0,3% nadtlenek wodoru z azydkiem sodu i lewamizolem.

Transkrypt

1 Dako EnVision + Dual Link System-HRP (DAB+) Nr kat. K4065 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. PoniŜsze instrukcje dotyczą Dako EnVision+ Dual Link System-HRP (DAB+). Opisywany system jest przeznaczony do stosowania z pierwotnymi przeciwciałami mysimi i króliczymi wybranymi przez UŜytkownika, w celu jakościowej identyfikacji antygenów w preparatach tkanek prawidłowych i zmienionych chorobowo zatapianych w parafinie, preparatach mroŝakowych lub cytologicznych. Identyfikację prowadzi się w mikroskopie świetlnym. MoŜna uŝywać tkanek przygotowanych za pomocą róŝnych środków utrwalających, w tym etanolu, B-5, płynu Bouina, formaliny z cynkiem oraz obojętnego roztworu buforowanej formaliny. Streszczenie i informacje ogólne Zasady procedury Dostarczane odczynniki Zestaw EnVision+ Dual Link System-HRP słuŝy do dwuetapowego barwienia IHC. W opisywanym systemie wykorzystano polimer znakowany peroksydazą chrzanową (HRP) skoniugowany z przeciwciałami wtórnymi. Znakowany polimer nie zawiera awidyny ani biotyny. Dzięki temu uzyskano wyraźne zmniejszenie lub wyeliminowano nieswoisty odczyn wywołany endogennym wiązaniem awidyny i biotyny w wątrobie, nerkach, tkance chłonnej i przy stosowaniu skrawków mroŝakowych. Wszystkie odczynniki w zestawie EnVision+ Dual Link System-HRP z substratem (z wyjątkiem płynnego związku substrat-chromogen DAB+), są gotowe do uŝycia. System stanowi wyjątkowo czułą metodę i w związku z tym optymalne rozcieńczenia przeciwciała pierwotnego są do 20 razy większe niŝ uŝywane w tradycyjnych technikach PAP oraz kilka razy większe niŝ stosowane w metodach ABC lub LSAB. Opisywany protokół pozwala na uzyskanie wzmocnienia sygnału w celu detekcji antygenów występujących w niskich stęŝeniach lub przeciwciał o niskim mianie. Przeciwciała uzyskiwane od myszy lub królików dają silną reakcję ze znakowanym polimerem. Interpretacja dodatniego lub ujemnego odczynu powinna być uzupełniona przez badania morfologiczne i histologiczne oraz wykonywanie odpowiednich prób kontrolnych. Endogenna aktywność peroksydazy jest wyeliminowana przez 5 10 minutową inkubację próbki z podwójnym odczynnikiem blokującym (Dual Endogenous Enzyme Block). Następnie inkubuje się próbkę ze stosownymi, właściwie rozcieńczonymi przeciwciałami pierwotnymi mysimi lub króliczymi, po czym inkubuje ze znakowanym polimerem, stosując zalecaną 30 minutową inkubację dla kaŝdego. NaleŜy zauwaŝyć, Ŝe dla przeciwciał wymagających trawienia enzymatycznego lubodmaskowywania antygenu moŝe się okazać konieczne zwiększenie czasu inkubacji przeciwciała pierwotnego i znakowanego polimeru o 5 10 minut. Ostatnim etapem odczynu jest 5 10 minutowa inkubacja z kompleksem substrat-chromogen z 3,3 -diaminobenzydyną (DAB+), w wyniku której w miejscu występowania antygenu wytrąca się precypitat o brązowym zabarwieniu. (DAB moŝe wykazywać działanie rakotwórcze; zobacz część Środki ostroŝności.) Nr kat. K4065 Opisywany zestaw zawiera następujące materiały wystarczające do przygotowania 150 skrawków tkankowych, przy uŝyciu 100 µl na skrawek: Ilość 1x15 ml Opis Dual Endogenous Enzyme Block 0,3% nadtlenek wodoru z azydkiem sodu i lewamizolem. 1x15 ml Znakowany polimer Polimer znakowany peroksydazą skoniugowany z immunoglobulinami kozimi przeciwko antygenom mysim i króliczym w buforze Tris-HCl zawierającym białko stabilizujące i substancję o działaniu przeciwbakteryjnym. 1x18 ml Bufor do substratu Roztwór buforowy substratu, ph 7,5, zawierający nadtlenek wodoru i środek konserwujący. 1x1 ml Chromogen DAB+ Roztwór chromogenu, 3,3'-diaminobenzydyny ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 1/7

