(12) OPIS PATENTOWY. (54) Sposób izolacji pałeczek Salmonella z mieszanek paszowych i ich komponentów

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: (22) Data zgłoszenia: (51) IntCl5: C12N 1/20 C12R 1/42 (54) Sposób izolacji pałeczek Salmonella z mieszanek paszowych i ich komponentów (73) Uprawniony z patentu: (43) Zgłoszenie ogłoszono: Instytut Weterynarii, Puławy, PL BUP 17/90 (72) Twórcy wynalazku: Marian Truszczyński, Puławy, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: Andrzej Hoszowski, Puławy, PL WUP 12/92 PL B1 (57) 1. Sposób izolacji pałeczek Salmonella z mieszanek paszowych i ich kom ponentów przez kilku etapową hodow lę, znamienny tym, że badaną próbkę mieszanki paszowej lub jej komponentu homogenizuje się w wyjałowionej wodzie destylowanej i przetrzymuje przez 2-3 godzin w temperaturze pokojowej, po czym poddaje wstępnemu namnożeniu we wzbogaconym bulionie w temperaturze 37 C korzystnie przez 18 godzin, z kolei hodowlę przenosi się na podłoże wybiórczo-namnażające (MK) według Muellera-Kauffmanna i prowadzi inkubację korzystnie przez 24 godziny w temperaturze 43 C, po czym dokonuje się przesiewu na jedną płytkę zawierającą stałe podłoże różnicująco-selektywne z zielenią brylantową (BGE) według Edela i Kampelmachera i na jedną płytkę z podłożem różnicująco-selektywnym (BxLH) według Hoszowskiego i Truszczyńskiego, inkubuje je korzystnie przez 24 godziny w temperaturze 37 C i wybiera podejrzane kolonie do potwierdzających badań biochemicznych i serologicznych.

2 SPOSÓB IZOLACJI PAŁECZEK SALMONELLA Z MIESZANEK PASZOWYCH I ICH KOMPONENTÓW Z a s t r z e ż e n i a p a t e n t o w e 1. Sposób Izolacji pałeczek Salmonella z mieszanek paszowych I ich komponentów przez kllkuetapową hodowlę, z n a m i e n n y t y m, że badaną próbkę mieszanki paszowej lub jej komponentu homogenizuje się w wyjałowionej wodzie destylowanej i przetrzymuje przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, po czym poddaje wstępnemu namnożeniu we wzbogaconym bulionie w temperaturze 37 c korzystnie przez 18 godzin, z kolei hodowlę przenosi się na podłoże wybiórczo-namnażające /MK/ według Muellera-Kauffmanna i prowadzi inkubację korzystnie przez 24 godziny w temperaturze 43 -C, po czym dokonują się przesiewu na jednę płytkę zawierającą stałe podłoże różnicująco-selektywne z zielenią brylantową /BGE/ według Edela i Kampelmachera i na jednę płytkę z podłożeń różnicująco-selektywnym /BxLH/ według Hoszowskiego i Truszczyńskiego, inkubuje je korzystnie przez 24 godziny w temperaturze 37 C i wybiera podejrzane kolonie do potwierdzających badań biochemicznych i serologicznych. 2. Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y tym, że podczas homogenizacji wzajemny stosunek wagowy badanego materiału do wody wynosi 1 : 1,5-2,5. 3. Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y tym, że materiał z wodę homogenizuje się przez co najmniej 1 minutę. 4. Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y tym, że homogenizat poddaje się wstępnemu namnożeniu w rozcieńczeniu korzystnie 1 : Sposób według zastrz.1, z n a m i e n n y tym, że wstępnie namnożonym materiałem posiewa się w ilości po 1 ml każdą z dwóch probówek zawierajęcych po 9 ml podłoża /MK/ dla selektywnego namnożenia pałeczek Salmonella, a następnie dokonuje się z nich posiewu na płytki z podłożem /BGE/ 1 /BxLH/ za pomocą czy o średnicy oczka 3 mm. