Przeciwciała królicze w zestawie c-kit pharmdx pozwalają na swoistą detekcję białka c-kit w komórkach wykazujących ekspresję antygenu CD117.

Transkrypt

1 c-kit pharmdx Nr kat. K testów metodą manualną Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Zestaw c-kit pharmdx jest przeznaczony do jakościowych testów immunohistochemicznych (IHC) w celu detekcji ekspresji białka c-kit/antygenu CD117 (białka c-kit) w tkankach prawidłowych i nowotworowych, standardowo utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie do badania histopatologicznego. Przeciwciała królicze w zestawie c-kit pharmdx pozwalają na swoistą detekcję białka c-kit w komórkach wykazujących ekspresję antygenu CD117. Zestaw c-kit pharmdx jest stosowany pomocniczo w diagnostyce róŝnicowej guzów stromalnych przewodu pokarmowego (GIST). Po zdiagnozowaniu guzów GIST wyniki z zestawu c-kit pharmdx moŝna pomocniczo stosować do identyfikacji pacjentów klasyfikujących się do leczenia preparatem Gleevec /Glivec (mesylan imatinibu). Wyniki z barwień hematoksyliną i eozyną (H+E) oraz panelu przeciwciał moŝna pomocniczo stosować w diagnostyce róŝnicowej guzów GIST. Interpretacja wyniku musi być dokonana z uwzględnieniem kontekstu klinicznego, kontroli oraz wyników innych metod diagnostycznych przez wykwalifikowanego patologa. Uwaga: Diagnoza guzów GIST oraz wybór sposobu leczenia Gleevec/Glivec nie powinny opierać się jedynie na wynikach tego testu. Nie uzyskano ujemnego odczynu c-kit dla pacjentów, u których zdiagnozowano guza GIST, leczonych lekiem z zastosowaniem preparatu Gleevec/Glivec. Wynik ujemny nie koniecznie wyklucza rozpoznania guza GIST, ani leczenia z zastosowaniem preparatu Gleevec/Glivec 1,2,3 Wszystkich pacjentów uczestniczących w próbach klinicznych leku Novartis Gleevec/Glivec wybierano przy uŝyciu Protokołu Badania Klinicznego Novartis (NCTP, ang. Novartis Clinical Trial Protocol), będącego przedmiotem badań. Odczynnik będący pierwotnym poliklonalnym przeciwciałem króliczym przeciwko c-kit zastosowanym w protokole NCTP został zakupiony od Dako. Sposób produkcji, oczyszczania i kontroli jakości odczynnika będącego pierwotnym poliklonalnym przeciwciałem c-kit pharmdx jest taki sam jak w przypadku odczynnika poliklonalnego przeciwko c-kit (NCTP). Streszczenie i informacje ogólne Wprowadzenie Protoonkogen c-kit, zwany równieŝ antygenem CD117 lub Stem Cell Factor Receptor (receptorem czynnika komórek pnia), jest przezbłonowym białkiem receptorowym typu III o masie 145 kd o aktywności kinazy tyrozynowej. Gen c-kit koduje receptor przezbłonowy o aktywności kinazy tyrozynowej, wykazujący podobieństwo strukturalne do receptorów PDGF (czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego) typu A i B oraz do receptora CSF (czynnika stymulującego kolonie) typu 1. UwaŜa się, Ŝe gen odgrywa istotną rolę w procesie hematopoezy, spermatogenezy i melanogenezy. Białko c-kit zawiera domeny pozakomórkowe z pięcioma pętlami przypominającymi strukturą immunoglobuliny, silnie hydrofobową domenę transbłonową oraz domenę wewnątrzkomórkową wykazującą aktywność kinazy tyrozynowej. Domena wewnątrzkomórkowa jest przedzielona wstawką kinazową na region wiąŝący ATP oraz domenę o aktywności fosfotransferazy. Po aktywacji receptora następuje jego dimeryzacja, fosforylacja substratu i autofosforylacja, a następnie internalizacja receptora, aktywacja kinaz białkowych i fosfolipaz oraz transkrypcja innych protoonkogenów. 4 Wykazano, Ŝe szlak metaboliczny receptora kinazy tyrozynowej c-kit odgrywa duŝą rolę w procesie wzrostu i progresji wielu rodzajów nowotworów złośliwych. 5 Mutacje w obrębie genu c-kit mogą prowadzić do niezaleŝnej od ligandu fosforylacji (aktywacji) kinazy tyrozynowej c-kit, co, jak się uwaŝa, określa podstawową rolę w patogenezie m.in. guzów stromalnych przewodu pokarmowego. 6 Diagnostyka róŝnicowa i rozpoznanie nowotworów podścieliska przewodu pokarmowego sprawiały dotychczas spore trudności. W 2001 roku Agencja ds. śywności i Leków USA zaaprobowała stosowanie mesylanu imatinibu (preparat Gleevec, produkowany przez firmę Novartis z siedzibą w Bazylei w Szwajcarii) do leczenia guzów stromalnych przewodu pokarmowego (GIST). Akceptacja została wydana na podstawie badania klinicznego prowadzonego w grupie dorosłych pacjentów z guzami stromalnymi przewodu pokarmowego, zakwalifikowanych do badania na podstawie potwierdzonej immunohistochemicznie ekspresji białka c-kit (Protokół Badania Klinicznego Novartis), leczonych za pomocą mesylanu imatinibu. 7 Opisano trzy postaci morfologiczne GIST: postać wrzecionowatokomórkową, nabłonkowatokomórkową i mieszaną. NiezaleŜnie od morfologii, w większości komórek nowotworowych GIST stwierdza się ekspresję białka c-kit NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w niewielkim odsetku nowotworów GIST nie stwierdza się ekspresji białka c-kit. Dodatni wynik badania na obecność białka c-kit moŝe występować w przypadku stosunkowo niewielkiej ilości innych rodzajów nowotworów przerzutów czerniaka, mięsaka naczyniowego, mięsaka Ewinga, mastocytoma, nasieniaka oraz drobnokomórkowego raka płuc. Nowotwory typu GIST zwykle wykazują takŝe obecność kaldesmonu o duŝej masie cząsteczkowej, często wykazują obecność CD34 (60 80%) i najczęściej nie wykazują obecności desminy ani białka S Swoistość ( ) PL_001 s. 1/16

2 Poliklonalne przeciwciała królicze przeciwko c-kit otrzymano podając zwierzętom w iniekcji podskórnej peptyd o długości 14 aminokwasów (pozycje wewnątrzkomórkowego końca C białka c-kit) połączony z tyreoglobuliną. Surowicę odpornościową oczyszczono poprzez swoiste związanie z antygenem przy uŝyciu chromatografii AvidGel F z aktywowanym tiolem. Stwierdzono, Ŝe niewielka liczba mięsaków tkanek miękkich daje dodatni odczyn w teście c-kit. 6 Niektóre z tych nowotworów (np. mięśniakomięsak gładkokomórkowy) badano na obecność ekspresji białka c-kit. W jednym z badań porównywano test c-kit pharmdx oraz Protokół Badania Klinicznego Novartis (NCTP) stosowany w celu kwalifikacji pacjentów do badań klinicznych preparatu Gleevec TM prowadzonych przez firmę Novartis. W 2 z 28 przypadków uzyskano dodatni odczyn. Ten sam wynik uzyskano przy uŝyciu obu metod diagnostycznych. Po absorpcji przeciwciał pierwotnych przez syntetyczny peptyd (koniec C białka c-kit o długości 16 aminokwasów) odczyn dodatni został zniesiony. Tak więc na podstawie badania dwóch mięsaków tkanek miękkich stwierdzono swoistą dodatnią reakcję przeciwciał pierwotnych stosowanych w teście c-kit pharmdx z białkiem c-kit. Wewnętrzne badania z zastosowaniem zestawu c-kit pharmdx wykazały ekspresję białka c-kit w róŝnych komórkach prawidłowych. Do komórek tych zalicza się komórki przewodzików oraz mioepitelialne gruczołów sutkowych, wypustki komórek Purkinjego, komórki blaszki właściwej okręŝnicy, nabłonek cewki nerkowych, melanocyty warstwy podstawnej naskórka, komórki mioepitelialne gruczołów skóry, komórki jelitowych splotów nerwowych (Cajala) jelita cienkiego oraz komórki tuczne. Reaktywność cytoplazmatyczna w granulocytach była spowodowana przez aktywność endogennej peroksydazy i widoczna przy stosowaniu odczynnika do kontroli ujemnej. Odczynniki Odczynnik o nr. katalogowym K1906 jest przeznaczony do odczynów wykonywanych metodą manualną. Wyszczególnione substancje wystarczają na wykonanie 25 testów (25 preparatów od pacjentów i 10 preparatów kontrolnych inkubowanych z przeciwciałami przeciwko białku c-kit i 25 preparatów inkubowanych z odpowiadającym odczynnikiem do kontroli ujemnej Negative Control Reagent). Liczbę testów obliczono na podstawie badania przy uŝyciu protokołu manualnego dla testu c-kit pharmdx, z zastosowaniem odczynników gotowych do uŝycia. Materiał znajdujący się w zestawie wystarcza na wykonanie co najwyŝej 10 pojedynczych serii oznaczeń. Dostarczane materiały Ilość Opis 1x4 ml Przeciwciała poliklonalne IgG pochodzenia króliczego c-kit pharmdx Poliklonalne przeciwciała IgG pochodzenia króliczego przeciw ludzkiemu białku c-kit w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 1x4 ml Odczynnik do kontroli ujemnej IgG pochodzenia króliczego Poliklonalne przeciwciała IgG pochodzenia króliczego o stęŝeniu równym lub większym od stęŝenia przeciwciał dodatnich przeciwko c-kit w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i roztwór azydku sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l. 2x5 szkiełek Preparaty kontrolne c-kit pharmdx Na kaŝdym szkiełku znajdują się fragmenty dwóch linii komórek mysich (+) i ludzkich (-), odwirowanych, utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie, reprezentujące umiarkowany poziom ekspresji białka c-kit i brak ekspresji białka c-kit. Nasilenie odczynu wirowanych komórek wynosi 2+ i 0. ( ) PL_001 s. 2/16