2 Materiały wymagane, ale niedostarczane Środki ostroŝności Woda dejonizowana lub destylowana Etanol absolutny i roztwór o stęŝeniu 95% Ksylen, toluen lub substytuty ksylenu Przeciwciała pierwotne i odczynnik do kontroli ujemnej Szkiełka powlekane poli-l-lizyną lub szkiełka sylanizowane Silanized Slides (nr kat. S3003) (zobacz część Przyleganie skrawków tkankowych zatapianych w parafinie). Tkanka kontrolna (kontrola dodatnia i ujemna) Roztwór wodorotlenku amonu o stęŝeniu 15 mmol/l rozcieńczony do 0,037 mol/l Barwnik kontrastowy, środek oparty na roztworze wodnym np. Mayer s Hematoxylin lub Lillie s Modified Mayer s Hematoxylin (Nr kat. S3002 do uŝytku automatycznego; nr kat S3001 do uŝytku ręcznego) (zobacz część Przygotowanie odczynników). Do nakrywania zaleca się stosowanie środka wodnego, np. Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to- Use (nr kat. S3025), bezwodnego (Ultramount (nr kat. S1964) lub trwałego środka bezwodnego Permanent Mounting Medium (nr kat. S3026) Szkiełka nakrywkowe Mikroskop optyczny (20x 800x) Ściereczki wchłaniające Naczynia lub kąpiele do barwienia Minutnik (z zakresem 3 40 minut) Butelki z roztworem płuczącym Roztwór buforu płuczącego, np. Automation Buffer (nr kat. S3006), TBS (nr kat. S3001) lub PBS (nr kat. S3024) 1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek azydek sodu (NaN 3), w czystej postaci. StęŜenie NaN 3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN 3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŝywać duŝych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 3. Nie naleŝy zastępować odczynników produktami pochodzącymi z innych partii lub z zestawów innych producentów. 4. W przypadku ekspozycji na silne światło jakość odczynników enzymatycznych i substratów-chromogenów moŝe ulec zmniejszeniu. Nie naleŝy przechowywać składników zestawu ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne. 5. Stosowanie innych od opisanych parametrów czasu inkubacji lub temperatur moŝe powodować błędne wyniki badania; wszystkie zmiany tego rodzaju muszą zostać zweryfikowane przez UŜytkownika. 6. Podobnie jak w przypadku kaŝdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŝy stosować odpowiednie procedury postępowania. 7. NaleŜy stosować właściwe wyposaŝenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 8. Niewykorzystany odczynnik naleŝy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. 9. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie. Niebezpieczeństwo Dual Endogenous Enzyme Block: <0.1% 3(2H)-Isothiazolone, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl- 3(2H)-isothiazolone H314 Powoduje powaŝne oparzenia skóry oraz uszkodzenia oczu. H317 MoŜe powodować reakcję alergiczną skóry. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P261 Unikać wdychania par. P264 Dokładnie umyć ręce po uŝyciu. P272 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P330 + P331 P303 + P361 + P353 + P363 + P310 P302 + P352 P333 + P313 Zanieczyszczonej odzieŝy ochronnej nie wynosić poza miejsce pracy. W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO DRÓG ODDECHOWYCH: Wyprowadzić lub wynieść poszkodowanego na świeŝe powietrze i zapewnić warunki do odpoczynku w pozycji umoŝliwiającej swobodne oddychanie. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. W PRZYPADKU POŁKNIĘCIA: Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. Wypłukać usta. NIE wywoływać wymiotów. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ (lub z włosami): Natychmiast zdjąć całą zanieczyszczoną odzieŝ. Spłukać skórę pod strumieniem wody/prysznicem. Wyprać zanieczyszczoną odzieŝ przed ponownym uŝyciem. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. W PRZYPADKU KONTAKTU ZE SKÓRĄ: Umyć duŝą ilością wody/ W przypadku wystąpienia podraŝnienia skóry lub wysypki: Zgłosić się do lekarza po poradę. ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 2/7

