały ufności 474/577 82,1% 78,1 86,1% 105/140 75,0% 66,9 83,1% 292/401 72,8% 68,0 77,6% Badania kliniczne panitumumabu Dane o skuteczności uzasadniające stosowanie panitumumabu w leczeniu pacjentów z odpornym na leczenie przerzutowym rakiem okręŝnicy (mcrc) uzyskano z badań pacjentów, u których nowotwory były EGFR-dodatnie w badaniu za pomocą testu Dako EGFR pharmdx. Kontrolowana randomizowana próba kliniczna panitumumabu Wieloośrodkowe, randomizowane, otwarte badanie porównawcze panitumumabu ( , towarzyszące badanie w okresie wydłuŝonym: ) z najlepszym leczeniem podtrzymującym (BSC) w porównaniu z samym najlepszym leczeniem podtrzymującym chorych na przerzutowego raka okręŝnicy, u których nieskuteczna była chemioterapia środkami zawierającymi oksaliplatynę i irynotekan, i u których odczyn błonowy EGFR występował w 1% badanych komórek nowotworu. W obu grupach leczenia mediana odsetka komórek nowotworowych z dodatnim odczynem błonowym EGFR wynosiła 20% (zakres: od 1% do 100%). W badaniu w grupie leczonej panitumumabem z towarzyszącym BSC zaobserwowano znamienną statystycznie poprawę w pierwotnym punkcie końcowym (zdefiniowanym jako czas przeŝycia bez progresji, PFS) w porównaniu z grupą objętą tylko BSC (p < 0,0001, próba warstwowa log-rank). W tej randomizowanej próbie kontrolowanej odsetek odpowiedzi klinicznych wynosił 8,3% (19/229, 95% przedział ufności: 5,1%, 12,6%), przy czym uwzględniano odpowiedzi pełne albo częściowe (zmodyfikowane kryteria RECIST) o potwierdzonym czasie trwania co najmniej 4 tygodnie. Odpowiedni odsetek odpowiedzi u 174 pacjentów przeniesionych z leczenia BSC do leczenia panitumumabem w towarzyszącym badaniu w okresie przedłuŝonym wynosił 9,8% (17/174, 95% przedział ufności: 5.8%,15.2%). Nie stwierdzono korelacji między wpływem leczenia na czas przeŝycia bez progresji a odsetkiem komórek wykazujących dodatni odczyn błonowy EGFR lub nasileniem odczynu z EGFR. (Zobacz tabelę 5 poniŝej). ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 10/14

11 Tabela 5: Wpływ leczenia na czas przeŝycia bez progresji a odczyn z EGFR Badanie Liczba pacjentów / zdarzeń Stopień ryzyka a 95-procentowy przedział ufności dla stopnia ryzyka Wszyscy randomizowani 463 / 401 0,54 (0,44; 0,66) <0,0001 % odczynów błonowych z EGFR b a 1-<10% 114 / 91 0,46 (0,30; 0,71) 0, % 182 / 157 0,55 (0,40; 0,76) 0,0004 >35% 164 / 150 0,56 (0,40; 0,78) 0,0007 Maksymalne nasilenie odczynu błonowego z EGFR / 113 0,61 (0,41; 0,90) 0, / 206 0,49 (0,37; 0,65) <0, / 80 0,61 (0,39; 0,97) 0,0379 Wartość p Stopnie ryzyka dla panitumumabu z leczeniem BSC względem samego leczenia BSC oszacowano na podstawie modelu proporcjonalnego ryzyka Coxa skorygowanego dla punktacji ECOG i regionu geograficznego. Wartość < 1,0 oznacza niŝszą średnią częstość zdarzeń i dłuŝszy czas do wystąpienia zdarzenia dla grupy leczonej panitumumabem z BSC względem grupy objętej tylko BSC. b wykluczono 3 pacjentów, u których nowotwór wykazywał odczyn błonowy z EGFR w < 1% komórek (naruszenia protokołu) c wykluczono 2 pacjentów, u których nowotwór wykazywał odczyn błonowy z EGFR w < 1% komórek i maksymalne nasilenie odczynu błonowego z EGFR < 1+ (naruszenia protokołu) Tabela 6: Podsumowanie wartości procentowych przypadków ekspresji EGFR u pacjentów z rakiem jelita grubego Nr badania Badanie osiowe Stosunek ekspresji EGFR (l. dodatnich/l. badanych) % EGFRdodatnich 95-procentowe przedziały ufności 735/ ,2% 70,4 75,9% Powtarzalność Powtarzalność między seriami odczynów Powtarzalność między seriami odczynów testowano w ciągu 3 dni przy uŝyciu manualnej metody badania w dwóch pracowniach. W kaŝdej