3 Zasady procedury Materiały wymagane, ale niedostarczane W składu zestawu IHC c-kit pharmdx wchodzą przeciwciała poliklonalne i szkiełka kontrolne konieczne do przeprowadzenia całej procedury barwienia IHC dla preparatów utrwalanych w formalinie i zatapianych w parafinie. W zastosowanym zestawie po zakończeniu inkubacji pierwotnych przeciwciał poliklonalnych przeciw ludzkiemu białku c-kit optymalne jest stosowanie gotowego systemu wizualizacji wykonanego z wykorzystaniem dekstranu. W skład odczynnika wchodzą cząsteczki wtórnych przeciwciał kozich skierowanych przeciw antygenom króliczym oraz cząsteczki peroksydazy chrzanowej połączone ze wspólnym szkieletem polimerowym dekstranu. W ten sposób wyeliminowano konieczność sekwencyjnego stosowania przeciwciała wtórnego i koniugatu peroksydazy. Po dodaniu chromogenu następuje reakcja enzymatyczna, której produktem jest widoczny produkt, zlokalizowany w miejscu występowania antygenu. Następnie moŝna wykonać barwienie kontrastowe i nakryć preparat szkiełkiem nakrywkowym. Wynik reakcji ocenia się w mikroskopii świetlnej. Dostarczane są równieŝ dwa preparaty kontrolne zawierające utrwalane i zatapiane w parafinie komórki mysie i ludzkie o nasileniu odczynu odpowiednio 2+ i 0. Preparaty są przeznaczone do kontroli jakości i działania zestawu odczynnikowego. Test IHC c-kit pharmdx został zweryfikowany przy uŝyciu następujących odczynników barwiących produkowanych przez firmę Dako: Wash Buffer (nr kat. S3006) Dual Endogenous Enzyme Block (nr kat. S2003) Target Retrieval Solution (nr kat. S1699 lub S1700) EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (nr kat. K4002 lub K4003) DAB+ (nr kat. K3467 lub K3468) Środki ostroŝności Uwaga: Aby zapewnić właściwe wyniki barwienia, z zestawem c-kit pharmdx naleŝy stosować wyłącznie wymienione odczynniki. Nie prowadzono weryfikacji metod odbiegających od zalecanego protokołu. Pozostałe materiały wymagane do wykonania oznaczenia c-kit pharmdx : Hematoksylina, roztwór alkoholowy lub wodny, np. Dako Hematoxylin (nr kat. S3301 lub S3302) Szkiełka nakrywkowe Prawidłowo skalibrowana łaźnia wodna umoŝliwiająca utrzymanie temperatury C lub prawidłowo skalibrowany szybkowar umoŝliwiający podgrzanie do temperatury 125 C. Woda destylowana lub dejonizowana (woda do odczynników laboratoryjnych) Suszarka umoŝliwiająca utrzymanie temperatury C Etanol absolutny i roztwór o stęŝeniu 95% Mikroskop świetlny (wzmocnienie obiektywu 4x 40x) Środki do zatapiania, np. Dako Faramount (nr kat. S3025), Dako Glycergel (nr kat. C0563) lub Dako Ultramount (nr kat. S1964) Tkanki o dodatnim i ujemnym odczynie, do stosowania w charakterze próby kontrolnej (zobacz część Kontrola jakości) Szkiełka podstawowe Fisher SuperFrost Plus, szkiełka pokryte poli-l-lizyną, szkiełka elektrostatyczne, lub Dako Silanized Slides (nr kat. S3003) (patrz część Przygotowanie materiału) Naczynia lub kąpiele do barwienia Minutnik (pomiar w odstępach 2 30 minut) Butelka z roztworem płuczącym Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu Pipeta 1 ml Komora nawilŝająca Uwaga: Wszystkie odczynniki dostępne w zestawie lub oddzielnie. np. Dako Wash Buffer (nr kat. S3006) są specjalnie przeznaczone do stosowania w opisywanym teście. Warunkiem działania testu zgodnie ze specyfikacją jest niestosowanie zamienników. 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. Do stosowania w diagnostyce in vitro. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3), w czystej postaci. StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 3. Tak jak w wypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, podczas pracy z próbkami i odczynnikami naleŝy stosować odpowiednie procedury. 4. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji, temperatury lub metod moŝe powodować błędne wyniki badania. 5. Nie naleŝy zastępować przeciwciał pierwotnych ani odczynników kontroli ujemnej przeciwciałami pierwotnymi lub odczynnikami kontroli ujemnej naleŝącymi do odmiennych partii produkcyjnych (numery partii podano na etykietach fiolek), bądź pochodzącymi od róŝnych producentów. Mogłoby to spowodować uzyskanie błędnych wyników. 6. Odczynniki wchodzące w skład zestawu są dostarczane w optymalnych rozcieńczeniach. nie zaleca się zwiększania rozcieńczenia z uwagi na moŝliwość utraty odczynu antygenów. W razie zmian któregokolwiek z parametrów konieczna jest weryfikacja przez UŜytkownika. 7. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 8. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i ogólnokrajowymi. 9. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie. ( ) PL_001 s. 3/16

4 ZagroŜenia i warunki bezpiecznego stosowania DAB Chromogen* Zawiera: 1-5% czterochlorek bifenylo-3,3,4,4 -tetrailotetraamonowy / Symbol zagroŝenia: Szkodliwe R 40 Ograniczone dowody działania rakotwórczego. R43 MoŜe powodować uczulenie w kontakcie ze skórą. R68 Istnieje ryzyko nieodwracalnych skutków. S35 Niniejszy materiał wraz z opakowaniem musi być usuwany z zachowaniem zasad bezpieczeństwa. S 36/37 NaleŜy stosować odpowiednią odzieŝ i rękawice ochronne. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem dla osób w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkowników naleŝy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy, niebezpiecznych właściwości produktu i środków ostroŝności. (Zgodnie z dyrektywą 94/33/WE Unii Europejskiej). Dodatkowe informacje zawiera Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej. (*DAB Chromogen to substancja wymagana, ale niedostarczana z tym zestawem). Przechowywanie Zestaw c-kit pharmdx naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Preparaty kontrolne muszą być równieŝ przechowywane w temperaturze 2 8 C. Nie naleŝy uŝywać zestawu po upływie daty waŝności wydrukowanej na zewnętrznej części opakowania zestawu. PoniewaŜ nie istnieją ewidentne objawy wskazujące na utratę trwałości produktu, równocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŝy wykonywać dodatni i ujemny odczyn kontrolny. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane na wkładce informacyjnej do opakowania, UŜytkownik powinien sprawdzić ich jakość. 13 Oświadczenie dot. jakości Przygotowanie próbek Odczynniki zestawu c-kit pharmdx zostały poddane kontroli jakości metodami immunohistochemicznym w następujących warunkach: odmaskowanie antygenu w szybkowarze Pascal (nr kodu S2800) w temperaturze 125 C przez 30 sekund, ochłodzenie do temperatury 9 0 C, a następnie poddanie działaniu systemu detekcji EnVision+ Rabbit, HRP. Materiał biopsyjny naleŝy traktować tak, by zachować materiał tkankowy do wykonania odczynów IHC. Dla wszystkich preparatów naleŝy stosować standardowe metody przeprowadzania tkanek. 14 Skrawki zatapiane w parafinie Do badania moŝna stosować tkanki utrwalane w formalinie i zatapiane w parafinie. Nie przeprowadzono weryfikacji innych środków utrwalających, a ich stosowanie mogłoby spowodować uzyskanie błędnych wyników. Preparaty biopsyjne naleŝy pociąć na bloczki o grubości 3 lub 4 mm i utrwalać przez okres właściwy dla danej substancji utrwalającej. Następnie tkanki poddaje się przepojeniu i oczyszczeniu, stosując serię kąpieli alkoholowych i ksylenowych, po czym przepaja płynną parafiną. Temperatura parafiny nie powinna przekraczać 60 C. Właściwie utrwalone i zatopione bloczki tkanek wykazujących ekspresję białka c-kit nadają się do sporządzania preparatów po dowolnym okresie przechowywania, o ile były utrzymywane w chłodnym miejscu, w temperaturze (15 25 C). 14,15 Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o wymiarach 3 5 µm. Wykonane skrawki tkankowe mogą zostać umieszczone na szkiełkach mikroskopowych Fisher SuperFrost Plus, Dako Silanized (nr kat. S3003), szkiełkach z ładunkiem elektrostatycznym lub pokrytych warstwą poli-l-lizyny, a następnie umieszczone w stojaku suszarki. Stojaki na szkiełka naleŝy osuszyć, uderzając o pochłaniający ręcznik w celu usunięcia wody znajdującej się pod warstwą parafiny i na szkiełku, a następnie suszyć w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Następnie stojak wraz z preparatami naleŝy umieścić na jedną godzinę w cieplarce, w temperaturze C. Ewentualne poz ostałości wody po wyjęciu preparatów z cieplarki naleŝy usunąć otrzepując o pochłaniający ręcznik, a następnie znów suszyć w cieplarce przez jedną godzinę. Po wyjęciu z cieplarki, preparaty naleŝy przechowywać w temperaturze pokojowej aŝ do czasu ich schłodzenia i stwardnienia parafiny. Aby zachować antygenowość, skrawki tkankowe zatopione na szkiełkach powinny zostać poddane barwieniu w ciągu 2 miesięcy od sporządzenia skrawków, o ile skrawki były przechowywane w temperaturze pokojowej (20 25 C). Szczegółowe inf ormacje dotyczące przygotowywania próbek przedstawiono w podręczniku Dako Immunochemical Staining Methods 16 oraz 14. i 15. pozycji piśmiennictwa. Z uwagi na brak odpowiednich badań, nie zaleca się stosowania opisywanego testu w odwapnionych tkankach. Preparaty słuŝące do oceny c-kit i weryfikacji obecności nowotworu naleŝy przygotowywać w tym samym czasie. Zaleca się przygotowanie co najmniej 5 szkiełek jednego do badania obecności nowotworu, dwóch do oceny białka c-kit oraz dwóch szkiełek zapasowych. Przygotowanie odczynników Przed przystąpieniem do barwienia naleŝy przygotować następujące odczynniki: Target Retrieval Solution (nr kat. S1699) Przygotować wystarczającą ilość roztworu Target Retrieval Solution, rozcieńczając roztwór wodą destylowaną lub dejonizowaną (wodą do odczynników laboratoryjnych) w stosunku 10 x 1:10, dla kolejnych etapów oznaczenia. Po uŝyciu naleŝy usunąć roztwór Target Retrieval Solution. Uwaga: Roztwór Dako Target Retrieval Solution (nr kat. S1700) nie wymaga rozcieńczenia. ( ) PL_001 s. 4/16