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób izolacji pałeczek Salmonella z mieszanek paszowych i ich komponentów. Badania mikrobiologiczne przemysłowych mieszanek paszowych, jak też komponentów służących do ich otrzymywania na obecność w nich pałeczek Salmonella, są zagadnieniem aktualnym i ważnym z punktu widzenia epizootiologicznego. Stanowią one jeden z elementów działań profilaktycznych, zmierzających do ograniczenia zakażeń zwierzą t drobnoustrojami Salmonella, a pośrednio umożliwiają dostarczenie na rynek zdrowej żywności, wolnej od tych zarazków. Kontrola obejmuje wyizolowanie pałeczek Salmonella z badanej próbki paszy i późniejsze ich badanie biochemiczne i serologiczne. Pasza, w której stwierdzono obecność pałeczek Salmonella nie nadaje się bez dodatkowego uzdatniania do żywienia zwierząt. Znany sposób izolacji pałeczek Salmonella polega na zawieszeniu próbki paszy/komponentu w bulionie namnażającym z mannitolem i ich inkuboweniu w kolejno zmniejszających się rozcieńczeniach w temperaturze 37 C przy ciągłym wytrząsaniu. Skład bulionu z mannitolem: Bacto-beef extract - 3 g, Pepton bakteriologiczny - 5 g, Mannirol - 5 c, ml. Po doprowadzeniu ph do wartości 6,8-7,2 podłoże sterylizuje się w temperaturze 121 C przez 15 minut. Następnie prowadzi się hodowlę w ściśle określonych warunkach kolejno: 1/ w bulionie Hottingera o składzie: Wyciąg Hottin-

3 gera ml, NaCl - 5 g, Na2HP04-0,2 g, ml. Po zagotowaniu powyższych składników ustalić ph na 7,6-7,8, przesączyć i wyjałowić w temperaturze 121 C w ciągu 20 minut; 2/ bulionie wybiórczo-namnażającym Muellera-Kauffmanna o składzie : A. podłoże podstawowe Bacto-Beef extract firmy :"Difco" Iub - 5 g Lab-Lemco beef extrect f-my Oxoid* Pepton bacto f-my D lifco" - 10 g Sodu chlorek - 3 g Wapnia węglan - 45 g Woda destylowana ad ml Po doprowadzeniu wartości ph do 7,0 ± 0,1 podłoże sterylizuje się w temperaturze 121 C przez 20 minut. B. roztwór tiosiarczanu sodu tiosiarczan sodu - 50 g ad ml roztwór sterylizuje się w temperaturze 121 C przez 20 minut. C. roztwór jodu Jod - 20 g potasu jodek - 25 g ad m D. roztwór zieleni brylantowej zieleń brylantowa - 0,5 g ad ml E. roztwór żółci żółć wołowa odwodniona - 10 g ad ml roztwór sterylizuje się w temperaturze 121 C przez 20 minut. Podłoże kompletne : 900 ml A +100 ml B + 20 ml C + 2 ml D + 50 E. Po 24-godzinnej inkubacji wysiewa się na stałe podłoże różnicująco-w ybiórcze /8G/ o składzie : ekstrakt drożdżowy - 3 g chlorek sodu - 5 g pepton bakteriologiczny Iub - 10 g Pepton Proteose nr 3 firmy Difco" laktoza - 10 g sacharoza - 10 g zieleń brylantowa - 0,0125 g czerwień fenolowa - 0,08 g Agar bacto firmy "Difco/ - 20 g ml Po doprowadzeniu ph do wartości 6,9-7,0 podłoże sterylizuje się w temperaturze 121 C przez 20 minut. Przykładowo 20 g badanej próbki paszy zawiesza się w 180 ml bulionu namnaża jącego z dodatkiem 0,5% mannitolu /rozcieńczenie 1 : 10/ i wytrząsa całość w te m p e r a t u r z e 37 C w ciągu 1 godziny /hodowla A/. Następnie 20 ml hodowli A przenosi się do 180 ml bulionu z mannito- lem, uzyskując rozcieńczenie 1 : 100 i ponownie wytrząsa całość w temperaturze 37 c w ciągu 1 godziny /hodowla B/. W przypadku badań kontrolnych n p. odwoławczych lub bardzo dużych ilości pasz, 20 ml hodowli B przenosi s ię do k o l e j n y c h i ponow-

