ĆWICZENIE 1. Aminokwasy

Transkrypt

1 ĆWICZENIE 1 Aminokwasy Przygotować 5 (lub więcej) 1% roztworów poszczególnych aminokwasów i białka jaja kurzego i dla każdego z nich wykonać wszystkie reakcje charakterystyczne. Reakcja ksantoproteinowa (19) 7ml stężonego HNO 3 21 ml 20% NaOH 1 ml stężonego HNO 3. Zamieszać i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej przez ok. 1 min. W probówkach zawierających aminokwasy z pierścieniami aromatycznymi tworzy się żółta barwa. Każdą probówkę ochłodzić pod bieżącą zimna wodą i OSTROŻNIE dodać 2-3 ml 20% NaOH w celu zobojętnienia roztworu. Następuje zmiana zabarwienia na pomarańczowe. Zaobserwować barwę roztworu i tworzącego się osadu Wykonać reakcje dla wszystkich dostępnych aminokwasów, białka jaja kurzego i wody, i na tej postawie określić, które z nich zawierają pierścienie aromatyczne. Wykrywanie grup tiolowych w aminokwasach zawierających siarkę oraz w białkach. (18) 4 ml octanu ołowiu (0,25M) 7 ml 20% NaOH 1

2 po 1 ml 20% NaOH i jedną kroplę 0,25M octanu ołowiu. Zawartość zamieszać i ogrzewać na wrzącej łaźni wodnej (2-3min). W probówkach zawierających aminokwasy posiadające grupy tiolowe można obserwować powstawanie czarnego zabarwienia powstającego siarczku ołowiu. Rekcje wykonać dla wszystkich dostępnych aminokwasów, roztworu białka jaja kurzego i wody. Na tej podstawie określić które z nich zawierają grupy tiolowe. Wykrywanie układu indolowego reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa 4 ml kwasu glioksalowego 7 ml stężonego H 2 SO 4 po 0,5ml kwasu glioksalowego, zamieszać a następnie podwarstwić 1ml stężonego H 2 SO 4. W probówkach zawierających aminokwasy z pierścieniem indolowym na granicy faz tworzy się fioletowy pierścień. Wykonać dla każdego dostępnego aminokwasu, białka jaja kurzego i wody i na tej podstawie określić które z nich zawierają pierścienie indolowe. Białka Reakcja biuretowa (Piotrowskiego) - wykrywanie wiązań peptydowych. (20) 2 ml 10% NaOH 2

3 1 ml 0,5% CuSO 4 Przygotować 2 probówki. Do pierwszej wlać 1 ml wody destylowanej a do drugiej 1 ml roztworu białka jaja kurzego. Następnie do każdej z nich dodać 1 ml 10% NaOH, zamieszać, i dodać 3 krople 0,5% CuSO 4. W probówce zawierającej białko pojawia się fioletowe zabarwienie. Reakcja Hellera 2 ml stężonego HNO 3 3x pipetki plastikowe Przygotować 2 probówki. Do każdej z nich wlać 1 ml stężonego HNO 3. Następnie do pierwszej nawarstwić 1 ml wody destylowanej, a do drugiej 1 ml roztworu białka jaja kurzego (tak aby roztwory nie zmieszały się). W probówce z białkiem w miejscu zetknięcia się roztworów tworzy się biały lub żółty pierścień zdenaturowanego i wytrąconego białka nierozpuszczalnego w nadmiarze kwasu. Reakcja z NaOH 1 ml 10% NaOH 5 ml 1% kwasu octowego Przygotować 2 probówki. Do pierwszej wlać 1 ml wody destylowanej a do drugiej 1 ml roztworu 3

4 białka jaja kurzego. Następnie do każdej z nich dodać 2 krople 10% NaOH, zawartość zamieszać i do każdej dodać ok. 20 kropli 1% kwasu octowego (nie mieszać). W probówce z białkiem wytwarza się kłaczkowaty osad wytrąconego białka. Działanie alkoholu 11 ml wody destylowanej 2 ml 1% białka jaja kurzego 6 ml 95% EtOH 3x szklane probówki 3x pipetki plastikowe Przygotować trzy probówki. Do pierwszej nalać 1 ml wody destylowanej, a do pozostałych dwóch po 1 ml białka jaja kurzego. Do każdej probówki delikatnie dodać 2 ml 95% etanolu (nie mieszać). W probówkach z białkiem wytrąca się osad białka. Do jednej z nich dodać po 10 min 5mL wody destylowanej i zamieszać. Osad powinien ponownie się rozpuścić. Drugą pozostawić na 40 min i następnie także do niej dodać 5 ml wody. Po zamieszaniu osad nie powinien zaniknąć. Strącanie białek za pomocą kationów (soli metali ciężkich) 3 ml wody destylowanej 3 ml 1% białka jaja kurzego 2 ml 1% roztworu FeCl 3 2 ml 2% roztworu Pb(CH 3 COO) 2, 2 ml 2% roztworu CuSO 4 5x pipetki plastikowe Przygotować 6 probówek. Do trzech nalać po, a do trzech pozostałych po 1 ml białka jaja kurzego. Probówki ustawić parami: woda i białko. Do pierwszej pary dodać po 4 krople 1% roztworu FeCl 3, do drugiej po 4 krople 2% roztworu Pb(CH 3 COO) 2, do trzeciej po 4 krople 2% roztworu CuSO 4. W probówkach z białkiem wytwarza się kłaczkowaty osad wytrąconego białka, którego ilość zależy od użytego jonu metalu ciężkiego. Denaturacja cieplna 1 ml wody destylowanej 1 ml 1% białka jaja kurzego 4

5 1 ml 1% roztworu CH 3 COOH 2 ml roztworu NaCl Przygotować 2 probówki. Do pierwszej odmierzyć 1 ml wody destylowanej a do drugiej 1 ml białka jaja kurzego. Następnie do każdej probówki dodać 1 kroplę 1% roztworu CH 3 COOH i ogrzewać do wrzenia na łaźni wodnej. W probówce z białkiem tworzy się biały kłaczkowaty osad, który staje się wyraźny po dodaniu 5-10 kropli roztworu NaCl. Wyznaczanie wartości punktu izoelektrycznego białka 60 ml wody destylowanej 25 ml 0,05M kwasu octowego 8 ml 0,5% roztworu kazeiny w 0,1M octanie sodu 8x szklanych probówek 1x pipeta szklana na 10 ml 1x pipeta szklana do odmierzenia 0,1 ml Do 8 probówek odmierzyć wodę destylowaną i 0,05M kwas octowy w ilościach podanych w tabelce, a następnie po wymieszaniu dodać do każdej z nich po 1 ml przygotowanego roztworu kazeiny w octanie sodowym. Zawartość probówek ponownie wymieszać, zmierzyć wartość ph i po około 5 min ocenić stopień zmętnienia płynów w poszczególnych probówkach. Wypełnić tabelę. Nr probówki: Substancja Ilość substancji [ml]: ] Woda destylowana 8,9 8,8 8,5 8,0 7,0 5,0 1,0 0,0 Kwas octowy 0,05M 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 9,0 Roztwór kazeiny w octanie sodowym 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 ph roztworu teoretyczne 5,6 5,3 5,0 4,7 4,4 4,1 3,8 3,7 ph roztworu zmierzone Stopień zmętnienia 5