Dako EnVision+ System-HRP (Dwuaminobenzydyna) Do stosowania z podstawowymi przeciwciałami króliczymi

Transkrypt

1 Dako EnVision+ System-HRP (Dwuaminobenzydyna) Do stosowania z podstawowymi przeciwciałami króliczymi Kod K ml Kod K ml Przeznaczenie Do badań diagnostycznych in vitro. Wskazówki te dotyczą systemu EnVision+ peroksydazy chrzanowej firmy Dako (EnVision+ System, HRP). Zestaw ten przeznaczony jest do stosowania z podstawowymi przeciwciałami króliczymi dostarczanymi przez uŝytkownika do jakościowego oznaczania antygenów w mikroskopie świetlnym w prawidłowych i patologicznych tkankach zatopionych w parafinie, zamroŝonych tkankach lub preparatach komórek. MoŜna uŝywać tkanek preparowanych w róŝnych utrwalaczach, łącznie z etanolem, B-5, płynem Bouina, formaliną cynkową i obojętnym roztworem buforowanej formaliny. NaleŜy zapoznać się z paragrafem Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego lub ze Wskazówkami systemu detekcyjnego dotyczącymi postępowania immunohistochemicznego odnośnie: (1) zasady postępowania, (2) wymaganych materiałów, nie dostarczanych, (3) przechowywania, (4) preparatyki próbki, (5) procedury barwienia, (6) kontroli jakości, (7) wykrywania i usuwania problemów, (8) interpretacji wyniku barwienia, (9) ograniczeń ogólnych. Streszczenie i objaśnienie Zasady postępowania Dostarczane odczynniki EnVision+ System-HRP stanowi dwuetapową technikę barwienia immunohistochemicznego. Podstawę systemu stanowi polimer znakowany peroksydazą chrzanową (HRP), który związany jest z drugimi przeciwciałami. Znakowany polimer nie zawiera awidyny ani biotyny. Wskutek tego, wyeliminowane lub znacznie zmniejszone jest nieswoiste barwienie wynikające z aktywności awidyna-biotyna w wątrobie, nerkach, tkankach limfoidalnych i skrawkach zamroŝonych. Wszystkie odczynniki w EnVision+ System-HRP, oprócz płynnej dwuaminobenzydyny+ substratu-chromogenu są gotowe do uŝycia. System ten jest niezwykle czułą metodą i w wyniku tego optymalne rozcieńczenia przeciwciała podstawowego są do 20 razy wyŝsze od rozcieńczeń stosowanych w tradycyjnej metodzie peroksydaza anty-peroksydaza i kilkakrotnie wyŝsze niŝ rozcieńczenia stosowane w tradycyjnych metodach z wiązaniem antygenu lub znakowaną streptawidynąbiotyną. Przyjęte postępowanie oferuje udoskonalony system generowania sygnałów, słuŝących do wykrywania antygenów obecnych w niskich stęŝeniach lub niskich mian podstawowych przeciwciał. Podstawowe przeciwciała wytwarzane przez króliki reagują dobrze ze znakowanym polimerem. Interpretację jakiegokolwiek barwienia dodatniego lub jego nieobecność powinno się dopełnić badaniem morfologicznym i histologicznym z odpowiednią kontrolą. Całą aktywność endogennej peroksydazy tłumi się inkubując próbkę z odpowiednim odczynnikiem blokującym endogenną peroksydazę. Próbkę następnie inkubuje się z odpowiednio odznaczonym i rozcieńczonym podstawowym przeciwciałem króliczym, po którym następuje inkubacja ze znakowanym polimerem z zastosowaniem dwóch kolejnych, 30. minutowych inkubacji. NaleŜy zauwaŝyć, Ŝe w przypadku przeciwciał wymagających trawienia enzymatycznego lub docelowego odzyskiwania koniecznym moŝe być wydłuŝenie czasów inkubacji przeciwciałą podstawowego i znakowanego polimeru o 5 do 10 minut. Barwienie kończy się 5. do 10. minutową inkubacją z 3,3 -dwuaminobenzydyną (DAB)+ substratemchromogenem, co daje w wyniku brązowo zabarwiony strąt w miejscu antygenu. (Dwuaminobenzydyna jest potencjalnym środkiem rakotwórczym, patrz paragraf Środki ostroŝności.). Kod K4010: Następujące materiały, starczające na 150 wycinków tkanek, zakładając 100 µl na wycinek tkanki, znajdują się w tym zestawie: Ilość 1x15 ml Opis Blok peroksydazy 0,03% nadtlenek wodoru zawierający azydek sodu. 1x15 ml Znakowany polimer Polimer znakowany peroksydazą związany jest z kozimi immunoglobulinami przeciwkróliczymi w buforze Tris-HCl zawierającym proteinę stabilizującą i środek przeciwbakteryjny. ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 1/7

