(12) OPIS PATENTOWY(19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY(19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/CZ98/00024 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO99/50434, PCT Gazette nr 40/99 (51) IntCl7 C12P 15/00 C12N 1/14 C12R 1/80 (54) Szczep Penicillium oxalicum i sposób prowadzenia hodowli tego szczepu (3 0 ) Pierwszeństwo: ,CZ,PV (7 3 ) U praw niony z patentu: Sardaryan Eduard, Pardubice, CZ (4 3 ) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 15/01 (7 2 ) Twórcy w ynalazku: Eduard Sardaryan, Pardubice, CZ ( 4 5 ) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 03/05 (74) Pełnom ocnik: Bartnik Urszula, POLSERVICE Sp z o.o. (57) 1. Szczep Penicillium oxalicum var. Armeniaca CCM PL B1

2 Szczep Pénicillium oxalicum i sposób prowadzenia hodowli tego szczepu Zastrzeżenia patentowe 1. Szczep Pénicillium oxalicum var. Armeniaca CCM Sposób prowadzenia hodowli szczepu określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że hodowla ta przeprowadzana jest w temperaturze 25 do 30 C, pod ciśnieniem kpa w bulionie o ph 3 do 9, zawierającym węglowodany i azot amoniakowy, przez 60 do 72 godz., a następnie w ten sposób wyprodukowany czerwony barwnik izolowany jest z pożywki. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że hodowla przeprowadzona jest w temperaturze 27 do 29 C, pod ciśnieniem kpa, z ciągłym mieszaniem, z prędkością obwodową 160 do 280 rpm, z dostarczeniem powietrza w stosunku 1,2 objętości powietrza do 1,0 objętości bulionu o ph 5,8 do 6,2, zawierającego od 1,5 do 1,8% wag. węglowodanów i od 0,66 do 0,69% wag. azotu amoniakowego, przez 64 do 68 godzin. * * * Dziedzina techniki Wynalazek dotyczy nowego szczepu grzybów, mającego zdolność produkcji czerwonego barwnika, który może być zastosowany jako barwnik w przemyśle spożywczym i kosmetycznym. Stan techniki W przemyśle spożywczym i kosmetycznym istnieje potrzeba barwników dobrze rozpuszczalnych w składnikach odpowiednich produktów, barwników nie wykazujących efektu batochromowego w kąpieli z wodą oraz stabilnych podczas gotowania. Istota wynalazku Wynalazek obejmuje szczep Pénicillium oxalicum var.armeniaca CCM Gdy opisywany szczep, należący do gatunku Pénicillium oxalicum, hodowany był w podłożu, zarówno ciekłym, jak i stałym, już w drugim dniu inkubacji obserwowano wzrastającą syntezę czerwonego barwnika, uwalnianego do podłoża. Z 1 litra pożywki otrzymano 1,5 do 2 g oczyszczonego czerwonego barwnika. Szczep zdeponowano w International Depositary Authority CCM-Czeskiej Kolekcji Mikroorganizmów na Uniwersytecie Mesaryk, Tvrdého 14, Brno, Republika Czeska, 19 marca, 1998 roku i zarejestrowano jako No. CCM Omawiany szczep tworzy krótkie konidiofory o wymiarach 60 do 70 na 5 do 6 j.m. Każdy strzępek zawiera od 2 do 7 konidów. Konidia mają okrągły kształt, średnicę 15 do 20 )jjn, gładką żółto-zieloną powierzchnię i są łatwo rozdzielane podczas obserwacji mikroskopowych. W bulionie mineralnym Czapka, szczep tworzy standardowo rosnące kolonie, które osiągają 2 do 2,5 cm w trzecim dniu inkubacji i do 4,5 cm w piątym, szóstym dniu. Kolonie są niezdefiniowane, aksamitne, strzępki są krótkie, zarodnikujące, o kruchej powierzchni, rozpadające się. Przy potrząsaniu naczynia zawierającego dojrzałą kulturę, charakterystyczne dla konidów jest, że odpadają w grupie. Nie wykazano efektu strefy. Grzybnia jest krótka, o jasnozielonym kolorze, który zmienia się w trakcie wzrostu kultury w kolor ciemnozielony. Biały kolor rosnącej kolonii obserwowany jest na jej brzegach, o szerokości 1 do 2 mm. Odwrotna strona kolonii jest czerwona, omawiany kolor czerwony staje się bardzo intensywny podczas wzrostu kultury i dyfunduje w głąb agaru, który przybiera uderzająco czerwoną barwę. Jeśli chodzi o kwasy organiczne, przyswaja kwas bursztynowy, mlekowy i maleinowy. Optymalna temperatura dla wzrostu grzybów i dla biosyntezy barwnika to 27 do 29 C. Szczep produkcyjny ulega namnożeniu także w temperaturze 37 do 38 C, nie tracąc przy tym zdolności do wytwarzania pigmentu. Szczep produkcyjny grzybów przechowywany jest za pomocą metody okresowych przeszczepień, w probówkach testowych, zawierających zestalo-

