TOP2A IQFISH pharmdx. Wydanie 3. Nr kat. K5733. Do stosowania w diagnostyce in vitro. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 badań.

Transkrypt

1 / TOP2A IQFISH pharmdx Nr kat. K5733 Wydanie 3. Do stosowania w diagnostyce in vitro. Zestaw zawiera odczynniki wystarczające do wykonania 20 badań. P04092PL_02/K str. 1/39

2 Spis treści Strona Przeznaczenie... 3 Streszczenie i informacje ogólne... 3 Zasady procedury... 4 Odczynniki... 4 Dostarczane materiały... 4 Materiały wymagane, ale niedostarczane... 6 Środki ostrożności... 6 Przechowywanie... 9 Przygotowanie próbek... 9 Skrawki zatapiane w parafinie... 9 INSTRUKCJA UŻYCIA A. Przygotowanie odczynników A.1 Pre-Treatment Solution A.2 Bufor do płukania głębokiego A.3 Buforze do płukania A.4 Seria rozcieńczeń etanolu A.5 Roztwór pepsyny B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury B.2 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu B.3. Procedura barwienia Kontrola jakości Interpretacja odczynu Ograniczenia metody Ograniczenia ogólne Charakterystyka działania Czułość analityczna Swoistość analityczna Badania wrażliwości wyników Powtarzalność Odtwarzalność Użyteczność kliniczna Badanie pilotażowe Badanie potwierdzające - DBCG 89D/TOP2A Metodyka badania Metodologia statystyczna Wyniki Dyskusja i wnioski Rozwiązywanie problemów Dodatek Dodatek Dodatek Piśmiennictwo Objaśnienie symboli P04092PL_02/K str. 2/39

3 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. TOP2A IQFISH pharmdx stworzono do wykrywania amplifikacji i delecji (zmian liczby kopii) genu TOP2A, w wykorzystaniem techniki hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH) w utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków raka sutka. Delecje i amplifikacje genu TOP2A stanowią marker złego rokowania u pacjentek wysokiego ryzyka z rakiem sutka. Wykrywanie w teście TOP2A IQFISH pharmdx amplifikacji genu TOP2A jest zalecane jako metoda przewidywania wskaźnika przeżywalności bez nawrotów u pacjentek wysokiego ryzyka z rakiem sutka leczonych dodatkowo chemioterapią z wykorzystaniem epirubicyny. Wyniki testu TOP2A IQFISH pharmdx mają pełnić funkcję wspomagającą wobec istniejących informacji klinicznych i patologicznych. Streszczenie i informacje ogólne Gen TOP2A koduje enzym topoizomerazę IIα (topo IIα), która katalizuje rozpad i ponowne łączenie dwuniciowego DNA prowadzące do relaksacji superspiral DNA. Topoizomerazy typu II są podstawowymi enzymami przekształcającymi topologiczne formy DNA poprzez tworzenie przejściowych dwuniciowych pęknięć w szkielecie DNA (1). Enzymy te grają istotną rolę w wielu podstawowych procesach jądrowych (2), łącznie z replikacją, transkrypcją, tworzeniem struktury chromosomu, kondensacją i segregacją (3). Gen topoizomerazy IIα, TOP2A, występuje w dwóch kopiach we wszystkich prawidłowych komórkach diploidalnych i jest zlokalizowany na chromosomie 17q21 (4). Gen TOP2A obejmuje obszar około 27,5 kb i zawiera 35 eksonów kodujących białko o masie cząsteczkowej 170 kda (5). Białko topo IIα jest uznawane za marker proliferacji, a ekspresja topo IIα zmienia się w cyklu komórkowym zarówno w komórkach prawidłowych, jak i nowotworowych (6). Ekspresja topo IIα w rakach sutka koreluje z ekspresją Ki-67 (7-10). Nie znaleziono prostej zależności dla topo IIα na poziomie białkowym i genowym (7, 9, 10). Tylko w 20% przypadków z nadekspresją białka topo IIα występuje amplifikacja genu TOP2A lecz wśród przypadków z amplifikacją genu TOP2A nadekspresja białka topo IIα występuje w 93% (11). Na nadekspresję topo IIα wydaje się składać kilka czynników współistniejących, zarówno amplifikacja swoista dla nowotworu, jak i większa szybkość proliferacji komórek. Ekspresja białka Ki-67 i topo IIα przebiega równolegle, co można uznać za potwierdzenie wpływu szybkości proliferacji na ekspresję topo IIα, nawet w przypadkach z amplifikacją TOP2A (12). Topoizomerazy typu II stanowią cel dla antracyklin takich jak doksorubicyna i epirubicyna, nazywanych również inhibitorami topoizomerazy (13-15). Status HER2 jako markera predykcyjnego dla antracyklin jest kwestią kontrowersyjną i jak zauważono, brak uzasadnienia biologicznego takiego wnioskowania. W dalszej części poddano pod dyskusję, czy HER2 powinien być traktowany jako marker zastępczy lub pseudo-marker rzeczywistego celu antracyklin, jakim jest topoizomeraza II (16-18). Wykazano, że liczba kopii TOP2A wpływa na wrażliwość nowotworu na działanie inhibitorów topoizomerazy (16-28). Parametry kliniczne zestawu Dako TOP2A FISH pharmdx Kit były oznaczane w dwóch badaniach przeprowadzonych przez Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) w Kopenhadze (21, 29, 30). Ostatnie badanie wskazuje na istnienie (21, 30) amplifikacji genu TOP2A w około 10% raka sutka oraz delecji w podobnej liczbie przypadków, gdy w badaniu uwzględniono zarówno nowotwory HER2 pozytywne, jak i negatywne. Wstępnie zakładano, że nieprawidłowa liczba kopii genu TOP2A, jako wynik amplifikacji lub delecji dotyczyła tylko P04092PL_02/K str. 3/39

4 nowotworów z amplifikacją HER2 (16, 31). Niedawno zmiany liczby kopii genu TOP2A wykryto w próbkach nowotworów o normalnym statusie genu HER2 (21, 23, 29, 30, 32, 33). W badaniu DBCG, zmiany w TOP2A zostały odnalezione w niemal 60% przypadków pierwotnych nowotworów sutka z amplifikacją HER2, natomiast 20% przypadków nowotworów z nieprawidłowym TOP2A posiadało normalny status HER2 (21, 23, 29, 30, 32). Badanie to zostało potwierdzone przez inne badanie przeprowadzone w Kanadzie, które wykazało, że status genu TOP2A (amplifikacja lub delecja) jest znaczącym czynnikiem predykcyjnym dla korzyści z chemioterapii opartej na epirubicynie (23). U około 35% pacjentów w tym badaniu występowały nowotwory z amplifikacją HER2 i wykazano statystycznie znaczące powiązanie ze statusem genu HER2 i występowaniem aberracji TOP2A (23, 34). W przypadku badań aberracji genu TOP2A większość wyników jest zgodna pod względem wartości predykcyjnej badań TOP2A(21-25, 30), w przeciwieństwie do wyników badań nad HER2 (35). Jakkolwiek geny HER2 i TOP2A są zlokalizowane w tym samym amplikonie i niektóre badania skupiły się na ko-amplifikacji genów (22, 24, 25), badanie DBCG 89D i inne wykazały, że geny te powinny być traktowane i badane oddzielnie (10, 20, 21, 26-30). Zasady procedury TOP2A IQFISH pharmdx zawiera wszystkie odczynniki niezbędne do wykonania testu FISH z użyciem utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie próbek skrawków tkanek. Po deparafinizacji i rehydratacji próbki podgrzewa się w roztworze Do obróbki wstępneja następnie przeprowadza trawienie proteolityczne pepsyną. Po podgrzaniu i proteolitycznym nadtrawieniu do zestawu dodaje się gotową mieszankę sond FISH Probe Mix wyprodukowaną w oparciu o technologię PNA (peptydowego kwasu nukleinowego) (36) oraz DNA. Mieszanina sond składa się z mieszaniny znakowanych czerwienią teksańską sond DNA, będących klonami kosmidów, obejmujących region długości 228 kb amplikonu TOP2A na chromosomie 17 oraz mieszaniny znakowanych fluoresceiną sond PNA, skierowanych przeciwko obszarowi centromeru chromosomu 17. W wyniku swoistej hybrydyzacji z obszarami docelowymi uzyskuje się wyraźny czerwony sygnał fluorescencyjny dla każdego amplikonu TOP2A oraz wyraźny zielony sygnał fluorescencyjny dla każdego centromeru chromosomu 17. Po bardzo dokładnym przepłukaniu próbki osadza się na szkiełku przy użyciu Fluorescencyjnego środka do zatapiania, zawierającego DAPI, a następnie przykrywa szkiełkiem nakrywkowym. Wyniki interpretuje się przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w odpowiednie filtry (zob. Dodatek 3). Komórki rakowe są lokalizowane i następnie oceniane pod kątem stosunku sygnałów TOP2A/CEN-17. Zdrowe komórki w analizowanym skrawku tkanki spełniają rolę wewnętrznej kontroli dodatniej skuteczności preparowania oraz hybrydyzacji próbki. Szczegółowe informacje przedstawiono w rozdziale Interpretacja odczynu. TOP2A IQFISH pharmdx, nr kat. K5733 jest odpowiedni do odczynów wykonywanych metodą manualną. Odczynniki Dostarczane materiały Wymienione poniżej materiały wystarczają do wykonania 20 badań (pojedyncze badanie definiuje się dla pojedynczego obszaru docelowego o rozmiarach 22 mm x 22 mm). Liczbę testów określono przy założeniu zużycia 250 µl (5 8 kropli) roztworu na preparat z fiolki 2A, 10 µl na preparat z fiolki 3 oraz 15 µl na preparat z fiolki 5. Roztwory w fiolce 3 i w fiolce 5 są lepkie i powinny być krótko odwirowywanie w mikrowirówce aby zebrać cały użyty odczynnik. Zestaw zawiera ilość materiału wystarczającą na 10 indywidualnych serii odczynu (cztery oddzielne serie, w razie stosowania metody z zanurzaniem w pepsynie). TOP2A IQFISH pharmdx jest dostarczany w suchym lodzie. Obecność suchego lodu przy odbiorze stanowi gwarancję, iż składniki zestawu nie były poddane działaniu wysokich temperatur podczas transportu. Prosimy zwrócić uwagę na to, że niektóre składniki mogą P04092PL_02/K str. 4/39

5 pozostać niezamrożone; nie wpływa to jednak na jakość działania zestawu TOP2A IQFISH pharmdx. Fiolka 1 Fiolka 2A Fiolka 2B Fiolka 3 Fiolka 4 Fiolka 5 Fiolka 6 Roztwór do obróbki wstępnej(20x) 150 ml, 20-krotnie stężony Bufor MES (kwas 2-[N-morfolino]etanosulfonowy). Pepsyna 4 x 6,0 ml, gotowy do użycia Roztwór pepsyny o ph 2,0; zawiera środek stabilizujący i przeciwbakteryjny. Rozcieńczalnik pepsyny (10x) 24 ml, koncentrat 10x Bufor do rozcieńczania o ph 2,0; zawiera środek przeciwbakteryjny. Mieszanina sond TOP2A/CEN-17 IQISH 0,2 ml, gotowy do użytku Mieszanina znakowanych czerwienią teksańską sond DNA dla TOP2A oraz znakowanych fluoresceiną sond PNA dla CEN-17; dostarczana w buforze hybrydyzacyjnym IQISH. Bufor do płukania głębokiego(20x) 150 ml, 20-krotnie stężony Bufor SSC (sól fizjologiczna z cytrynianem sodowym) z detergentem (Tween20). Fluorescencyjny środek do zatapiania 0,4 ml, gotowy do użytku Preparat fluorescencyjny do osadzania preparatu histologicznego, zawierający 500 µg/l DAPI (4,6-diamidyno-2-fenyloindol). Bufor do płukania(20x) 500 ml, 20-krotnie stężony Bufor Tris/HCl. Szczeliwo do szkiełek nakrywkowych 1 tubka, gotowe do użytku Rozpuszczalnik do szczeliwa szkiełka nakrywkowego UWAGA: Następujące odczynniki zestawu: Roztwór do obróbki wstępnej(20x), Pepsyna, Rozcieńczalnik pepsyny (10x), Bufor do płukania głębokiego(20x), Fluorescencyjny środek do zatapiania, Bufor do płukania(20x) i Szczeliwo do szkiełek nakrywkowych są wymienne z następującymi odczynnikami zestawu Dako Histology FISH Accessory Kit, nr kat. K5799. P04092PL_02/K str. 5/39

