EnVision DuoFLEX Doublestain System, (Link)

Transkrypt

1 EnVision DuoFLEX Doublestain System, (Link) Nr kat. SK110 Wydanie 06/15 Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania testów. Dla urządzeń Autostainer Link. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 1/12

2 Spis treści Strona Przeznaczenie... 3 Streszczenie i informacje ogólne... 3 Odczynniki... 3 Środki ostroŝności... 5 Przechowywanie... 8 Przygotowanie odczynników... 8 Pobieranie i przygotowanie próbek... 9 Procedura... 9 Kontrola jakości Interpretacja wyników Piśmiennictwo ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 2/12

3 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. System detekcji Dako EnVision DuoFLEX Doublestain System jest przeznaczony do stosowania w immunohistochemii, razem z aparatami do barwienia Dako Autostainer Link. System został stworzony do równoczesnego wykrywania wielu róŝnych antygenów w jednej próbce. System wykrywa pierwotne przeciwciała mysie i królicze, a zachodząca reakcja jest wizualizowana przy uŝyciu chromogenów EnVision DuoFLEX DAB+ i EnVision DuoFLEX Permanent Red. Odczynniki EnVision DuoFLEX są przeznaczone do stosowania na skrawkach tkankowych utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie. Streszczenie i informacje ogólne System detekcji Dako EnVision DuoFLEX Doublestain System został zaprojektowany w celu uzyskania optymalnego odczynu w urządzeniach Dako Autostainer Link, przy zastosowaniu procedur zalecanych w niniejszej ulotce. System przydatny jest do równoczesnego wykrywania wielu antygenów obecnych w niskich lub wysokich stęŝeniach w jednej próbce. Obrazowanie oparte jest na peroksydazie (HRP) z wykorzystaniem DAB+ jako chromogenu i fosfatazy alkalicznej (AP) oraz chromogenu Permanent Red. System nie zawiera biotyny, co znacząco redukuje odczyny nieswoiste wynikające z endogennego wiązania awidyny-biotyny. Procedura polega na równoczesnym podwójnym odczynie, w którym dwa antygeny obrazowane są za pomocą odpowiednio HRP/DAB+ i AP/Permanent Red. Odczynnik EnVision DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block hamuje występującą w niektórych tkankach aktywność endogennej fosfatazy alkalicznej, peroksydazy i pseudoperoksydazy. Po zablokowaniu enzymów endogennych pierwszym krokiem jest inkubacja próbki z mieszaniną optymalnie rozcieńczonych mysich i króliczych przeciwciał pierwotnych, po której następuje inkubacja z odczynnikiem EnVision DuoFLEX /HRP, a następnie z EnVision DuoFLEX /AP. Reakcja obrazowana jest za pomocą EnVision DuoFLEX DAB+ Chromogen dla przeciwciała mysiego i EnVision DuoFLEX Permanent Red dla przeciwciała króliczego. W zestawie dostarczane są wszystkie podane odczynniki oprócz przeciwciał pierwotnych. Zaleca się stosowanie przeciwciał z serii gotowych do uŝycia mieszanin przeciwciał Dako DuoFLEX lub stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako. Do rozcieńczania stęŝonych przeciwciał pierwotnych Dako zaleca się stosowanie odczynnika EnVision FLEX Antibody Diluent (K8006). UWAGA: Odczynniki w tym zestawie są przeznaczone do pracy jako całość i powinny być uŝywane w sposób opisany w sekcji Procedura. W szczególności, gdy mają być zastosowane roztwory chromogenu, wszystkie odczynniki naleŝy uŝywać zgodnie z instrukcją, nawet jeśli tylko jeden chromogen ma być zastosowany. Niestosowanie się do określonego protokołu moŝe spowodować nieprawidłowe wyniki barwienia, w tym moŝliwość braku wybarwienia. Odczynniki A: Materiały dostarczane z nr kat. SK110 1 x 30 ml EnVision DuoFLEX Dual Endogenous Enzyme Block Ready-to-Use Roztwór blokujący enzymy endogenne, ph 2, zawiera 1-<5% nadtlenku wodoru, detergenty, inhibitory enzymów i środek konserwujący. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 3/12