5 Wash Buffer Solution (nr kat. S3006) Przygotować wystarczającą ilość roztworu bufora płuczącego Wash Buffer, rozcieńczając odczynnik Wash Buffer wodą destylowaną lub dejonizowaną (wodą do odczynników laboratoryjnych) w stosunku 10 x 1:10, dla kolejnych etapów oznaczenia. Niewykorzystany roztwór przechowywać w temperaturze 2 8 C nie dłuŝej niŝ przez 7 dni. W przypadku zmętnienia bufor nie nadaje się do uŝycia. Substrate-Chromogen Solution (DAB+) (nr kat lub K3468) Roztwór naleŝy dokładnie wymieszać przed uŝyciem. Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu. Przygotowanie roztworu DAB+ Substrate-Chromogen Solution: dodać 1 kroplę roztworu Liquid DAB+ Chromogen do jednego ml roztworu DAB+ Substrate Buffer i wymieszać. Odrzucić niewykorzystany roztwór. Tak przygotowany roztwór DAB+ zachowuje trwałość przez ok. 5 dni, o ile jest przechowywany w temperaturze 2 8 C. WaŜna uwaga: Roztwór Liquid DAB+ Chromogen w butelce moŝe przyjmować odcienie od przejrzystego do jasnofioletowo-brązowego. Barwa roztworu nie wpływa na wydajność produktu. Stosować rozcieńczenie zgodnie z opisem przedstawionym powyŝej. Dodanie nadmiernej ilości roztworu Liquid DAB+ Chromogen do buforu DAB+ Substrate Buffer spowoduje pogorszenie jakości dodatniego odczynu. Środek do zatapiania Zalecane są bezwodne środki do zatapiania, np. Dako Ultramount (nr kat. S1964). Dopuszczalne jest równieŝ stosowanie wodnych środków do zatapiania, jak Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat. S3025) lub Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŝyciem naleŝy przeprowadzić preparat Glycergel w stan płynny, ogrzewając do temperatury ok. 40 (±5) C. Wykonanie odczynu metodą manualną Uwagi dotyczące procedury Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŝnie przeczytać podane instrukcje i zaznajomić się ze wszystkimi elementami zestawu (zobacz część Środki ostroŝności). Przed przystąpieniem do wykonania odczynu wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Wszystkie procedury inkubacji naleŝy równieŝ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Podczas wykonywania barwienia nie moŝna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. Aby uniknąć wysuszenia preparatów tkankowych, naleŝy umieścić szkiełka w komorze nawilŝającej. Uwaga: Odczynniki i instrukcje dostarczane z systemem opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników z zalecanymi odczynnikami i materiałami. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych lub sprzecznych wyników. Odparafinowanie i ponowne uwadnianie Przed przystąpieniem do wykonania odczynu naleŝy odparafinować preparaty w celu usunięcia środka zatapiającego i ponownego uwodnienia. NaleŜy unikać niecałkowitego usunięcia parafiny poniewaŝ pozostałości środka zatapiającego powodują nasilenie nieswoistego odczynu. KROK 1. Umieścić preparaty w kąpieli ksylenowej i inkubować przez 5 (±1) minut. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. KROK 2. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w etanolu absolutnym na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. KROK 3. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w roztworze etanolu o stęŝeniu 95% na 3 (±1) minuty. Zmienić kąpiel i jednokrotnie powtórzyć procedurę. KROK 4. Strząsnąć nadmiar płynu i umieścić preparaty w wodzie do odczynników laboratoryjnych na 5 (±1) minut. KROK 5. Strząsnąć nadmiar buforu i umieścić preparaty w buforze płuczącym Wash Buffer. Rozpocząć wykonywanie odczynu zgodnie z opisem w części Wykonanie odczynu. Po wykonaniu barwienia 40 preparatów naleŝy zmienić roztwór ksylenu i alkoholu. MoŜna stosować ksylen lub substytuty ksylenu, np. preparat Histoclear. Odmaskowanie antygenu Zalecana procedura: łaźnia wodna KROK 1. Napełnić naczynia do barwienia (np. naczynia Coplin) rozcieńczonym roztworem Target Retrieval Solution (zobacz część Przygotowanie odczynników). Umieścić naczynia do barwienia z roztworem Target Retrieval Solution w łaźni wodnej. Ponownie doprowadzić roztwór Target Retrieval Solution i kąpiel wodną do temperatury C (nie doprowadzić do wrzenia). Przykryć naczynia w celu osiągnięcia stabilnej temperatury i uniknięcia parowania. KROK 2. Zanurzyć odparafinowane skrawki o temperaturze pokojowej w podgrzanym roztworze Target Retrieval Solution znajdującym się w naczyniach do barwienia. Ponownie podgrzać łaźnię wodną i roztwór Target Retrieval Solution do uzyskania stabilnej temperatury C. Inkubować przez 20 (±1) minut w temperaturze C. ( ) PL_001 s. 5/16