6 Materiały wymagane, ale niedostarczane Odczynniki laboratoryjne Woda destylowana lub dejonizowana Etanol, 96% Ksylen lub jego odpowiedniki Sprzęt laboratoryjny Waciki Pipety nastawne Wykalibrowany termometr do częściowego zanurzania (zakres C) Wykalibrowany termometr powierzchniowy (zakres C) Szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm) Dako Hybridizer (nr kat. S2450/S2451)* Płyta grzejna lub piec hybrydyzacyjny* Wilgotna komora hybrydyzacyjna* Pinceta Wyciągow MicrocentrifugeSlides, Szkiełka silanizowane Dako Silanized Slides nr kat. S3003 lub szkiełka opłaszczone poli-l-lizyną (patrz Przygotowanie próbek) Słoje lub łaźnie barwiące Stoper (odpowiedni do wyznaczenia 2 15-minutowych okresów) Mieszadło wirowe Łaźnia wodna z pokrywą (zapewniająca utrzymanie temperatury 37 (±2) C, 63 (±2) C oraz od 95 C do 99 C) Kuchenka mikrofalowa z funkcją detekcji, jeżeli w procedurze wstępnej wykorzystywana jest kuchenka mikrofalowa (patrz B3. Protokół barwienia. Etap 1: Obróbka wstępna, Metoda B) * Może być również użyta płyta grzejna lub piec hybrydyzacyjny do denaturacji (66 (±2) C) i hybrydyzacji (45 (±2) C) wraz z wilgotną komorą hybrydyzacyjną. Sprzęt i przybory mikroskopowe Filtry do mikroskopu fluorescencyjnego: podwójny filtr dla DAPI i FITC/czerwieni teksańskiej lub pojedyncze filtry dla FITC i czerwieni teksańskiej szczegółowe informacje w Załączniku 3. Należy stosować mikroskop fluorescencyjny ze źródłem światła w postaci lampy rtęciowej 100 W. Do stosowania z wymienionymi filtrami nie są zalecane inne źródła światła. Pojemnik na preparaty (tekturowa podstawka na 20 preparatów z odchylaną przegubowo pokrywą lub podobny). Środki ostrożności 1. Do badań diagnostycznych in vitro. 2. Do stosowania przez wyszkolony personel. 3. Fiolka 1, roztwór Pre-Treatment Solution (20x), nie wymaga oznaczenia jako produkt niebezpieczny. Karta charakterystyki substancji jest dostępna na żądanie wyszkolonego personelu. 4. Fiolka 2A, odczynnik Pepsin, zawiera 5 <10% propan-2-olu, 0,1 <0,3% pepsyny A, 0,011 <0,1% 5-chloro-2-metylo-4-izotiazolin-3-onu i 2-metylo-2H-izotiazol-3-onu. Fiolka 2A ma etykietę: P04092PL_02/K str. 6/39

7 Niebezpieczeństwo H314 H317 P280 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 + P310 P305 + P310 P405 P501 Powoduje poważne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. Może powodować reakcję alergiczną skóry Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Stosować odzież ochronną. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ (lub na włosy): natychmiast usunąć/zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Natychmiast skontaktować się z ośrodkiem zatruć lub lekarzem. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem. Przechowywać pod zamknięciem. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 5. Fiolka 2B, odczynnik Pepsin Diluent (10x) zawiera 50 <75% propan-2-olu i 5 <10% chlorowodorku 2-amino-2-(hydroksymetylo)propan-1,3-diolu Fiolka 2B ma etykietę: Niebezpieczeństwo H225 H319 H336 P280 P210 P241 P304 + P340 P303 + P361 + P533 P235 P501 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. Działa drażniąco na oczy. Może wywoływać uczucie senności lub zawroty głowy. Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić. Używać sprzętu elektrycznego, wentylacyjnego, oświetleniowego oraz przeznaczonego do przenoszenia substancji, który został dopuszczony do pracy w środowisku zagrożonym wybuchem. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeże powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umożliwiającej swobodne oddychanie. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ (lub na włosy): natychmiast usunąć/zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Przechowywać w chłodnym miejscu. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 6. Fiolka 3, mieszanina sond HER2/CEN-17 IQISH Probe Mix, zawiera 10 <25% węglanu etylenu i 3 <5% chlorku sodu. Fiolka 3 ma etykietę: H319 P280 Ostrzeżenie Działa drażniąco na oczy. Stosować ochronę oczu lub twarzy. P04092PL_02/K str. 7/39

8 P264 P305 + P351 + P338 Dokładnie umyć ręce po użyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: płukać ostrożnie wodą przez kilka minut. W przypadku posiadania szkieł kontaktowych należy je usunąć, jeśli to możliwe. Kontynuować płukanie. 7. Fiolka 4, bufor Stringent Wash Buffer (20x), zawiera 10 <25% chlorku sodu i 10 <20% 2-amino-2-(hydroksymetylo)propan-1,3-diolu Fiolka 4 ma etykietę: Ostrzeżenie H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Działa drażniąco na oczy. Powoduje podrażnienie skóry. Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Dokładnie umyć ręce po użyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: płukać ostrożnie wodą przez kilka minut. W przypadku posiadania szkieł kontaktowych należy je usunąć, jeśli to możliwe. Kontynuować płukanie. 8. Fiolka 6, bufor Wash Buffer (20x), zawiera 10 <25% chlorku sodu i 10 <20% trometamolu. Fiolka 6 ma etykietę: Ostrzeżenie H319 H315 P280 P264 P305 + P351 + P338 Działa drażniąco na oczy. Powoduje podrażnienie skóry. Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Dokładnie umyć ręce po użyciu. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: płukać ostrożnie wodą przez kilka minut. W przypadku posiadania szkieł kontaktowych należy je usunąć, jeśli to możliwe. Kontynuować płukanie. 9. Coverslip Sealant zawiera 100% hydrorafinowanej benzyny ciężkiej (ropy naftowej) i ma następujące oznaczenia: Niebezpieczeństwo H225 H304 H411 P280 P210 P241 P273 P301 + P310 + P331 P303 + P361 + P353 P235 Wysoce łatwopalna ciecz i pary. Połknięcie i dostanie się przez drogi oddechowe może grozić śmiercią. Działa toksycznie na organizmy wodne, powodując długotrwałe skutki. Stosować rękawice ochronne. Stosować ochronę oczu lub twarzy. Przechowywać z dala od źródeł ciepła, gorących powierzchni, źródeł iskrzenia, otwartego ognia i innych źródeł zapłonu. Nie palić. Używać sprzętu elektrycznego, wentylacyjnego, oświetleniowego oraz przeznaczonego do przenoszenia substancji, który został dopuszczony do pracy w środowisku zagrożonym wybuchem. Unikać uwalniania do środowiska. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM ZATRUĆ lub lekarzem. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ NA SKÓRĘ (lub na włosy): natychmiast usunąć/zdjąć całą zanieczyszczoną odzież. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Przechowywać w chłodnym miejscu. P04092PL_02/K str. 8/39

9 P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. 10. Próbki przed i po utrwaleniu oraz wszystkie materiały mające z nimi kontakt należy traktować jako potencjalnie zakaźne i usuwać przy zachowaniu odpowiednich środków ostrożności (37). Nigdy nie należy pipetować odczynników ustami. Unikać kontaktu odczynników i wycinków ze skórą i błonami śluzowymi. W razie kontaktu odczynników z wrażliwymi okolicami skóry należy je spłukać obfitą ilością wody. 11. Do minimum ograniczyć skażenie odczynników bakteriami, aby uniknąć możliwości uzyskiwania błędnych wyników. 12. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod może powodować błędne wyniki badania. 13. Użycie innych niż opisane metod utrwalania tkanki oraz skrawków o innej grubości może spowodować zmianę morfologii tkanki i/lub natężenia sygnału. 14. Aby uniknąć odparowywania mieszaniny TOP2A/CEN-17 Probe Mix podczas hybrydyzacji, należy zapewnić odpowiednią wilgotność w komorze hybrydyzacyjnej. 15. Odczynniki zostały optymalnie rozcieńczone. Dalsze rozcieńczanie może wpłynąć negatywnie na ich działanie. 16. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą należy nosić odpowiednie osobiste wyposażenie ochronne. Dodatkowe informacje zawiera Karta charakterystyki substancji. 17. W metodzie zanurzania preparatów w roztworze pepsyny (Krok 2, metoda C) należy używać wyłącznie czystych naczyń do barwienia. Przechowywanie Preparat Mieszanina sond TOP2A/CEN-17 IQISH (fiolka 3) należy przechowywać w temperaturze -18 C, w ciemności. Pozostałe odczynniki mogą być przechowywane w temperaturze 2 8 C, w ciemności. Wszystkie odczynniki tolerują przechowywanie w stanie zamrożonym. Zamrażanie i rozmrażanie odczynników do 10 razy nie wpływa na jakość ich działania. Ciepło może w niekorzystny sposób wpływać na jakość działania gotowej do użycia pepsyny, Mieszaniny sond TOP2A/CEN-17 IQISH oraz Fluorescencyjnego środka do zatapiania (fiolki 2A, 3 i 5). Odczynników tych nie należy pozostawiać w temperaturze pokojowej. Światło o dużym nasileniu może w niekorzystny sposób wpływać na jakość działania Mieszaniny sond TOP2A/CEN-17 IQISH oraz Fluorescencyjnego środka do zatapiania (fiolki 3 i 5). Nie należy przechowywać ani prowadzić oznaczeń za pomocą tych odczynników w miejscach silnie naświetlonych, np. w bezpośrednim świetle słonecznym. Nie używać zestawu po upływie daty ważności, podanej na opakowaniu. W przypadku przechowywania odczynników w warunkach innych niż określone na ulotce dołączonej do opakowania, użytkownik musi zweryfikować poprawność działania odczynników (38). Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Dlatego też bardzo ważna jest ocena zdrowych komórek w analizowanej próbce tkanki. Jeśli wystąpi nieoczekiwany wzór fluorescencji, którego nie można wyjaśnić różnicami w procedurach laboratoryjnych, i istnieje podejrzenie, że jego przyczyną jest stosowany TOP2A IQFISH pharmdx, należy niezwłocznie skontaktować się z Działem Pomocy Technicznej Dako. Przygotowanie próbek Materiał biopsyjny należy traktować tak, by zachować materiał tkankowy do wykonania odczynów FISH. W przypadku wszystkich próbek należy zastosować standardowe metody przygotowania do barwienia immunohistochemicznego (39). Skrawki zatapiane w parafinie Do użytku nadają się jedynie tkanki utrwalone w obojętnie buforowanej formalinie i zatopione w parafinie. Próbki pochodzące z biopsji należy przygotować np. w formie bloczków o grubości od 3 do 4 mm i utrwalać przez godziny w obojętnie zbuforowanej formalinie. Następnie tkanki powinny zostać poddane odwodnieniu, stosując serię kąpieli alkoholowych i P04092PL_02/K str. 9/39

10 ksylenowych o stopniowo zmieniających się stężeniach, po czym przepaja się je płynną parafiną w temperaturze nieprzekraczającej 60 C. Prawidłowo utrwalone i zatopione tkanki można przed pocięciem na skrawki i zatopieniem na szkiełkach przechowywać dowolnie długo w chłodnym miejscu (15 25 C) (39, 40). Inne środki utrwalające są nieodpowiednie. Preparaty tkankowe należy pociąć na skrawki o wymiarach 4 6 µm. Równocześnie należy przygotować szkiełka niezbędnie do oceny aberracji genu TOP2A i zweryfikowania obecności guza. Zaleca się użycie minimum 3 kolejnych skrawków: jednego skrawka do zbadania obecności guza barwionego hematoksyliną i eozyną (barwienie H&E), jednego skrawka do oceny aberracji genu TOP2A i 1 skrawka na zapas. Zaleca się osadzane skrawków na szkiełkach silanizowanych Dako Silanized Slides, nr kat. S 3003, SuperFrost Plus lub opłaszczonych poli-l-lizyną. Próbki przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C) należy zbadać w ciągu 4 6 miesięcy od momentu podzielenia na skrawki lub w ciągu 2 lat w razie przechowywania w temperaturze 2 8 C. P04092PL_02/K str. 10/39

