Do jednego litra medium dodać 10,0 g skrobi ziemniaczanej lub kukurydzianej i mieszać do uzyskania zawiesiny. Sterylizować w autoklawie.

Transkrypt

1 Ćwiczenie 3. Izolacja laseczek przetrwalnikujących z gleby Cel ćwiczenia: Izolacja i testowanie przydatności biotechnologicznej laseczek z rodzaju Bacillus występujących w glebie. Odczynniki i podłoża: Agar odżywczy wyciąg mięsny 1,0 g wyciąg drożdżowy 2,0 g pepton 5,0 g NaCl 5,0 g agar 20,0 g woda do 1000 ml; ph=7,4 Płytki mleczne Zmieszać w równych ilościach jałowe mleko odtłuszczone (0-0,5%) oraz jałowy bulion o składzie: pepton (20 g/l), ekstrakt drożdżowy (10 g/l), NaCl (20 g/l), agar (70 g/l). Płytki ze skrobią Skład podłoża mineralnego (MSB): K 2HPO 4 (NH 4) 2SO 4 MgSO 4 x 7H 2O FeSO 4 x 7H 2O CaCl 2 x 6H 2O MnCl 2 x 4H 2O agar woda 1,0 g 2,0 g 0,2 g 0,01 g 0,02 g 0,002 g 20,0 g do 1000 ml; ph=7,0 Do jednego litra medium dodać 10,0 g skrobi ziemniaczanej lub kukurydzianej i mieszać do uzyskania zawiesiny. Sterylizować w autoklawie. Materiał: świeża próbka gleby Wykonanie (3a): 1. Napełnić łaźnię wodną i podgrzewać do wrzenia. 2. Dodać jałowo (przy palniku) około 2 g gleby do probówki z 20 ml bulionu odżywczego. 3. Zatkać probówkę i umieścić we wrzącej łaźni dokładnie na 12 minut. Poziom wody w łaźni powinien przez cały czas znajdować się nad powierzchnią bulionu, aby całość probówki uległa jednakowemu ogrzewaniu. 4. Wyciągnąć probówkę z łaźni, schłodzić. Inkubować przez tydzień w cieplarce (temp. 32 C). 1

2 Gotowanie próbki gleby w bulionie odżywczym powoduje zabicie praktycznie wszystkich bakterii, a jednocześnie stymuluje kiełkowanie przetrwalników Bacillus sp. (szok cieplny). Kiełkujące spory przekształcają się w podłożu hodowlanym w komórki wegetatywne dające początek koloniom. Następne ćwiczenia (3b): 5. Wysiać ezą materiał na podłoża stałe i inkubować w cieplarce (32 C): a. agar mineralny ze skrobią b. płytki mleczne c. agar odżywczy (kontrola) Następne ćwiczenia (3c): 6. Ocenić morfologię kolonii i wykonać preparaty mikroskopowe: a. Morfologia kolonii: kolonie Bacillus sp. są płaskie, białe, mogą nieco przypominać kolonie grzybów (kształt rhizoidalny). Wiele gatunków wykazuje ruchliwość, dlatego kolonie mogą migrować po szalce pokrywając całą powierzchnię agaru. b. Ocena morfologii komórek pod mikroskopem (barwienie fioletem krystalicznym lub metodą Grama patrz załącznik). c. Wykrywanie zarodników Bacillus sp. za pomocą barwienia Schaeffera-Fultona (patrz załącznik). 7. Ocenić zdolność wyizolowanych kolonii Bacillus sp. do produkcji enzymów pozakomórkowych: a. Wytwarzanie amylaz: na agarze mineralnym ze skrobią. Po tygodniu hodowli nanieść na powierzchnię szalki płyn Lugola. Po usunięciu płynu obserwować obecność stref przejaśnienia wokół kolonii. b. Wytwarzanie proteaz (zdolność do rozkładu kazeiny): na płytkach mlecznych obserwować strefy przejaśnień wokół kolonii. Wyniki: Liczba (lub % powierzchni szlaki porośniętej koloniami) i morfologia kolonii Bacillus rodzaj podłoża ilość kolonii agar odżywczy płytki mleczne płytki ze skrobią morfologia kolonii 2