6 KROK 3. Wyjąć naczynie zawierające preparaty z łaźni wodnej. Odczekać przez 20 (±1) min w temperaturze pokojowej, aŝ nastąpi schłodzenie preparatów w roztworze Target Retrieval Solution. KROK 4. Zlać roztwór Target Retrieval Solution i przepłukać skrawki buforem płuczącym Wash Buffer (zobacz część Przygotowanie odczynników). KROK 5. Aby zapewnić optymalną wydajność, po zakończeniu odmaskowania antygenu, a przed rozpoczęciem barwienia, naleŝy zanurzyć skrawki w buforze płuczącym Wash Buffer na 5 (±1) minut. Odmaskowanie antygenu Szybkowar (30 sekund w 125 C) W celu zapewnienia powtarzalności wyników barwienia bardzo waŝne jest zachowanie spójności w protokole odmaskowania antygenów. UŜywany szybkowar musi być w stanie osiągnąć i utrzymać temperaturę 125 C a przy kaŝdym barwieniu w szybkowarze powinna znajdować się taka sama całkowita ilość cieczy (roztwór Target Retrieval Solution i woda na tacy szybkowaru), jak równieŝ taka sama całkowita liczba preparatów. Optymalny protokół: KROK 1. Przed kaŝdym barwieniem dodać odpowiednią ilość wody do odczynników laboratoryjnych na tacę szybkowaru (500 ml lub zgodnie z wytycznymi producenta). KROK 2. Napełnić oba plastikowe termoodporne pojemniki do barwienia, w których zostanie umieszczony magazynek na 24 preparaty, 250 ml przygotowanym roztworem Target Retrieval Solution (zobacz część Przygotowanie odczynników). KROK 3. Zanurzyć odparafinowane skrawki o temperaturze pokojowej w roztworze Target Retrieval Solution znajdującym się w pojemnikach do barwienia. Uwaga: W celu zapewnienia powtarzalności podczas kaŝdego barwienia w szybkowarze naleŝy umieścić 48 preparatów; jeŝeli przetwarzanych będzie mniej niŝ 48 szkiełek z preparatami, magazynki do barwienia naleŝy wypełnić pustymi szkiełkami; jeŝeli przetwarzane będą 24 preparaty lub mniej, aby zaoszczędzić roztwór Target Retrieval Solution, drugi pojemnik do barwienia moŝna napełnić 250 ml wody. STEP 4. Umieścić dwa pojemniki do barwienia w szybkowarze i szczelnie zamknąć pokrywę. STEP 5. Nastawić temperaturę w szybkowarze na 125 C; preparaty inkubować w temperaturze 125 C przez 30 sekund. Przed otwarciem szybkowar pozostawić do schłodzenia na 30 minut, bez obniŝania ciśnienia. STEP 6. Przed otwarciem szybkowaru zredukować ciśnienie. Wyjąć pojemniki do barwienia, zlać roztwór Target Retrieval Solution i przepłukać skrawki buforem płuczącym Wash Buffer lub wodą do odczynników laboratoryjnych. KROK 7. Po zakończeniu odmaskowania antygenu, a przed rozpoczęciem barwienia, naleŝy zanurzyć skrawki w buforze płuczącym Wash Buffer na 5 (±1) minut. Uwaga: Roztwór Target Retrieval Solution jest przeznaczony do jednokrotnego stosowania. Nie uŝywać ponownie. Przebieg barwienia metodą manualną KROK 1. Dual Endogenous Enzyme Block (nr kat. S2003) Strząsnąć nadmiar wody. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek ostroŝnie otrzeć szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze zgodnym z zaleceniami. Nanieść taką ilość odczynnika Dual Endogenous Enzyme Block, aby przykryć preparat [minimum 3 krople (100µL)]. Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŝy kierować strumienia wody bezpośrednio na preparat, gdyŝ moŝe to spowodować jego zmycie ze szkiełka. Umieścić w kąpieli ze świeŝym buforem Wash Buffer na 5 (±1) minut. KROK 2. Przeciwciała pierwotne lub odczynnik do kontroli ujemnej Aby uniknąć wysuszenia tkanek, na czas inkubacji przeciwciał pierwotnych i odczynnika do kontroli ujemnej oraz znakowanego polimeru naleŝy umieścić preparaty w komorze nawilŝającej. Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść tyle kropli roztworu przeciwciał pierwotnych lub odczynnika kontroli ujemnej, by zakryć próbkę (minimum 3 krople [100µL]). Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŝacza. Przemyć preparaty tak jak podczas 1. kroku. KROK 3. EnVision+ HRP, Anti-Rabbit (nr kat. K4002 lub K4003) Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść taką ilość znakowanego polimeru, by preparat został zakryty (minimum 3 krople [100 µl]). Inkubować przez 30 (±1) minut w komorze nawilŝacza. Przemyć preparaty tak jak podczas 1. kroku. ( ) PL_001 s. 6/16

7 KROK 4. DAB+ Substrate-Chromogen Solution (nr kat. K3467 lub K3468) Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść roztwór substratu chromogenu DAB+ w takiej ilości by przykryć preparat. (minimum 3 krople (100 µl)]. Inkubować przez 10 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych z butelki. Nie naleŝy kierować strumienia wody bezpośrednio na preparat, gdyŝ moŝe to spowodować jego zmycie ze szkiełka. Umieścić odpady roztworu DAB+ Substrate-Chromogen w pojemniku na materiały niebezpieczne w celu właściwego usunięcia. Umieścić w kąpieli z wody destylowanej na 2 5 minut. Przejść do etapów Barwienie kontrastowe i zatapianie. Barwienie kontrastowe (instrukcje dla hematoksyliny) Barwny produkt końcowy reakcji barwienia jest nierozpuszczalny w alkoholu i wodzie. MoŜna stosować hematoksylinę, roztwór alkoholowy lub wodny, np. Dako Hematoxylin (nr kat. S3301 metoda automatyczna lub S3302 metoda ręczna). Nie stosować regresyjnego barwienia kontrastowego. KROK 1. Zanurzyć preparaty w kąpieli z roztworu hematoksyliny. Inkubować przez 2 5 minut, w zaleŝności od stęŝenia stosowanego roztworu hematoksyliny. KROK 2. OstroŜnie przepłukać wodą do odczynników laboratoryjnych. NaleŜy zadbać, by pozostałości hematoksyliny zostały dokładnie wypłukane. Uwaga: Zdecydowanie zaleca się stosowanie preparatu Dako Hematoxylin (nr kat. S3302). Po trzyminutowym okresie inkubacji, w wyniku barwienia kontrastowego powstaje końcowy produkt reakcji o barwie jasnofioletowej lub niebieskiej, niezakłócający swoistego odczynu immunologicznego. Silne barwienie kontrastowe moŝe maskować słabą ekspresję białka c-kit/cd117. KROK 3. OstroŜnie przepłukiwać wodą do odczynników laboratoryjnych przez 2 5 minut. Zatapianie preparatu Zalecane są bezwodne środki do zatapiania, np. Dako Ultramount (nr kat. S1964). Dopuszczalne jest równieŝ stosowanie wodnych środków do zatapiania, jak Dako Faramount Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat. S3025) lub Dako Glycergel Mounting Medium (nr kat. C0563). Przed uŝyciem naleŝy przeprowadzić preparat Glycergel w stan płynny, ogrzewając do temperatury ok. 40 (±5) C. Uwaga: Zaleca się odczytanie wyników barwienia w ciągu sześciu tygodni od wykonania barwienia. Jednak w zaleŝności między innymi od wymienionych czynników, do których naleŝą materiały i sposoby barwienia kontrastowego i zatapiania oraz warunki przechowywania preparatów, moŝe nastąpić zblaknięcie. Aby ograniczyć blaknięcie, naleŝy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze pokojowej (20 25 C). Kontrola jakości Stosowanie w laboratorium UŜytkownika innych niŝ zalecane metod utrwalania, przeprowadzania i zatapiania tkanek moŝe spowodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania dodatkowej wewnętrznej kontroli jakości, niezaleŝnie od standardowych załączonych preparatów kontroli jakości Dako. W USA naleŝy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości, wydanymi przez Kolegium Patologów Amerykańskich jako Program certyfikacji immunohistochemicznej (College of American Pathologists [CAP]: Certification Program for Immunohistochemistry). Dodatkowe informacje przedstawiono w dokumencie Kontrola jakości CLIS dla zatwierdzonych wytycznych dot. immunocytochemii (CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry Approved Guideline) 17 oraz pozycjach piśmiennictwa Kontrolne szkiełka mikroskopowe c-kit pharmdx (w zestawie) KaŜdy z dostarczanych preparatów kontrolnych zawiera dwa skupienia odwirowanych komórek pochodzących z mysich (+) i ludzkich (-) linii komórkowych, utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie, o nasileniu odczynu 2+ i 0. Dla kaŝdego odczynu naleŝy wykonać barwienie jednego preparatu kontrolnego. Ocena preparatów kontrolnych linii komórkowych Dako świadczy o waŝności serii odczynów. Preparatów kontrolnych nie naleŝy uŝywać do interpretacji wyników pacjenta. Tkanka do dodatniej próby kontrolnej Preparaty kontrolne naleŝy sporządzić ze świeŝych materiałów sekcyjnych, biopsyjnych lub chirurgicznych, moŝliwie szybko utrwalonych i zatopionych w sposób analogiczny do próbki (próbek) pochodzących od pacjenta. Wynik dodatniej kontroli potwierdza właściwe przygotowanie tkanek i prawidłową technikę barwienia. Dla wszystkich serii odczynów i dla kaŝdego rodzaju warunków badania naleŝy uwzględnić jedną dodatnią kontrolę tkankową. Tkanki stosowane jako dodatnie próby kontrolne powinny dawać słaby odczyn dodatni, pozwalający na wykrywanie niewielkich zmian czułości przeciwciał pierwotnych. Preparaty kontrolne dostarczane z opisywanym zestawem lub preparaty przeprowadzane w sposób odmienny od próbek pochodzących od pacjenta pozwalają wyłącznie na weryfikację działania odczynników; preparaty kontrolne nie nadają się do weryfikacji prawidłowego przygotowania tkanek. ( ) PL_001 s. 7/16

