mgr Sławomir Sułowicz Katedra Mikrobiologii UŚ

Transkrypt

1 mgr Sławomir Sułowicz Katedra Mikrobiologii UŚ

2 1) Analiza sanitarna wody 2) Analiza mikrobiologiczna gleby 3) Analiza sanitarna powietrza 4) Charakterystyka szczepów bakterii opornych na antybiotyki, wyizolowanych z gleby 5) Czy środki czystości zabijają bakterie? 6) Występowanie antybiotykoopornych szczepów bakterii wśród bakterii na terenach zanieczyszczonych metalami ciężkimi

3 Sery, jogurty, mleko Kiszonki Piwo, wino Produkcja antybiotyków Oczyszczanie ścieków Produkcja enzymów, substancji chemicznych, leków

4

5

6 Proste komórki wybarwiane są tylko jednym barwnikiem, np. błękitem metylenowym, fioletem krystalicznym lub fuksyną (1-2 min) Złożone barwienie kilkoma barwnikami wg ściśle określonej kolejności, np. metoda Grama, metoda Ziehl- Neelsena

7 1) Odtłuścić szkiełko podstawowe mydełkiem 2) Nanieść na szkiełko kroplę soli fizjologicznej (względnie wody) 3) Wykonać rozmaz bakterii na szkiełku (nie może być za dużo bakterii, bo preparat będzie za gruby do oglądania) 4) Szkiełko z rozmazem pozostawić do całkowitego wysuszenia (naniesienie zbyt dużej ilości soli fizjologicznej w punkcie 2 znacznie wydłuży proces wysuszania) 5) Utrwalić preparat przez 3-krotne przesunięcie nad płomieniem barwnika (odczekać chwilkę aż szkiełko ostygnie, by przy zalewaniu chłodnymi odczynnikami nie pękło) Harley Prescot Laboratory exercises in microbiology

8 1) Krystaliczny fiolet (2 min) spłukujemy wodą 2) Lugola płyn (1 min) spłukujemy wodą 3) Alkohol (30 sek) spłukujemy wodą 4) Zasadowa fuksyna (20 sek) spłukujemy wodą Osuszamy preparat bibułką Oglądamy pod imersją (pow. 10x100) Harley Prescot Laboratory exercises in microbiology

9 Gram-ujemne pałeczki Escherichia coli Gram-dodatnie laseczki Bacillus subtilis

10

11 N-acetyloglukozamina Kwas N-acetylomuraminowy Łańcuchy peptydowe Warstwy peptydoglikanu Błona komórkowa

12 PORÓWNANIE ŚCIAN BAKTERII Gram-dodatnia bakteria błona komórkowa przestrzeń peryplazmatyczna peptydoglikan (kilkadziesiąt warstw) błona komórkowa przestrzeń peryplazmatyczna peptydoglikan (1-3 warstwy) błona zewnętrzna Gram-ujemna bakteria

13 Fiolet krystaliczny Płyn Lugola Alkohol Fiolet wnika do cytoplazmy komórek Atom jodu wypiera mniejszy atom chloru z fioletu krystalicznego- tworzy się większy związek Alkohol powoduje zmniejszenie por w ścianie bakterii Gram-dodatnich; niszczy błonę zewnętrzną u Gramujemnych i wypłukuje barwnik Fuksyna zasadowa Fuksyna zabarwia Gram-ujemne bakterie

14 Jogurt Mleko niepasteryzowane Kefir Woda z ogórków kiszonych Gleba Woda Powietrze Ciało Bakterie z wody ze studni

15 Zakładana na pożywce płynnej (bulion odżywczy) w kolbce Pożywka i kolbka muszą być sterylne Kolbka musi być na tyle duża by był zapewniony dostęp powietrza do pożywki (odpowiednio duża powierzchnia styku pożywki z powietrzem)

16 Typy wzrostu mikroorganizmów w probówce na podłożu płynnym Benson 2001: Microbiological Applications Eza

17 Benson 2001 Microbiological application

18 Harley Prescot 2002 Laboratory exercises in microbiology Morello Granato Mizer 2003 Laboratory Manual and Workbook in microbiology

19 Szalka z podłożem stałym z licznymi bakteriami glebowymi Szalka z podłożem stałym (agarowym) i pojedynczymi koloniami bakterii

20 Różalski 2003 Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej

21 Harley Prescot 2002 Laboratory exercises in microbiology

22 Liczba bakterii [jednostek tworzących kolonie (jtk)] = liczba kolonii x rozcieńczenie x 10 (gdy wysiewano z 0,1 ml) Liczba bakterii = liczba kolonii x rozcieńczenie (gdy posiewano z 1 ml) Np. Liczba bakterii = 47 x 10 6 x 10= 4,7 x 10 8 jtk

23

24 Morello Granato Mizer Laboratory Manual and Workbook in microbiology

25

26 Mikroflora autochtoniczna (miejscowa) Mikroflora allochtoniczna (naniesiona) Bakterie żelaziste Leptotrix ochracea, Crenothrix polyspora W wodach czystych, przypowierzchniowych, bogatych w żelazo Leptotrix sp. Obrastają kamienie, liście, łodygi roślin podwodnych, rury

27 Masowy rozwój glonów w powierzchniowej warstwie wód Na wiosnę i jesienią: okrzemki Latem sinice i zielenice Liczba komórek glonów > 1000 na ml (nawet do kilkudziesięciu milionów!!!) Wydzielają silne trucizny: anatoksyna, saksitoksyna, hepatoksyna