11 INSTRUKCJA UŻYCIA A. Przygotowanie odczynników Dla wygody zaleca się przygotowanie następujących odczynników przed rozpoczęciem barwienia: A.1 Pre-Treatment Solution W fiolce 1 mogą się pojawić kryształki, które rozpuszczają się w temperaturze pokojowej. Przed przygotowaniem odczynnika upewnić się, że w fiolce nie ma kryształków. Rozcieńczyć odpowiednią ilość roztworu z fiolki 1 (Roztwór do obróbki wstępnej20x) w wodzie destylowanej lub demineralizowanej w proporcji 1:20. Niewykorzystany rozcieńczony bufor można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia bufor nie nadaje się do użycia. A.2 Bufor do płukania głębokiego Rozcieńczyć odpowiednią ilość roztworu z fiolki 4 (Bufor do płukania głębokiego20x) w wodzie destylowanej lub demineralizowanej w proporcji 1:20. Niewykorzystany rozcieńczony bufor można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia bufor nie nadaje się do użycia. A.3 Buforze do płukania Rozcieńczyć odpowiednią ilość roztworu z fiolki 6 (Bufor do płukania 20x) w wodzie destylowanej lub demineralizowanej w proporcji 1:20. Niewykorzystany rozcieńczony bufor można przechowywać w temperaturze 2 8 C przez jeden miesiąc. W przypadku zmętnienia rozcieńczony bufor wylać. A.4 Seria rozcieńczeń etanolu Z 96% roztworu etanolu przygotować 3 słoje z etanolem o stężeniach odpowiednio 70%, 85% i 96%. Zamknięte słoje przechowywać w temperaturze 2 8 C; roztwory użyć do maksymalnie 200 preparatów. W przypadku zmętnienia roztwór nie nadaje się do użycia. A.5 Roztwór pepsyny Roztwór pepsyny jest potrzebny jedynie w przypadku stosowania metody z zanurzaniem w pepsynie (metoda C). Sposób przygotowania roztworu pepsyny; W przypadku pojemnika na sześć preparatów przygotować 60 ml roztworu pepsyny: Dodać do pojemnika 48 ml destylowanej lub dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej (20 25 C). Dodać do pojemnika 6 ml zimnego (2 8 C) Rozcieńczalnika pepsyny (10x) (fiolka 2B). Dodać do pojemnika 6 ml zimnej (2 8 C) Pepsyny (fiolka 2A). Zamknąć pojemnik pokrywką i wyrównać temperaturę roztworu pepsyny do 37 (±2) C w łaźni wodnej. W przypadku pojemnika na 24 preparat przygotować 240 ml roztworu pepsyny: Dodać do pojemnika 192 ml destylowanej lub dejonizowanej wody o temperaturze pokojowej (20 25 C). Dodać do pojemnika 24 ml zimnego (2 8 C) Rozcieńczalnika pepsyny (10x) (fiolka 2B). Dodać do pojemnika 24 ml zimnej (2 8 C) RTU Pepsyny (fiolka 2A). Zamknąć pojemnik pokrywką i wyrównać temperaturę roztworu pepsyny do 37 (±2) C w łaźni wodnej. Roztwór pepsyny o wyrównanej temperaturze powinien zostać zużyty w czasie 5 godzin. P04092PL_02/K str. 11/39

12 B. Procedura barwienia B.1 Uwagi dotyczące procedury Przed użyciem należy dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się z wszystkimi składnikami (patrz Środki ostrożności). Wszystkie odczynniki przed użyciem należy doprowadzić do odpowiedniej temperatury. Fiolka 1, Rozcieńczony Roztwór do obróbki wstępnejnależy doprowadzić do temperatury C, jeżeli w obróbce wstępnej stosowana jest łaźnia wodna (B3. Protokół barwienia, etap 1: Metoda obróbki wstępnej A). Jeżeli w obróbce wstępnej stosowana jest kuchenka mikrofalowa z funkcją detekcji (B3. Protokół barwienia, etap 1: Metoda obróbki wstępnej B) wówczas rozcieńczony roztwór Do obróbki wstępnejpowinien być doprowadzony do temperatury pokojowej C. Fiolka 2A, Pepsyna powinna być stosowana w 2 8 C (B3, wykonanie odczynu, etap 2: metoda A i B) i stale utrzymywany w chłodzie. Fiolka 2B: Rozcieńczalnik pepsyny (10x) powinien być stosowany w 2 8 C (B3, wykonanie odczynu, etap 2: metoda C). Fiolka 3, Mieszanina sond TOP2A/CEN-17 IQISH podczas przechowywania w -18 C rozdziela się na dwie fazy. Przed użyciem fiolki 3 upewnić się, że występuje tylko jedna faza; w tym celu wymieszać mieszaninę sond i wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej (20 25 C). Rozmrażać fiolkę 3 w temperaturze pokojowej (20 25 C) przez maksymalnie 30 minut (chroniąc przed silnym światłem), następnie dokładnie wymieszać fiolkę w mieszadle wibracyjnym przez 15 sekund przy 2500 rpm. Natychmiast po użyciu umieścić fiolkę 3 w temperaturze -18 C. Fiolka 4, rozcieńczony Bufor do płukania głębokiego: przed użyciem należy doprowadzić jedno naczynie do temperatury pokojowej, a drugie do 63 (±2) C. Fiolka 5, Fluorescencyjny środek do zatapiania można stosować w dowolnej temperaturze z przedziału 2 25 C. Fiolka 6, rozcieńczony Bufor do płukania powinien zostać doprowadzony do temperatury pokojowej C. Szczeliwo do szkiełek nakrywkowych można stosować w dowolnej temperaturze z przedziału 2 25 C. Wszystkie etapy procedury należy wykonywać w podanej temperaturze. Procedura obejmuje kilkukrotne odwadnianie z następującym po nim suszeniem skrawków tkanek. Przed przystąpieniem do kolejnego kroku procedury należy sprawdzić, czy skrawki są całkowicie suche. Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas innych zabiegów. Jeśli konieczne jest przerwanie barwienia, preparaty po deparafinizacji można przechowywać w buforze Bufor do płukania przez maksymalnie 1 godzinę w temperaturze pokojowej (20 25 C) bez obawy o niekorzystny wpływ na uzyskiwane wyniki. B.2 Przygotowanie tkanek do wykonania odczynu Usunięcie parafiny i ponowne uwodnienie: Przed wykonaniem badania preparaty tkanek należy poddać deparafinizacji, aby usunąć medium, w którym były zatopione, i ponownie uwodnić. Należy usuwać parafinę całkowicie. Pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie odczynu nieswoistego. Ten etap powinien być wykonywany w temperaturze pokojowej (20 25 C). 1. Umieścić szkiełka w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. P04092PL_02/K str. 12/39

13 2. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w 96% etanolu na 2 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w 70% etanolu na 2 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. 4. Strząsnąć nadmiar cieczy i zanurzyć preparaty w rozcieńczonym buforze do płukania (patrz SPOSÓB UŻYCIA, część A.3) na przynajmniej 2 minuty. Rozpocząć procedurę barwienia zgodnie z instrukcją podaną w części B.3, etap 1, Obróbka wstępna. Po maksymalnie 200 preparatach należy wymieniać roztwory ksylenu i alkoholu. Można stosować zamienniki ksylenu. UWAGA: Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji może spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. Różnice w przygotowaniu tkanek oraz w procedurach technicznych w laboratorium użytkownika mogą stanowić przyczynę unieważnienia wyników badania. B.3. Procedura barwienia Etap 1: Przygotowanie wstępne Obróbkę wstępną można przeprowadzić za pomocą łaźni wodnej, jak opisano w metodzie A) lub, alternatywnie, za pomocą kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji, co opisano w metodzie B). Metoda A: Obróbka wstępna z użyciem łaźni wodnej Napełnić naczynie do barwienia rozcieńczonym roztworem Do obróbki wstępnej(zob. INSTRUKCJA UŻYCIA, sekcja A.1). Naczynia do barwienia z rozcieńczonym roztworem Do obróbki wstępnejumieścić w łaźni wodnej. Podgrzać łaźnię wodną i Roztworem do obróbki wstępnejdo C. Aby zagwarantować dokładny pomiar, temperaturę wewnątrz naczynia zmierzyć przy użyciu wykalibrowanego termometru. Naczynie nakryć pokrywą, aby ustabilizować temperaturę i zapobiec parowaniu. Deparafinowane skrawki o temperaturze pokojowej zanurzyć w podgrzanym roztworze Do obróbki wstępnejw naczyniu do barwienia. Ponownie skontrolować temperaturę i inkubować przez 10 (±1) minut w C. Wyjąć całe naczynie z preparatami z łaźni wodnej. Zdjąć pokrywę i odstawić preparaty na 15 minut do ostygnięcia w roztworze Do obróbki wstępnejw temperaturze pokojowej. Preparaty przenieść na 3 minuty do słoja z rozcieńczonym buforem do płukania (patrz SPOSÓB UŻYTKOWANIA, część A.3) w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor do płukania i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. UWAGA: Roztwór do obróbki wstępnejjest przeznaczony wyłącznie do jednorazowego użycia. Nie używać ponownie. Metoda B: Obróbka wstępna w kuchence mikrofalowej z funkcją detekcji Plastykowy pojemnik wypełnić rozcieńczonym Roztworem do obróbki wstępnejo temperaturze pokojowej (20 25 C). Zanurzyć odparafinowane skrawki w Pre-Treatment Solution, przykryć naczynie pokrywką z otworami i umieścić w kuchence mikrofalowej. Wybrać funkcję czujnika gotowania i zaprogramować ją tak, aby pracowała przez 10 minut po osiągnięciu temperatury wrzenia*. Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji, wyjąć pojemnik z pokrywką z kuchenki, zdjąć pokrywkę i przez 15 studzić w temperaturze pokojowej. Przenieść preparaty do pojemnika z rozcieńczonym buforem do płukania i moczyć przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor do płukania i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. * Wykorzystanie kuchenki mikrofalowej z funkcją detekcji oznacza, że musi ona posiadać czujnik i programy, które wstępnie podgrzeją Roztwór do obróbki wstępnejdo punktu wrzenia i następnie będą utrzymywać wymaganą temperaturę obróbki wstępnej (powyżej 95ºC), jednocześnie odmierzając ustawiony czas (10 (±1) minut). Niektóre modele kuchenek mikrofalowych z funkcją detekcji mogą nie posiadać możliwości swobodnego wprowadzania P04092PL_02/K str. 13/39

14 odliczanego czasu. Jeżeli konkretny model posiada jedynie gotowe programy, należy wybrać program, który podtrzymuje wymaganą temperaturę obróbki wstępnej (powyżej 95 ºC) przez przynajmniej 10 (±1) minut i ręcznie zatrzymać program po 10 (±1) minutach. UWAGA: Roztwór Do obróbki wstępnejjest przeznaczony wyłącznie do jednorazowego użycia. Nie używać ponownie. Etap 2: Pepsyna gotowa do użytku (RTU) lub roztwór pepsyny Inkubacja pepsyny może być wykonywana metodą bezpośredniej aplikacji kropli pepsyny RTU na preparaty w temperaturze pokojowej (20 25 C) (metoda A) lub 37 C (metoda B). Alternatywnie, preparaty można zanurzać w roztworze pepsyny i inkubować w 37 (±2) C (metoda C) Metoda A i Metoda B Strząsnąć nadmiar buforu. Używając materiału nie pozostawiającego włókien (np. wacika lub płatka gazy), ostrożnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną, w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynników w określonym miejscu. Dodać 5 8 kropli (250 µl) schłodzonej (2 8 C) pepsyny (fiolka 2), tak aby pokryć próbkę. Pepsynę należy zawsze przechowywać w temperaturze 2 8 C. Metoda A: Pepsyna, RTU - inkubacja w C Inkubować przez 5 15 minut w temperaturze pokojowej (20 25 C). W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja 5-minutowa, jednakże optymalny czas inkubacji może zależeć od sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez użytkownika. Strząsnąć nadmiar pepsyny i przez 3 minuty moczyć preparaty w rozcieńczonym buforze do płukania (patrz SPOSÓB UŻYTKOWANIA, sekcja A.3), w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor do płukania i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do odwodnienia. Metoda B: Pepsyna, RTU - inkubacja w 37 C Umieścić próbkę z pepsyną na płycie grzejnej w 37 C np. Dako Hybridizer i inkubować przez 3 5 minut. W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja 3 5 minutowa, jednakże optymalny czas inkubacji może zależeć od sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez użytkownika. Strząsnąć nadmiar pepsyny i namaczać skrawki w rozcieńczonym buforze do płukania w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor do płukania i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do odwodnienia. Odwadniać preparaty tkanek w roztworach etanolu o wzrastającym stężeniu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% oraz 2 minuty w etanolu 96%. Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. Metoda C: Roztwór pepsyny - zanurzanie preparatów w roztworze pepsyny o temperaturze 37 C Zestaw zawiera ilość odczynników wystarczającą na cztery oddzielne serie (60 ml roztworu pepsyny, mały pojemnik na sześć preparatów) lub jedną serię (240 ml roztworu pepsyny, duży pojemnik na 24 preparaty). Przygotować roztwór pepsyny zgodnie z opisem w części A.5. Zamknąć pojemnik pokrywką i wyrównać temperaturę roztworu pepsyny do 37 (±2) C w łaźni wodnej. Upewnić się, że temperatura ustabilizowała się. Zmierzyć temperaturę w pojemniku za pomocą skalibrowanego termometru, aby zapewnić uzyskanie prawidłowej temperatury. Strząsnąć nadmiar buforu do przemywania. Zanurzyć preparaty w roztworze pepsyny o temperaturze 37 (±2) C i inkubować przez minut. W przypadku większości preparatów wystarcza inkubacja minutowa, jednakże optymalny czas inkubacji może zależeć od P04092PL_02/K str. 14/39