3 P305 + P351 + P338 + P310 P405 P501 W PRZYPADKU DOSTANIA SIĘ DO OCZU: OstroŜnie płukać wodą przez kilka minut. Zdjąć soczewki kontaktowe, jeŝeli są załoŝone i moŝna je łatwo usunąć. Kontynuować przepłukiwanie. Natychmiast skontaktować się z OŚRODKIEM KONTROLI ZATRUĆ lub z lekarzem. Przechowywać pod zamknięciem. Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Niebezpieczeństwo DAB+ Chromogen: 1 5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium tetrachloride H350 MoŜe powodować raka. H341 Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne. P201 Przed uŝyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŝności. P202 Nie uŝywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa. P280 Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŝ ochronną. P308 + P313 W PRZYPADKU naraŝenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską. P405 Przechowywać pod zamknięciem. P501 Zawartość i pojemnik usuwać zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, krajowymi i międzynarodowymi przepisami. Jako zasadę naleŝy przyjąć zakaz pracy z produktem osobom w wieku poniŝej 18 lat. UŜytkowników naleŝy starannie poinstruować co do właściwych procedur pracy, niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŝności. Przechowywanie Odczynniki systemu EnVision+ Dual Link System-HRP naleŝy przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie zamraŝać. Nie naleŝy uŝywać produktów po upływie daty waŝności wydrukowanej na fiolkach odczynników i etykiecie zestawu. Jeśli odczynniki przechowywane są w warunkach innych niŝ określone powyŝej, faktyczne warunki przechowywania powinny zostać zweryfikowane przez uŝytkownika. 1 Zmiana w wyglądzie któregokolwiek odczynnika, na przykład wytrącenie się osadu, moŝe oznaczać niestabilność lub pogorszenie jakości. W takich przypadkach nie naleŝy uŝywać odczynnika (odczynników). Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności odczynników. Dlatego, równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów, naleŝy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŝna wyjaśnić róŝnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z zestawem, naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek Przygotowanie odczynników Przed wykonaniem odczynu IHC naleŝy utrwalić i przetworzyć tkanki. Utrwalenie zabezpiecza przed autolizą i rozkładem wycinków, utrzymuje antygenowość, zwiększa współczynnik załamania światła przez struktury tkankowe i zwiększa odporność składników komórek na przeprowadzenie. Przetworzenie tkanki polega na odwodnieniu, usunięciu środków odwadniających, przepojeniu substancją zatapiającą, zatopieniu i wykonaniu wycinków. Podane informacje mają charakter wyłącznie orientacyjny. Optymalna procedura powinna zostać ustalona i zweryfikowana przez UŜytkownika. Szczegółowe informacje dotyczące utrwalania i obróbki skrawków tkankowych przedstawiono w dokumencie Dako Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Roztwory buforów płuczących Badania wykazały, Ŝe roztwór Tris-HCl o stęŝeniu 0,05 mol/l i ph 7,6, zawierający NaCl w ilości 0,15 mol/l NaCl oraz 0,05% preparatu Tween 20, bez azydku sodu, znacząco pomaga w osłabianiu odczynu tła podczas barwienia przy uŝyciu tego systemu. Zalecany bufor płuczący to Automation Buffer (nr kat. S3006). Bufory płuczące zawierające azydek sodu unieczynniają peroksydazę