28 Do jałowej butelki pobrać badaną wodę (wodociągową, ze studni, ze stawu) Przenieść 1 ml na płytkę i zalać bulionem agarowym (metoda płytek lanych) Inkubować w temp. 37 C przez 24 godziny Bakterie mezofilne wyrosłe na bulionie agarze ich obecność wskazuje na zanieczyszczenie wody fekaliami możliwość zakażenia wody bakteriami chorobotwórczymi

29 Bakterie psychrofilne świadczą o zanieczyszczeniu wody substancjami organicznymi zdolnymi do gnicia Przenieść 1 ml wody na płytkę i zalać bulionem żelatynowym (podłoże Fraziera) Inkubować w temp. 20 C przez 48 godziny Po okresie inkubacji zalać płytkę roztworem HgCl 2 policzyć kolonie wokół których są przejaśnienia znak, że białko zostało rozłożone

30 Miano coli: najmniejsza ilość badanej próby w ml lub g, w której stwierdza się jeszcze obecność pałeczek z grupy coli. Poziomy czystości dla wody z rzek i jezior: 0,1 ml - woda jest niezdrowa 1,0 - woda jest zanieczyszczona (niepewna) 10 - woda jest stosunkowo czysta (możliwa do użycia) woda jest dostatecznie czysta Normy dla wody pitnej: studziennej > 50 cm 3 wodociągowej > 100 cm 3

31 Gleba ma strukturę heterogenną w małej objętości spotykamy równocześnie lito-, hydro- i atmosferę Ich wzajemne proporcje zależą do rodzajów i typów gleb W żyznej glebie liczba bakterii jest rzędu miliardów na g gleby Ryzosfera strefa oddziaływań roślin i korzeni

32 Sporządzić rozcieńczenie badanej gleby przez zmieszanie 10 g gleby w 90 ml soli fizjologicznej (0,85% roztwór NaCl) Kolbkę z zawiesiną wytrząsać 5 minut Sporządzić szereg rozcieńczeń do 10-6

33 Bacillus mycoides Nanieść 0,1 ml z odpowiednich rozcieńczeń zawiesiny glebowej na następujące podłoża: Bulion agar dla określenia ogólnej liczny bakterii glebowych Podłoże YS na promieniowce Podłoże Fraziera (żelatynowe) określenie liczby bakterii proteolitycznych Podłoże Fiodorowa (bezazotowe) dla określenia liczebności bakterii wiążących azot atmosferyczny Podłoże Czapek-Doxa dla określenia liczby grzybów

34 Powietrze wtóre środowisko mikroorganizmów Duże zanieczyszczenia pyłowe sprzyjają przenoszeniu drobnoustrojów w powietrzu W powietrzu dominują bakterie wytwarzające barwniki żółte, pomarańczowe, czerwone chronią przed fotoutlenianiem Zarodniki grzybów - uczulenia

35 3 płytki z bulionem agarowym (bakterie) i 3 z podłożem Czapek-Doxa (grzyby) otwieramy w miejscu wykonywania badań W zależności od spodziewanego skażenia zamykamy płytki po 5, 10 lub 15 minutach Płytki z BA inkubujemy w 27 C przez 48 godzin; płytki z podłożem Czapek-Doxa w temp. 22 C przez 7 dni

36 Założenie Omeliańskiego, że w 10 l powietrza znajduje się tyle mikroorganizmów ile osiądzie w ciągu 5 minut na powierzchni 100 cm 2 Liczebność mikroorganizmów = a x 100 (cm 2 )/ b (cm 2 ) x c a liczba wyrosłych kolonii b powierzchnia płytki Petriego c współczynnik odpowiadający czasowi ekspozycji, dla 5 min= 1, dla 10 min=2, dla 15 min=3, itd.

37

38 Zwilżonym w płynie Ringera tamponem zetrzeć 10 razy badaną powierzchnię Wacik wrzucić do kolbki z płynem Ringera (50 ml) i wytrząsać 30 sek Pobrać 1 cm 3 zawiesiny, przenieść do płytki Petriego i zalać agarem odżywczym Inkubować w temp. 27 C przez 48 godzin

39 Liczebność mikroorganizmów na 1 cm 2 badanej powierzchni = liczba kolonii wyrosłych na płytce x 50 / powierzchnia (cm 2 ) z której pobrano próbkę do badań

40

41 Barwienie proste Barwienie złożone metodą Grama Izolacja mikroorganizmów na podłożu stałym Namnażanie mikroorganizmów na podłożu płynnym Otrzymywanie czystego szczepu posiew redukcyjny Szereg rozcieńczeń Posiew mazany, metoda płytek lanych Liczenie mikroorganizmów Izolacja bakterii z gleby, wody, powietrza, powierzchni przedmiotów

42

43

44 1) Mrozowska J. :Laboratorium z mikrobiologii ogólnej i środowiskowej. Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, ) Różalski A.: Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej. Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, ) Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z. : Mikrobiologia techniczna tom I. Mikroorganizmy i środowiska ich występowania. PWN, ) Kunicki-Goldfinger W. :Życie bakterii. PWN, Warszawa, ) Schlegel H.: Mikrobiologia ogólna. PWN, Warszawa, ) Sigleton P.: Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie.pwn, Harley J.P., Prescott L.M Laboratory exercises in microbiology Benson Microbiological Applications Lab Manual Morello J.A., Granato P.A. Mizer H.E Laboratory Manual and Workbook in Microbiology

45