2 1x18 ml Bufor substratu Roztwór buforu substratu, ph 7,5 zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący. 1x1 ml Płynna dwuaminobenzydyna+ chromogen Roztwór chromogenu 3,3 -dwuaminobenzydyny. Kod K4011: Następujące materiały, starczające na 1100 wycinków tkanek, zakładając 100 µl na wycinek tkanki, znajdują się w tym zestawie: Ilość 1x110 ml Opis Blok peroksydazy 0,03% nadtlenek wodoru zawierający azydek sodu. 1x110 ml Znakowany polimer Polimer znakowany peroksydazą związany jest z kozimi immunoglobulinami przeciwkróliczymi w buforze Tris-HCl zawierającym proteinę stabilizującą i środek przeciwbakteryjny. 1x120 ml Bufor substratu Roztwór buforu substratu, ph 7,5 zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący. 1x5 ml Płynna dwuaminobenzydyna+ chromogen Roztwór chromogenu 3,3 -dwuaminobenzydyny. Przybory 1 Probówka kalibrowana 1 Plastykowa pipeta pasteurowska Materiały wymagane, lecz nie dostarczone Bibuła Tkanka kontrolna, dodatnia i ujemna Barwienie negatywne; wodne, takie jak such hematoksyliną Mayera lub hematoksyliną Mayera modyfikowaną wg Lillie ego (kod S3309) Szkiełka nakrywkowe Woda destylowana Etanol, bezwodny i 95% Mikroskop świetlny (20x-800x) PoŜywki do mocowania takie jak Glycergel Mounting Medium (kod C0563) lub Faramount, wodna poŝywka do montowania, gotowa do uŝycia (kod S3025) lub bezwodna, stała poŝywka do montowania Ultramont (kod S1964) Pierwsze przeciwciała lub odczynnik kontroli ujemnej Szkiełka, wielokrotnie opłaszczone L-lizyną lub szkiełka silanizowane (kod S3003) Słoje lub łaźnie barwiące Stoper (odpowiedni dla wyznaczenia 3-40 minutowych okresów) Tryskawki Roztwór buforu przemywającego Ksylen, toluen lub zamienniki ksylenu Opcjonalne materiały wymagane, lecz nie dostarczone Wodorotlenek amonu, 0,015 mol/l rozcieńczony do 0,037 mol/l Pen peroksydaza anty-peroksydaza (PAP Pen) kod S2002) Środki ostroŝności 1. Do stosowania przez wyszkolony personel. 2. Produkt zawiera azydek sodu (NaN3), substancję chemiczną silnie toksyczną w czystej postaci. Azydek sodu, zastosowany w produkcie w stęŝeniu, które nie jest sklasyfikowane jako niebezpieczne, moŝe reagować z elementami kanalizacji wykonanymi z ołowiu i miedzi, tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Po usunięciu spłukać duŝą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu się azydku metalu w kanalizacji Nie uŝywać odczynników po wygaśnięciu daty waŝności dla zalecanej metody przechowywania. Jeśli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŝ wskazane w niniejszej ulotce, uŝytkownik musi zweryfikować takie warunki. 4. Nie zastępować odczynników odczynnikami z innych numerów partii lub z zestawów innych producentów. ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 2/7