4 1 x 30 ml EnVision DuoFLEX/HRP Ready-to-Use Peroksydaza chrzanowa oraz przeciwciała izolowane ze względu na powinowactwo w postaci koniugatów polimerowych dekstranu. Dostarczane w buforze Tris/HCl zawierającym białko stabilizujące i środek konserwujący. 1 x 30 ml EnVision DuoFLEX/AP Ready-to-Use Fosfataza alkaliczna oraz przeciwciała izolowane ze względu na powinowactwo w postaci koniugatów polimerowych dekstranu. Dostarczane w buforze zawierającym białko stabilizujące i środek konserwujący. 2 x 36 ml EnVision DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer Roztwór buforowy substratu, ph 7,5, zawierający roztwór nadtlenku wodoru o stęŝeniu < 0,1%, substancje stabilizujące, substancje wzbogacające i środek przeciwbakteryjny. 1 x 2,16 ml EnVision DuoFLEX DAB+ Chromogen Roztwór chromogenu tetrachlorowodorku 3,3 -diaminobenzydyny. 2 x 36 ml EnVision DuoFLEX Permanent Red Substrate Buffer Buforowany roztwór substratu. 1 x 0,72 ml EnVision DuoFLEX Permanent Red Chromogen Roztwór Permanent Red Chromogen. 3 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) Koncentrat 50x Bufor Tris/EDTA, ph 9. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 4/12

5 1 x 1 L EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Koncentrat 20x Roztwór soli fizjologicznej z buforem TRIS, zawierający Tween 20, ph 7,6 (±0,1). 3 x 12 ml User-Fillable Reagent Bottle, pojemność 12 ml Butelki są przeznaczone do mieszania i przechowywania roztworu roboczego DAB+ i roztworu roboczego Permanent Red (patrz takŝe część Przygotowanie odczynników). B. Materiały wymagane, ale niedostarczane Aparat Autostainer Link Dako PT Link Dako Proteinase K, Ready-to-Use (w razie potrzeby) Mieszanina gotowych do uŝycia przeciwciał Dako DuoFLEX lub odpowiednio rozcieńczone stęŝone przeciwciała królicze lub mysie dostarczone przez firmę Dako Przybory do aparatu Dako Szkiełka mikroskopowe Odczynniki laboratoryjne ogólnego zastosowania do odparafinowania skrawków tkankowych zatopionych w parafinie Środek do zatapiania (wodny lub oparty na rozpuszczalniku organicznym) i szkiełka nakrywkowe C. Odczynniki opcjonalne K8004 K8005 K8006 K8007 K8008 EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) 3 x 30 ml, koncentrat 50x Bufor Tris/EDTA, ph 9. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) 3 x 30 ml, koncentrat 50x Bufor cytrynianowy, ph 6,1. EnVision FLEX Antibody Diluent 120 ml, gotowy do uŝycia Bufor Tris, ph 7,2, zawierający 15 mmol/l NaN 3 i białko. EnVision FLEX Wash Buffer (20x) 1 x 1L, koncentrat 20x Roztwór soli fizjologicznej z buforem TRIS, zawierający Tween 20, ph 7,6 (±0,1). EnVision FLEX Hematoxylin Środki ostroŝności 1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 5/12