15 sposobu utrwalania tkanek i/lub grubości próbki i powinien zostać określony przez użytkownika. Strząsnąć nadmiar roztworu pepsyny i namaczać skrawki w rozcieńczonym buforze do płukania w temperaturze pokojowej (20 25 C). Wymienić bufor do płukania i namaczać skrawki jeszcze przez 3 minuty. Przejść do odwodnienia. Odwadniać preparaty tkanek w roztworach etanolu o wzrastającym stężeniu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% oraz 2 minuty w etanolu 96%. Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. Etap 3: Mieszanina sond TOP2A/CEN-17 IQISH Podczas przechowywania w -18 C mieszanina sond TOP2A/CEN-17 IQISH rozdziela się na dwie fazy. Przed użyciem fiolki 3 upewnić się, że występuje tylko jedna faza; w tym celu wymieszać mieszaninę sond i wyrównać temperaturę do temperatury pokojowej (20 25 C). Rozmrażać fiolkę 3 w temperaturze pokojowej (20-25 C) przez maksymalnie 30 minut (chroniąc przed silnym światłem), następnie dokładnie wymieszać fiolkę w mieszadle wibracyjnym przez 15 sekund przy 2500 rpm. Natychmiast po użyciu umieścić fiolkę 3 w temperaturze -18 C. Wkropić 10 µl mieszaniny sond TOP2A/CEN-17 IQISH (fiolka 3) na środek skrawka tkanki. Natychmiast nałożyć szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 22 mm, tak aby mieszanina sond rozprowadziła się równomiernie pod szkiełkiem. Unikać pęcherzyków powietrza. W razie zaobserwowania pęcherzyków powietrza, delikatnie ostukać preparat pincetą, tak aby usunąć je z tkanek. Zaraz po użyciu należy umieścić fiolkę 3 w temperaturze -18 C. Uszczelnić szkiełko nakrywkowe za pomocą szczeliwa, nakładając je wokół brzegów szkiełka. Szczeliwo nakładać zarówno na szkiełko nakrywkowe, jak i podstawowe, tak aby utworzyć uszczelkę wokół szkiełka nakrywkowego. Sprawdzić, czy szczeliwo pokrywa cały brzeg szkiełka nakrywkowego. Przygotować Dako Hybridizer* (nr kat. S2450/S2451) do hybrydyzacji. Upewnić się, że Humidity Control Strips (nr kat. S2452) są wilgotne i optymalne do użycia. Uruchomić hybrydyzator i wybrać program, który: Denaturuje w 66 C przez 10 minut, po czym następuje hybrydyzacja w temperaturze 45 C trwająca minut. Umieścić skrawki w Hybridizer, upewnić się, że pokrywa jest właściwie zamknięta i uruchomić program. Szczegółowe informacje, patrz Dako Hybridizer Instruction Manual. *Do denaturacji i hybrydyzacji można używać urządzeń, które umożliwiają utrzymanie warunków denaturacji i hybrydyzacji, takich jak przykładowo opisane poniżej: Umieścić szkiełko na płaskiej metalowej lub kamiennej powierzchni (płycie grzejnej lub płycie w piecu hybrydyzacyjnym) wstępnie ogrzanej do temperatury 66 (±1) C. Denaturować przez dokładnie 10 minut. Umieścić preparaty w podgrzanej, nawilżonej komorze hybrydyzacyjnej. Przykryć komorę pokrywą i inkubować w temperaturze 45 (±2) C przez minut. Należy pamiętać, że temperatura hybrydyzacji równa 37 C jest nieodpowiednia dla sond zawartych w tym zestawie. Etap 4: Odpłukiwanie Dwa pojemniki do barwienia z rozcieńczonym roztworem buforu do płukania głębokiego (patrz SPOSÓB UŻYCIA, sekcja A.2). Zaleca się stosowanie minimum 100 ml lub 15 ml roztworu na preparat w każdym z naczyń. Jeden z pojemników do barwienia zawierających rozcieńczony bufor Stringent Wash o temperaturze pokojowej umieścić pod okapem wyciągowym, a drugi w łaźni wodnej. Łaźnię wodną i rozcieńczony bufor podgrzać do temperatury 63 (±2) C. Upewnić się, czy doszło do ustabilizowania temperatury. Naczynie nakryć pokrywą, aby ustabilizować temperaturę i zapobiec parowaniu. Aby zagwarantować dokładność pomiaru, temperaturę wewnątrz łaźni wodnej zmierzyć przy użyciu wykalibrowanego termometru. Bufor Stringent Wash zawiera P04092PL_02/K str. 15/39

16 detergent i może mętnieć w temperaturze 63 C; nie wpływa to jednak na jego jakość działania. Przy użyciu pincety lub rękawic wyciągnąć preparaty z komory hybrydyzacyjnej i delikatnie usunąć szczeliwo oraz szkiełko nakrywkowe, a następnie pojedynczo umieszczać preparaty w pojemniku do płukania wstępnego o temperaturze pokojowej. Nie umieszczać preparatów w Buforze do płukania głębokiego przed usunięciem szkiełek nakrywkowych. Niezwłocznie po zdjęciu wszystkich szkiełek nakrywkowych przenieść preparaty z naczynia tymczasowego do naczynia w łaźni wodnej o temperaturze 63 (±2) C. Natychmiast po przeniesieniu preparatów do pojemnika w łaźni wodnej o temperaturze 63 (±2) C, należy uruchomić licznik. Odpłukiwać przez dokładnie 10 minut. Wyciągnąć preparaty z rozcieńczonego roztworu Buforu do płukania głębokiegoi przez 3 minuty moczyć w rozcieńczonym roztworze Buforu do płukania w temperaturze pokojowej (20-25 C). Zmienić rozcieńczony bufor do płukania i moczyć preparaty przez kolejne 3 minuty. Odwadniać preparaty tkanek w roztworach etanolu o wzrastającym stężeniu: 2 minuty w etanolu 70%, 2 minuty w etanolu 85% oraz 2 minuty w etanolu 96%. Pozostawić preparaty do całkowitego wysuszenia. Etap 5: Zatapianie preparatu Na obszar docelowy na powierzchni szkiełka nałożyć 15 µl Fluorescencyjnego środka do zatapiania, zawierającego DAPI (fiolka 5) i przykryć szkiełkiem nakrywkowym. UWAGA: Preparaty można odczytywać po 15 minutach lub w ciągu 7 dni od osadzenia na szkiełku. Jednakże w przypadku kontaktu ze światłem lub wysokimi temperaturami może dochodzić do utraty zabarwienia. Aby zminimalizować płowienie barwy, preparaty należy przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze C. Kontrola jakości 1. Sygnał musi być jasny, wyraźny i łatwy do oceny. 2. Zdrowe komórki w preparacie pozwalają na wewnętrzną kontrolę procesu barwienia. Komórki zdrowe powinny dawać 1-2 wyraźnie widocznych sygnałów zielonych, sygnalizując prawidłową hybrydyzację sondy CEN-17 PNA z centromerowym obszarem chromosomu 17. Komórki zdrowe powinny również dawać 1-2 wyraźnie widoczne sygnały czerwone, wskazujące na prawidłową hybrydyzację sondy TOPA2A DNA z rejonem docelowym TOP2A. Ze względu na skrawanie tkanek niektóre zdrowe komórki będą dawać mniej niż dwa oczekiwane sygnały każdego koloru. Prawidłowe komórki przechodzące podział mogą posiadać więcej niż normalne 1-2 sygnały każdego koloru. Brak sygnałów w komórkach zdrowych wskazuje na niepowodzenie testu, a uzyskane wyniki należy unieważnić. 3. Przy użyciu filtra DAPI należy sprawdzić, czy jądro komórkowe pozostało nienaruszone. Obecność licznych pustych (ghost-like) komórek oraz słabo wyodrębnione jądra wskazują na nadmierne wytrawienie próbki prowadzące do utraty lub rozproszenia sygnałów. Próbki takie należy traktować jako nieważne. 4. Różnice w sposobie utrwalania, obróbki i zatapiania tkanek w laboratorium użytkownika mogą prowadzić do zmienności uzyskiwanych wyników, co powoduje konieczność przeprowadzania regularnej oceny kontroli wewnętrznych. Interpretacja odczynu Tkanki nadające się do oceny P04092PL_02/K str. 16/39

17 Badaniom należy poddawać jedynie próbki pobrane od pacjentów z rakiem inwazyjnym. Jeśli w próbce występują jednocześnie komórki raka in situ oraz inwazyjnego, należy oceniać wyłącznie składnik inwazyjny. Unikać obszarów martwicy oraz o niejednoznacznych granicach jądra komórkowego. Nie uwzględniać jąder wymagających oceny subiektywnej. Pominąć jądra dające sygnał o słabym nasileniu oraz o nieswoistym lub wysokim tle. Użyć filtra DAPI do sprawdzenia równomiernego wybarwienia jądra. Zliczanie sygnału: Zlokalizować komórki nowotworowe w obrębie wybarwionego techniką H&E preparatu i ocenić ten sam obszar preparatu barwionego metodą FISH. Obejrzeć kilka obszarów komórek guza, aby uwzględnić możliwą heterogeniczność. Wybrać obszar o równomiernie rozmieszczonych jądrach komórkowych. Rozpocząć analizę w lewej górnej ćwiartce wybranego obszaru i postępując od lewej do prawej, zliczać sygnały w obrębie granic każdego ocenianego jądra zgodnie ze wskazówkami poniżej (zobacz także Załącznik 3). Nastawiać ostrość w górę i w dół, aby znaleźć wszystkie sygnały w obrębie poszczególnych jąder. Dwa sygnały o tej samej wielkości w odległości równej lub mniejszej od średnicy sygnału zliczać jako jeden. W jądrach o wysokim poziomie amplifikacji genu TOP2A sygnały dla TOP2A mogą znajdować się bardzo blisko siebie, tworząc skupisko sygnałów. W takich przypadkach nie ma możliwości zliczenia sygnałów TOP2A i należy przeprowadzić oszacowanie. Szczególną uwagę należy zwrócić na sygnały zielone, ponieważ skupiska sygnałów czerwonych TOP2A mogą pokrywać sygnały zielone, uniemożliwiając ich dostrzeżenie. W razie wątpliwości prosimy skontrolować sygnały zielone przy użyciu odpowiedniego filtra FITC. Nie brać pod uwagę jąder bez zielonych sygnałów. W ocenie uwzględniać tylko te jądra, które dają jeden lub więcej zielonych sygnałów odniesienia. W tabeli zapisać wyniki w sposób przedstawiony w Załączniku 2. Wskazówki do zliczania sygnałów 1 Nie zliczać. Jądra komórkowe nakładają się na siebie; nie wszystkie obszary jądra są widoczne. 2 Zliczyć jako dwa sygnały zielone 3 Dwa sygnały czerwone; nie uwzględniać jąder dających tylko sygnały czerwone 4 Zliczyć jako 3 sygnały zielone i 12 sygnałów czerwonych (oszacowanie skupiska) 5 Zliczyć jako 1 sygnał zielony i 1 sygnał czerwony. Dwa sygnały tej samej wielkości w odległości mniejszej lub równej średnicy pojedynczego sygnału zlicza się jako jeden sygnał 6 Nie zliczać (jądro wytrawione nadmiernie lub niedotrawione). lub Brak sygnałów w centrum jądra (jądra pierścieniowate). 7 Zliczyć jako 2 sygnały zielone i 3 sygnały czerwone. Dwa sygnały tej samej wielkości w odległości mniejszej lub równej średnicy pojedynczego sygnału zlicza się jako jeden sygnał 8 Zliczyć jako 1 sygnał zielony i 5 sygnałów czerwonych P04092PL_02/K str. 17/39

18 9 Zliczyć jako 3 sygnały zielone (1 zielony sygnał nieostry) i 3 sygnały czerwone 10 Skupisko sygnałów czerwonych, zakrywających sygnały zielone. Sprawdzić liczbę sygnałów zielonych przy użyciu odpowiedniego filtru FITC lub wcale nie zliczać. Sygnały mogą być zliczane albo metodą konwencjonalną (41) albo alternatywną, pozwalającą oszczędzić czas i nakład pracy (21, 29). Zamiast konwencjonalnej metody zliczania sygnałów w 60 jądrach, zliczanych jest 60 zdarzeń, gdzie jednym zdarzeniem jest czerwony sygnał genetyczny. W tej alternatywnej metodzie, do osiągnięcia 60 czerwonych sygnałów TOP2A zliczana jest różna liczba jąder. Rejestrowane są powiązane, zielone sygnały CEN-17 z tego samego jądra. Minimalna liczba jąder do oceny to 6. W prawidłowych próbkach do osiągnięcia 60 czerwonych sygnałów wystarczy średnia z 35 jąder. W przypadkach z amplifikacją ujętych zostanie 6-35 jąder. Nawet w przypadkach z delecjami, często wystarczy mniej niż 60 jąder. O ile to możliwe należy zliczyć jądra z 3 różnych obszarów nowotworu (42). Obliczyć stosunek TOP2A/CEN-17, dzieląc całkowitą liczbę czerwonych sygnałów TOP2A przez całkowitą liczbę zielonych sygnałów CEN-17. Próbki o stosunku TOP2A/CEN-17 nie mniejszym niż 2 należy uznać za próbki z amplifikacją TOP2A a próbki o stosunku TOP2A/CEN-17 mniejszym niż 0,8 należy uznać za próbki z delecją TOP2A (18, 21, 29). Wyniki o wartości granicznej lub do niej zbliżonej (1,8 2,2 dla amplifikacji i 0,7 0,9 dla delecji) należy interpretować z dużą ostrożnością. Zaleca się, aby upewniać się, czy zliczenia nie zawierają wysokiego odsetka prawidłowych jąder. Jeżeli stosunek znajduje się w jednej z dwóch stref wyników niejednoznacznych lub w razie niepewności zaleca się, aby wynik dla próbki został sprawdzony przez ponowne zliczenie przez inną osobę, przez zliczenie jąder z 3 więcej obszarów nowotworu i/lub zliczenie razem 60 jąder. Zaleca się kryterium akceptacji równe ±10% CV. Ostateczny stosunek należy wyliczyć na podstawie wszystkich zliczeń. W przypadkach granicznych niezbędne jest porozumienie patologa i lekarza prowadzącego leczenie pacjenta. Ograniczenia metody Ograniczenia ogólne 1. Badanie immunocytochemiczne FISH polega na wieloetapowym procesie diagnostycznym, który wymaga specjalistycznego szkolenia w zakresie doboru odpowiednich odczynników, wyborze, utrwalaniu oraz przygotowaniu tkanek, przygotowaniu szkiełek immunocytochemicznych oraz interpretacji wyników wybarwienia. 2. W metodzie FISH wyniki zależą od traktowania i przygotowania tkanki przed barwieniem. Niewłaściwe utrwalanie, płukanie, suszenie, ogrzewanie, krojenie preparatów lub zanieczyszczenie innymi tkankami bądź płynami, może wpływać na hybrydyzację. Przyczyną sprzecznych wyników może być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub właściwości zależne od tkanek. 3. W celu uzyskania optymalnych i odtwarzalnych wyników preparaty mikroskopowe tkanek należy całkowicie oczyścić z parafiny. Usuwanie parafiny musi poprzedzać cały proces barwienia. (Patrz SPOSÓB UŻYCIA, część B.2). 4. Należy używać łaźni wodnej, cieplarki oraz suszarki hybrydyzacyjnej wyłącznie ze skalą temperaturową. Stosowanie sprzętu innego typu może spowodować wyparowanie mieszaniny sond TOP2A/CEN-17 IQISH podczas hybrydyzacji i dlatego powinno to być walidowane przez użytkownika. P04092PL_02/K str. 18/39