pracowni dwóch patologów badało 5 róŝnych preparatów po 4 dodatnie i 1 ujemny. ZróŜnicowane nasilenie odczynu preparatów randomizowano i maskowano. Uzyskano znakomitą powtarzalność (100%), dla wyników dodatnich i ujemnych ze względu na EGFR odpowiednio 0 oraz 1+, 2+ i 3+. Nasilenie odczynu róŝniło się o 1+ w dwóch spośród dodatnich preparatów i o 2+ w jednym preparacie. W jednym z testów dodatni fragment tkankowy został niemal całkowicie spłukany ze szkiełka. Dwa preparaty z ujemnym wynikiem badania pozostały ujemne. Powtarzalność odczynów między pracowniami Powtarzalność między pracowniami testowano w trzech pracowniach połoŝonych w róŝnych obszarach geograficznych, przy uŝyciu 30 randomizowanych i maskowanych preparatów zawierających tkanki o róŝnych nasileniach odczynu IHC. ŚwieŜo przygotowane preparaty przesłano do kaŝdej z pracowni w celu wykonania odczynów ręcznych i automatycznych oraz oceny przez histopatologa. Wartość procentowa powtarzalności między pracowniami wyniosła 100% dla dychotomicznego badania dodatnie/ujemne; zarówno w badaniu metodą manualną jak i automatyczną 0 oznaczało wynik ujemny, a 1+, 2+ i 3+ dodatni dla ekspresji białka EGFR. Immunoreaktywność W tabeli 7. przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności testu EGFR pharmdx w panelu prawidłowych tkanek. Zaleca się stosowanie podanych tkanek. Wszystkie skrawki utrwalano w formalinie i zatapiano w parafinie. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 11/14

12 Tabela 7.: Podsumowanie odczynów uzyskanych w prawidłowych tkankach przy uŝyciu przeciwciał EGFR pharmdx* Rodzaj tkanki (liczba testowanych przypadków) Nadnercza (2) Szpik kostny (3) Gruczoły sutkowe (2) Mózg/móŜdŜek (3) Mózg/mózgowie (3) Szyjka macicy (3) Jelito grube (3) Przełyk (2) Serce (3) Nerki (3) Wątroba (3) Płuca (3) Komórki międzybłonka (3) Jajniki (3) Trzustka (3) Przytarczyce (1) Nerwy obwodowe (3) Przysadka mózgowa (3) Gruczoł krokowy (3) Ślinianki (3) Mięśnie szkieletowe (3) Skóra (3) Jelito cienkie (3) Śledziona (3) śołądek (3) Jądra (3) Grasica (3) Tarczyca (3) Migdałki (3) Macica (3) Struktura wykazująca dodatnią ekspresję EGFR oraz rodzaj odczynu Komórki kory (2+): Odczyn cytoplazmatyczny Komórki nabłonka zrazików (2+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Warstwa drobinowa (1+): Odczyn przestrzeni pozakomórkowej Komórki warstwy podstawnej nabłonka wielowarstwowego płaskiego (2+): Odczyn błonowy ** Komórki podstawne nabłonka płaskiego (2+): Odczyn błonowy Cewki (1+): Odczyn cytoplazmatyczny (ziarnisty) Hepatocyty (sinusoidy) (3+); Przewodziki Ŝółciowe (3+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Komórki wyścielające pęcherzyki płucne/komórki podstawne nabłonka płaskiego (komórki mioepitelialne) (2+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Komórki międzybłonka (2+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Przewody trzustkowe (2+): Odczyn błonowy Wypustki komórek nerwowych (1+): Odczyn włókienkowy Komórki nabłonka gruczołowego (2+): Odczyn błonowy Struktury przewodzików (1+): Odczyn cytoplazmatyczny Komórki podstawne nabłonka płaskiego (2+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Nabłonek płaski (3+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Nabłonek gruczołów endometrium (2+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Komórki podścieliska endometrium (2+): Odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Warstwa mięśniowa: * W przypadku większości testowanych tkanek stwierdzono odczyn fibroblastów w tkance podścieliska (1+), onerwia i komórek mioepitelialnych. Niekiedy obserwowano endogenny odczyn eozynofilów wywoływany przez peroksydazę. **Obserwowano zmienny odczyn immunologiczny prawidłowego nabłonka jelita grubego. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 12/14