chrzanową i powodują odczyn ujemny. NieuŜywany bufor przechowywać w temperaturze 2 8 C. Nie uŝywać buforu, jeśli wystąpiło jego zmętnienie. RĘCZNE WYKONANIE ODCZYNU Skrawki tkankowe naleŝy wypłukać do trzech razy w świeŝych kąpielach z Automation Buffer (nr kat. S3006), TBS (nr kat S3001) lub PBS (nr kat. S3024) przez 3 5 minut między kaŝdym krokiem procedury odczynu EnVision+ Dual Link System. Przeciwciała pierwotne Firma Dako oferuje gotowe do uŝytku przeciwciała do systemu EnVision+ Dual Link System. Dako oferuje takŝe stęŝone przeciwciała, jednak optymalne rozcieńczenia muszą zostać wyznaczone doświadczalnie przez uŝytkownika. W związku z wysoką czułością EnVision+ Dual Link System, rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych mogą być 5 do 20 razy większe niŝ stosowane w tradycyjnych metodach IHC. Jeśli korzysta się ze stęŝonych przeciwciał, naleŝy je rozcieńczać przy pomocy Antibody Diluent (nr kat. S0809). W przypadku większości przeciwciał pierwotnych stosowanych z opisywanym zestawem, wystarczający czas inkubacji wynosi 30 minut. ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 3/7

4 Odczynnik do kontroli ujemnej W idealnych warunkach odczynnik kontroli ujemnej zawiera przeciwciała, które nie wykazują swoistej reaktywności z tkankami ludzkimi lub prawidłową bądź nieimmunizowaną surowicę w takim samym medium (roztworze), co rozcieńczone przeciwciała pierwotne. Odczynnik do kontroli ujemnej powinien zawierać przeciwciała pochodzące od tego samego gatunku zwierzęcia i naleŝące do tej samej podklasy, co przeciwciała pierwotne i rozcieńczone do takiego samego stęŝenia immunoglobulin lub białek, jak przeciwciała pierwotne, przy uŝyciu tego samego rozcieńczalnika. Czas inkubacji odczynnika do kontroli ujemnej powinien odpowiadać czasowi stosowanemu w przypadku przeciwciał pierwotnych. Dla wygody uŝytkowania odczynniki uniwersalnej kontroli ujemnej dla pierwotnych przeciwciał mysich i uniwersalnej kontroli ujemnej dla pierwotnych przeciwciał króliczych, dostępne są w Dako w formie gotowej do uŝycia. Szczegółowe informacje dotyczące przygotowywania odczynników do kontroli ujemnej przedstawiono w dokumencie Dako Instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Roztwór substrat-chromogen PoniŜej przedstawiono procedurę przygotowania 1 ml roztworu substratu chromogenu DAB+, wystarczającego do barwienia 10 skrawków tkankowych lub do 5 rozmazów cytologicznych. ETAP 1 ETAP 2 W zaleŝności od liczby barwionych szkiełek przenieść odpowiednią liczbę porcji 1 ml buforu do substratu do odpowiedniej wielkości pojemnika. Na kaŝdą 1 ml porcję buforu dodać 1 kroplę (20 µl) Liquid DAB+ Chromogen. Natychmiast zmieszać. Przygotowany roztwór substratu-chromogenu DAB+ jest stabilny przez około pięć dni, jeśli przechowywany jest w temperaturze 2 8 C. Odczynnik ten naleŝy dokładnie wymieszać przed uŝyciem. Wytrącanie się osadu nie wpływa na jakość odczynu. Wykorzystane w całości 18 ml dostarczonego buforu do substratu wystarczy do przeprowadzenia 15 pomiarów. MoŜe zostać nadmiarowa objętość buforu. Środki do zatapiania preparatu Do zatapiania wodnego zaleca się Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-use (nr kat. S3025). Do trwałego nakrywania moŝna stosować preparaty Ultramount (nr kat. S1964) lub Permanent Mounting Medium (nr kat. S3026). Wykonanie odczynu Uwagi dotyczące procedury Przed przystąpieniem do wykonania odczynu UŜytkownik powinien uwaŝnie przeczytać podane instrukcje i zapoznać się z zawartością zestawu. Zobacz część Środki ostroŝności. Przed wykonaniem odczynu immunochemicznego roztwór Dual Endogenous Enzyme Blocking Solution oraz polimer