6 2. Odczynniki EnVision DuoFLEX/HRP i DuoFLEX/AP zawierają materiał pochodzenia zwierzęcego. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 3. Odczynników EnVision DuoFLEX DAB+ Chromogen i EnVision DuoFLEX Permanent Red Chromogen lub przygotowanego roztworu roboczego DAB+ bądź roztworu roboczego Permanent Red nie wystawiać na działanie silnego światła. 4. Produkt EnVision DuoFLEX Endogenous Enzyme Block zawiera < 0,1% 3(2H)- izotiazolonu, 5-chloro-2-metylo-, zmieszanego z 2-metylo-3(2H)- izotiazolonem i jest oznaczony: H314 H317 P280 P261 P264 P272 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P330 + P331 P303 + P361 + P353 + P363 + P310 P302 + P352 P333 + P313 P305 + P351 + P338 + P310 P405 P501 Niebezpieczeństwo Powoduje powaŝne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. MoŜe powodować reakcję alergiczną skóry. Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. Unikać wdychania par. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. Zanieczyszczonej odzieŝy ochronnej nie wynosić poza miejsce pracy. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeŝe powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umoŝliwiającej swobodne oddychanie. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. Wypłukać usta. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzieŝ. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Wyprać zanieczyszczoną odzieŝ przed ponownym uŝyciem. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: Umyć duŝą ilością wody/ W przypadku wystąpienia podraŝnienia skóry lub wysypki: Zgłosić się do lekarza po poradę. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Zdjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są załoŝone i moŝna je łatwo usunąć. Kontynuować przepłukiwanie. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. Przechowywać pod zamknięciem. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 5. Produkt EnVision DuoFLEX DAB+ Chromogen zawiera 1 5% czterochlorku dwufenylo- 3,3',4,4'-tetrailotetraamonu i jest oznaczony: Niebezpieczeństwo H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P202 Nie uŝywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 6/12

7 P405 P501 lekarską. Przechowywać pod zamknięciem. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 6. Przestroga. Produkt zawiera substancję, która nie została jeszcze w pełni przebadana. Na Ŝyczenie uŝytkowników profesjonalnych udostępniana jest Karta Charakterystyki Substancji. 7. Produkt EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) zawiera 5 10% trometamolu, 1 5% nonylfenolu etoksylowanego oraz 1 5% kwasu octowego, (etylenodinitrylo)tetra-, sól dwusodową dwuwodną. Produkt EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x), jest oznaczony: Uwaga H319 H411 P280 P273 P264 P305 + P351+ P338 P337 + P313 P501 Działa draŝniąco na oczy. Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Unikać uwolnienia do środowiska. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 8. Produkt EnVision FLEX Wash Buffer (20x) zawiera 10 30% chlorowodorku 2-amino-2- (hydroksymetylo)propano-1,3-diolu i jest oznaczony: Uwaga H319 H315 P280 P264 P302 + P352 + P P363 P332 + P313 P305 + P351 + P338 P337 + P313 Działa draŝniąco na oczy. Działa draŝniąco na skórę. Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: Umyć duŝą ilością wody z mydłem. Zdjąć zanieczyszczoną odzieŝ. Wyprać zanieczyszczoną odzieŝ przed ponownym uŝyciem. W przypadku wystąpienia podraŝnienia skóry: Zgłosić się do lekarza po poradę. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Wyjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są i moŝna je łatwo usunąć. Nadal płukać. Jeśli podraŝnienie oczu się utrzymuje: Zgłosić się do lekarza po poradę. 9. Opcjonalny odczynnik EnVision FLEX Antibody Diluent (nr kat. K8006) zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3 ), w czystej postaci. Azydek sodu zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 10. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 11. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 7/12