19 Charakterystyka działania Czułość analityczna Czułość OP2A/CEN-17 IQISH Probe Mix badano przy zastosowaniu 18 próbek prawidłowego ludzkiego nabłonka sutka. Stosunek pomiędzy liczbą sygnałów TOP2A i sygnałów CEN-17 wyznaczono na podstawie zliczenia 60 jąder na próbkę. Stosunek TOP2A/CEN-17 dla 18 próbek prawidłowego ludzkiego nabłonka sutka wyniósł 0,97 1,11. Swoistość analityczna Sondy TOP2A DNA w Mieszaninie sond TOP2A/CEN-17 IQISH są w końcowej fazie sekwencjonowane i mapowane, aby uzyskać potwierdzenie całkowitego pokrycia 228 kb zawierających gen TOP2A. Sondy CEN-17 PNA w Mieszaninie sond TOP2A/CEN-17 IQISH zostały przetestowane osobno i w połączeniu w celu potwierdzenia ich specyficznej hybrydyzacji do obszaru centromeru chromosomu 17. W celu zmierzenia zdolności testu do jednoznacznej identyfikacji docelowych substancji TOP2A i CEN-17 bez interferencji ze strony innych substancji, wykonano badania dla próbek tkankowych prawidłowego nabłonka ludzkiego sutka z użyciem fiolki 3 zawierającej bufor hybrydyzacyjny bez mieszaniny sond. Zbadano razem 18 próbek pod kątem obecności sygnałów nie związanych z mieszaniną sond. W żadnej z 18 próbek nie wykryto innych chromosomalnych sekwencji docelowych ani interferencji z blisko powiązanymi substancjami. Badania wrażliwości wyników Wrażliwość testu TOP2A IQFISH pharmdx zbadano dla różnych czasów obróbki wstępnej, temperatury i metod ogrzewania buforu przygotowawczego (kuchenka mikrofalowa lub łaźnia wodna), czasu inkubacji pepsyny i metod (pepsyna RTU lub zanurzanie), temperatury i czasu denaturacji, czasu hybrydyzacji, oraz czasu i temperatury odpłukiwania. W następujących warunkach eksperymentalnych nie zaobserwowano żadnych znaczących różnic w wynikach: Obróbka wstępna - metoda A) Łaźnia wodna przez 10 minut z każdą z temperatur 95 C, C i 99 C i czasami 9, 10 i 11 minut w temperaturze C Obróbka wstępna - metoda B) Kuchenka mikrofalowa przez 9, 10 i 11 minut w temperaturze > 95 C. Trawienie pepsyną - metoda A) z czasami inkubacji równymi 5, 10 i 15 minut w temperaturze pokojowej (20 25 C). Trawienie pepsyną - metoda B) z czasami inkubacji równymi 3, 4 i 5 minut w temperaturze 37 C. Trawienie pepsyną - metoda C) z czasami inkubacji równymi 20, 25 i 30 minut w temperaturach 35, 37 i 39 C. Denaturacja przez 10 minut w połączeniu z każdą z temperatur 65, 66 i 67 C wraz z 9, 10 i 11 minutami przy 66 C. Czas hybrydyzacji równy 60, 90 i 120 minut w temperaturze 45 C. Odpłukiwanie przez 10 minut w połączeniu z każdą z temperatur 61, 63 i 65 C wraz z 9, 10 i 11 minutami przy 63 C. Niektóre z kombinacji czasu i temperatury, dla wartości zbliżonych do granic tolerancji były powodem nieznacznego spadku jakości struktur tkankowych, jakkolwiek nie zaobserwowano znaczących różnic natężenia sygnału. P04092PL_02/K str. 19/39

20 Wykonanie odczynu dla TOP2A IQFISH pharmdx umożliwia zastosowanie zmiennych czasów cieplnej obróbki wstępnej, trawienia pepsyną i czasu hybrydyzacji. Każdą, unikalną kombinację walidowano względem statusu genu TOP2A. Walidacji dokonano dla 10 próbek ludzkiego raka sutka FFPE dla każdej z 12 możliwych kombinacji. Zestaw TOP2A FISH pharmdx Kit (K5333) użyto jako odniesienie. Stosunek TOP2A/CEN-17 dla każdej z próbek przedstawiono na Rysunku 1. Zestawienie wyników w formie krzyżowej tabeli pomiędzy 12 testami i odczynami referencyjnymi wykazało ogólną zgodność względem statusu genu TOP2A na poziomie 100% (10/10) z dolną i górną granicą dwustronnego przedziału ufności 95% na poziomie odpowiednio 78,3% i 100%. Wartość Kappa wyniosła 1,00 a test McNemary wykazał brak odchyleń (dwustronna wartość p równa 1,00). Rysunek 1. Poszczególne stosunki TOP2A/CEN-17 dla 10 próbek ludzkiego raka sutka wybarwionych z użyciem 12 kombinatorycznych wersji protokołu dla testu TOP2A IQFISH pharmdx (nr kat. K5733) (Test 1-12) i TOP2A FISH pharmdx Kit (nr kat. K5333) stanowiącego test odniesienia (R). Linia pozioma obrazuje wartość odcięcia równą 2,0 a linia pozioma obrazuje wartość odcięcia równą 0,8. Powtarzalność Powtarzalność stosunku TOP2A/CEN-17 badano przy użyciu testu TOP2A IQFISH pharmdx wykorzystując kolejne skrawki dziewięciu próbek ludzkiego raka sutka ze statusem genu TOP2A z delecją, prawidłowy, z amplifikacją. Trzykrotne skrawki każdej próbki badano w tej samej serii. Średni współczynnik zmienności wyniósł 3% (zakres od 1% do 4%) dla próbek TOP2A z delecją, 7% (zakres od 2% do 10%) dla próbek TOP2A prawidłowych i 5,3% (zakres od 4% do 7%) dla próbek TOP2A z amplifikacją. Z użyciem zestawu TOP2A IQFISH pharmdx zbadano ogółem pięć kolejnych skrawków o różnej grubości z czterech próbek ludzkiego raka sutka (3, 4, 5, 6 i 7 µm). Średni współczynnik zmienności stosunku TOP2A/CEN-17 wyniósł 9,8% (zakres od 6% do 13%). P04092PL_02/K str. 20/39

21 Odtwarzalność Test TOP2A IQFISH pharmdx badano pod kątem odtwarzalności między seriami i między obserwatorami, korzystając z trzech partii zestawu TOP2A IQFISH pharmdx i wykorzystując trzech obserwatorów. Odtwarzalność badano na dziewięciu różnych próbkach ludzkiego raka sutka o statusie genu TOP2A z delecją, prawidłowym oraz z amplifikacją. Średni współczynnik zmienności wyniósł dla odtwarzalności między seriami 3,7% dla próbek TOP2A z delecją (zakres od 2% do 6%), 10,3% dla próbek TOP2A prawidłowych (zakres od 10% to 11%) i 9,3% dla próbek TOP2A z amplifikacją (zakres od 5% do 12%). Średni współczynnik zmienności wyniósł dla odtwarzalności między obserwatorami 13,7% dla próbek TOP2A z delecją (zakres od 2% do 17%), 7% dla próbek TOP2A prawidłowych (zakres od 10% to 11%) i 12,7% dla próbek TOP2A z amplifikacją (zakres od 10% do 15%). Użyteczność kliniczna Doksorubicyna i epirubicyna są antracyklinami należącymi do jednych z najczęściej stosowanych leków przeciwnowotworowych; udowodniono, że celem działania tych związków jest na poziomie molekularnym topoizomeraza IIα (14, 15). Wykazano skuteczność doksorubicyny i epirubicyny w wielu chorobach nowotworowych, łącznie z rakiem sutka, w którym są stosowane zarówno w leczeniu przerzutów, jak i jako lek uzupełniający (15). W przypadku uzupełniającego leczenia raka sutka, dane kliniczne wykazały, że reżimy chemioterapii obejmujące doksorubicynę i epirubicynę uzyskują statystycznie znaczącą poprawę współczynników przeżycia w porównaniu do reżimów nie zawierających antracyklin (43, 44). Indeks terapeutyczny antracyklin jest niski a ich wysoka skuteczność wynika z większej toksyczności w porównaniu do innych reżimów chemioterapii, np. CMF (cyklofosfamid/metotreksat/5-fluorouracyl) (19, 45). Poza toksycznością ostrą, leczenie doksorubicyną i epirubicyną może być powodem długotrwałych efektów ubocznych z kardiotoksycznością i wtórną ostrą białaczką szpikową (AML) (6, 15). Kardiomiopatia indukowana leczeniem jest często nieodwracalna i może prowadzić do zastoinowej niewydolności serca w kilka miesięcy lub lat po ukończeniu leczenia. W celu optymalizacji leczenia doksorubicyną i epirubicyną niezmiernie ważne dla lekarza jest posiadanie narzędzi pozwalających zidentyfikować pacjentki, które z największym prawdopodobieństwem odczują korzyści z leczenia doksorubicyną i epirubicyną. Parametry kliniczne zestawu Dako TOP2A FISH pharmdx Kit (nr kat. K5333) były oznaczane w dwóch badaniach przeprowadzonych przez Danish Breast Cancer Cooperative Group (DBCG) w Kopenhadze (21, 29, 30, 46). Badanie pilotażowe Parametry kliniczne zestawu TOP2A FISH pharmdx Kit zostały ocenione w badaniu pilotażowym próbek pobranych od 120 pacjentek z rakiem sutka(29) przeprowadzonym we współpracy z DBCG. W przypadku 20 nowotworów występowały zmiany liczby kopii TOP2A, z niemal równą liczbą amplifikacji (n=11) i delecji (n=9). Zmiany TOP2A znajdowano nie tylko w nowotworach pozytywnych dla HER2, lecz również w przypadku 4 nowotworów (20% przypadków nieprawidłowych dla TOP2A) HER2 negatywnych. Stosunek sygnałów (czerwonych do zielonych) nie mniejszy od 2 pozwala na odróżnienie przypadków z amplifikacją od prawidłowych, natomiast stosunek sygnałów niższy od 0,8 wskazuje na delecję genu. Badanie pilotażowe wykazało, że 2 identyczne metody zliczania dały identyczne wyniki: Niezależnie od tego, czy sygnały były zliczane w 60 jądrach, czy zliczano do 60 czerwonych sygnałów równolegle z liczeniem zielonych sygnałów w tym samym jądrze. Druga metoda posiada tę przewagę, że w przypadkach z delecją oraz prawidłowych zliczana jest największa liczba komórek, natomiast w przypadkach z P04092PL_02/K str. 21/39