4 nie wytrząsa w 37 C przez 1 godzinę /hodowla C, rozcieńczenie 1 : 1000/. Z każdej hodowli / A, B, C/ wysiewa się po 1 ml materiału do probówki zawierającej 9 m l bulionu Hottingera /podłoże namnażające/ i inkubuje w temperaturze 37 C, stosując wytrząsanie w ciągu 18 godzin, uzyskując hodowle A 1, B 1 i C 1. Z hodowli A 1, B 1 i C1 wysiewa się po 0,1 ml na stałe podłoże różnicująco-wybiórcze z zielenią brylantową /BG/ i inkubuje przez 48 godzin w temperaturze 37 C oraz po 1 ml do wybiórczo-namnażającego bulionu Muellera-Kauffmanna /MK/ w celu namnożenia pałeczek Salmonella przy jednoczesnym powstrzymaniu wzrostu niepożądanych bakterii. Z bulionu /MK/, po inkubacji prowadzonej w temperaturze 37 C przez 48 godzin, przenosi się 0,1 ml materiału na uprzednio wymienione stałe podłoże,/bg/. Z podłoża / B G /, po 48 godzinnym hodowaniu w temperaturze 37 C wybiera się do dalszych badań kolonie nie rozkładające laktozy /gładkie, barwy różowej/, wyglądem zbliżone do kolonii tworzonych przez pałeczki Salmonella i przesiewa na agar zwykły, z którego po 24 godzinach hodowania w 37 C pobiera się materiał do oznaczeń biochemicznych i serologicznych. Wyżej opisany sposób izolacji pałeczek Salmonella z pasz i ich komponentów jest czaso- i pracochłonny, wymaga użycia podłoży i dysponowania pomieszczeniem termoetatowym z wytrząsarką. Szczególnie kłopotliwym w realizacji tego sposobu j est przygotowanie bulionu Hottingera, dla otrzymania którego należy mięso wołowe poddać trawieniu świeżo uzyskaną zmieloną trzustkę wieprzową przez 48 godzin i wykonać szereg innych operacji. Ocena mikrobiologiczna paszy, bądź ich komponentów winna być dokonana w miarę szybko, a jednocześnie dokładnie. Zapewnia to sposób według wynalazku. Według wynalazku badaną próbkę mieszanki paszowej Iub jej komponentu homogenizuje się w wyjałowionej wodzie destylowanej i przetrzymuje przez 2-3 godziny w temperaturze pokojowej, po czym poddaje wstępnemu namnożeniu /preinkubacji/ we wzbogaconym bulionie w temperaturze 37 C korzystnie przez 18 godzin, z kolei hodowlę przenosi się na podłoże wy- biórczo-namnażające / MK-patrz str.2-3 niniejszego opracowania/ według Muellera-Kauffmanna i prowadzi inkubację korzystnie przez 24 godziny w temperaturze 43 C, po czym dokonuje się przesiewu na jedną płytkę zawierającą stałe podłoże różnicująco-selektywne z zielenią brylantową /BGE/ według Edela i Kampelmachera i na jedną płytkę z podłożem różnicująco-selek- tywnym /BxLH/ według Hoszowskiego i Truszczyńskiego. Skład podłoża z zielenią brylantową /BGE/ według Edela i Kampelmachera: A. podłoże podstawowe Lab-Lemco Powder firmy Oxoid ' - 5 g Pepton bacto L34 f- my "Oxoid'' - 10 g Extract drożdżowy f-my "Oxoid* - 3 g Na2HP04-1 g Na H2P04-0,6 g Agor bacto nr 1 f-my Oxoid" - 15 g 900 ml Po ustaleniu ph na 7,0-7,1 podłoże sterylizuje się w temperaturze 121 C przez 15 minut. B. roztwór cukrów i czerwieni fenolowej laktoza - 10 g sacharoza - 10 g czerwień fenolowa - 0,09 g roztwór ogrzać do 70 C i schłodzić. C. roztwór zieleni brylantowej Podłoże kompletne: 100 ml zieleń brylantowa - 0,5 g ad 100 ml 900 ml A ml B + 0,94 ml C. Skład podłoża różnicująco-selektywnego /BxLH/ według Hoszowskiego i Truszczyńskiego.