8 Przechowywanie Odczynniki EnVision DuoFLEX i EnVision FLEX przechowywać w temperaturze 2-8 C. Odczynnik EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8008) naleŝy przechowywać w temperaturze pokojowej. Nie naleŝy uŝywać odczynników po upływie terminu waŝności podanego na zestawie. Nie łączyć elementów zestawów z róŝnych partii. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane na ulotce dołączanej do opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z produktem, naleŝy się skontaktować z naszym działem wsparcia technicznego. Przygotowanie odczynników 1. EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph NaleŜy rozcieńczyć roztwór EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. Niewykorzystany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2-8 C przez miesiąc. W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do uŝycia. W przypadku stosowania PT Link w procedurze przygotowania próbek 3-w-1, rozcieńczony roztwór moŝe zostać wykorzystany 3 razy w ciągu 5 dni, jeśli przechowywano go w temperaturze pokojowej. 2. EnVision FLEX Wash Buffer NaleŜy rozcieńczyć bufor EnVision FLEX Wash Buffer w wodzie destylowanej lub dejonizowanej, w ilości wystarczającej do wykonania planowanej procedury. Niewykorzystany rozcieńczony roztwór moŝna przechowywać w temperaturze 2-8 C przez miesiąc. W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do uŝycia. 3. Roztwór roboczy DAB+ Roztwór roboczy DAB+ przygotowuje się przez dokładne wymieszanie 1 ml EnVision DuoFLEX DAB+ Substrate Buffer z 1 kroplą (25 30 µl) chromogenu DAB+. Przygotować tylko objętość wymaganą dla liczby wybarwianych slajdów. Gotowy roztwór roboczy DAB+ zachowuje trwałość przez około 5 dni, gdy jest przechowywany temperaturze 2-8 C. Przed uŝyciem roztwór naleŝy wymieszać. Osady powstające w roztworze w ciągu 5 dni nie mają wpływu na jakość odczynu. W przypadku pracy z urządzeniem Dako Autostainer Link, roztwór roboczy DAB+ naleŝy przygotować w butelce do odczynników Autostainer Link. 4. Roztwór roboczy Permanent Red Roztwór roboczy Permanent Red przygotowuje się, mieszając 100 części buforu do substratu Permanent Red z jedną częścią chromogenu Permanent Red, tj. wymieszanie 1 ml buforu do substratu Permanent Red z 10 µl chromogenu Permanent Red. Przygotować tylko objętość wymaganą dla liczby wybarwianych slajdów. Roztwór naleŝy wykorzystać w ciągu 30 minut. W przypadku pracy z urządzeniem Dako Autostainer Link, roztwór roboczy Permanent Red naleŝy przygotować w butelce do odczynników Autostainer Link. 5. Wytyczne optymalnego rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych System EnVision DuoFLEX Doublestain System jest kompatybilny z mieszaninami gotowych do uŝycia przeciwciał Dako DuoFLEX. Optymalne rozcieńczenie dla innych mieszanin przeciwciał przygotowywanych z koncentratów powinno zostać określone przez uŝytkownika. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 8/12