3 ne podłoże kapuściano-agarowe, w lodówce, w temperaturze +4 do +5 C. Okresowe przeszczepienia wykonuje się co 2-3 miesiące. Inny aspekt wynalazku to dostarczenie metody prowadzenia hodowli mikroorganizmu - - szczepu Pénicillium oxalicum var. Armeniaca, w której powyżej wymieniony szczep produkcyjny hodowany jest w temperaturze 25 do 30 C, korzystnie w 27 do 29 C, korzystnie pod ciśnieniem 50 do 80 kpa, korzystnie z ciągłym mieszaniem z peryferyczną prędkością 280 rpm, z dostarczeniem powietrza w stosunku 1,2 objętości powietrza do 1,0 objętości podłoża, w pożywce o ph 3 do 9, korzystnie ph 5,8 do 6,2, zawierającej węglowodany, korzystnie od 1,5 do 1,8% wag. i azot amoniakowy, korzystnie od 0,66 do 0,69% wag. przez 60 do 72 godz., korzystnie przez 64 do 68 godzin, a następnie usuwany jest płyn z pożywki i w rezultacie, izolowany jest z omawianego płynu czerwony barwnik. Otrzymany barwnik może być użyty jako barwnik żywności lub barwnik kosmetyczny. Barwnik jest ciemnoczerwonym, krystalicznym proszkiem o malinowo-czerwonym kolorze w roztworach wodnych. Nie wykazuje żadnego zapachu ani smaku, zarówno w krystalicznej formie, jak i w roztworze. Punkt topnienia to 127 C (rozpad). Nie jest rozpuszczalny w wodzie, natomiast jest rozpuszczalny w roztworach alkalicznych (ph 9,0 do 9,5) i alkoholu etylowym. Jest dobrze rozpuszczalny w białku jajek, w tłuszczach i stężonym kwasie octowym. Kolor barwnika nie ulega zmianie wraz ze zmianą ph, co oznacza, że nie wykazuje on efektu batochromowego. Charakteryzuje się wysoką stabilnością względem światła, jak i odpornością względem temperatury. Podczas gotowania w roztworach przez 5 godzin w 100 C nie występuje żadna zmiana koloru. Absorbuje światło w paśmie widzialnym (XmakS = 435 mm oraz 502 mm). Proporcja pików wynosi od 1,0 do 1,5. Wyniki badań analitycznych - zastosowania spektrometrii masowej wykazały, że produkowany czerwony barwnik zawiera pochodne antrachinonowe, np. pochodną o wzorze: o empirycznej postaci. C25H26O 14 i masie cząsteczkowej około 550. Badania przeprowadzone za pomocą ultrafioletu, podczerwieni i spektrometrii masowej potwierdziły antrachinonową strukturę. Namnożenie kultury szczepu produkcyjnego przeprowadzono w probówkach testowych z pożywką zawierającą agar z naparem z kapusty, stosując metodę okresowych przeszczepień. Powyższy bulion może być przygotowany np., według następującej procedury: 200 do 300 g drobno posiekanej kapusty dodano do 1 litra wody pitnej i gotowano przez 20 minut. Po obniżeniu temperatuiy do 50 C, roztwór filtrowano. Filtrat uzupełniano do 1 litra i dodawano 20 g agaru. Sterylizację bulionu przeprowadzano pod ciśnieniem 70 do 80 kpa, przez 20 minut. Tak otrzymany bulion rozdzielano po 6 do 8 ml do sterylnych probówek testowych, o wymiarach 18 x 150 mm, o temperaturze 50 do 55 C i sterylizowano w autoklawie w następujących warunkach: temperatura 116 C, strumień ciśnienia 100 kpa, czas sterylizacji 20 min. Po sterylizacji probówki testowe z bulionowym skosem agarowym są najpierw suszone w termostacie, w temperaturze 37 C, przez 1 dzień. Przygotowane w ten sposób probówki zaszczepiano hodowlą szczepu produkcyjnego i pozostawiano do dojrzewania w temperaturze 27 do 29 C. Okres inkubacji wynosił 5 dni. Aktywne kolonie mikroorganizmów są gromadzone za pomocą dalszych przeszczepień zarodników na płytkach Petriego, zawierających podłoże agarowe z naparem z kapusty. Podstawą selekcji aktywnych koloni jest intensywność zabarwienia kolonii o minimalnej średnicy 0,5 do 1 cm, o gładkiej powierzchni i minimalnej strefie wzrostu 0,1 do 0,2 cm. Aktywne kolonie gromadzone są na podłożu agarowym, zawierającym napar z kapusty.