5 A. podłoże podstawowe Lab-Lemco Powder firm y "Oxoid'' - 5 g Soya pepton neutralized f-my "Oxoid'' 15 g Extract drożdżowy f-my "Oxoid" - 3 g L-lizyny chlorowodorek - 5 g Pabiamid - 0,75 g Agar bacto nr 1 f-my "Oxoid" - 15 g 900 ml Po doprowadzeniu ph do wartości 6,9 podłoże sterylizuje się przez gotowanie w ciągu 5 minut. B. roztwór cukrów i czerwieni fenolowej sacharoza - 10 g ksyloza g czerwień fenolowa - 0,09 g 100 m l roztwór ogrzać do 70 C i schłodzić C. roztwór zieleni brylantowej zieleń brylantowa - 0,5 g ad ml D. wskaźnik siarkowodorowy sodu tiosiarczan - 34 g cytrynian żelazowo-amonowy - 4 g ad 100 ml Podłoże kompletne: 900 ml A ml B + 1,2 ml C + 20 ml D. Płytki inkubuje się korzystnie przez 24 godziny w temperaturze 37 C i wybiera podejrzane kolonie do potwierdzających badań biochemicznych i serologicznych. Zaleca się, aby podczas homogenizacji wzajemny stosunek wagowy badanego materiału do wody wynosił 1:1,5-2,5, a czas homogenizacji wynosił co najmniej 1 minutę. Więcej wody /stosunek 1:2,5/ dodaje się do takiego materiału, który zawiera duże ilości białka, a przez to sam chłonie wodę. Pozostawienie homogenizatu na 2-3 godziny w temperaturze pokojowej powoduje podwyższenie wartości współczynnika aktywności wodnej badanego materiału, co wpływa korzystnie na metabolizm pałeczek Salmonella, w wyniku czego zwiększa się wyraźnie szansa ich izolacji. Homogenizat poddaje się wstępnemu namnożeniu w rozcieńczeniu korzystnie 1:10 np. 25 ml homogenizatu przenosi się do 225 ml wzbogaconego bulionu i dalej poddaje go preinkubacji /wstępnemu namnożeniu/. D la zwiększenia pewności izolacji należy wstępnie namnożony materiał w ilości 1 ml przenieść do każdej z dwóch probówek zawierających po 9 ml podłoża /MK/ w celu selek-- tywnego namnożenia, a następnie dokonać z nich posiewu na płytki z podłożem /BGE/ i podłożem /BxLH/ za pomocą ezy o średnicy oczka 3 mm. Można oczywiście dokonać posiewu tylko do jednej probówki z podłożem /MK/, ale wtedy zmniejsza się czułość metody. Prowadzenie namnażania w podłożu /MK/ w wyższej temperaturze /43 C/ niż w sposobie znanym /37 C/ ułatwia izolację pałeczek Salmonella, gdyż w przeciwieństwie do nich, przy tej temperaturze wzrost wielu nie pożądanych bakterii utrudniających ich wykrycie jest w dużym stopniu zahamowany. W efekcie znacznie łatwiej jest na stałych, różnicująco-selektywnych podłożach dokonać właściwego wyboru kolonii do dalszych badań potwierdzających obecność pałeczek Salmonella. Dokonywanie przesiewów równoległych z podłoża /MK/ na dwa różne podłoża stałe /BGE i BxLH/ j est również czynnikiem podnoszącym efektywność sposobu według wynalazku, gdyż nie wszystkie serotypy salmonel rosnę równie dobrze na wszystkich