9 Pobieranie i przygotowanie próbek Preparatami mogą być utrwalane w formalinie i zatapiane w parafinie skrawki tkanek. Do konserwacji próbek moŝna uŝyć róŝnych utrwalaczy. Próbek nie naleŝy utrwalać w obojętnej zbuforowanej formalinie przez czas przekraczający 24 godziny, a w miarę moŝliwości czas utrwalania powinien być jak najkrótszy. Optymalna grubość skrawków zatopionych w parafinie wynosi około 4 µm. Próbki naleŝy zatapiać na szkiełkach mikroskopowych. Próbki powinny być umieszczone na szkiełkach maksymalnie płasko i bez fałdowania. Zbyt duŝe pofałdowanie będzie miało wpływ na wynik odczynu. UWAGA: NaleŜy uŝywać szkiełek mikroskopowych o szerokości odpowiedniej dla systemu Dako Autostainer Link. Informacje dotyczące właściwych szkiełek mikroskopowych patrz Podręcznik uŝytkownika poszczególnych urządzeń Dako. Skrawki parafinowe naleŝy zatapiać z podgrzanej łaźni wodnej z wodą destylowaną lub dejonizowaną. Łaźnia wodna nie powinna zawierać Ŝadnych dodatków (takich jak Ŝelatyna, poli-llizyna itp.). Skrawki powinny być suszone przez ogrzewanie, zasadniczo w temperaturze < 60 C przez co najmniej 60 minut (np. przez noc). Aby zapewnić właściwe przyleganie skrawków do szkiełek, waŝne jest osuszenie wody spod skrawków przed rozpoczęciem suszenia. Procedura W celu uzyskania optymalnego wyniku odczynu urządzenia Dako Autostainer Link wykorzystują róŝnorodne techniki. Przed uŝyciem wybranego protokołu w automacie Dako Autostainer Link naleŝy dokładnie zapoznać się z instrukcją obsługi tego automatu Dako. W celu zapewnienia powtarzalnego odmaskowania epitopu zaleca się, by zawsze ładować uchwyt na slajdy do pełna. Zapewnia to identyczne podgrzewanie skrawków w kaŝdej procedurze. Wszsytkie odczynniki zestawu dostarczane są we butelkach do odczynników Autostainer Link. Roztwór roboczy DAB+ oraz roztwór roboczy Permanent Red uŝywany w urządzeniu Dako Autostainer Link naleŝy przygotowywać we butelce do odczynnika Autostainer Link. Przed przystąpieniem do wykonania odczynu wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20-25 C). Wszystkie procedur y inkubacji naleŝy równieŝ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. W przypadku zastosowania EnVision DuoFLEX Doublestain System do skrawków utrwalanych formaliną i zatapianych w parafinie naleŝy przeprowadzić następującą obróbkę wstępną. Próbki naleŝy odparafinować i uwodnić. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowania próbek patrz część A.5 ulotki produktu indywidualnych mieszanin przeciwciał pierwotnych Dako. Zalecana procedura przygotowywania preparatów 3-w-1 z uŝyciem PT link: 1. Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńczenie koncentratu EnVision FLEX Target Retrieval Solution wodą destylowaną lub dejonizowaną. 2. Napełnić zbiorniki PT Link wystarczającą ilością (1,5 L) roztworu roboczego, by pokryć skrawki tkankowe. 3. Ustawić PT Link do wstępnego podgrzania roztworu do temperatury 65 C. 4. Zanurzyć zatopione, utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie tkanki w podgrzanym EnVision FLEX Target Retrieval Solution (roztwór roboczy) i inkubować przez minut w temperaturze 97 C. Optymalny czas inkubacji powinie n zostać określony przez uŝytkownika. 5. Pozostawić skrawki w PT Link do ochłodzenia do temperatury 65 C. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 9/12