22 amplifikacją liczba zliczanych komórek jest najmniejsza. Przypadki z amplifikacją są często oczywiste w identyfikacji, gdyż wystarczy na nie spojrzeć w mikroskop, lecz są trudniejsze do oceny, jeżeli zliczonych musi być 60 jąder. Badanie potwierdzające - DBCG 89D/TOP2A W większej skali, parametry kliniczne zestawu TOP2A FISH pharmdx Kit zostały ocenione z użyciem próbek nowotworowych prospektywnie zgromadzonych w badaniu uzupełniającym DBCG 89D (21, 30, 46, 47). Metodyka badania Podstawowym celem badania DBCG 89D/TOP2A było zbadanie, czy aberracje genu TOP2A (amplifikacje lub delecje) mogłyby służyć jako marker predykcyjny niewystępowania nawrotów oraz całkowitego współczynnika przeżycia u pacjentek wysokiego ryzyka z rakiem sutka, ze wskazaniami do uzupełniającej chemioterapii z użyciem epirubicyny. Dodatkowymi celami badania było ustalenie prognostycznych możliwości aberracji genu TOP2A i korelacji pomiędzy TOP2A i HER2. Badanie DBCG 89D zostało przygotowane jako otwarte, prospektywne badanie randomizowane. Po wykonaniu zabiegu operacyjnego, 980 kobiet w wieku przed- i postmenopauzalnym z inwazyjnym rakiem sutka o wysokim ryzyku zostało randomizowanych do grup CMF lub CEF (cyklofosfamid/epirubicyna/5-fluorouracyl). Podstawowym celem oceny efektywności było RFS (czas przeżycia bez nawrotów) i OS (całkowity czas przeżycia), stanowiącego dodatkowy punkt końcowy. Dla biologicznego sub-badania DBCG 89D/TOP2A bloczki tkanek pochodzące od pacjentek uczestniczących w badaniu DBCG 89D zostały uzyskane od instytucji biorących udział w badaniu i centralnie poddane retrospektywnej analizie pod kątem aberracji genów TOP2A i HER2 (Dako HER2 FISH pharmdx Kit) jak również nadmiernej ekspresji HER2 (Dako HercepTest ). Bloczki tkanek uzyskano od 806 spośród 980 pacjentek ujętych w badaniu DBCG 89D. W odniesieniu do aberracji genów TOP2A i HER2, stosunek był wyliczany przez podzielenie liczby sygnałów dla sond genowych przez liczbę sygnałów dla centromeru 17. Przypadki były klasyfikowane jako z amplifikacją HER2 lub TOP2A FISH wówczas, gdy stosunek sygnałów był 2. Obecność delecji TOP2A uznawano, gdy stosunek sygnałów wynosił < 0,8. Status TOP2A był klasyfikowany według dwóch grup: Z delecją: Współczynnik TOP2A/CEN-17 < 0,8 Tkanki normalne: 0,8 Współczynnik TOP2A/CEN-17 < 2,0 Z amplifikacją: Współczynnik TOP2A/CEN-17 2,0 W przypadku testu HercepTest, wszystkie próbki pozytywne, sklasyfikowane jako 1+, 2+ i 3+ poddawano badaniu HER2 FISH. Ocena przypadków pozytywnych dla HER2 (48) w badaniu była następująca: Pozytywne: HercepTest=3+ lub HercepTest=2+ i stosunek FISH HER2 2,0 Negatywne: HercepTest=0,1+ lub HercepTest=2+ i stosunek FISH HER2 < 2,0 Badanie kliniczne (DBCG 89D) i biologiczne sub-badanie (DBCG 89D/TOP2A) zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską i uzyskały akceptacje lokalnych Komitetów Etycznych. Metodologia statystyczna Podstawowym punktem końcowym badania było RFS, definiowane jako czas od randomizacji do zdarzenia lub usunięcia danych pacjenta. Dodatkowym punktem końcowym było OS, definiowane jako czas od randomizacji do śmierci lub usunięcia danych pacjenta. Wpływ leczenia z użyciem CEF nad CMF na RFS i OS był oceniany ilościowo przy użyciu współczynnika ryzyka, oszacowanego z wykorzystaniem proporcjonalnego modelu ryzyka Coxa. P04092PL_02/K str. 22/39

23 Model proporcjonalnego ryzyka Coxa został dopasowany do wyników procedur dopasowania oraz poszukiwań interakcji, definiujących podstawowy model Coxa z wieloma zmiennymi w celu analizy RFS i OS. Współczynnik ryzyka (HR), 95 % przedział ufności i wartość p testu Walda zostały nadane każdej zmiennej towarzyszącej terminowi interakcji modelu Coxa. Wartość HR dla terapii z CEF w porównaniu z terapią CMF w każdej podgrupie TOP2A (i podgrupie HER2) była uzyskiwana na podstawie wyników i kreślona na wykresie Forresta. Po dopasowaniu modeli proporcjonalnego ryzyka Coxa RFS i OS do wyników procedur przydatności do danego celu oraz badań nad interakcjami, przeprowadzono 3 rodzaje analiz dodatkowych. Estymacja wielu zmiennych w 3 podgrupach przypadków TOP2A: Z delecją, prawidłowych, z amplifikacją. Estymacja wielu zmiennych w 2 podgrupach przypadków HER2: Negatywne, pozytywne. Jednolita estymacja wielu zmiennych dla wszystkich pacjentów z uwzględnieniem interakcji TOP2A i HER2. Korelacje pomiędzy statusem TOP2A a zmiennymi klinicznymi i patologicznymi w tym statusem HER2 oceniono w χ2. Czas badań kontrolnych został oznaczony ilościowo z użyciem oceny Kaplan-Meiera potencjalnego przebiegu. Przeprowadzono analizy dla możliwego przesunięcia z użyciem testu χ2 i logarytmicznego testu rang. Pacjenci z brakującą wartością któregoś z parametrów, poza statusem receptorów, zostali wykluczeni z analizy wielu zmiennych modelu proporcjonalnego ryzyka Coxa. Wyniki Analiza TOP2A FISH zakończyła się powodzeniem w 773 spośród 806 (96%) próbek raka sutka. Całkowity rozkład statusu TOP2A pomiędzy objętymi pacjentkami przedstawia Tabela 1. Amplifikacja TOP2A została wykryta u 92 (11,9%) spośród 773 objętych pacjentek a delecja u 87 (11,3%). Tabela 1. Rozkład statusu TOP2A Status TOP2A n (%) Z delecją 87 (11,3) Tkanki normalne 594 (76,8) Z amplifikacją 92 (11,9) Razem 773 (100) P04092PL_02/K str. 23/39

24 Rozkład amplifikacji i delecji TOP2A względem statusu HER2 przedstawia Tabela 2. Tabela 2. Rozkład statusu HER2 względem statusu TOP2A Status HER2 TOP2A N n (%) Z delecją n (%) Tkanki normalne n (%) Z amplifikacją n (%) Ujemny 527 (100) 26 (4,9) 487 (92,4) 14 (2,7) Dodatni 246 (100) 61 (24,8) 107 (43,5) 78 (31,7) Razem 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) wartość p χ 2 p< 0,0001 Analizując status HER2 wśród nowotworów HER2 pozytywnych wykryto więcej aberracji TOP2A. Aberracje TOP2A znaleziono w 139 (56,5%) spośród 246 HER2 pozytywnych nowotworów i w 40 (7,6%) spośród 527 nowotworów HER2 negatywnych. Tym samym, 40 (22,3%) pacjentek z aberracjami TOP2A mogłoby zostać przeoczonych, jeżeli analizie poddano by tylko próbki HER2 pozytywne. Rozkład aberracji TOP2A względem statusu HER2 FISH przedstawia Tabela 3. Podobnie jak w przypadku statusu HER2, odnaleziono statystyczną korelację ze statusem TOP2A. Tabela 3. Rozkład statusu HER2 FISH względem statusu TOP2A HER2 FISH TOP2A N n (%) Tkanki 539 normalne (100) Z amplifikacją 234 (100) Razem 773 (100) Z delecją n (%) Tkanki normalne n (%) Z amplifikacj ą n (%) 31 (5,8) 493 (91,5) 15 (2,8) 56 (23,9) 101 (43,2) 77(32,9) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) wartość p χ 2 p< 0,0001 Rozkład aberracji TOP2A względem klasyfikacji punktowej HercepTest przedstawia Tabela 4. Podobnie jak w przypadku statusu HER2, odnaleziono statystyczną korelację ze statusem TOP2A. Tabela 4. Rozkład punktacji HercepTest względem statusu TOP2A HercepTes t TOP2A N n (%) Z delecją n (%) Tkanki normalne n (%) Z amplifikacj ą n (%) (100) 11 (5,3) 192 (91,9) 6 (2,9) (100) 13 (5,1) 238 (92,6) 6 (2,3) (100) 3 (3,9) 65 (83,3) 10 (12,8) (100) 60 (26,2) 99 (43,3) 70 (30,6) Razem 773 (100) 87 (11,3) 594 (76,8) 92 (11,9) wartość p χ 2 p< 0,0001 U sześciu spośród 773 pacjentek z dostępnymi danymi TOP2A brakowało danych klinicznych, co wykluczyło je z analizy wielu zmiennych. W przypadku pacjentek z dostępnymi wynikami badania TOP2A potencjalny czas prowadzenia badań kontrolnych wyniósł dla RFS 9,4 lat a odpowiadająca liczba zdarzeń 371. Mediana potencjalnego czasu prowadzenia badań kontrolnych wyniosła P04092PL_02/K str. 24/39

25 dla OS 11,1 lat a liczba zdarzeń 336. Wykres Kaplan Meiera dla RFS z podziałem na 2 grupy terapeutyczne dla każdej z 3 grup TOP2A przedstawiono na Rysunku 2-4. Rysunek 2. RFS dla pacjentek leczonych CMF i CEF z nowotworami z amplifikacją TOP2A Rysunek 3. RFS dla pacjentek leczonych CMF i CEF z nowotworami normalnymi pod względem TOP2A P04092PL_02/K str. 25/39

26 Rysunek 4. RFS dla pacjentek leczonych CMF i CEF z nowotworami z delecją TOP2A Zarówno w grupie z amplifikacją TOP2A jak i w grupie z delecją TOP2A leczenie CEF wykazało przewagę nad CMF. W przypadku pacjentów z amplifikacją TOP2A różnica była znacząca (p=0,037). Różnicy takiej nie udało się wykryć dla grupy pacjentek z prawidłowym TOP2A. Odnośnie podstawowego punktu końcowego badania (RFS) analiza z użyciem modelu proporcjonalnego ryzyka Coxa wykazała znaczącą wartość predykcyjną aberracji genu TOP2A (p=0,016). Grupa pacjentek z amplifikacjami TOP2A charakteryzowała się względną redukcją ryzyka powyżej 60%, gdy były leczone CEF w porównaniu do CMF (HR=0,389, p=0,0017). Także dla pacjentek z delecjami TOP2A wykryto redukcję ryzyka, jakkolwiek nie była ona statystycznie znacząca (HR=0,608, p=0,0828). Na Rysunku 5 względny wpływ CEF w każdej z podgrup TOP2A i HER2 przedstawiono z uwzględnieniem RFS. Rysunek 5. Względny wpływ CEF w każdej z podgrup TOP2A i HER2 na RFS (wykres Forresta) W przypadku OS uzyskano podobne wyniki jak dla RFS, lecz nie były one statystycznie znaczące (p=0,14). W grupie pacjentek z amplifikacjami TOP2A wystąpiła redukcja ryzyka powyżej 50%, gdy były leczone CEF w porównaniu do CMF (HR=0,485, p=0,0142). Także dla RFS wykryto nieznaczącą statystycznie redukcję ryzyka dla pacjentek z delecjami TOP2A (HR=0,678, p=0,155). Rysunek 6 przedstawia względny wpływ CEF w każdej z podgrup TOP2A i HER2 przedstawiono z uwzględnieniem OS. P04092PL_02/K str. 26/39

27 Rysunek 6. Względny wpływ CEF w każdej z podgrup TOP2A i HER2 na OS (wykres Forresta) Wartość predykcyjna statusu HER2 była również badana a uzyskane dane wykazały brak wpływu interakcji terapeutycznych, ani dla RFS ani OS. Analiza rozkładu aberracji TOP2A względem wyjściowej charakterystyki wykazała znaczący statystycznie związek z kilkoma uznanymi histopatologicznymi czynnikami prognostycznymi. Ponadto, dane wykazały, że stosunek ilości kobiet z aberracjami TOP2A wzrastał z wiekiem, co było powodem częstszego występowania choroby u kobiet po menopauzie, niż przed nią. Jednoczynnikowa analiza przeżycia wskazała na ujemny, statystycznie znaczący wpływ zarówno na RFS, jak i OS, gdyż pacjentki z amplifikacjami i delecjami wykazywały statystycznie znaczącą redukcję współczynnika przeżycia w porównaniu z pacjentkami o normalnym statusie TOP2A. Krzywe przeżycia wykazały również, że pacjentki z delecjami miały nawet gorsze rokowanie niż pacjentki ze statusem amplifikacji lub prawidłowym TOP2A. Krzywe przeżycia dla pacjentek ze statusem amplifikacji, normalnym i delecji TOP2A przedstawia Rysunek T. P04092PL_02/K str. 27/39

28 Rysunek 7. Status TOP2A z uwzględnieniem RFS i OS (N=767) Poza związkiem z uznanymi klinicznymi czynnikami prognostycznymi wykazano, że aberracje TOP2A posiadają niezależną wartość prognostyczną. Przy użyciu modelu proporcjonalnego ryzyka Coxa wykazano, że aberracja genu TOP2A wiązała się ze statystycznie gorszym rokowaniem zarówno względem RFS (p=0,0169) jak i OS (p=0,0118). HR i 95% przedziały ufności bazujące na modelu Coxa dla RFS i OS przedstawiają Tabele 5 i 6. P04092PL_02/K str. 28/39