3 5. Wystawienie enzymów i substratu-chromogenów na działanie silnego światła moŝe mieć niekorzystny wpływ. Nie przechowywać komponentów zestawu, ani nie prowadzić barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 6. Zastosowanie czasów inkubacji, temperatur innych niŝ podano w instrukcji moŝe spowodować błędne wyniki, wszelkie takie zmiany muszą być weryfikowane przez uŝytkownika. 7. Podobnie jak w przypadku wszelkich materiałów pochodzących ze źródeł biologicznych naleŝy stosować prawidłowe procedury postępowania. 8. W celu uniknięcia kontaktu z oczami i skórą naleŝy załoŝyć odpowiednie osobiste wyposaŝenie ochronne. 9. NiezuŜyte ilości roztworu naleŝy zutylizować zgodnie z odpowiednimi przepisami. 10. Na Ŝądanie dostępne są Karty charakterystyki bezpieczeństwa materiału. Niebezpieczeństwo DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P202 Nie uŝywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P281 Stosować wymagane środki ochrony indywidualnej. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Przechowywanie Odczynniki EnVision+ System-HRP naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamraŝać. Nie uŝywać po upływie daty waŝności wydrukowanej na fiolkach odczynników lub etykiecie zestawu. Zmiana w wyglądzie odczynnika taka jak wytrącanie się osadu moŝe wskazywać na niestabilność lub pogorszenie się stanu. W takich przypadkach, odczynnika/odczynników nie naleŝy uŝywać. Przygotowanie odczynników Brak oczywistych oznak wskazujących na brak stabilności produktów. Dlatego teŝ naleŝy wykonywać kontrole dodatnie i ujemne jednocześnie z badaniem próbek pacjentów. Jeśli zauwaŝone zostanie nieoczekiwane zabarwienie, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicą w procedurach laboratoryjnych i istnieje podejrzenie, Ŝe przyczyną moŝe być niniejszy produkt, naleŝy niezwłocznie skontaktować się z działem Pomocy Technicznej firmy Dako. Wskazane jest przygotowanie następujących odczynników przed wykonaniem barwienia. Roztworu buforu przemywającego TBST 0,05 mol/l zbuforowany Trisem roztwór soli z Tweenem (Tris Buffered Saline with Tween) (kod S3006) jest zalecanym buforem przemywającym do automatycznego lub ręcznego wykrywania immunohistochemicznego. TBS 0,05 mol/l zbuforowany Trisem roztwór soli (Tris Buffered Saline) (kod S1968) i PBS - 0,02 mol/l zbuforowany roztwór soli fizjologicznej (Phosphate Buffered Saline) (kod S3024) są takŝe właściwymi roztworami buforów przemywających do barwienia ręcznego. Nie zaleca się stosowania roztworów buforu przemywającego zawierających azydek sodu. Azydek sodu będzie inaktywować peroksydazę (HRP) doprowadzając do barwienia ujemnego. NiezuŜyty bufor przechowywać w temperaturze 2 8 C. Pozbyć się buforu, jeśli jego wygląd stanie się mętny. Wodę destylowaną moŝna stosować do płukania blokady peroksydazy, substratu i barwienia negatywnego. Pierwsze przeciwciało W firmie Dako dostępne są stęŝone przeciwciała, jednak optymalne rozcieńczenia muszą być doświadczalnie określone przez uŝytkownika. Ze względu na wysoką czułość EnVision+ System-HRP rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych mogą być od pięciu do dwudziestu razy wyŝsze niŝ rozcieńczenia stosowane w tradycyjnych metodach immunohistochemicznych. Rozcieńczenia naleŝy przygotować stosując 0,05 mol/l bufor Tris-HCl, ph 7,2-7,6, zawierający 1% albuminę surowicy wołowej (rozcieńczalnik przeciwciał (Antibody Diluent), kod S0809). Dla większości przeciwciał pierwszych stosowanych w tym zestawie 30. minutowy czas inkubacji jest wystarczający. Gotowe przeciwciała serii NP Plus zoptymalizowane są i zalecane do stosowania w wysokoczułych systemach detekcji Plus. W firmie Dako są równieŝ dostępne skoncentrowane przeciwciała. Wymaga się optymalizacji skoncentrowanych przeciwciał przez końcowego uŝytkownika. Rozcieńczenia naleŝy przygotować stosując rozcieńczalnik przeciwciał (Antibody Diluent) (kod S0809) lub rozcieńczalnik zawierający 0,05 mol/l bufor Tris-HCI z 1% albuminą surowicy wołowej (BSA). Gotowe przeciwciała serii N nie są zoptymalizowane do stosowania w wysokoczułych systemach detekcji Dako Plus. Odczynnik kontroli ujemnej Doskonale, gdy odczynnik kontroli ujemnej zawiera przeciwciało, które nie wykazuje swoistej reaktywności z ludzkimi tkankami lub zwykłą/nieodporną surowicą w tej samej matrycy/rozcieńczeniu co przeciwciało pierwotne. Odczynnik kontroli ujemnej powinien naleŝeć do tej samej podklasy i gatunku zwierząt co przeciwciało pierwsze, być rozcieńczony do takiego samego stęŝenia immunoglobulin lub protein co przeciwciało pierwsze z uŝyciem tego samego rozcieńczalnika. Czas inkubacji odczynnika kontroli ujemnej powinien odpowiadać czasowi inkubacji pierwszego przeciwciała. ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 3/7

4 Podczas uŝywania gotowych przeciwciał Dako serii NP Plus odczynnik Universal Negative Control(s)+ zaleca się jako odczynnik kontroli ujemnej. Kontrole te są zoptymalizowane do stosowania z gotowymi mysimi (kod NP015) lub króliczymi przeciwciałami serii NP Plus (kod NP001). Roztwór substrat-chromogen Przygotowany według następującego postępowania 1 ml roztworu substrat-chromogen wystarcza na do dziesięciu wycinków tkanek lub do pięciu rozmazów komórek. Etap 1 Etap 2 W zaleŝności od ilości szkiełek do barwienia przenieść do probówek po 1 ml buforu z butelki 3a (bufor substratu) do dostarczonych probówek kalibrowanych. Do kaŝdego 1 ml buforu dodać jedną kroplę (20 µl) z butelki 3b (płynny chromogen dwuaminobenzydyny+). Natychmiast wymieszać i nałoŝyć na wycinki tkanek za pomocą pipety pasteurowskiej. Przygotowany roztwór substratu-chromogenu jest stabilny przez około pięć dni podczas przechowywania w temperaturze 2 8 C. Roztwór przed uŝyciem naleŝy dokładnie wymieszać. Ewentualny osad pojawiający się w roztworze nie ma wpływu na jakość barwienia. Po kaŝdym uŝyciu probówkę i pipetę umyć dokładnie. Stosowane w całości, 18 ml buforu substratu dostarczanego z K4006 zapewni ilość wystarczającą na 150 badań. Nadmiar moŝe pozostać. Stosowane w całości, 120 ml buforu substratu dostarczanego z K4011 zapewni ilość wystarczającą na 1100 badań. MoŜe pozostać nadmiar. Barwienie negatywne Barwny produkt końcowy reakcji barwienia jest rozpuszczalny w alkoholu i powinno się go uŝywać tylko z wodnym barwieniem negatywnym, takim jak hematoksylina Mayera lub hematoksylina Mayera modyfikowana wg Lillie ego (kod S3309). Barwienie negatywne wykonywać hematoksyliną z dokładnym płukaniem wodą destylowaną, następnie szkiełka z tkankami zanurzyć w w kąpieli 0,037 mol/l amoniaku lub podobnego środka tuszującego. 0,037 mmol/l wodę amoniakalną przygotowuje się poprzez zmieszanie 2,5 ml 0,015 mol/l (stęŝonego) wodorotlenku amonowego z 1 litrem wody. Niewykorzystana woda amoniakalna 0,037 mmol/l moŝe być przechowywana w temperaturze pokojowej (20 25 C) w szczelnie zamkniętej butelce do 12 miesięcy. Po alternatywne procedury barwienia negatywnego naleŝy zajrzeć do wytycznych producenta. PoŜywka do montowania PoŜywka do montowania Glycergel (Glycergel Mounting Medium) (kod C0563) lub Faramount bezwodna poŝywka do montowania, gotowa do uŝycia (kod S3025) zalecane do montowania bezwodnego. Glycergel trzeba przed uŝyciem podgrzać do przynajmniej 50 C. MoŜna równieŝ uŝywać bezwodnej, stałej poŝywki do montowania Ultramount (kod S1964). Przygotowanie próbek NaleŜy zapoznać się z paragrafem Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego i/lub kartą specyfikacji przeciwciała. Przed barwieniem immunohistochemicznym tkanki trzeba utrwalić i opracować. Utrwalanie chroni przed