SEKCJA MIKROBIOLOGICZNA STUDENCKIEGO KOŁA NAUKOWEGO BIOLOGÓW

Transkrypt

1 SEKCJA MIKROBIOLOGICZNA STUDENCKIEGO KOŁA NAUKOWEGO BIOLOGÓW

2 GŁÓWNY CEL PROJEKTU Próba uzyskania celulozy bakteryjnej (BC) jako produktu biosyntezy Gluconacetobacter xylinus (Acetobacter xylinum). Wykorzystany w projekcie szczep (próbka z podłożem bulion brzeczkowaty) otrzymano od Pani prof. dr hab. Zdzisławy Libudzisz z Instytutu Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej. 2

3 CELE DODATKOWE PROJEKTU Zbadanie wpływu różnych podłoży hodowlanych na wzrost i rozwój badanego szczepu Acetobacer xylinum. Określenie stresogennego oddziaływania etanolu na A. xylinum. Identyfikacja morfologiczna barwienie Grama i barwienie pozytywne. Zbadanie potencjalnej możliwości występowania form inwolucyjnych. 3

4 PODŁOŻA MIKROBIOLOGICZNE I MATERIAŁY WYKORZYSTANE W PROJEKCIE Podłoże Hestrin-Schramm Car medium Podłoża stałe na płytkach Petriego Mannitol medium Acetobacter medium M238 Plastikowe płytki Petriego Podłoża płynne w kolbach ( pozbawione Agaru) Szklane kolby Erlenmayera o pojemności od 250 do 500 ml 4

5 SKŁAD PODŁOŻY MIKROBIOLOGICZNYCH (1) Hestrin Schramm Acetobacter M238 Glukoza - 20 g Pepton 5 g Ekstrakt z drożdży - 5 g Bezwodny disodek potasu 2,7 g Kwas cytrynowy 1,5 g Woda destylowana 1000 ml Glukoza - 3 g Ekstrakt z drożdży 10 g Węglan wapnia -10 g Agar 15 g woda destylowana 1000 ml ph = 7,4 +/- 0,2 ph = 6,5 5

6 SKŁAD PODŁOŻY MIKROBIOLOGICZNYCH (2) Mannitol Agar Ekstrakt z drożdży 5 g/ l Agar 15 g/ l Pepton 3 g Mannitol 25 g woda destylowana 1000 ml Podłoże stresogenne Car medium Ekstrakt z drożdży - 30 g Etanol 20 g Purpura bromokrezolowa 0,02 g Agar 20 g Woda destylowana 1000 ml ph = 5,

7 WPROWADZENIE Gluconacetobacter xylinus (Acetobacter xylinum): - bakteria fermentacji octowej, - niepatogenna, - Gram-zmienna, - kształt pałeczki. W przyrodzie występuje w dojrzałych owocach, glebie i stojącej wodzie. Wykazuje zdolność do syntezy celulozy - substancji kojarzonej na ogół wyłącznie z roślinami wyższymi. Jest to reakcja formalnie odwrotna do hydrolizy celulozy przebiegającej wg równania: nc6h12o6 (C6H10O5)n + nh20 Bakterie te wytwarzają enzym - syntazę celulozową, która katalizuje reakcję polimeryzacji cząsteczek glukozy, zawartych w podłożu hodowlanym. 7

8 DLACZEGO G. XYLINUS WYTWARZA CELULOZĘ? Uważa się, że G. xylinus syntetyzują celulozę z dwóch powodów: jest to produkt uboczny metabolizmu-dzięki celulozie bakterie unoszą się na powierzchni cieczy, co pozwala im na dostęp do tlenu oraz do pożywienia w wodzie stanowi środowiskowy mechanizm obronny - zabezpiecza bakterie przed szkodliwym promieniowaniem jonizującym 8

9 CECHY CELULOZY BAKTERYJNEJ (BC) Celuloza bakteryjna jest wyjątkowo czysta, nie towarzyszą jej żadne inne substancje (ligniny czy hemicelulozy). Eliminuje to konieczność oczyszczania, co jest niezwykle korzystne pod względem ekologicznym. Proces produkcji celulozy bakteryjnej nie jest wysoce skomplikowany. Do produkcji BC mogą być wykorzystywane tanie surowce, np. odpadowe - melasa. Powstały produkt jest biodegradowalny. Rodzaj hodowli warunkuje postać celulozy. 9

10 PERSPEKTYWY ZASTOSOWANIA CELULOZY BAKTERYJNEJ Opatrunek celulozowy wytwarzany w dowolnych kształtach i rozmiarach o dużej elastyczności. Celulozę bakteryjną można wysycać antybiotykami, enzymami lub innymi substancjami. Wykorzystanie rurek z celulozy bakteryjnej do protezowania naczyń krwionośnych o małym przekroju. Oceniono również przydatność modyfikowanej celulozy bakteryjnej jako materiału do protezowania tchawicy Przemysł tekstylny i odzieżowy Tzw. elektroniczny papier w wyświetlaczach Przemysł spożywczy 10

11 ZALETY ZASTOSOWANIA KOMERCYJNEGO Stosunkowo prosty proces syntezy. Produkcja nie wymaga użycia pestycydów, sztucznych nawozów, chemikaliów. Przy obróbce zużywa się o wiele mniej wody niż przy przetwarzaniu włókien bawełny, ponieważ płyn z fermentacji można powtórnie wykorzystać. Możliwość dodawania barwników w czasie syntezy celulozy. W zależności od tego, jakie warunki zapewni się mikroorganizmom, łatwo jest zmienić parametry produkowanego przez nie materiału. Biodegradowalność 11