EnVision+ Dual Link System naleŝy doprowadzić do temperatury pokojowej. Wszystkie procedury inkubacji zostały zoptymalizowane do wykonywania w temperaturze pokojowej. Odczynniki i instrukcje dostarczane w zestawie opracowano w celu uzyskania optymalnych wyników. Dodatkowe rozcieńczenie odczynników wchodzących w skład zestawu bądź nieprzestrzeganie czasu lub temperatury inkubacji moŝe spowodować uzyskanie błędnych wyników. Podczas wykonywania barwienia nie moŝna dopuścić do wysychania skrawków tkankowych. Wysuszone skrawki tkankowe mogą powodować nasilenie nieswoistego odczynu. NaleŜy osłonić szkiełka nakrywkowe znajdujące się w miejscach naraŝonych na przeciągi. JeŜeli stosuje się długie czasy inkubacji, preparaty powinny się znajdować w środowisku o odpowiedniej wilgotności. Czułość EnVision+ Dual Link System-HRP moŝna dodatkowo zwiększyć przez wydłuŝenie czasów inkubacji w etapach 2 i 3 o 5 10 minut. PRZEBIEG BARWIENIA METODĄ MANUALNĄ ETAP 1 BLOKOWANIE ENDOGENNEJ PEROKSYDAZY Strząsnąć nadmiar buforu. Posługując się chusteczką niepozostawiającą nitek (np. Kimwipe lub gazikiem) ostroŝnie otrzeć szkiełko wokół preparatu tak, by usunąć pozostałości płynu i utrzymywać odczynniki w obszarze zgodnym z zaleceniami. Dodać tyle odczynnika blokującego enzymy (Dual Endogenous Enzyme Block) by zakryć próbkę. Inkubować przez 5 10 (±1) minut. OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną lub roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŝy kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŝej kąpieli z buforem TBS. ETAP 2 PRZECIWCIAŁA PIERWOTNE LUB ODCZYNNIK DO KONTROLI UJEMNEJ Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść optymalnie rozcieńczony roztwór przeciwciał pierwotnych lub odczynnika do kontroli ujemnej, aŝ próbka zostanie zakryta. Inkubować przez 30 (±1) minut. OstroŜnie przepłukać roztworem buforowym z butelki na płyn płuczący (nie naleŝy kierować strumienia płynu bezpośrednio na tkankę), a następnie umieścić preparat w świeŝej kąpieli z buforem. W razie konieczności przerwania wykonywania odczynu, preparaty moŝna przechowywać w roztworze buforu po inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi (etap 2) i utrzymuje przez okres do jednej godziny w temperaturze pokojowej bez wpływu na wyniki odczynu. ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 4/7

5 ETAP 3 ZNAKOWANY POLIMER-HRP Strząsnąć nadmiar buforu i przetrzeć preparaty jak poprzednio. Dodać tyle znakowanego polimeru, aby zakryć próbkę. Inkubować przez 30 (±1) minut. Przemyć preparaty jak podczas etapu 2, a następnie umieścić w kąpieli z buforem na 5 (±1) minut. ETAP 4 SUBSTRAT-CHROMOGEN Wytrzeć preparaty jak poprzednio. Nanieść dość roztworu substratu-chromogenu by pokryć próbkę (zobacz część Przygotowanie odczynnika). Inkubować przez 5 10 (±1) minut. OstroŜnie przepłukać wodą destylowaną z butelki (nie kierować strumienia wody bezpośrednio na tkankę). Umieścić odpady roztworu substrat-chromogen w pojemniku na materiały niebezpieczne w celu właściwego usunięcia. ETAP 5 BARWIENIE KONTRASTOWE HEMATOKSYLINĄ (opcjonalnie) Zanurzyć preparaty w kąpieli z wodnego roztworu hematoksyliny. Długość okresu inkubacji zaleŝy od stęŝenia stosowanego roztworu hematoksyliny. OstroŜnie przepłukać w łaźni z wodą destylowaną. Dziesięciokrotnie zanurzyć preparaty w kąpieli wodnego roztworu amoniaku o stęŝeniu 0,037 mol/l lub podobnego środka róŝnicującego. Przepłukiwać w kąpieli z wody destylowanej lub dejonizowanej przez 2 5 minut. Przejść do zatapiania. Zatapianie preparatu MoŜna stosować wodne preparaty do nakrywania, np. Faramount, Aqueous Mounting Medium, Ready-to-Use (nr kat. S3025). Do