29 Tabela 5. HR dla RFS TOP2A z uwzględnieniem interakcji terapeutycznych Zmienny Menopauza Przed Po Wielkość nowotworu wzrost w cm Węzły chłonne zajęte Status TOP2A Z delecją Tkanki normalne Z amplifikacją Status HER2 Ujemny Dodatni wartość p 0,0576 <0,0001 <0,0001 0,0169 0,2998 HR 95% CI 1 1,26 (0,99 1,60) 1,15 (1,09 1,22) 1 2,01 4,16 1,66 1 1,56 (1,39 2,91) (2,88 6,02) (1,12 2,45) (1,00 2,42) 1 1,15 (0,88 1,49) Tabela 6. HR dla OS TOP2A z uwzględnieniem interakcji terapeutycznych Zmienny Menopauza Przed Po Wielkość nowotworu wzrost w cm Węzły chłonne zajęte Status TOP2A Z delecją Tkanki normalne Z amplifikacją Status HER2 Ujemny Dodatni wartość p 0,0124 <0,0001 <0,0001 0,0118 0,0519 HR 95% CI 1 1,37 (1,07 1,75) 1,16 (1,10 1,23) 1 2,62 5,50 1,82 1 1,37 (1,70 4,04) (3,58 8,45) (1,22 2,71) (0,87 2,16) 1 1,31 (1,00 1,72) Gdy w Tabeli 5 (RFS) sklasyfikowano wartości HR różnych zmiennych względem ich wartości prognostycznej, lista ta wygląda następująco: liczba zajętych węzłów chłonnych > TOP2A status > status menopauzalny > status HER2 i wielkość nowotworu. Jak widać na podstawie tego zestawienia, liczba zajętych węzłów chłonnych jest zmienną o największym wpływie prognostycznym, po niej występuje status TOP2A, status menopauzalny, wielkość nowotworu i status HER2. Jeżeli zestawienie to powtórzyć dla OS (tabela 6) wyniki są podobne jak dla RFS, wskazując na dużą wartość prognostyczną statusu TOP2A. Wartość prognostyczna statusu HER2 była również badana i jednoczynnikowa analiza przeżycia wskazała statystycznie znaczący, ujemny wpływ zarówno na RFS jak i OS, gdyż pacjentki HER2 pozytywne wykazywały redukcję przeżywalności w porównaniu z pacjentkami o normalnym statusie HER2. Podstawowa analiza RFS z użyciem analizy regresji P04092PL_02/K str. 29/39

30 proporcjonalnego ryzyka Coxa wykazała brak znaczącego statystycznie wpływu statusu HER2. Przy powtórzeniu analizy dla OS, pozytywny status HER2 wykazał statystycznie znaczący, ujemny wpływ na przeżywalność. Dyskusja i wnioski Badanie DBCG 89D/TOP2A wykazało statystycznie znaczącą wartość predykcyjną i prognostyczną aberracji genu TOP2A. W oparciu o porównania ze statusem HER2 można wyciągnąć wniosek, że status HER2 i status TOP2A nie są zamienne, ani pod względem wartości predykcyjnej, ani prognostycznej. TOP2A jest na poziomie molekularnym celem działania farmakologicznego epirubicyny i badanie wykazało, że aberracja genu TOP2A, szczególnie jego amplifikacje, jest użytecznym markerem predykcyjnym odpowiedzi na epirubicynę. Chemioterapia bazująca na antracyklinach z użyciem doksorubicyny i epirubicyny jest jednym z najbardziej aktywnych reżimów terapeutycznych raka sutka. Jednakże, substancje te posiadają znaczące ostre i długoterminowe efekty uboczne, takie jak kardiotoksyczność i białaczka. Badanie porównawcze pomiędzy TOP2A FISH pharmdx Kit i TOP2A IQFISH pharmdx Zestaw Dako TOP2A IQFISH pharmdx (nr kat. K5733) porównano z zestawem Dako TOP2A FISH pharmdx Kit (nr kat. K5333) w badaniu porównawczym 80 próbek sutka z ludzkiego raka sutka. Tabela krzyżowa statusów genu TOP2A uzyskanych w dwóch testach wykazuje całkowitą zgodność równą 100% z dolnymi i górnymi progami dla przedziału ufności 95% równymi 96,9% i 100%. Wartość Kappa wynosiła 1. P04092PL_02/K str. 30/39

31 Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak lub słabe sygnały 1a. Podczas transportu lub przechowywania zestaw był narażony na wysokie temperatury. 1b. Mikroskop nie działa prawidłowo - Założono niewłaściwy filtr - Nieodpowiednia lampa - Przestarzała lampa rtęciowa - Zabrudzone i/lub pęknięte soczewki kolektora - Nieodpowiedni olej immersyjny 1a. Kontrola warunków przechowywania. Należy upewnić się, że w otrzymanej partii towaru obecny był suchy lód. Upewnić się, że fiolka 3 była przechowywana w temperaturze -18 C, w ciemności. Upewnić się, że fiolki 2A i 5 były przechowywane w temperaturze nie wyższej niż 2 8 C oraz, że były przechowywane w ciemności. 1b. Należy sprawdzić mikroskop i upewnić się, że używane filtry są odpowiednie do stosowania z zestawem fluorochromowym, a lampa rtęciowa jest prawidłowa i nie został przekroczony czas jej spodziewanej żywotności (patrz Załącznik 3). W razie wątpliwości należy skontaktować się z lokalnym przedstawicielem firmy produkującej mikroskopy. 1c. Zanikanie sygnałów 1c. Należy unikać długich badań mikroskopowych oraz zminimalizować czas narażenia na silne źródła światła. 1d. Nieodpowiednie warunki obróbki wstępnej 1e. Parowanie mieszaniny sond podczas hybrydyzacji 1d. Należy upewnić się, że przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. 1e. Należy upewnić się, że w komorze hybrydyzacyjnej panuje dostateczna wilgotność. 2. Brak zielonych sygnałów 3. Brak czerwonych sygnałów 2a. Nieprawidłowe warunki odpłukiwania 3a. Nieodpowiednie warunki obróbki wstępnej 2a. Należy upewnić się, że przestrzegana jest zalecana temperatura i czas odpłukiwania, oraz że przed płukaniem usunięto szkiełka nakrywkowe. 3a. Upewnić się, że przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. P04092PL_02/K str. 31/39

32 Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 4. Obszary poza sygnałem 4a. Zbyt mała objętość sondy 4a. Upewnić się, czy objętość sondy jest wystarczająco duża, aby pokryć obszar pod szkiełkiem nakrywkowym 4b. Zbieranie się pęcherzyków powietrza podczas aplikacji mieszaniny sond lub zatapiania 4b. Unikać pęcherzyków powietrza. Jeśli są widoczne, delikatnie ostukać preparat pincetą 5. Nadmierne wybarwienie tła 6. Zaburzona morfologia tkanek 7. Zbyt wysoki poziom zieleni w preparacie, z uwzględnieniem obszarów bez tkanek FFPE 5a. Niewłaściwe utrwalenie tkanek 5b. Parafina nie została całkowicie usunięta 5c. Zbyt niska temperatura odpłukiwania 5d. Przedłużona ekspozycja części hybrydyzowanej na silne źródło światła 6a. Nieprawidłowe poddanie działaniu pepsyny 6b. Niewłaściwe warunki wstępnego przygotowania mogą spowodować niejasny lub mętny wygląd 6c. Zbyt długie stosowanie pepsyny lub bardzo mała grubość preparatów mogą być przyczyną pojawienia się cieni komórkowych lub komórek obrączkowatych. 7. Użycie przeterminowanych lub niezalecanych szkiełek 5a. Należy upewnić się, że badane są wyłącznie skrawki utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie 5b. Stosować procedury deparafinizacji i uwodnienia, przedstawione w rozdziale B.2 5c. Należy upewnić się, że temperatura odpłukiwania wynosi 63 (±2) C 5d. Należy unikać długich badań mikroskopowych oraz zminimalizować czas narażenia na silne źródła światła 6a. Należy przestrzegać zalecanych czasów inkubacji z pepsyną. Patrz część B.3, etap 2. Należy upewnić się, czy pepsyna przechowywana jest we właściwej temperaturze. Patrz część B.1 6b. Upewnić się, że przestrzegano zalecanej temperatury i czasu obróbki wstępnej. 6c. Należy skrócić czas inkubacji z pepsyną. Patrz część B.3, etap 2. Należy upewnić się, że grubość preparatów wynosi 4 6 µm 7. Upewnić się, że powlekane szkiełka (Dako Silanized Slides, nr kat. S3003 lub szkiełka powlekane poli-llizyną) nie są przeterminowane. UWAGA: Jeśli problemu nie daje się przypisać żadnej z powyższych przyczyn, bądź jeśli zalecane postępowanie jest nieskuteczne, należy się skontaktować z Działem Pomocy Technicznej Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. P04092PL_02/K str. 32/39

33 Dodatek 1 TOP2AIQFISH pharmdx, nr kat. K5733 Lista kontrolna protokołu Numer identyfikacyjny serii barwienia: Data serii: TOP2AIQFISH pharmdx, K5733 partia: Numer identyfikacyjny próbki: Numer identyfikacyjny sprzętu: Data rozcieńczenia/ważności 1x Bufor do płukania (fiolka 6, rozcieńczona w stosunku 1:20): / Tkanki utrwalone w obojętnej, buforowanej formalinie Tak Nie Etap 1: Przygotowanie wstępne Data rozcieńczenia/wygaśnięcia ważności Roztworu do obróbki wstępnej (fiolka 1, rozcieńczona w stosunku 1:20) Zmierzona temperatura roztworu Do obróbki wstępnej (95 99 C) C Obróbka wstępna (10 minut) i schłodzenie (15 minut) Płukanie w Buforze do płukania (fiolka 6, rozcieńczona 1:20) (2 x 3 minuty) Etap 2: Pepsyna Czas poddania działaniu pepsyną (fiolka 2) w temperaturze 37 C lub Czas poddania działaniu pepsyną (fiolka 2) w temperaturze pokojowej lub Czas zanurzenia w pepsynie w temperaturze 37 (±2) C Płukanie w Buforze do płukania (fiolka 6, rozcieńczona 1:20) (2 x 3 minuty) Preparaty należy odwodnić (3 x 2 minuty) w kolejnych stężeniach etanolu i odłożyć do wyschnięcia Etap 3: Mieszanina sond TOP2A/CEN-17 IQISH Nanieść mieszaninę sond (fiolka 3), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnić za pomocą Szczeliwa do szkiełek nakrywkowych / Minuty Minuty Minuty Zmierzona temperatura denaturacji (66 ±1 C) C Denaturacja przez 10 minut Zmierzona temperatura hybrydyzacji (45 ±2 C) C Hybrydyzacja przez noc (chronić przed światłem) Etap 4: Odpłukiwanie Data rozcieńczenia/wygaśnięcia ważności Buforu do płukania głębokiego (fiolka 4, rozcieńczona 1:20) Zmierzona temperatura Buforu do płukania głębokiego (63 ±2 C) C Odpłukiwanie (10 minut) po zdjęciu szkiełek nakrywkowych Płukanie w Buforze do płukania (fiolka 6, rozcieńczona 1:20) (2 x 3 minuty) Preparaty należy odwodnić (3 x 2 minuty) w kolejnych stężeniach etanolu i odłożyć do wyschnięcia Etap 5: Zatapianie preparatu Nanieść 15 µl Fluorescencyjnego środka do zatapiania (fiolka 5) i przykryć szkiełkiem nakrywkowym / Komentarze: Data i podpis technika: P04092PL_02/K str. 33/39

34 Dodatek 2 TOP2AIQFISH pharmdx, nr kat. K5733 Schemat zliczania Data serii: TOP2AIQFISH pharmdx, K5733 partia: ID serii barwienia w dzienniku: Numer identyfikacyjny próbki: Jądro Nr Punktacja TOP2A Punktacja CEN-17 Jądro Nr Punktacja TOP2A Punktacja CEN-17 Jądro Nr Punktacja TOP2A Punktacja CEN Ogółem (1-20) Ogółem (21-40) Ogółem (41-60) W celu oznaczenia stosunku TOP2A/CEN-17, zliczyć liczbę sygnałów TOP2A oraz liczbę sygnałów CEN-17 w 60 jądrach lub liczbę jąder potrzebną dla uzyskania 60 sygnałów TOP2A (patrz sekcja Interpretacja odczynu). Podzielić sumaryczną liczbę sygnałów TOP2A przez sumaryczną liczbę sygnałów CEN-17. Jeżeli stosunek TOP2A/CEN-17 jest graniczny (0,7 0,9 lub 1,8 2,2), zlicz ponownie próbkę i ponownie wylicz stosunek dla wszystkich zliczonych komórek. Liczba zliczonych komórek Sygnały TOP2A Sygnały CEN-17 Stosunek TOP2A/CEN-17 Delecja genu TOP2A (Stosunek < 0,8) Status genu TOP2A - normalny (0,8 Stosunek < 2) Amplifikacja genu TOP2A (Stosunek 2) Data i podpis technika: Data i podpis histopatologa: Komentarze: P04092PL_02/K str. 34/39