8 Znane dodatnie kontrole tkankowe powinny być stosowane wyłącznie w celu monitorowania jakości badanych tkanek i odczynników testowych, a NIE pomocniczo do formułowania swoistych rozpoznań próbek pochodzących od pacjentów. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach dodatnich kontroli tkankowych naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są niewaŝne. Do prawidłowych komórek, które mogą być stosowane do uzyskania słabo dodatniego odczynu c-kit naleŝą melanocyty warstwy podstawnej naskórka, komórki mioepitelialne gruczołów skóry oraz komórki nabłonkowe i mioepitelialne gruczołów sutkowych. Komórki jelitowych splotów nerwowych (Cajala) i komórki tuczne w jelitach stanowią skuteczne kontrole wewnętrzne. Tkanka do ujemnej próby kontrolnej NaleŜy stosować ujemną kontrolę za pomocą tkanki dającej odczyn ujemny, w której nie występuje białko c-kit. Dla kaŝdej serii odczynów tkanka powinna zostać utrwalona, przeprowadzona i poddana zatapianiu w sposób podobny jak próbka (próbki) pochodząca od pacjenta, w celu weryfikacji swoistości przeciwciał pierwotnych i identyfikacji obecności odczynu tła. W charakterze wewnętrznej kontroli ujemnej moŝna wykorzystywać róŝne rodzaje komórek pochodzące z większości tkanek. Preparaty do kontroli ujemnej powinny zostać zweryfikowane przez UŜytkownika. JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbek pochodzących od pacjenta naleŝy uznać za niewaŝne. Kardiomiocyty zalicza się do tkanek, które mogą być wykorzystane w charakterze ujemnych kontroli. Komórki zrazików trzustkowych dają równieŝ ujemny odczyn c-kit, natomiast komórki nabłonka przewodu Ŝółciowego odczyn dodatni. Nieswoisty odczynnik do kontroli ujemnej W celu oceny występowania odczynu nieswoistego i ułatwienia interpretacji swoistego odczynu w miejscach występowania antygenów, dla kaŝdego wycinka pochodzącego od pacjenta, w miejsce przeciwciał pierwotnych naleŝy stosować odczynnik Negative Control Reagent. Czas inkubacji odczynnika Negative Control Reagent powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Jeśli do skrawków seryjnych uŝywane są panele przeciwciał, obszary jednego szkiełka dające odczyn ujemny mogą słuŝyć jako kontrola ujemna/wiązania nieswoistego dla innych przeciwciał. Weryfikacja odczynu Przed pierwszym zastosowaniem przeciwciał lub systemu do wykonywania odczynów UŜytkownik powinien zweryfikować swoistość przeciwciał. W tym celu naleŝy wykonać testy serii wewnątrzlaboratoryjnych tkanek kontrolnych o znanej charakterystyce odczynów w zakresie IHC, odpowiadających tkankom o dodatnim i ujemnym odczynie. NaleŜy zapoznać się z procedurami kontroli jakości omówionymi wcześniej w tej sekcji ulotki oraz z wymaganiami określonymi w dokumentach CAP Certification Program for Immunohistochemistry oraz CLIS Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline. 17 PowyŜsze procedury kontroli jakości naleŝy powtarzać z kaŝdą nową partią przeciwciał i za kaŝdym razem, gdy wystąpi zmiana w parametrach odczynu. Do weryfikacji odczynu moŝna stosować preparaty guzów stromalnych przewodu pokarmowego (GIST) o znanych odczynach c-kit oraz tkanki dające ujemny odczyn. Tabela 1: Cel codziennej kontroli jakości Rodzaj tkanki: utrwalona i przeprowadzona identycznie jak próbki pochodzące od pacjenta Swoiste przeciwciała i system detekcji Tło: nieswoiste przeciwciała królicze odczynnik do kontroli ujemnej Preparat kontrolny dostarczany przez firmę Dako. Kontrola dodatnia: tkanki lub komórki zawierające antygen docelowy (mogą występować w tkankach pacjenta). Idealna próba kontrolna jest tkanką wykazującą słabo dodatni odczyn i moŝliwie największą czułość na utratę własności przez przeciwciała lub antygeny. Wyłącznie odczyn z preparatami kontrolnymi. Ocena preparatów kontrolnych linii komórkowych Dako świadczy o waŝności serii odczynów. Kontrola wszystkich etapów badania. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Weryfikacja odczynników i procedur stosowanych do odczynu kit. Kontrola ujemna: tkanki lub komórki z oczekiwanym ujemnym wynikiem odczynu (mogą występować w tkankach pacjenta lub dodatniej kontroli tkankowej). Detekcja niepoŝądanej reakcji krzyŝowej przeciwciał z komórkami lub strukturami komórkowymi. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Tkanka pochodząca od pacjenta. Detekcja odczynu swoistego. Detekcja nieswoistego odczynu tła. Interpretacja Ocena preparatów powinna być prowadzona przez patologa przy uŝyciu mikroskopu świetlnego. Wszystkie ( ) PL_001 s. 8/16

9 odczynu analizy naleŝy prowadzić na podstawie oceny części preparatu zawierającej utkanie nowotworu. W celu oceny obecności i nasilenia odczynu immunocytochemicznego naleŝy stosować obiektyw o powiększeniu 10x lub 20x. Do interpretacji naleŝy wybierać jedynie komórki prawidłowe, gdyŝ w komórkach z martwicą lub uszkodzonych często występują odczyny nieswoiste. 14,17 W celu weryfikacji działania testu do kaŝdego z zestawów c-kit pharmdx załączono linie komórkowe dające odczyn dodatni i ujemny. Odpowiedni odczyn preparatów kontrolnych stanowi dowód na prawidłowe funkcjonowanie odczynników c-kit pharmdx i postępowanie ściśle według protokołu. odczynu kontrolnej linii komórkowej HT-29 (0) i umiarkowanie silne (2+) zabarwienie cytoplazmatyczne lub okołojądrowe kontrolnej linii komórkowej P815 na kolor brązowy wskazuje, Ŝe wynik serii odczynów jest waŝny. JeŜeli intensywność barwienia linii komórkowej kontroli dodatniej nie jest optymalna (zbyt słaba lub zbyt silna), naleŝy powtórzyć test z uwagi na ryzyko otrzymania wyniku fałszywie dodatniego lub fałszywie ujemnego. NaleŜy dokonać oceny dodatniej kontroli tkankowej. Słabe barwienie komórek mioepitelialnych skóry wskazuje prawidłowe działanie odczynników. JeŜeli nie udaje się potwierdzić dodatniego odczynu w preparatach tkankowych kontroli dodatnich, naleŝy uznać, Ŝe wyniki preparatów testowych są niewaŝne. Tkankę do kontroli ujemnej naleŝy zbadać po tkance do kontroli dodatniej, aby zweryfikować swoistość znakowania antygenu przez przeciwciało pierwotne. odczynu swoistego w tkance do kontroli ujemnej potwierdza brak reaktywności krzyŝowej przeciwciała z komórkami/składnikami komórek. JeŜeli w badaniu tkanek stanowiących ujemną próbę kontrolną uzyskuje się swoisty odczyn, wyniki uzyskane dla próbki pochodzącej od pacjenta naleŝy uznać za niewaŝne. Jeśli odczyn nieswoisty występuje, zazwyczaj ma on charakter rozproszony. W preparatach tkanek poddawanych nadmiernemu utrwalaniu w formalinie moŝe niekiedy występować odczyn w obrębie tkanki łącznej. Interpretację odczynu naleŝy prowadzić w oparciu o komórki nieuszkodzone. Komórki zmienione martwiczo lub uszkodzone często wykazują nieswoisty odczyn. 18 Na końcu naleŝy zbadać próbki pochodzące od pacjenta. Intensywność odczynu dodatniego naleŝy oceniać w kontekście nieswoistego odczynu tła występującego w próbce z odczynnikiem kontroli ujemnej. Interpretacja ekspresji białka c-kit/cd117 musi uwzględniać ogólny obraz morfologiczny i kontekst kliniczny nowotworu. Nowotwory GIST dzieli się na trzy kategorie morfologiczne: postać wrzecionowatokomórkową (70%), nabłonkowatą (20%) i mieszaną. 22 NiezaleŜnie od morfologii, w większości komórek nowotworowych typu GIST stwierdza się ekspresję białka c-kit. W trakcie homogenicznego odczynu immunologicznego przy uŝyciu testu c-kit pharmdx uzyskuje się najczęściej odczyn cytoplazmatyczny, któremu moŝe towarzyszyć barwienie aparatów Golgiego i strefy okołojądrowej (punktowe) oraz odczyn błonowy, obejmujący całość lub część obwodu komórek. Niektóre przypadki wykazują heterogeniczny rodzaj odczynu (silny lub słaby odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy). Występowanie odczynu obserwowano równieŝ w przestrzeni pozakomórkowej. Wyniki testu c-kit pharmdx naleŝy oceniać jako dodatnie lub ujemne na podstawie oceny obserwowanego barwienia ocenianej struktury cytoplazmy i błony komórkowej (Tabela 2). Dodatni wynik ekspresji białka c-kit jest definiowany jako swoisty odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy komórek nowotworu. W przypadku uzyskania ogniskowego wyniku dodatniego lub odczynu w mniej niŝ 10% komórek nowotworu ich interpretację naleŝy przeprowadzać z rozwagą. 23 Podobnie jak w kaŝdym badaniu IHC, wynik ujemny oznacza, Ŝe nie antygen nie został wykryty, a nie Ŝe nie występował w badanych komórkach/tkankach.naleŝy równieŝ zwrócić uwagę, Ŝe w niewielkim odsetku nowotworów GIST nie występuje ekspresja białka c-kit. Tak więc nieobecność odczynu białka c-kit nie wyklucza rozpoznania GIST. Tabela 2: Test c-kit pharmdx wyniki odczynu Wynik przekazywany lekarzowi prowadzącemu leczenie białko c-kit odczyn ujemny białko c-kit odczyn dodatni Definicja odczynu w komórkach nowotworowych. Odczyn dodatni definiowany jest jako dowolny odczyn IHC cytoplazmy i/lub błon komórkowych komórek nowotworowych powyŝej poziomu tła. Nasilenie odczynu: 1+, 2+, lub 3+ W razie potrzeby naleŝy uŝyć panelu przeciwciał w celu zidentyfikowania reakcji fałszywie ujemnych. Jeśli uzyskano odczyn ogniskowy dodatni, naleŝy rozwaŝyć przeprowadzenie dodatkowego testu potwierdzającego diagnozę GIST. Badanie genetyczne, jak równieŝ rodzaje odczynów wymienione w Tabeli 3 są pomocne w róŝnicowaniu guzów GIST i innych mięsaków pochodzenia mezenchymalnego. Konkretne informacje na temat immunoreaktywności moŝna znaleźć w sekcji Streszczenie i wyjaśnienia oraz Ograniczenia i charakterystyka wydajnościowa. ( ) PL_001 s. 9/16

