Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 Clone EP17/EP30. Nr kat. M3652. Przeznaczenie

Transkrypt

1 Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 Clone EP17/EP30 Nr kat. M3652 Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, są przeznaczone do stosowania w immunohistochemii. Przeciwciała przeciwko cytokeratynie 8/18 mogą być przydatne w identyfikacji guzów pochodzenia nabłonkowego (1). Interpretacja kliniczna wystąpienia barwienia lub jego braku musi być uzupełniona o badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Synonimy antygenu Keratyna 8/18 (K8/18) (1), CK8/18 (2). Streszczenie i informacje ogólne Dostarczony odczynnik Cytokeratyna 8/18 (CK8/18) naleŝy do rodziny filamentów pośrednich, zróŝnicowanej grupy białek heteropolimerycznych kodowanych przez 54 róŝne geny. Polipeptydy cytokeratyny (CK) klasyfikuje się do podrodzin polipeptydów kwaśnych (typ I) i obojętno-zasadowych (typ II). Polipeptydy typu I i II parują się ze sobą, tworząc dojrzały heteropolimer tetrameryczny. CK18 to białko o masie 45 kda naleŝące do podrodziny cytokeratyn kwaśnych typu I, które zwykle łączy się z cytokeratyną CK8 typu II o masie 54 kda. Razem tworzą one jedną z cytokeratyn niskocząsteczkowych (LMW-CK). CK8/18 ulega ekspresji w nabłonku prostym jednowarstwowym, komórkach podstawnych i powierzchniowych nabłonka przejściowego, komórkach światła kanalików/komórkach wydzielniczych nabłonka złoŝonego, międzybłonku oraz w niektórych typach komórek mezenchymalnych (1). W danej komórce ekspresji moŝe ulegać wielu przedstawicieli rodziny cytokeratyn i są oni cechą charakterystyczną dla typu komórki oraz stanu jej zróŝnicowania (1). CK8/18 ulega ekspresji w komórkach niemal wszystkich nowotworów pochodzenia nabłonkowego i międzybłoniaków (2), dlatego przeciwciała przeciwko CK8/18 są uŝyteczną wskazówką w klasyfikacji guzów nieznanego pochodzenia i raków słabo zróŝnicowanych (1). Przeciwciała przeciwko CK8/18 wykazują odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy. Słaby odczyn ogniskowy moŝe równieŝ występować w przypadku guzów mezenchymalnych, w tym mięśniaka gładkokomórkowego, mięśniakomięsaka prąŝkowanokomórkowego, czerniaka złośliwego, nerwiaka, mięsaka Ewinga, desmoplastycznego nowotworu drobnokomórkowego, raka płaskonabłonkowego oraz chłoniaka (3, 4). Patrz dokument General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych) firmy Dako lub instrukcje do systemu detekcji IHC. Mieszanina dwóch króliczych przeciwciał monoklonalnych jest dostarczana w postaci nadsączu hodowli komórkowej w buforze Tris-HCl o stęŝeniu 0,05 mol/l z azydkiem sodu o stęŝeniu 0,015 mol/l, ph 7,2. Produkt zawiera białko stabilizujące. Klon: EP17 (CK8) i EP30 (CK18). Izotyp: królicze IgG. StęŜenie króliczych lgg [mg/l]: Patrz informacja podana na etykiecie fiolki. StęŜenie białek w róŝnych partiach moŝe się róŝnić bez wpływu na rozcieńczenie optymalne. W celu zapewnienia jednolitości odczynów immunohistochemicznych wykonywanych przy uŝyciu róŝnych partii produktu, miano kaŝdej partii jest porównywane i dostosowywane do partii referencyjnej. Immunogeny CK8: Syntetyczny peptyd odpowiadający resztom C-końcowego fragmentu ludzkiego białka cytokeratyny 8. CK18: Ludzkie białko cytokeratyny 18 wyizolowane z komórek HT-29. Swoistość CK8/18 jest mieszaniną dwóch przeciwciał monoklonalnych. W badaniach Western blot lizatów komórek A431 przeciwciało przeciwko CK8, klon EP17, rozpoznaje główny prąŝek odpowiadający masie cząsteczkowej 52 kda, zgodnej z oczekiwaną masą cząsteczkową CK8, a przeciwciało przeciwko CK18, klon EP30, rozpoznaje prąŝek odpowiadający masie cząsteczkowej 45 kda, zgodnej z oczekiwaną masą cząsteczkową CK18. Środki ostroŝności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Opisywany produkt zawiera azydek sodu (NaN 3), związek silnie toksyczny w czystej postaci. Azydek sodu zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, powodując nagromadzenie silnie wybuchowych azydków metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydków metali w kanalizacji. 3. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych, naleŝy stosować właściwe procedury postępowania. 4. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŝy nosić odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 5. Niewykorzystany roztwór usuwać zgodnie z rozporządzeniami lokalnymi, wojewódzkimi i krajowymi. ( ) P02831PL_02_M3652/ s. 1/5