6 podłożach, a większe liczba płytek na które są dokonywane posiewy /korzystnie 4 płytki/ w porównaniu do sposobu znanego / 1 płytka/ zwiększa czułość tej techniki. Końcowy wzrost pałeczek Salmonella prowadzi się na podłożu /BGE/ według Edela i Kampelmachera oraz na podłożu /BxLH/ według Hoszowskiego i Truszczyńskiego. To ostatnie bogate jest w różnego rodzaju peptony, aminokwasy i w it a miny, dz ięki czemu pałeczki Salmonella doskonale się na nim namnażają. Ponadto podłoże to zawiera para-amino-benzeno-sulfonamid i zieleń brylantowy, które to czynniki hamuję wzrost nie pożądanych bakterii, a zwłaszcza z rodzaju Proteus. Jednocześnie zastosowany w nim specyficzny system różnicujący /brak laktozy, wskaźnik produkcji siarkowodoru, obecność ksylozy i lizyny/ pozwala na wykrywanie nie tylko typowych ale i laktozododatnich wariantów pałeczek Salmonella, coraz częściej ostatnio stwierdzanych. Sposób według wynalazku jest prosty w realizacji. W porównaniu do sposobu znanego pozwala skrócić czas izolacji pałeczek Salmonella z badanej próbki mieszanki paszowej Iub jej komponentu o 1/3, przy jednoczesnym obniżeniu kosztów i zwiększeniu czułości metody. Sposób według wynalazku j est szczególnie przydatny do izolacji pałeczek Salmonella z przemysłowych mieszanek paszowych, jak mączki rybne i mięsno-kostne. Przykład. Do 90 g badanej próbki mączki mięsno-kostnej dodano jałową wodę destylowaną w Ilości 135 ml, uzyskując w ten sposób wzajemny stosunek składników 1 : 1,5. Całość homogenizowano przez 60 sekund i pozostawiono w temperaturze pokojowej przez 2-3 godziny. Następnie 25 ml homogenizatu przeniesiono do 225 ml wzbogaconego bulionu /bulion wzbogacony produkowany w Wytwórni Surowic i Szczepionek w Warszawie/ Iub bulionu odżywczego /Nutrient Broth firmy "D ifco"/ i inkubowano przez 28 godzin w temperaturze 37 C. Skład bulionu wzbogaconego /produkowanego w Wytwórni Surowic i Szczepionek w Warszawie/: wyciąg mięsny - 0,4 g enzymat hydrolizat kazeiny - 5,4 g hydrolizat drożdży - 1,7 g pepton - 4,0 g chlorek sodowy - 3,5 g 1000 ml ph końcowe 7,4 Skład bulionu odżywczego /Nutrient Broth firmy "D ifco"/: Bacto-Beef Extract - 3 g Pepton-Bacto - 5 g ph końcowe 6,8 Z tego bulionu przenoszono po 1 ml do każdej z 2 probówek zawierających bulion MK, sporządzony według opisu zawartego w normach ISO /patrz s tr.2-3 niniejszego opracowania/ i hodowano przez 24 godziny w temperaturze 43 C. Po tym okresie czasu z każdej hodowli, za pomocą ezy o średnicy oczka 3 mm posiewano jedną płytkę z agarem z zielenią brylantową według Edela i Kampelmachera /podłoże różnicująco-selektywne BGE - patrz str. 5-6 niniejszego opracowania/ sporządzonym według opisu zawartego w Bull.Wrld.Hlth.org. 1974,50,421 i jedną płytkę z podłożem BxLH według Hoszowskiego i Truszczyńskiego /patrz str.6-7 niniejszego opracowania/, sporządzonym według opisu zawartego w przykładzie zamieszczonym w polskim zgłoszeniu patentowym nr /BUP 17/90/. Wybrane po 24 godzinach hodowli w 37 C kolonie, przypominające swym wyglądem kolonie tworzone przez pałeczki Salmonella, przekazano do badań biochemicznych i serologicznych. Badania te potwierdziły obecność pałeczek Salmonella w próbce. Zakład Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena zł