12 ETAPY DOŚWIADCZENIA Pobranie materiału Posiew tarty Inkubacja bakterii na płytkach Przeniesienie do kolb z podłożem płynnym Analiza wyników Barwienie Grama Barwienie Pozytywne 12

13 13

14 WARUNKI HODOWLI Przygotowano 100 ml każdego rodzaju podłoża Podłoża wysterylizowano w autoklawie w temp 121 C przez min. Zaszczepiono A. xylinum na odpowiednie podłoża. Inkubowano w temperaturze C przez 7-14 dni. (optymalne warunki wzrostu przy ph = 5-6,8 i w temp. 24 C) 14

15 WYNIKI HODOWLI 15

16 WYNIKI LICZBA POWSTAŁYCH KOLONII C.f.u Mannitol M238 Hestrin Schramm medium 16

17 CHARAKTERYSTYKA KOLONII o o o o o o o Morfologia kolonii wyrosłych na podłożach hodowlanych: I hodowla na płytkach ( ) charakteryzowała się stosunkowo dużymi wypukłymi koloniami o kształcie okrągłym i ząbkowanym. Takie kolonie wyrosły na podłożach M238. Kolonie o mniejszej średnicy były na podłożach HS i Mannitol agar. I hodowla to kolonie białe, nieprzejrzyste. II hodowla j.w (z tym że bakterie hodowano wyłącznie na HS, nieliczne kolonie). III hodowla ( ) wielkość kolonii mała, kolonie bardzo liczne, również wypukłe. białe i nieprzejrzyste, raczej kruche (podłoża M238, Car Medium, Mannitol medium). Najlepsze rezultaty otrzymano na podłożu Hestrin-Schramm 17

18 WYNIKI BARWIENIA GRAMA HS HS HS Mannitol Mannitol M238 18

19 WYNIKI BARWIENIA GRAMA Barwienie metodą Grama wyraźnie widoczne zróżnicowanie organizmów ze względu na różnice w budowie ściany komórkowej bakterie barwią się na kolor ciemno-fioletowy = Gram + bakterie barwią się w kolorze różowym, określamy jako Gram - Gram zmienność zgodna z danymi podanymi w naukowych. publikacjach Wyraźne występowanie zróżnicowanych form inwolucyjnych szczególnie w przypadku próbek bakteryjnych uzyskanych z Mannitolu czy Agaru M238 19

20 WYNIKI BARWIENIA POZYTYWNEGO Mannitol Mannitol Mannitol M238 M238 M238 20

21 WYNIKI BARWIENIA POZYTYWNEGO Wyniki barwienia pozytywnego wskazywałyby na pojawienie się nitek włókien BC Podobnie jak w przypadku barwienia Grama jest zauważalne występowanie zróżnicowanych form inwolucyjnych. Próbki bakteryjne uzyskano z hodowli na podłożu Mannitol medium (pierwsze trzy zdjęcia) i M238 medium (kolejne trzy zdjęcia). 21

22 PROBLEMY ZWIĄZANE Z HODOWLĄ A. XYLINUM Predyspozycje wybranego szczepu Wiek szczepu, warunki przechowywania szczepu Odpowiedni skład pożywki. Uzyskanie odpowiedniego ph pożywki. W przypadku podłoży zawierających składniki biologicznie aktywne np. na bazie miodu dobór metody sterylizacji (wysokie temperatury niszczą witaminy) Zapewnienie bakteriom dostępu do tlenu. Utrzymywanie odpowiedniej i stabilnej temperatury podłoża (24-30 C ) Pojawianie się niepożądanych celulozo-ujemnych mutantów przy wytrząsaniu próbek. Zakwaszanie podłoża w czasie hodowli. 22

23 WNIOSKI Stwierdzono występowanie zróżnicowanych morfologicznie form A. xylinum o różnym stopniu inwolucji. Wyniki barwienia metodą Grama wskazują na gram-zmienność co jest zgodnie z najnowszymi badaniami (Kadere, Miyamoto i inni, 2008, Wee i inni 2011) Wyniki barwienia pozytywnego sugerują pojawienie się pasm BC 23

24 WYKORZYSTANE ŹRÓDŁA Young-Jung Wee, Soo-Yeon Kim, Soon-Do Yoon and Hwa-Won Ryu., 2011, Isolation and characterization of bacterial cellulose-producing bacterium derived from the persimmon vinegar, ), African Journal of Biotechnology Vol. 10 (72): Bielecki S., Malinowska H., 2008, Biotechnologiczne Nanomateriały, Postępy Mikrobiologii 47 (3): Kadere T. T., Miyamoto T., Oniang o R. K., Kutima P. M., and Njoroge S. M., 2008, Isolation and identification of the genera Acetobacter and Gluconobacter in coconut toddy (mnazi), African Journal of Biotechnology Vol. 7 (16): Son, Changjin, Seonyong Chung, Jieun Lee, and Seongjun Kim, 2002, Isolation and Cultivation Characteristics of Acetobacter xylinum KJ-1 Producing Bacterial Cellulose in Shaking Cultures, Journal of Microbiology and Biotechnology 12 (5), Forng E. R., Anderson S. M., and Cannon R. E., May 1989, Synthetic Medium for Acetobacter Xylinum that can be used for isolation of Auxotrophic Mutants and study of Cellulose Biosynthesis, Applied and Environmental Microbiology Vol. 55 (5): m/restriction/sources/acetobacterxylinus.shtml 24

25 PODZIĘKOWANIA Prof. dr hab. Zdzisława Libudzisz Dr hab. Katarzyna Hrynkiewicz Zakład Mikrobiologii Ogólnej 25