2 Przechowywanie Skrócona instrukcja uŝytkownika* Przechowywać w temperaturze 2-8 C. Nie naleŝy uŝywać odczynników po upływie terminu waŝności podanego na fiolce. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ podane powyŝej, uŝytkownik powinien zweryfikować te warunki. Nie ma wyraźnych oznak wskazujących na niestabilność produktu. Dlatego jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjenta naleŝy wykonywać kontrole pozytywne i negatywne. W przypadku uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, i gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŝy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Krok Komentarze Utrwalanie Formalina ND Obróbka wstępna Odczynnik EnVision FLEX, High ph (nr kat. K8000/K8004) 20 min HIER, 3 w 1 z uŝyciem PT Link i PT Link Rinse Station Rozcieńczenie 1:50 Inkubacja 20 min Bufor do rozcieńczania Dako Antibody Diluent (nr kat. S0809). Rozcieńczyć bezpośrednio przed uŝyciem Kontrola ujemna Negative Control, Rabbit IgG (nr kat. X0936) Inkubacja 20 min Wizualizacja EnVision FLEX, High ph (nr kat. K8000/K8010) Inkubacja 20 min, inkubacja w odczynniku DAB+ 2x5 min Barwnik Odczynnik EnVision FLEX Hematoxylin Inkubacja 5 min kontrastowy (nr kat. K8008/K8018) Tkanka kontrolna Wątroba prawidłowa Odczyn cytoplazmatyczny/błonowy Szkiełka FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020) Zaleca się stosowanie w celu uzyskania lepszego przylegania skrawków tkankowych do szkiełek. Zatapianie preparatu Wymagane niewodne, trwałe zatapianie preparatów Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania. Oprzyrządowanie Autostainer Link 48 i Autostainer Plus NaleŜy stosować fiolki dostosowane do aparatu (nr kat. SK200-SK203 i S3425) *UŜytkownik jest zobowiązany przeczytać ulotki dostarczane do opakowań, które zawierają dokładne instrukcje przeprowadzania procedury barwienia i postępowania z produktem. Przygotowanie próbek Skrawki parafinowe: Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŝy pociąć na skrawki o grubości około 4 µm. Obróbka wstępna: wymagane jest poddanie utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER). Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki HIER tkanek przy uŝyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High ph (50x) (nr kat. K8004). Odparafinowanie, nawodnienie i cieplne odmaskowanie determinanty antygenowej (HIER) moŝna przeprowadzić z uŝyciem aparatu Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe informacje zawiera instrukcja uŝytkownika aparatu PT Link (PT Link User Guide). Dla aparatów PT Link naleŝy stosować następujące parametry: Temperatura ogrzewania wstępnego: 65 C; temperatura i czas odmaskowania antygenu: 97 C przez 20 (±1) minut; ochłodzić do 65 C. Usunąć statyw z preparatami ze zbiornika PT i natychmiast zanurzyć preparaty w naczyniu/zbiorniku (np. PT Link Rinse Station, nr kat. PT109) zawierającym rozcieńczony bufor EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (nr kat. K8007) o temperaturze pokojowej. Zostawić szkiełka w buforze Wash Buffer na 1 5 minut. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą zostać odwodnione, oczyszczone i zatopione w środku do trwałego zatapiania. ( ) P02831PL_02_M3652/ s. 2/5

3 Procedura barwienia Interpretacja wybarwienia Rozcieńczenie: Zaleca się rozcieńczenie przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP30, nr kat. M3652, w stosunku 1:50. NaleŜy rozcieńczyć przeciwciało w odczynniku Dako Antibody Diluent (nr kat. S0809). Skrawki tkanek poddane wstępnej obróbce naleŝy inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Są to jednak wyłącznie wytyczne. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŝności od rodzaju materiału i sposobu jego przygotowania i powinny być zatwierdzone indywidualnie w kaŝdym laboratorium. Kontrola ujemna: Zalecana kontrola ujemna to odczynnik Dako Negative Control, Rabbit IgG (nr kat. X0936) rozcieńczony do tego samego stęŝenia Ig, co przeciwciało pierwotne. O ile nie potwierdzono stabilności rozcieńczonych przeciwciał i kontroli ujemnej w rzeczywistej procedurze wykonania odczynu, naleŝy rozcieńczyć te odczynniki bezpośrednio przed uŝyciem. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŝy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne. Wizualizacja: Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High ph (nr kat. K8000/K8010) przy zastosowaniu trwającego 20 minut okresu inkubacji w temperaturze pokojowej. Postępować zgodnie z procedurą dostarczoną z wybranymi systemami do wizualizacji. Automatyzacja: Przeciwciała dobrze nadają się do wykonywania odczynów immunohistochemicznych w systemach zautomatyzowanych, takich jak Dako Autostainer, Autostainer Plus oraz Autostainer Link, a takŝe PT Link do obróbki wstępnej. Barwienie kontrastowe: Zalecanym barwnikiem kontrastowym jest EnVision FLEX Hematoxylin (nr kat. K8008/K8018). W celu uzyskania optymalnych wyników zaleca się stosowanie bezwodnego, trwałego środka do zatapiania. Kontrole: Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŝy wykonywać pozytywne i negatywne próby kontrolne z uŝyciem identycznego protokołu. Tkankowa kontrola pozytywna powinna obejmować prawidłową wątrobę, a komórki/struktury powinny wykazywać odczyn taki, jak opisany dla tej tkanki w części Charakterystyka działania. Odczyn komórkowy ma charakter cytoplazmatyczny/błonowy. ( ) P02831PL_02_M3652/ s. 3/5