10 Tabela 3. Schemat immunohistochemiczny do diagnostyki róŝnicowej guzów przewodu pokarmowego mających postać wrzecionowatokomórkową. 5 Guz stromalny przewodu pokarmowego (GIST) Nowotwór z komórek mięśni ckit CD34 SMA (aktyna gładkomięśniowa) S-100 Desmin 95% 60-70% 30-40% 5% 2% % + Sporadycznie + gładkich Nerwiak - Typowo Włókniakowatość Dyskusyjne* Sporadycznie + - Sporadycznie * Według doniesień większości autorów włókniakowatość wykazuje ujemny odczyn z białkiem c-kit. W zaleŝności od czasu inkubacji i stęŝenia roztworu hematoksyliny, barwienie kontrastowe powoduje wybarwienie jąder komórkowych na kolor blady do ciemnoniebieskiego. Nadmierne barwienie kontrastowe moŝe utrudniać interpretację wyników. Ograniczenia metody Ograniczenia ogólne IHC jest wieloetapową metodą diagnostyczną wymagającą specjalistycznego przeszkolenia w doborze odpowiednich odczynników, wyborze tkanek, utrwalaniu i przeprowadzaniu, przygotowaniu preparatów do IHC i interpretacji wyników barwienia. Wybarwienie tkanek jest uzaleŝnione od obróbki i przetworzenia tkanki przed wykonaniem odczynu. Nieprawidłowe utrwalanie, zamraŝanie, rozmraŝanie, przemywanie, suszenie, ogrzewanie lub zanieczyszczenie skrawków domieszką innych tkanek lub płynów moŝe powodować artefakty, ukrycie przeciwciał lub wyniki fałszywie ujemne. Przyczyną sprzecznych wyników moŝe być stosowanie zmiennych metod utrwalania i zatapiania lub właściwości zaleŝne od tkanek. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być prowadzona w kontekście objawów klinicznych, morfologicznych i innych kryteriów histopatologicznych. Interpretacja kliniczna dodatniego lub ujemnego odczynu musi być uzupełniona przez badania morfologiczne, wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych i innych badań diagnostycznych. Odpowiedzialność związana z interpretacją wybarwionego preparatu spoczywa na wykwalifikowanym histopatologu, dysponującym doświadczeniem obejmującym stosowane przeciwciała, odczynniki i metody. Barwienie naleŝy wykonać w akredytowanej pracowni histopatologicznej, pod nadzorem histopatologa odpowiedzialnego za przeglądanie i ocenę wybarwionych preparatów i właściwe wykonanie dodatnich i ujemnych prób kontrolnych. Opisywany produkt nie nadaje się do stosowania w cytometrii przepływowej. Nie ustalono charakterystyki wydajnościowej dla cytometrii przepływowej. Tkanki pochodzące od osób z zakaŝeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową. 24 W tkankach które nie zostały uprzednio przetestowane, odczynniki mogą wykazywać nieoczekiwane reakcje. Nie moŝna wykluczyć wystąpienia nieoczekiwanych reakcji równieŝ w przetestowanych grupach tkanek z uwagi na zmienność biologiczną ekspresji antygenów w tkankach nowotworów i innych tkankach zmienionych chorobowo. 20 W przypadku uzyskania nieoczekiwanych reakcji naleŝy przesłać odpowiednią dokumentację do działu wsparcia technicznego firmy Dako. Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu W niewielkim odsetku nowotworów GIST nie występuje ekspresja białka c-kit. Tak więc nieobecność odczynu na c-kit nie wyklucza rozpoznania GIST. Wiązanie białek lub produktów reakcji na drodze mechanizmów innych niŝ immunologiczne moŝe być przyczyną wyników fałszywie dodatnich. Wyniki fałszywie dodatnie mogą równieŝ wystąpić na skutek aktywności podobnej do peroksydazy (erytrocyty) i endogennej aktywności peroksydazy (cytochromu C). 19 W celu uzyskania optymalnych, powtarzalnych wyników, barwienie w kierunku białka c-kit wymaga stosowania odmaskowaniu antygenu w preparatach utrwalanych standardowo (buforowany roztwór formaliny) i zatapianych w parafinie. Dako zaleca stosowanie c-kit pharmdx w aparatach Dako Autostainer lub Autostainer Plus. Nie przeprowadzono weryfikacji zastosowania zestawu c-kit pharmdx w opcjonalnych systemach zautomatyzowanych, a ich stosowanie mogłoby spowodować uzyskanie błędnych wyników. Barwione kontrolne linie komórkowe naleŝy stosować wyłącznie w celu weryfikacji wyników serii odczynów, a nie w celu oceny odczynu w skrawkach tkankowych. ( ) PL_001 s. 10/16

11 Do testowania za pomocą zestawu c-kit pharmdx nadają się preparaty przygotowane przy uŝyciu rutynowej techniki, z zastosowaniem roztworu buforowanej formaliny. Nie prowadzono weryfikacji innych metod utrwalania tkanek. Charakterystyka wydajnościowa Swoistość Badano reaktywność przeciwciał przeciwko antygenom c-kit w liniach komórkowych wykazujących ekspresję białka c-kit. W teście Western blot lizatu linii komórkowej raka drobnokomórkowego płuc SY, wykazującej nadmierną ekspresję mrna c-kit, stwierdzono znakowanie przeciwciałami prąŝka o masie cząsteczkowej 145 kd, odpowiadającego białku c-kit. Znakowany prąŝek ma dość znaczną szerokość, wynoszącą kd. Znakowany został równieŝ dodatkowy prąŝek odpowiadający 100 kd. 25 Dalsze wyznakowanie białka o masie 100 kd uzyskano w dodatkowych badaniach z zastosowaniem drugiego zestawu przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom c-kit. Znakowanie zostało zniesione po inkubacji przeciwciał z syntetycznym antygenem białka c-kit, stosowanym do immunizacji. 26 W dodatkowych badania przeciwciała przeciwko c-kit testowano metodą Western blot pod kątem reaktywności krzyŝowej z białkami homologicznymi strukturalnie, takimi jak receptor płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRa), receptor czynnika stymulującego wzrost kolonii makrofagów (c-fms) oraz kinazę tyrozynową 3 typu FMS (FLT-3). Nie stwierdzono reaktywności krzyŝowej z tymi białkami homologicznymi. Ponadto, przeciwciała Dako stosowane w teście Western blot nie reagowały z lizatem linii komórkowej raka gruczołowego HS, niewykazującego ekspresji genu c-kit. 25 Badania porównawcze Przy uŝyciu zestawu c-kit pharmdx wykonywano odczyny immunohistochemiczne na skrawkach utrwalanych w formalinie i zatopionych w parafinie oraz na macierzach tkankowych MTA zawierających preparaty z mięsaków o dodatniej i ujemnej ekspresji białka c-kit. Tkanki badano przy uŝyciu zestawu c-kit pharmdx po wcześniejszym zastosowaniu dwóch zalecanych metod odmaskowania epitopu (HIER). Preparaty ogrzewano w łaźni wodnej o temperaturze C przez 20 min., sch ładzano przez 20 min., ogrzewano w szybkowarze w temperaturze 121 C przez 5 min. i ponownie chłodz ono przez 20 min. Pozostałe etapy odczynu były identyczne do opisanych. Wyniki były porównywane z równolegle przeprowadzaną symulacją Protokołu Badania Klinicznego Novartis (NCTP) uŝywanego wcześniej do kwalifikacji pacjentów do badania klinicznego, na podstawie którego agencja FDA wyraziła zgodę na podawanie leku Gleevec/Glivec pacjentom ze zdiagnozowanym GIST. W oritijike NCTP uŝywane było 2x wyŝsze stęŝenie przeciwciał pierwotnych poliklonalnych Dako przeciwko c-kit (A4502) (tego samego odczynnika, co w zestawie c-kit pharmdx), bez odmaskowania epitopu. Wyniki porównania równoległych badań NCTP i c-kit pharmdx przy uŝyciu szybkowaru jako źródła ciepła podano w Tabeli 4, a podobne wyniki (ogólna zgodność=98,7%) uzyskano w przypadku uŝycia łaźni wodnej. W obu porównaniach zgodność wyników dodatnich i ujemnych była podobna. Tabela 4. Podwójne porównanie protokołu c-kit pharmdx z zastosowaniem szybkowaru z wynikiem testu NCTP Wynik dla c-kit pharmdx z szybkowarem Dodatni n (%) Wynik równoległego testu wg NCTP Ujemny n (%) Razem Dodatni 188 (60,8) 3 (0,9) 191 Ujemny 1 (0,3) 117 (37,9) 118 Razem Procentowa zgodność wyników ujemnych = 188/(188 +1); = 0,995 x 100 = 99,5% (dokładny przedział ufności dla 95%: 97,1% - 100%) Procentowa zgodność wyników ujemnych = 117/(117+3); = 0,975 x 100 = 97,5% (dokładny przedział ufności dla 95%: 92,9% - 99,5%) Ogólna zgodność = ( )/309 = 0,987 x 100 = 98,7% (dokładny przedział ufności dla 95%: 96,7% - 99,7%) Część preparatów (35) pobrano od pacjentów uczestniczących w badaniu klinicznym Gleevec firmy Novartis. 21 (58,3%) pacjentów z tej grupy otrzymywało preparat Gleevec. Po ponownym przebadaniu tych samych preparatów przy uŝyciu testu NCTP i c-kit pharmdx stwierdzono 20 wyników dodatnich i 1 ujemny, z zastosowaniem wszystkich trzech procedur. U 54% ze 147 pacjentów otrzymujących preparat Gleevec stwierdzono częściową odpowiedź, a u 28% stabilną postać choroby. 7 Dla podzbioru 259 próbek wymienionych w Tabeli 4 wyniki testu na c-kit określono w chwili umieszczania próbek w macierzy MTA. Trzydzieści pięć przypadków włączono do badań klinicznych Gleevec (n=35), a pozostałe testowano w tych samych laboratoriach, które uczestniczyły w badaniu Gleevec. Wyniki dla 179 próbek (suma mniejsza niŝ 259 z uwagi na utratę próbki lub brak komórek nowotworowych w macierzach MTA) przedstawiono w Tabeli 5 poniŝej. W wynikach tych uzyskano zgodność z pierwotnym statusem ekspresji c-kit na poziomie 94,9% (dokładny przedział ufności dla 95%: 90,7% - 97,7%). ( ) PL_001 s. 11/16