trwałego nakrywania moŝna stosować preparaty Ultramount (nr kat. S1964) lub Permanent Mounting Medium (nr kat. S3026). Uwaga: Odczyt odczynu moŝna przeprowadzić w dogodnym momencie. Niemniej jednak, jeŝeli szkiełka mikroskopowe są naraŝone na silne światło przez okres jednego tygodnia, moŝe nastąpić pewne zblaknięcie. Aby ograniczyć utratę zabarwienia naleŝy przechowywać preparaty w zaciemnionym miejscu, w temperaturze pokojowej (20 25 C). Kontrola jakości RóŜnice w metodach obróbki tkanek i procedurach technicznych stosowanych w laboratorium UŜytkownika mogą powodować istotne róŝnice wyników, wymagające regularnego wykonywania wewnętrznej kontroli jakości. NaleŜy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi kontroli jakości College of American Pathologists Certification Program for Immunohistochemistry (Program certyfikacji immunohistochemicznej Kolegium Patologów Amerykańskich) oraz publikacjami 3 5, wyszczególnionymi w Piśmiennictwie. Informacje dotyczące czułości i immunoreaktywności przedstawiono w kartach specyfikacji poszczególnych przeciwciał. Dalsze informacje na temat kontroli dodatnich i ujemnych przedstawiono w dokumencie Dako Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych. Interpretacja odczynu Ograniczenia ogólne Ograniczenia swoiste dla opisywanego produktu Wskazówki dotyczące interpretacji przedstawiono w dokumencie Dako General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych). Uwagi dotyczące ograniczeń przedstawiono w dokumencie Dako General Instructions for Immunohistochemical Staining (Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych). W przypadku stosowania starych lub niebuforowanych utrwalaczy lub ekspozycji na temperaturę przekraczającą 60ºC podczas przygotowania preparatów moŝe nastąpić zmniejszenie czułości odczynu. Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze moŝe występować w hemoproteinach np. hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie oraz w eozynofilach. 2,3 Tego rodzaju aktywność moŝna zahamować inkubując próbki przez 5 minut z odczynnikiem Dual Endogenous Enzyme Block z zestawu EnVision+ Dual Link System-HRP. Opisywany odczynnik moŝna stosować do rozmazów krwi i szpiku kostnego oraz preparatów mroŝakowych. MoŜna równieŝ stosować roztwór alkoholowy nadtlenku wodoru. Ta procedura powoduje jednak denaturację niektórych antygenów. Tkanki pochodzące od osób z zakaŝeniem wirusem zapalenia wątroby typu B i zawierające antygen powierzchniowy wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg) mogą wykazywać nieswoiste barwienie w reakcji z peroksydazą chrzanową. 4 Prawidłowe i nieimmunizowane surowice uzyskiwane od tego samego gatunku zwierzęcia, od którego pochodzą przeciwciała wtórne stosowane do blokowania nieswoistego enzymu, mogą powodować wyniki fałszywie ujemne lub fałszywie dodatnie z uwagi na obecność autoprzeciwciał lub przeciwciał naturalnych. Odczynniki dostarczane w zastawie mają optymalne rozcieńczenia. Zwiększanie rozcieńczenia moŝe powodować utratę detekcji antygenów. ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 5/7

6 Rozwiązywanie problemów RĘCZNE Problem Prawdopodobna przyczyna Zalecane postępowanie 1. Brak 1a. Odczynniki nie są uŝywane 1a. Sprawdzić sposób uŝycia odczynników. barwienia we wszystkich preparatach we właściwej kolejności. 1b. Azydek sodu obecny 1b. UŜyć świeŝego buforu niezawierającego 2. Słabe barwienie we wszystkich preparatach 3. Nadmierne barwienie tła we wszystkich preparatach. w kąpieli z buforem. 2a. Skrawki zawierają zbyt duŝo roztworu po kąpieli płuczącej. 2b. Preparaty nie są inkubowane wystarczająco długo z przeciwciałami lub substratem. 