autolizą i gnilnym rozkładem wyciętych tkanek, zachowuje immunogenność, zwiększa współczynnik załamania składników tkanki i zwiększa odporność elementów komórkowych na obróbkę tkanki. Obróbka tkanki obejmuje odwodnienie, usunięcie środków odwadniających, nasączanie środkiem zatapiającym, zatapianie i dzielenie tkanki na skrawki. Najczęściej stosowane środki utrwalające do preparatów immunohistochemicznych tkanek zostały omówione w paragrafie Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego. Są to tylko wytyczne. Optymalne metody postępowanie muszą być określone i sprawdzone przez uŝytkownika. Procedura barwienia Uwagi dotyczące postępowania Przed uŝyciem uŝytkownik powinien dokładnie przeczytać niniejsze instrukcje oraz zapoznać się zawartością zestawu. Odczynniki i instrukcje podane w niniejszym zestawie zostały przygotowane w celu uzyskania optymalnych wyników. Dalsze rozcieńczanie odczynników zestawu lub zmiana czasów lub temperatur inkubacji mogą powodować błędne wyniki. Przed immunobarwieniem wszystkie odczynniki naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej (20 25 C). Analogicznie, wszystkie inkubacje naleŝy przeprowadzić w temperaturze pokojowej. Nie dopuścić do wysuszenia skrawków tkanek podczas procedury barwienia. Wysuszone skrawki tkanek mogą wykazywać zwiększone nieswoiste barwienie. Zakryć szkiełka wystawione na działanie przeciągów. Jeśli stosowane są wydłuŝone inkubacje umieścić tkanki w wilgotnym środowisku. ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 4/7

5 Czułość EnVision+ System-HRP moŝna dalej zwiększyć poprzez wydłuŝanie czasów inkubacji etapów 2 i 3 przez 5-10 minut. Procedura barwienia ETAP 1 BLOK PEROKSYDAZY Postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar buforu. UŜywając bezkłaczkowego materiału (np. Kimwipe lub płatka gazy) ostroŝnie przetrzeć dookoła próbkę kliniczną w celu usunięcia nadmiaru płynu oraz utrzymania odczynnika w określonym miejscu. NałoŜyć blok peroksydazy z butelki 1 w ilości wystarczającej do zakrycia próbki. Inkubować przez 5 (±1) minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŝej kąpieli buforu. ETAP 2 PIERWSZE PRZECIWCIAŁO LUB ODCZYNNIK KONTROLI UJEMNEJ Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio. NałoŜyć optymalnie rozcieńczone pierwsze przeciwciało lub odczynnik kontroli ujemnej w ilości wystarczającej do zakrycia próbki. Inkubować przez 30 (±1) minut. Delikatnie przepłukać roztworem buforu z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę) i umieścić w świeŝej kąpieli buforowej. Jeśli procedurę barwienia trzeba przerwać, szkiełka moŝna trzymać po inkubacji w kąpieli buforowej pierwszego przeciwciała (Etap 2) przez okres do godziny w temperaturze pokojowej (20 25 C) bez wpływu na jakość barwienia. ETAP 3 ETAP 4 ETAP 5 ETAP 6 POLIMER ZNAKOWANY PEROKSYDAZĄ Postukać szkiełkiem w celu usunięcia nadmiaru buforu i wytrzeć je jak wskazano poprzednio. NałoŜyć znakowany polimer z butelki 2 w ilości wystarczającej do zakrycia próbki. Inkubować przez 30 (±1) minut. Wypłukać szkiełka jak polecono w etapie 2. SUBSTRAT-CHROMOGEN Wytrzeć szkiełka jak polecono wcześniej. NałoŜyć przygotowany roztwór płynnej dwuaminobenzydyny+ substratu-chromogenu w ilości wystarczającej do zakrycia próbki (patrz paragraf Przygotowanie odczynników.) Inkubować przez 5 10 minut. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną z tryskawki (nie kierować strumienia bezpośrednio na tkankę). Zebrać odpady roztworu substrat-chromogen do pojemnika na odpady niebezpieczne celu właściwego ich usunięcia. BARWIENIE NEGATYWNE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalne) Zanurzyć szkiełka w kąpieli wodnej hematoksyliny (kod S3309). Długość czasu inkubacji zaleŝy od stęŝenia stosowanej hematoksyliny. Delikatnie przepłukać wodą destylowaną. Szkiełka zanurzyć 10 razy w kąpieli z 0,037 mol/l amoniaku lub podobnego środka tuszującego. Delikatnie przepłukać szkiełka wodą destylowaną lub dejonizowaną przez 2 5 minut. MONTOWANIE Próbki moŝna montować i przykrywać szkiełkiem nakrywkowym z wodną poŝywką do montowania, taką jak Glycergel Mounting Medium (kod C0563) lub Faramount (kod S3025) lub bezwodną, stałą poŝywką do montowania Ultramount (kod S1964). Szkiełka moŝna takŝe odwodnić i montować na stałe. Kontrola jakości RóŜnice w traktowaniu i procedurach technicznych mogą powodować znaczącą zmienność wyników w laboratorium uŝytkownika, powodującą konieczność regularnego wykonywania dodatkowych kontroli wewnętrznych oprócz następujących procedur. NaleŜy sprawdzić wskazówki dotyczące kontroli jakości zawarte w Programie Certyfikacji dla Immunochemii wg Amerykańskiego Kolegium Patologii (The College American Pathologists, CAP) oraz w celu uzyskania dalszych informacji naleŝy sprawdzić pozycje piśmiennictwa od 3 do 5. Szczegóły dotyczące czułości i reaktywności immunologicznej kaŝdego stosowanego przeciwciała pierwotnego naleŝy sprawdzić arkusz specyfikacji. Odnośnie dalszych informacji dotyczących kontroli ujemnej i dodatniej naleŝy zapoznać się z paragrafem Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego. Interpretacja wybarwienia Odnośnie wskazówek dotyczących interpretacji naleŝy zapoznać się z paragrafem Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego. ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 5/7

6 Ograniczenia Odnośnie ograniczeń ogólnych naleŝy zapoznać się z paragrafem Ogólne wskazówki barwienia immunohistochemicznego. Wybarwienie tkanek zaleŝy od traktowania i przygotowania tkanek przed barwieniem. Nieprawidłowe utrwalenie, zamraŝanie, rozmraŝanie, przemywanie, suszenie, podgrzewanie, dzielenie na skrawki lub skaŝenie innymi tkankami lub płynami moŝe powodować artefakty, zatrzymywanie przeciwciał lub fałszywie ujemne wyniki. UŜycie starych lub niezbuforowanych środków utrwalających lub ekspozycja tkanek na zbyt wysokie temperatury (wyŝsze od 60 C) podczas traktowania moŝe doprowadzić do zmniejszenia czułości barwienia. Aktywność endogennej peroksydazy lub pseudoperoksydazy moŝna stwierdzić w hemoproteinach takich jak hemoglobina, mioglobina, cytochrom i katalaza, ja równieŝ granulocyty kwasochłonne (eozynofile). 6,7 Aktywność moŝna hamować inkubując próbki z blokiem peroksydazy butelka nr 1 EnVision+ System, HRP przez pięć minut przed zastosowaniem pierwszego przeciwciała. Odczynnikiem tym moŝna równieŝ traktować rozmazy krwi i szpiku kostnego oraz tkanek zamroŝonych. However, this procedure does not abolish the reddish-brown pigment of hemoproteins. Jednak procedura ta nie usuwa brunatno-czerwonawego barwnika hemoprotein. Naprzemiennie moŝna stosować roztwór metanol-nadtlenek wodoru. W tej procedurze niektóre antygeny mogą ulec denaturacji. Tkanki pochodzące od osób zakaŝonych wirusem zapalenia wątroby typu B oraz u których występuje antygen powierzchniowy wzw typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste wybarwienie z peroksydazą chrzanową. 