12 Tabela 5: macierz 2x2 porównania wyników z szybkowaru z wynikami pierwotnego badania Pierwotny status ekspresji c-kit w tkance Wyniki testu z Dodatni Ujemny Razem zastosowaniem n n n (%) szybkowaru Dodatni (78%) Ujemny (22%) Razem Procentowa zgodność wyników ujemnych = 136/(136+3); = 0,957 x 100 = 95,7% (dokładny przedział ufności dla 95%: 91,0% - 98,4%) Procentowa zgodność wyników ujemnych = 34/(34+3); = 0,919 x 100 = 91,9% (dokładny przedział ufności dla 95%: 78,1% - 98,3%) Ogólna zgodność = (136+34)/179 = 0,949 x 100 = 94,9% (dokładny przedział ufności dla 95%: 90,7% - 97,7%) Powtarzalność Powtarzalność między seriami odczynów (ręczne wykonanie odczynu) Powtarzalność między seriami odczynów testowano w ciągu 3 dni przy uŝyciu ręcznej metody badania w trzech pracowniach. W kaŝdej pracowni dwóch patologów badało 5 róŝnych preparatów po 4 dodatnie i 1 ujemny. W 30 przebadanych tkankach nasilenie odczynu róŝniło się o nie więcej niŝ +/- jeden punkt nasilenia, z poniŝszymi wyjątkami: w ośrodkach 1 i 3 wyniki dla jednego preparatu (tj. po jednym w kaŝdym ośrodku) róŝniły się o więcej niŝ dwa punkty. Było to skutkiem rozerwania tkanki w ośrodku 1. W sumie uzyskano znakomitą powtarzalność (100%), dla wyników dodatnich i ujemnych. Powtarzalność międzylaboratoryjna (ręczne i automatyczne wykonanie odczynów przy uŝyciu aparatu Dako Autostainer) W trzech laboratoriach znajdujących się w róŝnych lokalizacjach geograficznych wykonano odczyn immunohistochemiczny na 30 zrandomizowanych i zamaskowanych próbkach wykazujących róŝny poziom ekspresji c-kit (10 ujemnych i 20 dodatnich). Przygotowane preparaty przesłano do kaŝdej z pracowni w celu wykonania odczynów ręcznych i automatycznych oraz oceny przez histopatologa. W dwóch ośrodkach powtarzalność wyników rozpoznania dodatniego/ujemnego statusu ekspresji białka c-kit była idealna (100%), tak w ramach jednego laboratorium, jak i między laboratoriami, zarówno w metodzie manualnej, jak i automatycznej. W ośrodku 2 zduplikowane szkiełka z dwiema tkankami, które przed badaniem określono jako ujemne, uznane zostały za faktycznie dodatnie. Późniejsza analiza wykazała, Ŝe mały obszar (około 20% komórek nowotworu) wykazał odczyn dodatni. Ta część nowotworu nie była widoczna w próbkach badanych w innych laboratoriach. Powtarzalność w jednej serii odczynów (ręczne wykonanie odczynu) W kaŝdym ośrodku 5 preparatów z tej samej próbki dodatniej włączono do zbioru 30 próbek barwionych ręcznie. Oceniano nasilenie odczynu i procent wybarwienia nowotworu. Wyniki dla tkanek były dodatnie we wszystkich ośrodkach, a nasilenie odczynu róŝniło się o nie więcej niŝ +/- 1 punkt. Immunoreaktywność W Tabeli 6 przedstawiono podsumowanie immunoreaktywności testu c-kit pharmdx w zalecanym panelu prawidłowych tkanek. Wszystkie tkanki były utrwalane w formalinie i zatopione w parafinie. Wykonano 30 standardowych testów tkankowych w automacie DAKO Autostainer zgodnie z dołączonymi instrukcjami i zastosowaniem odczynników zalecanych w ulotce dołączonej do opakowania. Tabela 6: Podsumowanie odczynów uzyskanych w prawidłowych tkankach przy uŝyciu testu c-kit pharmdx * Rodzaj tkanki (liczba testowanych przypadków) Nadnercza (3) Szpik kostny (3) Gruczoły sutkowe (3) Mózg/móŜdŜek (3) Mózg/mózgowie (3) Szyjka macicy (3) Jelito grube (3) Przełyk (3) Serce (3) Nerki (3) Rodzaj odczynu Nieliczne komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki nabłonkowe (3+): odczyn błonowy i cytoplazmatyczny Komórki mioepitelialne: (1+): odczyn cytoplazmatyczny Wypustki komórek Purkinjego (1+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne błony podśluzowej (2+): i blaszka właściwa (2+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne błony podśluzowej (2+): odczyn cytoplazmatyczny Nabłonek cewek nerkowych (2+): odczyn cytoplazmatyczny ( ) PL_001 s. 12/16

13 Wątroba (3) Płuca (3) Komórki międzybłonka (3) Jajniki (3) Trzustka (3) Przytarczyce (3) Nerwy obwodowe (3) Przysadka mózgowa (3) Gruczoł krokowy (3) Ślinianki (3) Mięśnie szkieletowe (3) Skóra (3) Jelito cienkie (3) Śledziona (3) śołądek (3) Jądra (3) Grasica (3) Tarczyca (3) Migdałki (3) Macica (3) Komórki tuczne i makrofagi (2+): odczyn cytoplazmatyczny Rzadko występujące, duŝe komórki nabłonka kanalików (3+): Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne w tkankach miękkich (2+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny Melanocyty warstwy podstawnej (1+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki mioepitelialne nabłonka gruczołowego (1+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki nerwowe (1+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne (2+): odczyn cytoplazmatyczny Komórki tuczne blaszki podstawnej (2+): odczyn cytoplazmatyczny * W przypadku większości testowanych tkanek stwierdzono dodatni odczyn fibroblastów w tkance podścieliska (1+), komórek tucznych i makrofagów. Niekiedy obserwowano odczyn w obrębie eozynofilów wywoływany przez obecność endogennej peroksydazy. Wewnętrzne badania z zastosowaniem zestawu c-kit pharmdx wykazały ekspresję białka c-kit w róŝnych komórkach prawidłowych. Do komórek tych zalicza się komórki przewodzików oraz mioepitelialne gruczołów sutkowych, wypustki komórek Purkinjego, komórki blaszki właściwej okręŝnicy, nabłonek cewek nerkowych, melanocyty warstwy podstawnej naskórka, komórki mioepitelialne gruczołów skóry, komórki jelitowych splotów nerwowych (Cajala) jelita cienkiego oraz komórki tuczne. Reaktywność cytoplazmatyczna w granulocytach była spowodowana przez aktywność ednogennej peroksydazy i widoczna przy stosowaniu odczynnika do kontroli ujemnej. Rozwiązywanie problemów Tabela 7: Rozwiązywanie problemów Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. barwienia preparatów 2. Słabe barwienie preparatów. 1a. Odczynniki nie są uŝywane we właściwej kolejności. 1b. Azydek sodu obecny w kąpieli z buforem płuczącym. 2a. Niedostateczny czas inkubacji. 2b. UŜyto niewłaściwej metody utrwalania. 2c. Niedostateczne odmaskowanie antygenu po uŝyciu roztworu Target Retrieval Solution. 1a. Sprawdzić sposób uŝycia odczynników. 1b. UŜyć świeŝego buforu płuczącego niezawierającego azydku. 2a. Przejrzeć instrukcje podane w części Wykonanie odczynu. 2b. Dopilnować, by tkanki pacjenta nie były poddawane nadmiernemu utrwalaniu i Ŝe jest stosowana odpowiednia substancja utrwalająca 2c. Upewnić się, Ŝe łaźnia wodna lub szybkowar działa prawidłowo, i Ŝe prawidłowo przeprowadzono odmaskowanie epitopu. (Niska temperatura i nieprzestrzeganie przepisanego czasu spowodują, Ŝe odczyn będzie słabszy.) ( ) PL_001 s. 13/16