13 Rozwiązywanie problemów Tabela 8.: Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. barwienia preparatów. 2. Słabe barwienie preparatów. 3. Nadmierne barwienie tła we wszystkich preparatach. 4. Tkanka oddziela się od szkiełka. 5. Nadmiernie silny odczyn swoisty. 6. Słaby odczyn 2+ kontrolnej linii komórkowej. 7. Nadmierne trawienie preparatu tkankowego. 1a. Odczynniki nie są uŝywane we właściwej kolejności. 1b. Azydek sodu obecny w kąpieli z buforem płuczącym. 2a. Niedostateczne trawienie enzymatyczne Proteinase K. 2b. Skrawki zawierają zbyt duŝo roztworu po kąpieli płuczącej. 2c. Preparaty nie są inkubowane wystarczająco długo z przeciwciałami lub roztworem DAB+ Substrate- Chromogen Solution. 2d. UŜyto niewłaściwej metody utrwalania. 3a. Niecałkowicie usunięta parafina. 3b. Podczas zatapiania skrawków zastosowano pochodne skrobi. 3c. Preparaty nie są odpowiednio przemywane. 3d. Wysychanie skrawków podczas wykonywania odczynu. 3e. Nieswoiste wiązanie odczynników do skrawka tkanki. 4a. Zastosowano niewłaściwe szkiełka mikroskopowe. 5a. UŜyto niewłaściwej metody utrwalania. 5b. Zbyt długie czasy inkubacji odczynników. 5c. UŜyto niewłaściwego roztworu płuczącego. 6a. Niedostateczne trawienie enzymatyczne Proteinase K. 6b. Preparaty nie są inkubowane wystarczająco długo z przeciwciałami lub roztworem DAB+ Substrate- Chromogen Solution. 6c. Nastąpiła utrata własności preparatu kontrolnego. 7a. Zbyt długi czas inkubacji z Proteinase K. 7b. Niewłaściwe utrwalanie. 1a. Sprawdzić sposób uŝycia odczynników. 1b. Stosować świeŝy bufor płuczący dostarczany z zestawem. 2a. Dopilnować, by roztwór Proteinase K był inkubowany przez pełne 5 min. 2b. OstroŜnie usunąć nadmiar roztworu przed wytarciem preparatu wokół skrawka. 2c. Sprawdzić zalecany czas inkubacji. 2d. Dopilnować, by tkanki pacjenta nie były poddawane nadmiernemu utrwalaniu i Ŝe jest stosowana zatwierdzona substancja utrwalająca (zobacz część Przygotowanie materiału). 3a. Stosować świeŝe roztwory do przemywania; postępować zgodnie z opisem procedury w części Usuwanie parafiny i ponowne uwadnianie. 3b. Unikać stosowania jakichkolwiek dodatków zwiększających przyczepność skrawków do szkiełek mikroskopowych. Wiele takich preparatów wykazuje reaktywność immunologiczną. 3c. Zastosować świeŝe roztwory w kąpielach z buforem i butelkach z roztworem płuczącym. 3d. Stosować komorę nawilŝającą. Dopilnować, by na szkiełka były nanoszone odpowiednie objętości odczynnika. Wycierać tylko trzy do czterech szkiełek w czasie pomiędzy nanoszeniem odczynnika. 3e. Dopilnować właściwego utrwalania preparatów i (lub) upewnić się, Ŝe preparat nie zawiera obszarów martwicy. 4a. Stosować szkiełka elektrostatyczne (Fisher SuperFrost Plus) lub silanilizowane (Dako Silanized Slides, nr kat. S3003). 5a. Dopilnować, by były stosowane jedynie zatwierdzone substancje utrwalające i metody utrwalania (zobacz część Przygotowanie materiału). 5b. Przejrzeć instrukcje podane w części Wykonanie odczynu. 5c. Stosować wyłącznie rozcieńczony bufor płuczący dostarczany z zestawem. 6a. Dopilnować, by roztwór Proteinase K był inkubowany przez pełne 5 min. 6b. Sprawdzić zalecany czas inkubacji. 6c. Sprawdzić datę waŝności i warunki przechowywania zestawu podane na etykiecie opakowania. 7a. Dopilnować, by roztwór Proteinase K był inkubowany nie dłuŝej niŝ przez 5 min. 7b. Po zakończeniu utrwalania stosować procedurę opisaną w protokole wykonywania odczynu dla nowych preparatów; wykonać barwienie przy uŝyciu standardowej procedury. Uwaga: Więcej informacji podano w części Troubleshooting w publikacji Dako Handbook: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition, 16 the Atlas of Immunohistology, 23 or Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 20 W razie wystąpienia niezwykłego odczynu naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 13/14