10 6. Wyciągnąć stojaki na szkiełka ze zbiornika PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) z rozcieńczonym roztworem EnVision FLEX Wash Buffer, nr kat. K8007 o temperaturze pokojowej. 7. Pozostawić szkiełka w rozcieńczonym EnVision FLEX Wash Buffer, nr kat. K8007 na 1-5 minut. 8. Umieścić szkiełka w urządzeniu Dako Autostainer Link i kontynuować odczyn. Skrawki nie powinny wyschnąć w trakcie obróbki ani procedury barwienia immunocytochemicznego. Wysuszenie próbek moŝe powodować nasilenie odczynu nieswoistego. W przypadku stosowania w PT Link do procedury HIER, rozcieńczonych odczynników Target Retrieval Solution i Wash Buffer moŝna uŝyć 3 razy w ciągu 5 dni, jeśli przechowywano je w temperaturze pokojowej. Procedura HIER z uŝyciem PT Link: Po odparafinowaniu i nawodnieniu buforem (wodą), większość skrawków tkankowych wymaga poddaniu procedurze cieplnego odmaskowania antygenu (heat-induced epitope retrieval, HIER). 1. Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńczenie koncentratu EnVision FLEX Target Retrieval Solution wodą destylowaną lub dejonizowaną. 2. Napełnić zbiorniki PT Link wystarczającą ilością (1,5 L) roztworu roboczego, by pokryć skrawki tkankowe. 3. Ustawić PT Link do wstępnego podgrzania roztworu do temperatury 65 C. 4. Zanurzyć ręcznie odparafinowane/nawodnione tkanki w podgrzanym EnVision FLEX Target Retrieval Solution (roztwór roboczy) i inkubować przez minut w temperaturze 97 C. Optymalny czas inkubacji powinien zostać określony przez uŝytkownika. 5. Pozostawić skrawki w PT Link do ochłodzenia do temperatury 65 C. 6. Wyciągnąć stojaki na szkiełka ze zbiornika PT Link i natychmiast zanurzyć szkiełka w słoju/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) z rozcieńczonym roztworem EnVision FLEX Wash Buffer, nr kat. K8007 o temperaturze pokojowej. 7. Pozostawić szkiełka w rozcieńczonym EnVision FLEX Wash Buffer, nr kat. K8007 na 1-5 minut. 8. Umieścić szkiełka w urządzeniu Dako Autostainer Link i kontynuować odczyn. Skrawki nie powinny wyschnąć w trakcie obróbki ani procedury barwienia immunocytochemicznego. Wysuszenie próbek moŝe powodować nasilenie odczynu nieswoistego. 9. W celu wykonania barwienia hematoksyliną zanurzyć preparaty w kąpieli z roztworu hematoksyliny. Długość lub czas inkubacji zaleŝy od stęŝenia uŝywanego roztworu hematoksyliny. Po barwieniu kontrastowym hematoksyliną preparat naleŝy starannie wypłukać wodą destylowaną lub dejonizowaną. Dla naczyń Coplin: 1. Umieścić naczynia do barwienia zawierające EnVision FLEX Target Retrieval Solution w łaźni wodnej. 2. Doprowadzić łaźnię wodną z roztworem EnVision FLEX Target Retrieval Solution do temperatury C. Osłonić naczynka pokrywkami w celu ustabilizowania temperatury i eliminacji parowania. 3. Zanurzyć skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym wstępnie roztworze EnVision FLEX Target Retrieval Solution w naczyniach do barwienia. 4. Doprowadzić temperaturę łaźni wodnej i roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution z powrotem do C. 5. Wyciągnąć naczynie z preparatami z łaźni wodnej. Pozostawić skrawki do ochłodzenia w EnVision FLEX Target Retrieval Solution przez 20 (±1) minut w temperaturze pokojowej. ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 10/12