14 3. Nadmierne barwienie tła w preparatach 4. Tkanka oddziela się od szkiełka. 5. Nadmiernie silny odczyn swoisty. 3a. Niecałkowicie usunięta parafina. 3b. Podczas zatapiania skrawków zastosowano pochodne skrobi. 3c. Preparaty nie są odpowiednio przemywane. 3d. Wysychanie skrawków podczas wykonywania odczynu. 3e. Nieswoiste wiązanie odczynników do skrawka. 4a. Zastosowano niewłaściwe szkiełka mikroskopowe. 5a. UŜyto niewłaściwej metody utrwalania. 5b. Zbyt długie czasy inkubacji odczynników. 5c. UŜyto niewłaściwego buforu płuczącego. 3a. Stosować świeŝe roztwory do odparafinowywania; postępować zgodnie z opisem procedury w części Usuwanie parafiny i ponowne uwadnianie. 3b. Unikać stosowania jakichkolwiek dodatków zwiększających przyczepność skrawków do szkiełek mikroskopowych. Wiele takich preparatów wykazuje reaktywność immunologiczną. 3c. Zastosować świeŝe roztwory w kąpielach z buforem i butelkach z roztworem płuczącym. 3d. Stosować inkubację w komorze nawilŝającej przez 30 min. 3e. Dopilnować właściwego utrwalania preparatów i (lub) upewnić się, Ŝe w preparat nie zawiera obszarów martwicy. 4a. Stosować szkiełka elektrostatyczne (Fisher SuperFrost Plus) lub sylanilizowane (Dako Silanized Slides, nr kat. S3003). 5a. Dopilnować, by były stosowane jedynie zatwierdzone substancje utrwalające i metody utrwalania 5b. Zapoznać się z instrukcjami podanymi w części Wykonanie odczynu. 5c. Stosować wyłącznie rozcieńczony bufor płuczący, zalecany do stosowania z zestawem. 6. Słaby odczyn 2+ kontrolnej linii komórkowej. 5d. Niewłaściwe stosowanie komory nawilŝającej. 6a. Niedostateczne odmaskowanie antygenów. 6b. Niedostateczny czas inkubacji. 6c. Rozkład preparatu kontrolnego. 5d. Stosować inkubację w komorze nawilŝającej przez 30 min. 6a. Zweryfikować, Ŝe procedura odmaskowaniu antygenu została właściwie wykonana. 6b. Zapoznać się z instrukcjami podanymi w części Wykonanie odczynu. 6c. Sprawdzić datę waŝności i warunki przechowywania zestawu podane na etykiecie opakowania. Uwaga: Dodatkowe informacje przedstawiono w części Troubleshooting w publikacji Dako Handbook: Immunochemical Staining Methods, 3rd Edition, 16 Atlas of Immunohistology, 21 lub Immunoperoxidase Techniques. A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 18 W razie wystąpienia niezwykłego odczynu naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. ( ) PL_001 s. 14/16

15 Piśmiennictwo 1. Heinrich, M., Corless, C., Duensing, A., McGreevey, L., Chen, C.J., Joseph, N., Singer, S., Griffith, D., Haley, A., Town, A., Demetri, G., Fletcher, C. and Fletcher, J. PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors, Science 229: , Taniguchi, M., Nishida, T., Hirota, S.. Isozaki, K., Ito, T., Nomura, T., Matsuda, and Kitamura, Y. Effect of c- KIT mutation on prognosis of gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res 59: , Medeiros, F., Codess. C.L., Duensing, A., Homick, J.L., Oliveira, AM., Heinrich, MC., Fletcher, J.A., Fletcher, C.D. KIT-negative gastrointestinal stromal tumors: Proof of concept and therapeutic implications. Am J Surg Pathol. Jul 28(7): Bühring H-J, Ashman LK, Gattei V, Kniep B, Larregina A, Pinto A, et al. CR2.7 Stem-cell factor receptor (p145(c-kit)) summary report (CD117). Schlossman SF, Boumsell L, Gilks W, Harlan JM, Kishimoto T, Morimoto C, et al., editors. Leukocyte typing V. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 5 th International Workshop and Conference; 1993 Nov 3 7; Boston, USA. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University Press 1995; Smithey BE, Pappo AS, Hill DA. C-kit expression in pediatric tumors: a comparative immunohistochemical study. Am J Surg Pathol 2002; 26: Hornick JL and Fletcher CDM. Immunohistochemical staining for KIT (CD117) in soft tissue sarcomas is very limited in distribution. Am J Pathol 2002; 117: Demetri GD, von Mehren M, Blanke CD, Van den Abbeele AD, Eisenberg B, Roberts PJ, Heinrich MC, Tuveson DA, Singer S, Janicek M, Fletcher JA, Silverman SG, Silberman SL, Capdeville R, Kiese B, Peng B, Dimitrijevic S, Druker BJ, Corless C, Fletcher CD, Joensuu H. Efficacy and safety of imatinib mesylate in advanced gastrointestinal stromal tumors. NEJM 2002; 347, 7: Fletcher CDM, Berman J, Corless C, Gorstein F, Lasota J, Longley JB, Miettinen M, O Leary TJ, Remotti H, Rubin BP, Shmookler B, Sobin LH, and Weiss SW. Diagnosis of Gastrointestinal Stromal Tumors: A Consensus Approach. Human Pathology May 2002; 33: Dematteo RP, Heinrich MC, El-Rifai WM, Demetri G: Clinical management of gastrointestinal stromal tumors: before and after STI-571. Human Pathol 2002; 33: Hasegawa T, Matsuno Y, Shimoda T, Hirohashi S: Gastrointestinal stromal tumor: Consistent CD117 immunostaining for diagnostic and prognostic classification based on tumor size and MIB-1 grade. Human Pathol 2002; 33: Graadt van Roggen JF, Van Velthuysen MLF, Hogendoorn PCW. The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumors. J Clin Pathol 2001; 54: Kindblom LG, Remotti HE, Aldenborg F, Meis-Kindblom JM. Gastrointestinal pacemaker cell tumor (GIPACT): gastrointestinal stromal tumors show phenotypic characteristics of the interstitial cells of Cajal. Am J of Pathol 1998; 152, 5: Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, 57 FR7163, February 28, Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: The C. V. Mosby Co Kiernan JA. Histological and histochemical methods: Theory and practice. New York: Pergamon Press Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook: Immunochemical Staining Methods. 3rd Edition. Dako CLIS (formerly National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS). Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. Villanova, PA Order code MM4-A 18. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase techniques. A practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Elias JM, Gown AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herman GE, Jaffe ES, Battifora H, Brigati DJ. Special Report: quality control in Immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: Herman GE, Effont EA. The taming of Immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech Histochem 1991; 66: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specimen processing and quality assurance. Atlas of Immunohistotechnology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986; Demtri GD, Benjamin R, Blanke CD, Choi H, Corless C, DeMatteo RP, Eisenberg BL, Fletcher CDM, Maki RG, Rubin BP, Van den Abbeele AD, and Margaret von Mehren. NCCN Task Force Report: Optimal Management of Patients with Gastrointestinal Stromal Tumor (GIST) Expansion and Update of NCCN Clinical Practice Guideline. Journal of the National Comprehensive Cancer Network 2004, Volume 1: Supplement Berman J, O Leary TJ. Gastrointestinal Stromal Tumor Workshop. Human Pathology 2001; 32(6): Omata M, Liew CT, Ascavali M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemsitry. Amer J Clin Pathol 1980; 73: Tsura Y, Hiraki H, Watanabe K, Igarashi S, Shimamura K, Fukuda T, et al. Preferential localization of c-kit product in tissue mast cells, basal cells of skin, epithelial cells of breast, small cell lung carcinoma and seminoma/dysgerminoma in human: immunohistochemical study on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Virchows Arch 1994; 424: Yardern Y, Kuang W-J, Yang-Feng T, Coussens L, Munemitsu S, Dull TJ, et al. Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptor tyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J 1987; 6:3341 ( ) PL_001 s. 15/16

16 Edition 07/08 ( ) PL_001 s. 16/16