35 Do wytycznych zliczania: patrz: Interpretacja wyniku barwienia. Dodatek 3 TOP2A IQFISH pharmdx, nr kat. K5733 Charakterystyka mikroskopu fluorescencyjnego Dako zaleca stosowanie następującej aparatury z zestawem TOP2A IQFISH pharmdx, K5733: 1. Typ mikroskopu Mikroskop epifluorescencyjny. 2. Lampa Lampa rtęciowa 100-watowa (odnotowywać czas świecenia). 3. Obiektywy Do badania przesiewowego tkanek nadają się suche obiektywy fluorescencyjne, powiększające 10X, lub fluorescencyjne z olejkiem immersyjnym, powiększające 16X. Do silnego powiększenia i zliczania sygnałów zalecane są wyłącznie obiektywy fluorescencyjne z olejkiem immersyjnym, np. 100X. 4. Filtry Filtry są projektowane indywidualnie dla określonych fluorochromów i tak muszą być dobierane. Dako zaleca stosowanie specyficznego filtra DAPI w połączeniu z wysokiej jakości podwójnym filtrem Texas Red/FITC. Filtr DAPI Filtr podwójny dla czerwieni teksańskiej/fitc Pojedyncze filtry Texas Red oraz FITC można stosować w celu potwierdzenia. Fluorochrom Częstotliwość fali wzbudzającej Częstotliwość emitowanej FITC 495 nm 520 nm Texas Red 596 nm 615 nm fali Do każdego typu mikroskopu stosowane są charakterystyczne filtry. Używanie odpowiednich filtrów ma decydujące znaczenie dla interpretacji. Jeśli potrzebują Państwo szczegółowych informacji, prosimy o kontakt z dostawcą mikroskopu lub przedstawicielem firmy Dako. 5. Olejek Olej niefluorescencyjny. Środki ostrożności Nie zaleca się stosować lamp rtęciowych o mocy 50 watów. Nie należy stosować filtrów rodaminowych. Nie zaleca się używania filtrów potrójnych. Mikroskop, który nie został zoptymalizowany, może spowodować trudności w odczytywaniu sygnałów fluorescencyjnych. Ważne jest, aby źródła światła nie były przeterminowane oraz były właściwie ustawione i zogniskowane. Klienci powinni zapoznać się z zaleceniami producenta odnośnie do eksploatacji lampy rtęciowej i szczegółowo ich przestrzegać. Mikroskop należy konserwować, a lampę rtęciową regulować przed interpretacją wyników. Należy dołożyć starań, aby próbka była wystawiona możliwie najmniej na światło wzbudzające, w celu zminimalizowania zanikania fluorescencji. Przed rozpoczęciem hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ zaleca się omówienie budowy mikroskopu z producentem lub zapoznanie się z literaturą. P04092PL_02/K str. 35/39

36 Piśmiennictwo 1. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol 2002;3: Austin CA, Marsh KL. Eukaryotic DNA topoisomerase II beta. Bioessays 1998;20: Roca J. The mechanisms of DNA topoisomerases. Trends Biochem Sci 1995;20: Tsai-Pflugfelder M, Liu LF, Liu AA, Tewey KM, Whang-Peng J, Knutsen T, et al. Cloning and sequencing of cdna encoding human DNA topoisomerase II and localization of the gene to chromosome region 17q Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85: Sng JH, Heaton VJ, Bell M, Maini P, Austin CA, Fisher LM. Molecular cloning and characterization of the human topoisomerase IIalpha and IIbeta genes: evidence for isoform evolution through gene duplication. Biochim Biophys Acta 1999;1444: Smith K, Houlbrook S, Greenall M, Carmichael J, Harris AL. Topoisomerase II alpha coamplification with erbb2 in human primary breast cancer and breast cancer cell lines: relationship to m-amsa and mitoxantrone sensitivity. Oncogene 1993;8: Petit T, Wilt M, Velten M, Millon R, Rodier JF, Borel C, et al. Comparative value of tumour grade, hormonal receptors, Ki-67, HER-2 and topoisomerase II alpha status as predictive markers in breast cancer patients treated with neoadjuvant anthracycline-based chemotherapy. Eur J Cancer 2004;40: Nakopoulou L, Lazaris AC, Kavantzas N, Alexandrou P, Athanassiadou P, Keramopoulos A, et al. DNA topoisomerase II-alpha immunoreactivity as a marker of tumor aggressiveness in invasive breast cancer. Pathobiology 2000;68: Durbecq V, Desmed C, Paesmans M, Cardoso F, Di Leo A, Mano M, et al. Correlation between topoisomerase-iialpha gene amplification and białek expression in HER-2 amplified breast cancer. Int J Oncol 2004;25: Mueller RE, Parkes RK, Andrulis I, O'Malley FP. Amplification of the TOP2A gene does not predict high levels of topoisomerase II alpha białek in human breast tumor samples. Genes Chromosomes Cancer 2004;39: Callagy G, Pharoah P, Chin SF, Sangan T, Daigo Y, Jackson L, et al. Identification and validation of prognostic markers in breast cancer with the complementary use of array-cgh and tissue microarrays. J Pathol 2005;205: Cardoso F, Durbecq V, Larsimont D, Paesmans M, Leroy JY, Rouas G, et al. Correlation be tween complete response to anthracycline-based chemotherapy and topoisomerase II-alpha gene amplification and białek overexpression in locally advanced/metastatic breast cancer. Int J Oncol 2004;24: Hande KR. Topoisomerase II inhibitors. Cancer Chemother Biol Response Modif 2003;21: Tewey KM, Rowe TC, Yang L, Halligan BD, Liu LF. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian DNA topoisomerase II. Science 1984;226: Hortobagyi GN. Anthracyclines in the treatment of cancer. An overview. Drugs 1997;54 Suppl 4: Järvinen TA, Tanner M, Rantanen V, Barlund M, Borg A, Grenman S, et al. Amplification and deletion of topoisomerase IIα associate with ErbB-2 amplification and affect sensitivity to topoisomerase II inhibitor doxorubicin in breast cancer. Am J Pathol 2000;156: Coon JS, Marcus E, Gupta-Burt S, Seelig S, Jacobson K, Chen S, et al. Amplification and Overexpression of Topoisomerase IIalpha Predict Response to Anthracycline-based Therapy in Locally Advanced Breast Cancer. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Gancberg D, Larsimont D, Tanner M, Jarvinen T, Rouas G, et al. HER-2 amplification and topoisomerase IIalpha gene aberrations as predictive markers in nodepositive breast cancer patients randomly treated either with an anthracycline-based therapy or with cyclophosphamide, methotrexate, and 5-fluorouracil. Clin Cancer Res 2002;8: Di Leo A, Cardoso F, Durbecq V, Giuliani R, Mano M, Atalay G, et al. Predictive molecular markers in the adjuvant therapy of breast cancer: state of the art in the year Int J Clin Oncol 2002;7: Park K, Kim J, Lim S, Han S. Topoisomerase II-alpha (topoii) and HER2 amplification in breast cancers and response to preoperative doxorubicin chemotherapy. Eur J Cancer 2003;39: P04092PL_02/K str. 36/39

37 21. Knoop AS, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen BB, Overgaard J, Nielsen KV, et al. Retrospective analysis of topoisomerase IIa amplifications and deletions as predictive markers in primary breast cancer patients randomly assigned to cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil or cyclophosphamide, epirubicin, and fluorouracil: Danish Breast Cancer Cooperative Group. J Clin Oncol 2005;23: Tanner M, Isola J, Wiklund T, Erikstein B, Kellokumpu-Lehtinen P, Malmstrom P, et al. Topoisomerase IIalpha gene amplification predicts favorable treatment response to tailored and dose-escalated anthracycline-based adjuvant chemotherapy in HER-2/neu-amplified breast cancer: Scandinavian Breast Group Trial J Clin Oncol 2006;24: O'Malley F, Chia S, Tu D, Shepherd L, Levine M, Huntsman D, et al. Prognostic and predictive value of topoisomerase II alpha in a randomized trial comparing CMF to CEF in premenopausal women with node positive breast cancer (NCIC CTG MA.5). Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement): Press MF, Mass RD, Zhou JY, Sullivan-Halley J, Villalobos IE, Lieberman G, et al. Association of topoisomerase II-alpha (TOP2A) gene amplification with responsiveness to anthracycline-containing chemotherapy among women with metastatic breast cancer entered in the Herceptin H0648g pivotal clinical trial. In: ASCO Annual Meeting; Abstract No Slamon D, Eiermann W, Robert N, al. e. Phase III randomized trial comparing doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel (AC-T) with doxorubicin and cyclophosphamide followed by docetaxel and trastuzumab (AC-TH) with docetaxel, carboplatin and trastuzumab (TCH) in HER2 positive early breast cancer patients: BCIRG 006 study. Breast Cancer Res Treat 2005; 94: S5 (Abstr 1). 26. Harris L, Dressler L, Cowan D, Berry D, Cirrincione C, Broadwater G, et al. The role of HER- 2 + Topo IIa Amplification in predicting benefit form CAF dose escalation CALGB ASCO Annual Meeting; Abstract no Park K, Han S, Gwak GH, Kim HJ, Kim J, Kim KM. Topoisomerase II-alpha gene deletion is not frequent as its amplification in breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2006;98(3): Villman K, Sjostrom J, Heikkila R, Hultborn R, Malmstrom P, Bengtsson NO, et al. TOP2A and HER2 gene amplification as predictors of response to anthracycline treatment in breast cancer. Acta Oncol 2006;45: Olsen KE, Knudsen H, Rasmussen BB, Balslev E, Knoop A, Ejlertsen B, et al. Amplification of HER2 and TOP2A and deletion of TOP2A genes in breast cancer investigated by new FISH probes. Acta Oncol 2004;43: Knoop A, Knudsen H, Balslev E, Rasmussen B, Overgaard J, During M, et al. TOP2A aberrations as predictive and prognostic marker in high-risk breast cancer patients. A randomized DBCG Trial (DBCG89D). In: Journal of Clinical Oncology, ASCO Annual Meeting Proceedings Part I. Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: Järvinen TAH, Tanner M, Bärlund M, Borg Å, Isola J. Characterization of Topoisomerase IIα Gene Amplification and Deletion in Breast Cancer. Genes Chromosomes Cancer 1999;26: Jarvinen TA, Liu ET. Topoisomerase IIalpha gene (TOP2A) amplification and deletion in cancer--more common than anticipated. Cytopathology 2003;14: Bofin AM, Ytterhus B, Hagmar BM. TOP2A and HER-2 gene amplification in fine needle aspirates from breast carcinomas. Cytopathology 2003;14: Pritchard KI, Shepherd LE, O'Malley FP, Andrulis IL, Tu D, Bramwell VH, et al. HER2 and responsiveness of breast cancer to adjuvant chemotherapy. N Engl J Med 2006;354: Sledge GW, Jr. Is HER-2/neu a predictor of anthracycline utility? No. J Natl Cancer Inst Monogr 2001: Nielsen KV, Müller S, Poulsen TS, Gabs S, Schonau A. Combined Use of PNA and DNA for Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). In: Nielsen PE, editor. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. 2 ed. Norfolk: Horizon Bioscience; p P04092PL_02/K str. 37/39

38 37. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN ]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania USA, Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule C, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: Mosby Company; Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York: Pergamon Press; Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer 2001;92: Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No 176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol 2004;57: Poole CJ, Earl HM, Hiller L, Dunn JA, Bathers S, Grieve RJ, et al. Epirubicin and cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil as adjuvant therapy for early breast cancer. N Engl J Med 2006;355: Group EBCTC. Effects of chemotherapy and hormonal therapy for early breast cancer on recurrence and 15-year survival: an overview of the randomised trials. Lancet 2005;365: Kelleher M, Miles D. 21. The adjuvant treatment of breast cancer. Int J Clin Pract 2003;57: Jørgensen JT, Nielsen KV, Ejlertsen B. Pharmacodiagnostics and Targeted Therapies - A rational approach for individualizing medical anti-cancer therapy in breast cancer. Oncologist 2007;12: Ejlertsen B, Mouridsen HT, Jensen MB, Andersen J, Cold S, Edlund P, et al. Improved outcome from substituting methotrexate with epirubicin: Results from a randomised comparison of CMF versus CEF in patients with primary breast cancer. Eur J Cancer 2007;43: Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol 2003;16: P04092PL_02/K str. 38/39

39 Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania Numer serii Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Sprawdzić w instrukcji stosowania Nie wystawiać na działanie promieni słonecznych (zob. rozdział Przechowywanie) Zawiera ilość materiału wystarczającą do <n> badań Zużyć przed Producent Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostrożności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostrożności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostrożności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostrożności) Piktogram GHS (przestrzegać zaleceń zawartych w części dotyczącej środków ostrożności) Wersja Producent: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dania Tel Fax P04092PL_02/K str. 39/39