11 6. Zlać EnVision FLEX Target Retrieval Solution i wypłukać skrawki w EnVision FLEX Wash Buffer. 7. Umieścić stojak z wypłukanymi skrawkami w urządzeniu Dako Autostainer Link. Niezwłocznie rozpocząć zaprogramowane wcześniej wybarwienie. UWAGA: W przypadku stosowania naczyń Coplin podczas procedury HIER, rozcieńczonych odczynników EnVision FLEX Target Retrieval Solution i EnVision FLEX Wash Buffer moŝna uŝyć tylko 1 raz (jednorazowego uŝytku). Niektóre, nieliczne epitopy nie są odporne na cieplne odmaskowanie (HIER), a niektóre wymagają wstępnego trawienia enzymatycznego. Odpowiednie instrukcje moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania uŝywanych mieszanin przeciwciał pierwotnych Dako. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides firmy Dako (nr kat. K8020). Inkubacja z mieszaniną przeciwciał pierwotnych: Mieszaniny gotowych do uŝycia przeciwciał pierwotnych Dako DuoFLEX moŝna uŝywać z systemem detekcji Dako EnVision DuoFLEX Doublestain system do skrawków utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie. W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji jako procedurę DuoFLEX. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŝywanym urządzeniu Autostainer Link, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Optymalne czasy inkubacji mieszaniny przeciwciał pierwotnych EnVision DuoFLEX/HRP i EnVision DuoFLEX /AP zaleŝne są od stosowanej mieszaniny przeciwciał pierwotnych. Odpowiednie instrukcje moŝna znaleźć w ulotce dołączonej do opakowania uŝywanych mieszanin przeciwciał pierwotnych Dako. UŜytkownik musi zweryfikować stosowaną procedurę. Po wybarwieniu preparaty naleŝy zatopić. W celu zatapiania przy uŝyciu środka rozpuszczalnego w wodzie zaleca się stosowanie preparatów Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563) lub Faramount Aqueous Mounting Medium (nr kat. S3025). W przypadku niewodnego zatopienia trwałego zaleca się całkowite wysuszenie szkiełek na powietrzu w temperaturze pokojowej lub przez 1 godzinę w temperaturze 60 C, a następnie inkubację w ksylenie lub jego substytucie przez 5 minut. NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w niektórych przypadkach mogą być obserwowane małe, punktowe artefakty dla próbek suszonych na powietrzu przed nałoŝeniem szkiełek nakrywkowych. Ten problem moŝna rozwiązać przez obróbkę preparatów według jednej z następujących procedur: Opcja 1: Natychmiastowe przeniesienie preparatów mikroskopowych tkanek z urządzenia Autostainer do alkoholu: D. 99% alkohol z inkubacją przez okres do 2 minuty, lub E. Trzy kolejne kąpiele w 100% alkoholu, po 10 zanurzeń w kaŝdej. Następnie preparaty naleŝy zanurzyć po 10 razy w kaŝdej z dwóch kolejnych kąpieli w ksylenie, po czym preparaty trwale zatopić. Opcja 2: Natychmiastowe przeniesienie preparatów mikroskopowych tkanek z urządzenia Autostainer do kolejnych stęŝeniach alkoholu, ale tylko przez 30 sekund w kaŝdym kroku i bez poddawania działaniu ksylenu, po czym preparaty trwale zatopić. DłuŜsze działanie alkoholu i/lub ksylenu moŝe prowadzić do ekstrakcji chromogenu, a tym samym spowodować gorszej jakości barwienie. NaleŜy zauwaŝyć, Ŝe procedury te nie były testowane na kaŝdym przeciwciele pierwotnym i dlatego powinny być traktowane jedynie jako wytyczne. W związku z tym działanie zmodyfikowanego protokołu odwodnienia, następujące po trwałym zatopieniu preparatów musi być zweryfikowane w celu zapewnienia, Ŝe jest ono nadal aktualne w odniesieniu do wspomnianych przeciwciał pierwotnych. KaŜde uŝyte przeciwciało ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 11/12

12 pierwotne naleŝy ocenić według skorygowanego protokołu odwodnienie, aby potwierdzić, Ŝe odczyn jest taki jak opisany w części Charakterystyka wydajnościowa. Kontrola jakości W kaŝdej serii odczynów naleŝy uwzględnić jedną dodatnią próbkę kontrolną, co pozwoli potwierdzić prawidłowe działanie wszystkich zastosowanych odczynników. JeŜeli za pomocą kontroli dodatniej nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu, naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów badanych są niewaŝne. Interpretacja wyników Antygen rozpoznawany przez przeciwciało mysie wybarwiany jest przez chromogen DAB+ na brązowo. Antygen rozpoznawany przez przeciwciało królicze wybarwiany jest przez chromogen Permanent Red na czerwono. Oba kolory pozwalają na obrazowanie po wybarwieniu kontrastowym hematoksyliną. Jeśli dojdzie do powstania odczynu nieswoistego, moŝna go będzie rozpoznać jako rozmyte odczyny brązowe lub czerwone. Jądra komórkowe w barwieniu kontrastowym hematoksyliną barwią się na niebiesko. W przypadku określonych tkanek podczas niewielkich zadań (tj. z uŝyciem ok. dziewięciu lub mniejszej liczby preparatów) wykonywanych w urządzeniu Autostainer Link moŝliwe jest wystąpienie odczynu tła. Odczyn tła moŝna wyeliminować poprzez wydłuŝenie czasów płukania w protokole barwienia. Aby uzyskać więcej informacji naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Piśmiennictwo 1. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby Company; 1980 Producent: Dako North America, Inc Via Real Carpinteria, CA 93013, USA ( ) P04070PL_01/SK110/ str. 12/12