4 Charakterystyka działania Tkanki prawidłowe: Komórki nabłonka wykazują odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy o nasileniu od umiarkowanego do silnego (5). NaleŜy zwrócić uwagę, Ŝe w obrębie tkanek limfoidalnych moŝliwe jest wystąpienie barwienia komórek siateczki. Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni Nadnercza 3/3 Trzustka 3/3 Szpik kostny 0/3 Przytarczyce 3/3 Gruczoły sutkowe 3/3 Przysadka mózgowa 1/3 MóŜdŜek 0/3 Gruczoł krokowy 3/3 Mózgowie 0/3 Ślinianki 3/3 Szyjka macicy 1/3 Mięśnie szkieletowe 0/3 Jelito grube 3/3 Skóra 3/3 Przełyk 3/3 Jelito cienkie 3/3 Serce 0/3 Śledziona 3/3 Nerki 3/3 śołądek 3/3 Wątroba 3/3 Jądra 2/3 Płuca 3/3 Grasica 3/3 Komórki międzybłonka 2/3 Tarczyca 3/3 Nerwy obwodowe 0/3 Migdałki 3/3 Jajniki 3/3 Macica 1/3 Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni Tkanki nieprawidłowe: Komórki nabłonka wykazują odczyn cytoplazmatyczny i/lub błonowy o nasileniu od umiarkowanego do silnego (41/56) (6). Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni Rak wątrobowokomórkowy 3/3 Czerniak 0/3 Rak nerkowokomórkowy 3/3 Rak niezróŝnicowany 1/3 Rak brodawkowaty nerek 3/3 Mięśniakomięsak 0/1 gładkokomórkowy (1) Rak gruczołowy płuc(2) 2/2 Mięśniakomięsak 0/1 prąŝkowanokomórkowy (1) Rak płaskonabłonkowy płuc 1/1 Rakowiak jelita (2) 2/2 (1) Rak drobnokomórkowy płuc 3/3 Rak jajnika (2) 2/2 Rak gruczołowy Ŝołądka 3/3 Tkanka włóknista (2) 0/2 Rak gruczołowy trzustki 3/3 Potworniak dojrzały (1) 0/1 Rak brodawkowaty tarczycy 3/3 Potworniak niedojrzały (1) 0/1 Rak przewodowy sutka 3/3 Mięśniak gładkokomórkowy 1/2 (2) Rak zrazikowy sutka 3/3 Chłoniak rozlany z duŝych 0/2 komórek B (2) Rak gruczołowy gruczołu 2/3 Chłoniak z komórek T (2) 0/2 krokowego Rak gruczołowy okręŝnicy 3/3 Chłoniak grudkowy (2) 0/2 Składniki tkankowe wykazujące odczyn dodatni ( ) P02831PL_02_M3652/ s. 4/5

5 Piśmiennictwo 1. Moll R, Divo M, Langbein L. The human keratins: biology and pathology. Histochem Cell Biol 2008;129: Dabbs DJ. Diagnostic Immunohistochemistry. Philadelphia,PA: Churchill Livingstone, Adams H, Schmid P, Dirnhofer S, Tzankov A.Cytokeratin expression in hematological neoplasms: A tissue microarray study on 866 lymphoma and leukemia cases. Pathol Res Pract 2008;204: Lane EB, Alexander CM. Use of keratin antibodies in tumor diagnosis (review). Semin Cancer Biol 1990; 1: Yu J. Report of Normal Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP Report on file, D Yu J. Report of Cancer Tissue Immunohistochemical Testing Using Dako Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18, Clone EP17/EP Report on file, D Przeciwciała Monoclonal Rabbit Anti-Human Cytokeratin 8/18 (CK8/18), Clone EP17/EP30, są produkowane przez firmę Epitomics Inc. przy uŝyciu własnej technologii produkcji króliczych przeciwciał monoklonalnych chronionej patentami nr 5,675,063 i 7,402,409. Wydanie 04/14 ( ) P02831PL_02_M3652/ s. 5/5