3 Morfologia komórek Bacillus sp. (barwienie metodą Grama) Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej SUM, 2015/16 Wykrywanie zarodników Bacillus sp. (barwienie metodą Schaeffera-Fultona) Testowanie zdolności Bacillus sp. do wytwarzania enzymów zewnątrzkomórkowych rodzaj podłoża wyniki obserwacji płytki mleczne płytki ze skrobią agar odżywczy Wnioski: 3

4 Załącznik BARWIENIE METODĄ Grama Metoda opracowana w 1884 roku przez duńskiego lekarza Hansa Christiana Grama. 1. Na szkiełku podstawowym umieścić 1-2 oczka ezy zawiesiny bakteryjnej. 2. Rozprowadzić zawiesinę ezą po powierzchni szkiełka. Pozostawić w temperaturze pokojowej do wyschnięcia. 3. Utrwalić preparat w płomieniu palnika. 4. Przeprowadzić barwienie wg poniższego schematu: a. Barwienie fioletem krystalicznym (1-2 min.). b. Płukanie wodą. c. Płyn Lugola lub jodyna (0.5-1 min.). d. Płukanie wodą. e. Odbarwienie alkoholem (10-20 sek.). f. Płukanie wodą. g. Barwienie safraniną lub fuksyną zasadową (15-40 sek.). h. Płukanie wodą. 5. Osuszyć preparat bibułą i oglądać pod imersją. Wyniki: komórki bakterii Gram(+) niebiesko-fioletowe, komórki bakterii Gram(-) różowe. Rozprowadzenie hodowli na szkiełku podstawowym, wysuszenie i utrwalenie Barwienie fioletem krystalicznym, Dodanie płynu Lugola, Odbarwianie etanolem, G - G + Dobarwienie fuksyną zasadową lub safraniną, 4

5 Mechanizm barwienia: 1. Wszystkie komórki bakteryjne, zarówno Gram(+), jak i Gram(-), zabarwiają się fioletem krystalicznym. 2. Dodanie płynu Lugola powoduje, że fiolet reaguje z jodem, w wyniku czego tworzą się stosunkowo duże kompleksy złożone z barwnika i jodu komórki przyjmują zabarwienie granatowe. 3. Płukanie w alkoholu powoduje, że w komórkach Gram(+) następuje zmniejszenie pustej przestrzeni w wielowarstwowych ścianach komórkowych, mających wygląd wielu nałożonych na siebie siatek. W rezultacie kompleksy fioletu krystalicznego z jodem nie ulegają wypłukaniu. W przypadku 1-2 warstwowej ściany bakterii Gram(-) nie jest przeszkodą - alkohol świetnie wypłukuje barwnik. 4. Po zakończonym płukaniu komórki Gram(+) są granatowo-fioletowe, a Gram(-) bezbarwne. 5. Dodatkowy barwnik dobarwia komórki Gram(-), nie zmieniając barwy komórek Gram(+). Zjawisko Gram-chwiejności dotyczy głównie bakterii Gram(+) z rodzajów Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Propionibacterium. Pewne gatunki bakterii rosnąc w starej hodowli w późnej fazie wzrostu tracą swoją cechę barwliwości. Dzieje się tak na skutek wyczerpania się w pożywce składników niezbędnych do syntezy ściany komórkowej. Podobnie zachowują się bakterie podczas podziału. Działanie czynników, które zaburzają proces syntezy ściany komórkowej (np. penicyliny, cefalosporyny) bądź uszkadzają ścianę komórkową (lizozym) powoduje, że bakterie Gram(+) barwią się ujemnie. BARWIENIE przetrwalników bakteryjnych METODĄ Schaeffera-Fultona Barwniki: * 1% roztwór zieleni malachitowej (rozpuścić bez podgrzewania w 1% fenolu) * 0,5% roztwór safraniny. Procedura: Rozmaz bakteryjny wysuszyć na powietrzu, następnie utrwalić nad płomieniem. Zalać preparat zielenią malachitową i odparować (nie zagotować!) umieszczając preparat na zlewce z gotującą się wodą na 5 minut (w razie potrzeby uzupełnić ilość barwnika na szkiełku). Płukać w wodzie przez 1 minutę. Dobarwić przez 30 sekund roztworem safraniny. Wynik barwienia: przetrwalniki zielone, komórki wegetatywne zabarwione na kolor czerwony. Opisać kształt zarodników i położenie w komórce; wykonać odpowiedni rysunek. 5