4 Na podstawie morfologicznej charakterystyki i właściwości kultury, otrzymany szczep grzybów jest najbliższy szczepowi Pénicillium oxalicum (wg I.M.Pidoplichko, 1972). Możliwe jest przeprowadzenie hodowli szczepu produkcyjnego, którego dotyczy wynalazek, w fermentorze, w podłożu ciekłym, za pomocą metody zanurzeniowej. Ilość materiału inokulacyjnego wynosi 3 do 7% wag. Po zaszczepieniu, 5-dniową kulturą inkubowaną w naparze z kapusty używano w dalszym etapie. Hodowla materiału zarodowego jest przeprowadzana w temperaturze 27 do 29 C przez 64 do 68 godzin. Optymalne warunki dla przeprowadzenia mikrobiologicznej syntezy są właściwe temperaturze 27 do 29 C, w połączeniu z peryferyczną prędkością około 280 min 1, napowietrzeniem w proporcji 1,2 objętości powietrza do 1,0 objętości bulionu i ciśnieniem w fermentorze operacyjnym wynoszącym 50 do 80 kpa. Już po fermentacji mikroorganizmu produkcyjnego, trwającej 30 do 35 godzin, płyn ponad kulturą staje się czerwony a intensywność koloru czerwonego osiąga maksimum-ciemno czerwoną barwę po okresie inkubacyjnym, wynoszącym 68 do 72 godzin. Jako składniki bulionu zastosowane są węglowodany, różne sacharydy, wielofunkcyjne alkohole i węglowodory a także produkt odpadowy, pochodzący z produkcji cukru-melasa w ilości 10 do 20 g na 1 litr wody. W celu dostarczenia azotu, można zastosować ekstrakt zbożowy, autolizat lub ekstrakt drożdżowy a także składniki zawierające azot w różnych formach (tak jak aminokwasy), w ilości 0,5 do 0,7% wag. azotu. Optymalne wartości bulionu są następujące: ph 5,8 do 6,2, zawartość węglowodorów; 1,5 do 1,8 % wag., zawartość azotu amoniakowego: 0,66 do 0,69% wag. Przykłady: Skład bulionu Przykład 1 Cukier granulowany 12 do 20 g/l Ekstrakt zbożowy 5 do 10 g/l Siarczan cynku 0,002 g/l Siarczan magnezu 0,001 g/l Przykład 2 Cukier granulowany 12 do 20 g/l Ekstrakt drożdżowy 5 do 10 g/l Siarczan cynku 0,002 g/l Siarczan magnezu 0,001 g/l Przykład 3 Melasa 12 do 20 g/l Ekstrakt zbożowy lub drożdżowy, lub autolizat 5 do 10 g/l Siarczan cynku 0,002 g/l Siarczan magnezu 0,001 g/l Bulion w fermentorze operacyjnym zaszczepiany jest dwu dniową kulturą Peniciilium oxalicum var.armeniaca CCM 8242, wyhodowaną w urządzeniu inokulacyjnym. Ilość materiału inokulacyjnego wynosi 3 do 7% obj. bulionu. Oddzielenie superntantu kultury od grzybowej biomasy. Po zakończeniu biosyntezy czerwonego barwnika, całkowity płyn z bulionu jest filtrowany lub wirowany w celu oddzielenia od biomasy. W celu wytrącenia barwnika płyn zakwaszany jest do ph 3,0 do 2,5. Zakwaszenie może być wykonane za pomocą organicznego lub nieorganicznego kwasu. Wytrącenie może być przeprowadzone za pomocą siarczanu potasowego glinu. W ten sposób otrzymany barwnik jest nierozpuszczalny w zasadach i alkoholach. Jest rozpuszczalny w alkalicznym roztworze w ph 9,0 do 10,0. Po wytrąceniu barwnik jest oddzielany od płynu przez wirowanie. Przykład 4 Precypitat jest rozpuszczany w alkoholu etylowym i filtrowany. Alkohol jest usuwany i otrzymuje się barwnik w formie krystalicznej.

5 Przykład 5 Precypitat jest rozpuszczany w roztworze amoniaku o ph 9,0 do 10,0. Otrzymywany jest 5 do 50% wodny roztwór czerwonego barwnika. Możliwość przemysłowego zastosowania. Końcowy produkt technologii według wynalazku jest czerwonym barwnikiem pochodzenia mikrobiologicznego, przeznaczonym do przemysłu żywnościowego i kosmetycznego.

6 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.