8 Normalne/nieodporne surowice o tym samym zwierzęcym źródle pochodzenia co wtórne surowice odpornościowe stosowane na etapach blokowania mogą dać fałszywie-ujemne lub fałszywie dodatnie wyniki ze względu na autoprzeciwciała lub naturalne przeciwciała. Odczynniki dostarczane w tym zestawie zostały przygotowane w celu uzyskania optymalnych wyników. Dalsze rozcieńczanie moŝe spowodować brak zabarwienia antygenu. Rozwiązywanie problemów Opis problemu Prawdopodobne przyczyna Sugerowane działanie 1. Brak barwienia szkiełek 1a. Odczynniki nie zostały uŝyte w prawidłowej kolejności 1b. Azydek sodu w kąpieli buforowej. 1a. Sprawdzić stosowanie odczynników. 1b. UŜyć świeŝego, pozbawionego buforu 2. Słabe barwienie wszystkich szkiełek. 3. Nadmierne barwienie tła szkiełek 2a. Wycinki zatrzymują zbyt wiele roztworu po kąpieli. 2b. Szkiełek nie inkubowano wystarczająco długo z przeciwciałami lub mieszaniną substratu. 3a. Próbki wykazują wysoką aktywność endogennej peroksydazy. 3b. Parafina nie została całkowicie usunięta. 3c. Szkiełka nie zostały dokładnie wypłukane. 3d. Reakcja szybsza niŝ reakcja zwykłego substratu z powodu np. zbyt wysokiej temperatury pomieszczenia. 3e. Skrawki wyschły podczas procedury barwienia 3f. Nieswoiste wiązanie odczynników z wycinkiem tkanki. 3g. Roztwór przeciwciał zbyt stęŝony. azydku. 2a. Delikatnie postukać szkiełkiem, aby usunąć nadmiar roztworu przed wytarcie wokół wycinka. 2b. Sprawdzić zalecane czasy inkubacji. 3a. Zastosować dłuŝszy czas inkubacji bloku peroksydazy, butelka nr 1. 3b. Zastosować kąpiel ze świeŝego ksylenu i toluenu. Podczas jednoczesnego barwienia kilku szkiełek, druga kąpiel z ksylenu powinna zawierać świeŝy ksylen. 3c. UŜyć świeŝe roztwory w kąpielach buforowych i tryskawki. Opcjonalnie jako bufora przemywającego moŝna uŝyć 0,05 mol/l buforu Tris zawierającego 0,3 mol/l NaCl i 0,1% Tween (kod S3306). 3d. Zastosować krótszy czas inkubacji z roztworem substratu-chromogenu. 3e. Zastosować komorę wilgotną. Jednorazowo wycierać tylko trzy do czterech szkiełek przed nałoŝeniem odczynnika. 3f. NałoŜyć roztwór blokujący zawierający niezwiązaną proteinę. 3g. Zastosować większe rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego. UWAGA: Jeśli problemu nie moŝna przypisać Ŝadnemu z powyŝszych powodów lub, gdy sugerowane działanie naprawcze nie rozwiązuje problemu naleŝy skontaktować się z działem Pomocy Technicznej firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 6/7

7 Dodatkowe informacje na temat technik barwienia i przygotowania próbek moŝna znaleźć w Podręczniku metod barwienia immunohistochemicznego 9 (dostępnym w firmie Dako), Atlasie immunohistologii 10 i technik immunoperoksydazowych praktycznym podejściu do diagnostyki nowotworów. 11 Piśmiennictwo Dodatkowe piśmiennictwo 1. Department of Health, Education and Welfare, National Institute for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. Procedures for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides. DHHS (NIOSH) Publ. No , Current 13. August 16, Center for Disease Control Manual Guide Safety Management, No. CDC-22, Atlanta, GA. Decontamination of laboratory sink drains to remove azide salts. April 30, Elias JM, et al. Special report: Quality control in immunohistochemistry. Amer J Clin Pathol 1989; 92: National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Kod C24-A:4 5. Herman GE and Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: The new era of quality control. Biotech & Histochem 1991; 66: Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Naish SJ (ed). Handbook immunochemical staining methods. Carpinteria: Dako Corporation Tubbs RR, et al. Atlas of immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3 8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 07/15 ( ) P04047PL_01_K4010_K4011/ s. 7/7