14 Piśmiennictwo 1. Carpenter G, Cohen S. Epidermal growth factor. J Biol Chem 1990; 265: Riese DJ, Stern DF. Specificity within the EGF family/erbb receptor family signaling network. Bioessays 1998; 20:41 3. Coussens L, Yang-Feng TL, Liao Y-C, Chen E, Gray A, McGrath J, Seeburg PH, Libermann TA, Schlessinger J, Francke U, Levinson A, Ullrich A. Tyrosine kinase receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu oncogene. Science 1985; 230: Yamamoto T, Ikawa S, Akiyama T, Semba K, Nomura N, Miyajima N, Saito T, Toyoshima K. Similarity of protein encoded by the human c-erb-b-2 gene to epidermal growth factor receptor. Nature 1986; 319: Schechter AL, Hung M-C, Vaidyanathan L, Weinberg RA, Yang-Feng TL, Francke U, Ullrich A, Coussens L. The neu gene: An erbbhomologous gene distinct from and unlinked to the gene encoding the EGF receptor. Science 1985; 229: Gusterson B, Cowley G, Smith JA, Ozanne B. Cellular localization of human epidermal growth factor receptor. Cell Biol Intl Rpts 1984; 8(8): Gullick WJ. Prevalence of aberrant expression of the epidermal growth factor receptor in human cancers. Br Med Bull 1991; 47(1):87 8. Sainsbury JRC, Farndon JR, Sherbet GV, Harris AL. Epidermal-growth-factor receptors and oestrogen receptors in human breast cancer. Lancet 1985; 1(8425): Ozanne B, Richards CS, Hendler F, Burns D, Gusterson B. Over-expression of the EGF receptor is a hallmark of squamous cell carcinomas. J Pathol 1986; 149:9 10. Werner MH, Nanney LB, Stoscheck CM, King LE. Localization of immunoreactive epidermal growth factor receptors in human nervous system. J Histochem Cytochem 1988; 36: Pii K, Andersen FG, Jensen S, Spaulding B. Characterization of a new monoclonal antibody, clone 2-18C9, for the measurement of Epidermal Growth Factor Receptor expression in solid tumors. Am Assoc Canc Res 95 th annual meeting, Abst #5029 Orlando, Fl Mar Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS and Störkel S. Immunohistochemical detection of EGFR in paraffinembedded tumor tissues: Variation in staining intensity due to choice of fixative and storage time of tissue sections. J Histochem Cytochem 2004; 52: Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved guideline. Villanova, PA Order code M29-A2 19. CLSI (formerly NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)). Quality assurance for immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA Order code MM4-A Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special report: quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. In: Atlas of immuno-histology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; Goldstein NS, Armin M. Epidermal growth factor receptor immunohistochemical reactivity in patients with American Joint Committee on Cancer Stage IV colon adenocarcinoma: implications for a standardized scoring system. Cancer 2001; 92: Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1980; 73: Press MF, Hung G, Godolphin W, Slamon DJ. Sensitivity of HER-2/neu antibodies in archival tissue samples: Potential source of error in immunohistochemical studies of oncogene expression. Cancer Res 1994; 54:2771 ( ) P04035PL_01/K1492/ tr. 14/14