3a. W próbkach występuje duŝa aktywność peroksydazy. 3b. Niecałkowicie usunięta parafina. 3c. Preparaty nie są odpowiednio przemywane. 3d. Szybsza niŝ zwykle reakcja substratu ze względu na nadmierną temperaturę w pomieszczeniu. 3e. Wysychanie skrawków podczas wykonywania odczynu. 3f. Nieswoiste wiązanie odczynników do skrawka tkanki. azydku. 2a. OstroŜnie usunąć nadmiar roztworu przed wytarciem preparatu wokół skrawka. 2b. Sprawdzić zalecany czas inkubacji. 3a. Stosować dłuŝszą inkubację z odczynnikiem blokującym Dual Endogenous Enzyme Block. 3b. Zastosować świeŝą kąpiel z ksylenu lub toluenu. W przypadku jednoczesnego wykonywania odczynu kilku preparatów, druga kąpiel z ksylenu powinna zawierać świeŝy ksylen. 3c. Zastosować świeŝe roztwory w kąpielach z buforem i butelkach z roztworem płuczącym. Jako buforu płuczącego uŝyć Automation Buffer (zobacz część Przygotowanie odczynników). 3d. Stosować krótszy czas inkubacji w roztworze barwiącym chromogen-substrat. 3e. Stosować komorę nawilŝającą. Wycierać tylko trzy do czterech szkiełek w czasie pomiędzy nanoszeniem odczynnika. 3f. Zastosować roztwór blokujący z nieistotnym białkiem (zobacz część Interpretacja odczynu). 3g. Przeciwciało zbyt stęŝone. 3g. Zastosować większe rozcieńczenie przeciwciała pierwotnego. UWAGA: Jeśli problemu nie daje się przypisać Ŝadnej z powyŝszych przyczyn, bądź jeśli zalecane postępowanie jest nieskuteczne, naleŝy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako w celu uzyskania dalszej pomocy. Dodatkowe informacje na temat technik wykonywania odczynów oraz przygotowywania próbek przedstawiono w publikacjach Handbook - Immunochemical Staining Methods 5 (dostępna w firmie Dako), Atlas of Immunohistology 6 oraz Immunoperoxidase Techniques, A Practical Approach to Tumor Diagnosis. 7 Piśmiennictwo 1. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Internal quality control testing: principles and definitions; approved guideline. Villanova, PA 1991; Order Code C24-A:4 2. Escribano LM, et al. Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J Histochem Cytochem 1987; 35: Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc of Clin Pathol Press 1990; Omata M, et al. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen: A possible source of error in immunohistochemistry. Amer J Pathol 1980; 73: Boenisch T, Farmilo AJ, Stead RH. Handbook-immunochemical staining methods. Carpinteria 3rd Edition. Dako Tubbs RR, et al. Atlas of Immunohistology. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press Nadji M and Morales AR. Immunoperoxidase techniques, a practical approach to tumor diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press 1986 ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 6/7

7 Dodatkowe materiały referencyjne Cartun RW. Immunohistochemistry of infectious diseases. J Histotechnol 1995; 18(3):195 Heras A, et al. Enhanced labelled-polymer system for immunohistochemistry. XVth Eur Cong Pathol. Copenhagen, Denmark 1995; Sept 3-8 Bisgaard K and Pluzek K-P. Use of polymer conjugates in immunohistochemistry: A comparative study of a traditional staining method to a staining method utilizing polymer conjugates. Abstract. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Pileri SA, et al. EnVision Plus: A new powerful tool for diagnosis and research. Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol and 12 th World Cong Acad Environ Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Bisgaard K. EnVision Plus-Introduction to a new technology. Abstract. Dako Symposium. XXI Intl Cong Intl Acad Pathol. Budapest, Hungary 1996; Oct Edition 07/15 ( ) P04048PL_01/K4065/ p. 7/7